WO2022141773A1

WO2022141773A1 - 光源装置、显微设备、光学检测设备和光学检测方法

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Publication number: WO2022141773A1
Application number: PCT/CN2021/076825
Authority: WO
Inventors: 冯子寅; 季敏标
Original assignee: 上海浚真生命科学有限公司
Priority date: 2020-12-28
Filing date: 2021-02-19
Publication date: 2022-07-07
Also published as: US20240012228A1

Abstract

本公开涉及一种光源装置、显微设备、光学检测设备和光学检测方法。光源装置包括：照明光源，所述照明光源被配置为产生照明光；以及光阑，所述光阑设于所述照明光源的出射光路上，所述光阑包括：遮光屏，所述遮光屏被配置为遮挡部分照明光；第一透光部，所述第一透光部开设在所述遮光屏上，且所述第一透光部覆盖所述光阑的中心，所述第一透光部被配置为使部分照明光透过以形成明场照明；以及第二透光部，所述第二透光部开设在所述遮光屏上，且所述第二透光部位于所述第一透光部的外围，所述第二透光部被配置为使部分照明光透过以形成暗场照明。

Description

光源装置、显微设备、光学检测设备和光学检测方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年12月28日提交的、申请号为202011582795.3的中国发明专利、于2020年12月28日提交的、申请号为202011582981.7的中国发明专利以及于2020年12月28日提交的、申请号为202011583924.0的中国发明专利的优先权，这些申请通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开涉及光学检测技术领域，具体而言，涉及一种光源装置、显微设备、光学检测设备和光学检测方法。

背景技术

在化学、生物等领域中，光学检测被越来越广泛地使用。在光学检测中，可以采用照明光对样品进行照明以观察样品，例如对样品中的生物颗粒(例如细胞)等进行计数和形貌观察等；还可以采用具有一定波长的激发光来激发样品中的各种信号(例如荧光信号等)，从而获取样品的相关性质。然而，在现有的光学检测设备中，用于照明和用于激发的光源组件通常是单独设置的，导致光学检测设备的体积较大，且常常需要在不同的光源组件之间进行复杂的切换，这给检测带来了很多不便。

在光学检测中，良好的照明可以帮助相关人员更好地观察样品，从而以简单的方式得到关于样品的更多的信息。例如，在生物检测中，可以借助照明来获得关于样品中的生物颗粒(例如细胞、细胞碎片、酵母、藻类等)及其性质(例如辨别细胞为活细胞还是死细胞等)的相关信息。然而，由于样品自身条件的限制，例如生物颗粒本身很小、且大多呈透明状等，对它们的有效照明往往是十分困难的。

此外，当采用具有一定波长的激发光照射待测样品以激发出例如荧光信号等时，可以获取待测样品的相关性质，从而对待测样品(例如细胞、细胞碎片、酵母、藻类等生物颗粒)等进行识别和分析。然而，在同一个待测样品中可能可以激发出处于不同波段的多种信号，不同的信号可能反映了待测样品的不同方面的性质。为了减少这些信号之间的相互干扰，需要通过滤光件等将其一一分离，再分别对每个信号进行分析。这样的检测过程往往十分复杂，且难以在单次检测中获得关于待测样品的更全面的信息，导致检测效果不够理想。

发明内容

本公开的目的之一在于提出一种光源装置、显微设备、光学检测设备和光学检测方法。

根据本公开的第一方面，提供了一种光源装置，所述光源装置包括：

照明光源，所述照明光源被配置为产生照明光；以及

光阑，所述光阑设于所述照明光源的出射光路上，所述光阑包括：

遮光屏，所述遮光屏被配置为遮挡部分照明光；

第一透光部，所述第一透光部开设在所述遮光屏上，且所述第一透光部覆盖所述光阑的中心，所述第一透光部被配置为使部分照明光透过以形成明场照明；以及

第二透光部，所述第二透光部开设在所述遮光屏上，且所述第二透光部位于所述第一透光部的外围，所述第二透光部被配置为使部分照明光透过以形成暗场照明。

在一些实施例中，所述第一透光部的外侧边缘与所述光阑的中心之间的距离R1、所述光阑与所述样品位置之间的距离l以及被配置为与所述光源装置配合使用的物镜的数值孔径n之间满足以下关系：

R1≤l·tg[arcsin(n)/3]。

在一些实施例中，所述第二透光部的内侧边缘与所述光阑的中心之间的距离R2、所述光阑与所述样品位置之间的距离l以及被配置为与所述光源装置配合使用的物镜的数值孔径n之间满足以下关系：

R2＞l·tg[arcsin(n)]。

在一些实施例中，所述遮光屏包括围绕所述光阑的中心的环状遮光部。

在一些实施例中，所述第一透光部包括从所述光阑的中心向外扩展的圆形通光孔。

在一些实施例中，所述第二透光部包括围绕所述光阑的中心布置的一个或多个通光缝。

在一些实施例中，通光缝包括弧形通光缝。

在一些实施例中，多个通光缝围绕所述光阑的中心呈环状布置。

在一些实施例中，所述第二透光部包括围绕所述光阑的中心布置的一个或多个通光孔。

在一些实施例中，通光孔包括圆形通光孔。

在一些实施例中，多个通光孔围绕所述光阑的中心均匀分布。

在一些实施例中，所述光阑包括可调光阑，所述可调光阑的第一透光部和第二透光部中的至少一者的透光范围能够被改变。

在一些实施例中，所述光源装置还包括：

第一透镜，所述第一透镜设于所述照明光源的出射光路上，且所述第一透镜被配置为将照明光会聚在所述样品位置处。

在一些实施例中，所述第一透镜设于所述光阑和所述样品位置之间。

在一些实施例中，所述光源装置还包括：

光衰减件，所述光衰减件设于所述照明光源的出射光路上，且所述光衰减件被配置为减小照明光的亮度。

在一些实施例中，所述光衰减件包括以下中的至少一种：

磨玻璃片；以及

偏振片。

在一些实施例中，所述光衰减件设于以下位置中的至少一处：

在所述照明光源和所述光阑之间；以及

在所述光阑和所述第一透镜之间。

在一些实施例中，所述照明光源包括热辐射光源和发光二极管中的至少一种。

根据本公开的第二方面，还提出了一种光源装置，所述光源装置包括：

第一光源组件，所述第一光源组件被配置为产生沿第一方向传播的第一出射光；

第二光源组件，所述第二光源组件被配置为产生沿第二方向传播的第二出射光，其中，所述第二方向与所述第一方向彼此相交；以及

第一二向色镜，所述第一二向色镜设于所述第一方向与所述第二方向相交的位置处，且所述第一二向色镜被配置为使所述第一出射光的至少一部分透射以继续沿所述第一方向传播，并将所述第二出射光的至少一部分反射成沿所述第一方向传播，其中，所述第一出射光的被透射的一部分处于第一波段，所述第二出射光的被反射的一部分处于第二波段，且所述第一波段与所述第二波段彼此分离。

在一些实施例中，所述第一出射光为照明光，所述第一光源组件为照明光源组件，且所述第二出射光为激发光，所述第二光源组件为激发光源组件；或者

所述第一出射光为激发光，所述第一光源组件为激发光源组件，且所述第二出射光为照明光，所述第二光源组件为照明光源组件。

在一些实施例中，当所述第一出射光为照明光、所述第二出射光为激发光时，所述第一波段的最小波长大于所述第二波段的最大波长；以及

当所述第一出射光为激发光、所述第二出射光为照明光时，所述第一波段的最大波长小于所述第二波段的最小波长。

在一些实施例中，所述照明光源组件包括：

照明光源；以及

光阑，所述光阑设于所述照明光源和所述第一二向色镜之间，所述光阑被配置为遮挡所述照明光源所产生的光的至少一部分。

在一些实施例中，所述照明光源组件还包括：

第二透镜，所述第二透镜设于所述照明光源和所述光阑之间，所述第二透镜被配置为使所述照明光源所产生的光准直。

在一些实施例中，所述光阑包括遮光屏以及开设在所述遮光屏上的多个通光孔，其中，所述多个通光孔中的一个通光孔开设在所述遮光屏的中心位置，所述多个通光孔中的其它通光孔围绕处于中心位置的通光孔均匀分布。

在一些实施例中，所述光阑包括遮光屏以及开设在所述遮光屏上的通光狭缝，其中，所述通光狭缝围绕所述遮光屏的中心位置呈环状分布。

在一些实施例中，所述光阑还包括开设在所述遮光屏的中心位置的通光孔。

在一些实施例中，所述光阑包括可调光阑，所述可调光阑被配置为使所述照明光源所产生的光的通过所述光阑的部分能够被改变。

在一些实施例中，所述激发光源组件包括：

激发光源；以及

第一滤光件，所述第一滤光件设于所述激发光源和所述第一二向色镜之间，所述第一滤光件被配置为对所述激发光源所产生的光进行滤光。

在一些实施例中，所述激发光源组件还包括：

第三透镜，所述第三透镜设于所述激发光源和所述第一滤光件之间，所述第三透镜被配置为使所述激发光源所产生的光准直。

在一些实施例中，所述激发光源包括发光二极管和激光器中的至少一种。

在一些实施例中，所述第一滤光件包括带通滤光片。

在一些实施例中，所述第一方向与所述第二方向彼此垂直。

在一些实施例中，所述第一出射光和所述第二出射光相对于所述第一二向色镜的入射角均为45度。

在一些实施例中，所述光源装置还包括：

第四透镜，所述第四透镜设于所述第一二向色镜和样品位置之间，所述第四透镜被配置为将所述第一出射光会聚到所述样品位置，和/或将所述第二出射光会聚到所述样品位置。

根据本公开的第三方面，提出了一种显微设备，所述显微设备包括如上所述的光源装置。

在一些实施例中，所述显微设备还包括物镜，所述物镜与所述光源装置关于所述样品位置相对地设置。

根据本公开的第四方面，提出了一种光学检测设备，所述光学检测设备包括如上所述的光源装置。

根据本公开的第五方面，提出了一种光学检测设备，所述光学检测设备包括：

光源装置，所述光源装置被配置为产生激发光，所述激发光的至少一部分能够激发出处于第三波段的第一光信号和处于第四波段的第二光信号，其中，所述第三波段与所述第四波段彼此分离，且所述第三波段的最大波长小于所述第四波段的最小波长；

第二滤光件，所述第二滤光件设于所述第一光信号和所述第二光信号所在的光路上，且所述第二滤光件被配置为使处于所述第三波段和所述第四波段的光通过，并滤除其它波段的光；以及

检测装置，所述检测装置设于所述第二滤光件的出射光路上，且所述检测装置被配置为响应于所述第一光信号和所述第二光信号产生检测信号。

在一些实施例中，所述光源装置包括：

激发光源，所述激发光源被配置为产生所述激发光；以及

第一滤光件，所述第一滤光件设于所述激发光源和样品位置之间，所述第一滤光件被配置为使所述激发光中的处于第五波段的光通过，并滤除所述激发光中的其它波段的光；

其中，所述第五波段的最大波长小于或等于所述第三波段的最小波长。

在一些实施例中，所述第三波段被包括在500～550nm的范围中，所述第四波段被包括在600～650nm的范围中，以及所述第五波段被包括在450～500nm的范围中。

在一些实施例中，所述光源装置还包括：

照明光源，所述照明光源被配置为产生照明光，所述照明光能够对处于所述样品位置的待测样品进行照明；以及

光阑，所述光阑设于所述照明光源和所述样品位置之间，所述光阑能够遮挡所述照明光的一部分以形成相衬照明。

在一些实施例中，所述照明光与所述激发光彼此呈角度；

所述光源装置还包括：

第一二向色镜，所述第一二向色镜设于所述照明光与所述激发光相交的位置处；

其中，所述第一二向色镜被配置为使所述照明光的至少一部分透射，并将所述激发光的至少一部分反射到所述照明光所在的方向上；或者所述第一二向色镜被配置为使所述激发光的至少一部分透射，并将所述照明光的至少一部分反射到所述激发光所在的方向上。

在一些实施例中，所述光源装置包括热辐射光源、发光二极管和激光器中的至少一者。

在一些实施例中，所述光学检测设备还包括：

转向装置，所述转向装置设于所述光源装置和所述检测装置之间，且所述转向装置被配置为改变光的传播方向。

在一些实施例中，所述转向装置包括：

反射镜，所述反射镜设于所述光源装置和所述样品位置之间，且所述反射镜被配置为将所述激发光反射到所述样品位置上。

在一些实施例中，所述转向装置包括：

第二二向色镜，所述第二二向色镜被配置为将所述激发光反射到所述样品位置上，并使所述第一光信号和所述第二光信号透射到所述检测装置上。

在一些实施例中，所述第二滤光件设于所述第二二向色镜和检测装置之间。

在一些实施例中，所述第二二向色镜呈长方体块状设置。

在一些实施例中，所述第二滤光件贴合于所述第二二向色镜的第一表面上，所述光源装置的第一滤光件贴合于所述第二二向色镜的垂直于所述第一表面的第二表面上。

在一些实施例中，所述第二二向色镜的反射面与所述第一表面和所述第二表面均呈45度角。

在一些实施例中，所述检测装置包括成像装置，所述成像装置被配置为基于所述第一光信号和所述第二光信号成像。

在一些实施例中，所述成像装置包括电荷耦合器件和互补金属氧化物半导体器件中的至少一种。

在一些实施例中，所述光学检测设备还包括：

存储器，所述存储器与所述检测装置通信地连接，所述存储器被配置为存储检测信号；和/或

处理器，所述处理器与所述检测装置通信地连接，所述处理器被配置为对所述检测信号进行处理。

根据本公开的第六方面，提出了一种光学检测方法，所述光学检测方法包括：

采用处于第五波段的光激发待测样品，其中，处于第五波段的光能够激发出处于第三波段的第一光信号和处于第四波段的第二光信号，所述第三波段与所述第四波段彼此分离，且所述第三波段的最大波长小于所述第四波段的最小波长，所述第五波段的最大波长小于或等于所述第三波段的最小波长；以及

检测来自所述待测样品的第一光信号和第二光信号。

在一些实施例中，在采用处于第五波段的光激发待测样品之前，所述光学检测方法还包括：

采用预定染料对待测样品进行染色。

通过以下参照附图对本公开的示例性实施例的详细描述，本公开的其它特征及其优点将会变得清楚。

附图说明

构成说明书的一部分的附图描述了本公开的实施例，并且连同说明书一起用于解释本公开的原理。

参照附图，根据下面的详细描述，可以更加清楚地理解本公开，其中：

图1(a)示出了一具体示例中的未染色时明场照明的成像照片；

图1(b)示出了一具体示例中的用台盼蓝染色时明场照明的成像照片；

图2示出了一具体示例中的明场照明的情况下照明光与样品之间的相互作用示意图；

图3(a)示出了一具体示例中的未染色时暗场照明的成像照片；

图3(b)示出了一具体示例中的用台盼蓝染色时暗场照明的成像照片；

图4示出了一具体示例中的暗场照明的情况下照明光与样品之间的相互作用示意图；

图5示出了根据本公开的一示例性实施例的光源装置、样品和物镜的结构示意图；

图6示出了图5中的光源装置、样品和物镜中的相关参数示意图；

图7示出了一具体实施例中的光阑的结构示意图；

图8示出了另一具体实施例中的光阑的结构示意图；

图9(a)示出了一具体示例中的未染色时复合照明的成像照片；

图9(b)示出了一具体示例中的用台盼蓝染色时复合照明的成像照片；

图10示出了根据本公开的一示例性实施例的光源装置和样品台的结构示意图；

图11示出了根据本公开的另一示例性实施例的光源装置和样品台的结构示意图；

图12示出了根据本公开的又一具体实施例的光阑的结构示意图；

图13示出了通过图12中的光阑的光路示意图；

图14示出了从待测样品激发出的处于第三波段的第一光信号的成像示意图；

图15示出了从待测样品激发出的处于第四波段的第二光信号的成像示意图；

图16示出了根据本公开的一示例性实施例的光学检测设备的结构示意图；

图17示出了在一具体实施例中的第二滤光件的透射率-波长示意图；

图18示出了在一具体实施例中的从待测样品激发出的处于第三波段的第一光信号和处于第四波段的第二光信号的成像示意图；

图19示出了根据本公开的另一示例性实施例的光学检测设备的结构示意图；

图20示出了根据本公开的又一示例性实施例的光学检测设备的结构示意图；

图21示出了根据本公开的一示例性实施例的光学检测方法的流程示意图。

注意，在以下说明的实施方式中，有时在不同的附图之间共同使用同一附图标记来表示相同部分或具有相同功能的部分，而省略其重复说明。在本说明书中，使用相似的标号和字母表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步讨论。

为了便于理解，在附图等中所示的各结构的位置、尺寸及范围等有时不表示实际的位置、尺寸及范围等。因此，所公开的发明并不限于附图等所公开的位置、尺寸及范围等。此外，附图不必按比例绘制，一些特征可能被放大以示出具体组件的细节。

具体实施方式

现在将参照附图来详细描述本公开的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本公开的范围。

以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本公开及其应用或使用的任何限制。也就是说，本文中的芯片测试方法和计算芯片是以示例性的方式示出，来说明本公开中的电路或方法的不同实施例，而并非意图限制。本领域的技术人员将会理解，它们仅仅说明可以用来实施本发明的示例性方式，而不是穷尽的方式。

对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。

在研究过程中，例如生物领域的研究过程中，为了对样品进行表征，通常将涉及对样品进行照明。相关人员可以根据需要，选择合适的照明方式来实现照明，这些照明方式可以包括明场照明和暗场照明等。

如图1(a)所示为一具体示例中的未染色时明场照明的成像照片，图1(b)所示为一具体示例中的用台盼蓝染色时明场照明的成像照片。在图1(a)和图1(b)所示的成像照片中，可以看到呈现出不同形貌的对象911、912、913等，它们可能是样品中所包含的活细胞、死细胞和其他杂质等。然而，在明场照明的情况下，样品中的不同对象通常具有彼此一致的焦平面，因此，在这样的成像照片中难以有效地区分开不同的对象。此外，样品中的透明对象的边缘可能不是很清晰，难以对这些透明对象的尺寸等进行估计，甚至有些透明对象不能被有效地观察到。

如图2所示为明场照明的情况下照明光与样品之间的相互作用示意图。在明场照明的情况下，照明光垂直或基本上垂直入射到样品上。当照明光照射在透明对象921上时，其可以基本上穿透透明对象921；当照明光照射在非透明对象922上时，其被非透明对象922阻挡。因此，在明场照明下，透明对象可能难以在成像照片中被很好地显现，而非透明对象的成像效果一般远好于透明对象，这也解释了在图1中所示的成像照片中观察到的现象。

为了便于对透明对象进行观察，还可以在暗场照明的情况下进行成像。如图3(a)所示为一具体示例中的未染色时暗场照明的成像照片，图3(b)所示为一具体示例中的用台盼蓝染色时暗场照明的成像照片，其中对象931较亮。在暗场照明的情况下，可以更好地观察透明对象，包括对例如活细胞之类的透明对象进行计数以及尺寸估计等。然而，暗场照明不利于对非透明对象或者被染色的对象(例如被台盼蓝染色细胞核的死细胞等)进行观察，因而难以掌握关于样品中所包含的各种对象的完整信息。

如图4所示为暗场照明的情况下照明光与样品的相互作用示意图。在暗场照明下，照明光以大角度入射在样品上，且照明光可以来自不同的方向。当照明光与样品中所包含的透明对象941相互作用时，来自不同方向的照明光将在透明对象941上的表面的不同位置处相交，从而能够更好地表征透明对象941的边缘，帮助清晰地显示出透明对象941。然而，当照明光照射在非透明对象942上时，将被该非透明对象942遮挡，又因为暗场情况下缺乏背景光，因此对样品中的非透明对象942的观察比较困难。

为了更好地观察样品中的各种对象，在本公开的示例性实施例中，提出了一种光源装置，该光源装置结合明场照明和暗场照明以产生复合照明，从而实现更好的照明效果。

如图5和图6所示，在本公开的一示例性实施例中，光源装置可以包括照明光源(图中未示出)以及光阑112。

其中，照明光源可以被配置为产生照明光，照明光一般处于可见光波段。在一些实施例中，照明光源可以包括热辐射光源和发光二极管中的至少一种，以产生例如白光或接近白光的可见光，从而方便对样品进行光学观察。

光阑112设于照明光源的出射光路上，并且可以通过调控照明光的透过部分，在样品200所在的样品位置处产生复合照明。可以理解的是，光阑112可以设置在照明光源的出射光路上的不同位置处，以实现对照明光的遮挡。然而，为了方便确定光阑112自身的通光参数以及光阑112沿着光轴的设置位置，可以将光阑112设置在处于准直状态下的照明光所经过的光路上。当照明光源直接产生的照明光不是准直光时，在光源装置中还可以包括与照明光源一体设置或者独立于照明光源设置的准直透镜。该准直透镜可以包括一个或多个彼此配合的透镜，以实现对照明光的准直，相应地，光阑112可以设置在准直透镜的出射光路上。

光阑112可以包括遮光屏112a、第一透光部112b和第二透光部112c。其中，遮光屏112a可以用非透明材料制成，其被配置为遮挡部分照明光。第一透光部112b开设在遮光屏112a上，且覆盖光阑112的中心，并被配置为使部分照明光透过以形成明场照明。第二透光部112c也开设在遮光屏112a上，且位于第一透光部112b的外围，并被配置为使部分照明光透光以形成暗场照明。

如图5所示，当通过第一透光部112b的以较小角度入射到样品200上的照明光与样品 200相互作用后，将产生靠近光轴的一部分直射光410(白区域)，其与明场照明相对应，可以增强整个观察视场的亮度，以改善观察效果。当通过第二透光部112c的以较大角度入射到样品200上的照明光与样品200相互作用后，将产生相对远离光轴的散射光420(灰区域)，其与暗场照明相对应，可以更好地显示出样品中的透明对象的边缘，以改善观察效果。此外，在图5中可以看到，在散射光420外侧还可能存在一部分直射光410，通过设计物镜300的相关参数，这部分直射光将不会被物镜300所收集，对观察基本不会造成影响，因此不再进行详细描述。

在光源装置中，通过调节第一透光部112b和第二透光部112c的相关尺寸，可以改变复合照明中明场照明和暗场照明彼此的比例，以实现理想的照明效果。具体而言，随着第一透光部112b的相对通光尺寸增大，透过的以较小角度入射到样品上的照明光增多，明场照明所占的比重增大，观察到的视野的亮度将更亮，但是透明对象的成像效果可能变差；而随着第二透光部112c的相对通光尺寸增大，透过的以较大角度入射到样品上的照明光增多，暗场照明所占的比重增大，透明对象的成像效果将更好，但是非透明对象或者被染色对象等的成像效果可能变差，视野的整体亮度将会变低。

图6示出了光源装置、样品以及物镜中的一些相关参数，通过调整它们之间的相互关系，可以获得较为理想的照明效果。

在一些实施例中，为了避免复合成像中明场照明所占的比重过大，通常需要满足以下关系：

其中，

sinα＝n，R1为第一透光部112b的外侧边缘与光阑112的中心之间的距离，l为光阑112与样品位置之间的距离，n为与光源装置配合使用的的物镜300的数值孔径，推导可得：R1≤l·tg[arcsin(n)/3]。

在一些实施例中，为了避免靠近外侧的直射光进入物镜300中干扰成像，也就是使与样品作用所产生的散射光能够覆盖物镜300的孔径，通常需要满足以下关系：∠β2＞∠α，其中，

sinα＝n，R2为第二透光部112c的内侧边缘与光阑112的中心之间的距离，l为光阑112与样品位置之间的距离，n为与光源装置配合使用的的物镜300的数值孔径，推导可得：R2＞l·tg[arcsin(n)]。

在光源装置中，遮光屏112a至少可以遮挡掉以较小角度入射到样品上的照明光，从而帮助形成暗场照明，避免以小角度入射的照明光对最终的成像造成干扰。

遮光屏112a可以包括彼此连接的多个遮光部。在一些实施例中，遮光屏112a可以包括围绕光阑112的中心的环状遮光部，以遮挡掉照明光中的以较小角度入射到样品上的一部分，而使垂直入射和一小部分以更小角度入射到样品上的光通过，从而实现暗场照明和明场照明结合的复合照明，例如图7中所示的在内的第一环状遮光部1121a。在一些情况下，如图7所示，遮光屏112a还可以包括围绕第一环状遮光部1121a的在外的第二环状遮光部1122a，以进一步约束照明光束。当然，在其他一些光阑112中，遮光屏112a的形状也可以是不规则的，例如图8中所示的光阑。

第一透光部112b可以使距离光轴较近的、具有较小入射角的光透过，以形成复合照明中的明场照明。在一些实施例中，第一透光部112b可以包括如图7和图8所示的从光阑112的中心向外扩展的圆形通光孔1121b。当然，在其他示例中，第一透光部112b也可以具有其他的形状和布置。

第二透光部112c可以使距离光轴较远的、具有较大入射角的光透过，以形成复合照明中的暗场照明。在一些实施例中，第二透光部112c可以包括围绕光阑112的中心布置的一个或多个通光缝。这些通光缝可以包括弧形通光缝1121c，如图7所示。此外，多个通光缝可以围绕光阑112的中心呈环状布置，以使得来自各个方向的大角度的入射光能够透过光阑112照射到样品上，从而帮助形成复合照明中的暗场照明。在一些实施例中，第二透光部112c可以包括围绕光阑112的中心布置的一个或多个通光孔。这些通光孔可以包括圆形通光孔1122c，如图8所示。此外，多个通光孔可以围绕光阑112的中心均匀分布，以使得来自各个方向的大角度的入射光能够透过光阑112照射到样品上，从而帮助形成复合照明中的暗场照明。当然，在其他示例中，第二透光部112c也可以具有其他的形状和布置。

在一些实施例中，光阑112还可以包括可调光阑，在可调光阑中，第一透光部112b和第二透光部112c中的至少一者的透光范围能够被改变，从而可以改变复合照明中暗场照明和明场照明之间的比例，以便根据实际情况对成像效果进行方便灵活的调节。

在一些实施例中，如图5和图6所示，光源装置还可以包括第一透镜113，第一透镜113可以设于照明光源的出射光路上，且被配置为将照明光会聚在样品位置处。

如上文所述，为了便于确定光阑112的相关参数及其在光轴上的位置，第一透镜113可以设于光阑112和样品位置之间，也就是说，先由光阑112对准直的照明光进行调制，再由第一透镜113对照明光进行会聚。

在一些实施例中，如图5和图6所示，光源装置还可以包括光衰减件114，光衰减件114可以设于照明光源的出射光路上，且被配置为减小照明光的亮度，以改善复合照明的效果，避免明场过亮。光衰减件114可以是磨玻璃片或者偏振片等，并且可以设置在照明光源和光阑112之间或者光阑112和第一透镜113之间的一个或多个位置上。为了便于确定光衰减件114的尺寸和在光轴上的位置，光衰减件114可以位于处于准直状态下的出射光所经过的光路上。

在本公开的示例性实施例中，通过在光源装置中设置光阑，可以在样品上形成暗场照明与明场照明相结合的复合照明，在保障了成像亮度的前提下可以更清楚地显示出透明对象，从而能够对透明对象和非透明对象两者都进行很好的观察。此外，由于样品中存在的不同对象(例如细胞和杂质)的高度存在差异，它们可以被分别成像在不同的焦平面上，因此当涉及不同对象时，可以仅调节焦距就实现很好的观察效果，而无需切换分别用于明场照明和暗场照明的不同的光源装置。

如图9(a)所示为一具体示例中的未染色时复合照明的成像照片，图9(b)所示为一具体示例中的用台盼蓝染色时复合照明的成像照片。尤其是当用台盼蓝染色时，可以清楚地分辨出透明的活细胞941以及被台盼蓝染色细胞核的死细胞942。此外，样品中的杂质与细胞之间的高度差较大，因此杂质对应的焦平面不同于细胞对应的焦平面，因此在观察细胞时可以很好地去除杂质的干扰，而当需要观察杂质时，仅通过调节焦距即可实现。

为了解决光学检测设备中光源组件所占据的体积较大、切换不方便的问题，本公开还提出了一种光源装置，该光源装置可以集成多个光源组件，从而在光学检测设备中分别实现不同的检测功能。本公开的光源装置和使用该光源装置的设备可以具有较小的体积，且光路切换简单，从而可以使检测更加方便高效。

在本公开的示例性实施例中，如图10和图11所示，光源装置100可以包括被配置为产生沿第一方向传播的第一出射光的第一光源组件、被配置为产生沿第二方向传播的第二出射光的第二光源组件以及第一二向色镜130。

其中，第二方向与第一方向彼此相交，从而使得第一光源组件和第二光源组件可以被分别设置在不同的位置上，以避免它们之间的相互干扰。

进一步地，第一二向色镜130可以使不同波长的光被透射或反射，从而使第一出射光和第二出射光能够共用一部分光路，以减小光源装置的体积，并简化不同光源组件的切换。

第一二向色镜130可以设于第一方向与第二方向相交的位置处，使得第一出射光和第二出射光都可以被入射到第一二向色镜130上。第一二向色镜130可以使第一出射光的至少一部分透射以继续沿第一方向传播，并将第二出射光的至少一部分反射成沿第一方向传播。也就是说，在经过第一二向色镜130之后，第一出射光和第二出射光将沿着相同的光路行进。

在一些实施例中，第一光源组件所产生的第一出射光所处的波段使得其可以全部透射通过第一二向色镜130。在另一些实施例中，第一出射光所处的波段可以更宽，而其中仅一部分可以通过第一二向色镜130，在这种情况下，第一二向色镜130还可以起到一定的滤光作用，从而降低了对第一光源组件所产生的第一出射光所处的波段的要求，有助于减少第一光源组件的成本。类似地，第二光源组件所产生的第二出射光所处的波段使得其可以全部被第一二向色镜130反射。在另一些实施例中，第二出射光所处的波段可以更宽，而其中仅一部分可以被第一二向色镜130反射，在这种情况下，第一二向色镜130也可以起到一定的滤光作用，从而降低了对第二光源组件所产生的第二出射光所处的波段的要求，有助于减少第二光源组件的成本。此外，一些第一二向色镜可以使波长较大的光透射，而反射波长较小的光，而另一些第一二向色镜可以反射波长较大的光，而使波长较小的光透射，可以根据需要来选择这两种不同的第一二向色镜用在光源装置中。基于第一二向色镜130的基本性质，第一出射光的被透射的一部分处于第一波段，第二出射光的被反射的一部分处于第二波段，且第一波段与第二波段可以是彼此分离的。

在图10所示的示例性实施例中，第一出射光为用于视觉观察的照明光，第一光源组件为照明光源组件110，且第二出射光为用于激发样品中的荧光信号等的激发光，第二光源组件为激发光源组件120。而在图11所示的示例性实施例中，第一出射光为激发光，第一光源组件为激发光源组件120，且第二出射光为照明光，第二光源组件为照明光源组件110。照明光一般处于可见光波段，例如可以为白光。而激发光的波段可以根据样品或对样品进行染色的试剂的性质来确定，在一些实施例中，激发光可以处于具有较高能量的紫外波段或可见光中偏蓝光的波段，例如，激发光的波段可以在450～500nm的范围。

如图10和图11所示，照明光源组件110可以包括照明光源111以及设于照明光源111和第一二向色镜130之间的光阑112。此外，照明光源组件110还可以包括设于照明光源111和光阑112之间的第二透镜114。

在一些实施例中，照明光源111可以包括热辐射光源和发光二极管中的至少一种。照明光源111例如可以产生白光或接近白光的可见光，以方便对样品进行光学观察。

第二透镜114可以对照明光源111所产生的光进行准直。在一些实施例中，第二透镜114可以仅包括一个会聚透镜，以将来自照明光源111的发散光会聚成平行光或接近平行光。在另一些实施例中，第二透镜114也可以包括多个透镜，以使照明光源111所产生的光准直。

光阑112可以遮挡照明光源111所产生的光的至少一部分，以改善在样品位置(样品 200)处的照明光斑。光阑112可以具有多种不同的形式。

除了如上文中关于图7和图8所描述的光阑112之外，在一些实施例中，光阑112如图12所示，可以包括遮光屏112a以及开设在遮光屏112a上的通光狭缝1121c，其中，通光狭缝1121c围绕遮光屏112a的中心位置呈环状分布。

如图13所示为通过图12中的光阑的光路示意图。从中可知，照明光的至少中心部分将被光阑遮挡。利用这样的光阑可以形成相衬，尤其是在观察透明物体(例如细胞等生物颗粒等)时，采用相衬原理可以使透明物体的边缘更清晰，从而改善观察效果。

如上文所述的，在一些实施例中，光阑112可以包括可调光阑，在可调光阑中，至少部分通光孔和/或通光狭缝的打开和闭合是可以被控制而改变的，从而可以改变通过光阑112的光量。在一些实施例中，可调光阑还可以被完全地闭合，以在不需要照明光的情况下阻断照明光的继续传播，从而避免了照明光源111被反复开关而导致其寿命下降。

如图10和图11所示，激发光源组件120可以包括激发光源121以及设于激发光源121和第一二向色镜130之间的第一滤光件122。此外，激发光源组件120还可以包括设于激发光源121和第一滤光件122之间的第三透镜123。

在激发过程中，通常对激发光的波长存在一定的要求，以使得激发光的能量足以激发出样品的荧光等信号。激发光源可以包括发光二极管和激光器中的至少一种。在一具体示例中，激发光源所产生的光的波段可以被包括在450～500nm中，配合相应的染料对细胞等生物颗粒进行染色，这样的激发光可以激发出例如500～550nm或600～650nm等的荧光信号。

第一滤光件122可以对激发光源所产生的光进行滤光，以获得处于所需波段的第二出射光。在一些实施例中，第一滤光件122可以包括带通滤光片。带通滤光片可以允许处于某个连续波长范围内的光通过，而滤除这个范围之外的其它波长的光。

第三透镜123可以对激发光源121所产生的光进行准直。与第二透镜114类似，第三透镜123可以仅包括一个会聚透镜，以将来自激发光源121的发散光会聚成平行光或接近平行光。或者，第三透镜123也可以包括多个透镜，以使激发光源121所产生的光准直。

将第一滤光件122设置在第三透镜123的出射端从而对准直后的激发光进行滤光，有助于减小所需的第一滤光件122的尺寸。

如图10和图11所示，第一方向与第二方向可以是彼此垂直的。而且，第一二向色镜130可以被设置为使得第一出射光和第二出射光相对其的入射角均为45度，从而将第一出射光和第二出射光均引导到第一方向上，对样品进行照明或激发。

激发光的波段可以在450～500nm的范围中，第一二向色镜130的截止波长可以为550nm。在一具体实施例中，如图10所示，第一二向色镜130可以透射波长在550nm以上的光，从而使得照明光能够继续沿第一方向传播到样品位置，而反射波长在550nm以下的光，从而将激发光反射成沿第一方向传播，以实现对样品的激发。在另一具体实施例中，如图11所示，第一二向色镜130可以反射波长在550nm以上的光，从而将激发光反射成沿第一方向传播，以实现对样品的激发，同时透射波长在550nm以下的光，使得照明光能够继续沿第一方向传播到样品位置。

如图10和图11所示，为了将从第一二向色镜130出射的平行光或接近平行光会聚到样品位置(样品200)，以改善对样品的照明或激发，光源装置还可以包括第四透镜140，该第四透镜140可以设于第一二向色镜130和样品位置之间。

在光学检测过程中，照明光和激发光一般并不同时被投射到样品上。在一些实施例中，可以通过分别控制照明光源111和激发光源121的开关来控制哪束光将被投射到样品上。在另一些实施例中，也可以在照明光和激发光的至少一个光路上设置光阑、快门等部件，以控制照明光和激发光的开关。

根据本公开的另一方面，提出了一种显微设备，该显微设备可以包括如上所述的光源装置。此外，在显微设备中，还可以包括用于承载样品的样品台、与光源装置关于样品位置相对地设置的物镜、结像镜、成像装置(例如CCD、CMOS等)等部件。光源装置所产生的照明光可以被投射到样品台处的样品上，以实现对样品的观察。

根据本公开的又一方面，还提出了一种光学检测设备，该光学检测设备可以包括如上所述的光源装置或者显微设备。此外，光学检测设备还可以包括存储器、处理器等，以对成像图像信息进行自动处理和存储等，以简化检测。

进一步地，在光学检测中，不同种类的、处于不同状态的生物颗粒等待测样品本身，或者这些待测样品与相应的染料结合，可以被激发出不同的荧光等信号，因此通过检测来自待测样品的激发光，可以获取有关的信息。针对各个波段的激发光的检测一般是单独进行的，可以采用滤光件来滤除来自待测样品的激发光中的处于其它波段的光，而仅留下期望检测的一个波段的光，以方便分析。如图14和图15所示，分别为从待测样品激发出的处于第三波段的第一光信号和处于第四波段的第二光信号的成像示意图，在图14中，可以看到对应于第三波段的第一光信号的第一成像光斑9a，在图15中，可以看到对应于第四波段的第二光信号的第二成像光斑9b。需要注意的是，根据光信号所成的图像通常为暗场像，即图像背景是暗的，而在图14、图15和下面的图18中，出于图示清楚的目的，将成像图像的背景调整为亮的。

然而，对于同一待测样品而言，上述检测方式往往涉及针对各个波段的多次检测，且每次检测中所获取的关于待测样品的信息十分有限，导致检测效果不够理想。

为了解决上述问题，本公开提供了一种光学检测设备和光学检测方法，在本公开的示例性实施例中，可以对从待测样品激发出的处于多个波段的多种光信号同时进行分析，从而改善检测效果。

在本公开的一示例性实施例中，如图16所示，光学检测设备可以包括被配置为产生用于激发待测样品200的激发光的光源装置100、被配置为从待测样品200所产生的光信号中过滤出处于第三波段的第一光信号和处于第四波段的第二光信号的第二滤光件500以及被配置为响应于第一光信号和第二光信号产生检测信号的检测装置400。

具体而言，在待测样品符合条件的情况下，光源装置100所产生的激发光的至少一部分可以激发出处于第三波段的第一光信号和处于第四波段的第二光信号。为了方便后续的分析，第三波段与第四波段是彼此分离的，且在这里将处于能量较高的第三波段的激发光作为第一光信号，将处于能量较低的第四波段的激发光作为第二光信号，以方便后文的描述。可以理解的是，激发光的至少一部分的能量可以大于或等于第一光信号的能量，从而能够激发出第一光信号和第二光信号。

光源装置100可以具有多种配置方式。例如，如图16所示，光源装置100可以包括一个或多个激发光源121，这些激发光源121可以是热辐射光源、发光二极管和激光器中的至少一者。可以理解的是，热辐射光源和发光二极管所产生的光通常在较宽的波长范围上都有分布，因此当使用热辐射光源和发光二极管所产生的光来激发待测样品时，还可以在光源装置100中设置第一滤光件122，从而从热辐射光源和发光二极管直接产生的光中过滤出想要的波段内的光。而激光器所产生的光通常具有很好的单色性，因此在一些情况下，可以用激光器产生的光直接激发待测样品，而不设置相应的第一滤光件，当然，在其它一些情况下，也可以为激光器设置第一滤光件来滤除可能存在的其它波长的光。

第一滤光件122可以设于激发光源121和用于放置待测样品200的样品位置之间，并被配置为使激发光中的处于第五波段的光通过，并滤除激发光中的其它波段的光。在一些实施例中，第一滤光件122可以包括带通滤光片，该带通滤光片可以允许处于某个连续波长范围内的光通过，而滤除这个范围之外的其它波长的光。经过第一滤光件122所获得的第五波段的光可以激发待测样品，可以理解的是，为了使第五波段的光的能量大于或等于第三波段和第四波段的光的能量，以实现激发，第五波段的最大波长小于或等于第三波段的最小波长。在一具体实施例中，第三波段可以被包括在500～550nm的范围中，第四波段可以被包括在600～650nm的范围中，而第五波段可以被包括在450～500nm的范围中。

此外，在光学检测过程中，通常还涉及对待测样品的光学观察，当光源装置100中用于激发的激发光源等部件所产生的光不适合用于光学观察时，还可以在光源装置100中设置用于对待测样品进行照明的照明光源等部件。光源装置100的具体设置可以参考上文关于光源装置的描述。

此外，在一些实施例中，与激发光源121相关联的光路和与照明光源111相关联的光路也可以是单独设置的，即激发光和照明光可以分别沿不同的光路被照射到待测样品200上。在光学检测设备中，可以设置相应的机械切换装置等来切换激发光源121和照明光源111。

当然，在一些实施例中，也可以直接使用用于激发的激发光源所产生的光的至少一部分来观察待测样品。

返回图16，在光学检测设备中，第二滤光件500可以设于第一光信号和第二光信号所在的光路上，并被配置为使处于第三波段和第四波段的光通过，并滤除其它波段的光。也就是说，第二滤光件500为多波段滤光件，其可以使至少两个彼此分离的波段中的光通过，以实现对从待测样品激发出的光的多波段检测，从而获得关于待测样品的更全面的信息，并简化检测过程。可以根据待测样品或者用于对待测样品进行染色的染料的相关性质，选择能够过滤出期望波段的光的第二滤光件500。

可以理解的是，在其它一些实施例中，第二滤光件500也可以被选择为能够使彼此分离的三个或三个以上的波段中的光透射通过，从而实现对更多个波段的同时检测。

图17所示为一种第二滤光件500的透射率-波长示意图。可以看到，该第二滤光件500能够使波长处于约500～550nm和585～670nm的波段中的光透射通过，而基本上滤除其它波段的光，以改善检测效果。此外，在图17中，在约690nm处存在一很窄的透射率峰，也就是说这个第二滤光件500可能使波长为690nm左右的一部分光通过。然而，在实际测量中，主要关注的是500～650nm波段内的光信号，因此可以忽略可能存在的690nm的光的影响。

如图18所示为一具体实施例中的从待测样品激发出的处于第三波段的第一光信号和处于第四波段的第二光信号的成像示意图。不同于图14和图15，在图18所示的成像示意图中，可以看到对应于第三波段的第一光信号的第一成像光斑9a和对应于第四波段的第二光信号的第二成像光斑9b两者，从而可以获得关于待测样品的更全面的信息。

如图16所示，光学检测设备还可以包括检测装置400，该检测装置400可以设于第二滤光件500的出射光路上，并被配置为响应于第一光信号和第二光信号产生检测信号。在一些实施例中，检测装置400可以包括被配置为基于第一光信号和第二光信号成像的成像装置，如图18所示的成像示意图就可以形成在成像装置上。当然，在另一些实施例中，检测信号也可以具有其它的形式。

在一些实施例中，成像装置可以包括物镜组件和结像镜组件。结像镜组件可以设置在物镜组件的出射端，从而使来自物镜组件的平行或接近平行的光束能够在有限远的成像位置处成像。

成像装置还可以包括电荷耦合器件和互补金属氧化物半导体器件中的至少一种，电荷耦合器件或互补金属氧化物半导体器件可以设置在结像镜组件的焦平面上，以将来自待测样品的、经过物镜组件和结像镜组件的光信号转化为电信号，形成成像图像。

在一些实施例中，为了使结构更紧凑，光学检测设备还可以包括设于光源装置100和检测装置400之间的转向装置，以改变光的传播方向，充分利用空间。

在本公开的另一示例性实施例中，如图19所示，转向装置可以包括反射镜610。该反射镜610可以设于光源装置100和待测样品200所在的样品位置之间，且反射镜610可以被配置为将激发光反射到样品位置上。

可以理解的是，在其它实施例中，根据需要，转向装置还可以包括更多的反射镜和/或透射镜，从而实现对相应的光束的调整，在此不再赘述。

在本公开的又一示例性实施例中，如图20所示，转向装置可以包括第二二向色镜620，该第二二向色镜620可以被配置为将激发光反射到待测样品200所在的样品位置上，并使第一光信号和第二光信号透射到检测装置400上。

为了延长第二滤光件500的使用寿命，第二滤光件500可以设于第二二向色镜620和检测装置400之间。这样，来自待测样品200的光信号可以首先经过第二二向色镜620，其中一部分可以被第二二向色镜620预先滤除，然后通过第二滤光件500的过滤到达检测装置400。

在图20所示的实施例中，待测样品200可以设于光源装置100、第二二向色镜620的上方，而检测装置400可以设于光源装置100、第二二向色镜620的下方，以接收待测样品200产生的、经过第二二向色镜620透射的第一光信号和第二光信号。这样，待测样品200可以被方便地放置在光学检测设备中的样品位置处或从样品位置处移除，且光学检测设备的整体结构可以更加紧凑。

进一步地，第二二向色镜620可以呈长方体块状设置，第二滤光件500可以贴合于第二二向色镜620的第一表面上，光源装置100的第一滤光件122可以贴合于第二二向色镜620的垂直于第一表面的第二表面上，并且第二二向色镜620的反射面621可以与第一表面和第二表面均呈45度角。这样，第二二向色镜620、第一滤光件122和第二滤光件500可以被集成在一起，从而使得光学检测设备的结构更紧凑，也无需再为第一滤光件122和第二滤光件500设置单独的支撑部件等。

在一些实施例中，光学检测设备还可以包括存储器，存储器可以与检测装置通信地连接，并被配置为存储检测信号，以待进一步处理。

在另一些实施例中，光学检测设备还可以包括处理器，处理器可以与检测装置通信地连接，并被配置为对检测信号进行处理。例如，当检测装置为成像装置时，处理器可以直接读取成像装置产生的图像信号，并采用相应的算法获取图像中生物颗粒的尺寸分布、位置分布、以及计数等信息，从而进一步简化检测过程。处理器也可以与光学检测设备中的存储器通信地连接，而与算法对应的程序指令也可以被存储在光学检测设备的存储器中。

本公开还提出了一种光学检测方法，如图21所示，该光学检测方法可以包括：

步骤S100，采用处于第五波段的光激发待测样品，其中，处于第五波段的光能够激发出处于第三波段的第一光信号和处于第四波段的第二光信号，第三波段与第四波段彼此分离，且第三波段的最大波长小于第四波段的最小波长，第五波段的最大波长小于或等于第三波段的最小波长；以及

步骤S200，检测来自待测样品的第一光信号和第二光信号。

在一些实施例中，在采用处于第五波段的光激发待测样品之前，光学检测方法还可以包括采用预定染料对待测样品进行染色，以获取期望的待测样品的信息。

在本公开的光学检测设备和方法中，可以用处于单一波长或波段中的激发光来激发待测样品，产生相应的光信号，所产生的光信号中的至少部分分布在彼此分离的多个波段中。通过在单次检测中分析多波段的光信号，可以获得关于待测样品的更全面的信息，并简化检测过程。

下面列举了一些光学检测方法的具体实施例。

实施例1：细胞计数和细胞活率

1.1荧光染色

1)贴壁生长细胞(例如HEK293细胞)的计数和细胞活率

材料和方法

使用含10％胎牛血清DMEM培养基、在二氧化碳培养箱内(5％CO ₂，37℃)静置培养HEK293细胞。当细胞生长到一定阶段，如细胞汇合度在50％左右时，使用胰蛋白酶进行细胞消化，并使用DMEM培养基细胞重悬。将重悬后的细胞混合均匀加入进样管中，并放置在光学检测设备的进样口，光学检测设备可以通过移液装置将样品自动加入包埋AO(吖啶橙)，PI(碘化丙啶)染料的耗材中，并使用成像装置和相关程序对样本进行计数和活率评估。其中，AO可以通过完整的细胞膜，嵌入所有细胞(活细胞和死细胞)的细胞核；PI只能通过不完整的细胞膜，嵌入所有死细胞的细胞核。使用成像装置观察，AO染色细胞呈现绿色荧光，PI染色细胞呈现红色荧光。当两种染料均存在于细胞核内，在合适的AO、PI配比下，两种染料发生能量共振转移，致活细胞在蓝色通道下(EX：470/20，EM：535/40)激发出绿色荧光，死细胞在绿色通道下(EX：470/20，EM：600LP)激发出红色荧光。

结果

AO和PI可立即对HEK293细胞进行染色，并根据染色情况判断活细胞，死细胞和总细胞，根据AO和PI的结合细胞染色情况，使用本发明的光学检测设备和方法可准确判断细胞浓度和活率。

2)悬浮生长细胞(例如Jurket细胞)的计数和细胞活率

3)昆虫细胞系(例如S2&Sf9细胞系)的计数和细胞活率

4)原代细胞(例如人体外周血细胞，鼠脾细胞和骨髓细胞)的计数和细胞活率

材料与方法

采用实验通用方式采集以上细胞系及原代细胞，细胞采集后混匀加入进样管，放置在光学检测设备进样口，光学检测设备可以通过移液装置将样品自动加入包埋AO和PI染料的耗材中，并使用成像装置和相关程序对样本进行计数和活率评估。

结果

结果与HEK293细胞一致，AO和PI可立即对对应细胞进行染色，并根据染色情况判断活细胞，死细胞和总细胞，根据AO和PI的结合细胞染色情况，使用本发明装置可准确判断细胞浓度和活率。

1.2台盼蓝染色

1)贴壁生长细胞(例如HEK293细胞)的计数和细胞活率

材料和方法

使用含10％胎牛血清DMEM培养基、在二氧化碳培养箱内(5％CO ₂，37℃)静置培养HEK293细胞。当细胞生长到一定阶段，如细胞汇合度在80％左右时，使用胰蛋白酶进行细胞消化，并使用DMEM培养基细胞重悬。将重悬后的细胞混合均匀加入进样管中，并放置在光学检测设备的进样口，光学检测设备可以通过移液装置将样品自动加入包埋台盼蓝染料的耗材中，并使用成像装置和相关程序对样本进行计数和活率评估。其中，台盼蓝是一种蓝色酸性染料，含有两个偶氮发色团，是一种较大、亲水和四磺酸化的阴离子染料，普遍用于检测细胞膜的完整性及评估细胞存活率。活细胞不着色，而死细胞则摄取染料，因此，可分别计数不着色的活细胞和蓝染的死细胞。

结果

台盼蓝可立即对HEK293细胞进行染色，根据明场成像结果分析识别总细胞，并根据染色情况判断活细胞，死细胞，使用本发明的光学检测设备和方法可准确判断细胞浓度和活率。

2)悬浮生长细胞(例如Jurket细胞)的计数和细胞活率

3)昆虫细胞系(例如S2&Sf9细胞系)的计数和细胞活率

材料与方法

采用通用方式采集以上细胞系，细胞采集后混匀加入进样管，放置在光学检测设备进样口，光学检测设备可以通过移液装置将样品自动加入包埋台盼蓝染料的耗材中，并使用成像装置和相关程序对样本进行计数和活率评估。

结果

结果与HEK293细胞一致，根据明场成像结果分析识别总细胞，并根据染色情况判断活细胞，死细胞，使用本发明的光学检测设备和方法可准确判断细胞浓度和活率。

实施例2：细胞转染

1)GFP转染细胞转染效率、细胞计数和细胞活率

HEK293是一种人体胚胎肾细胞系，本实施例中用融合了CMV启动子的GFP转染。用PI染色死细胞，GFP检测转染细胞，图像识别所有细胞，检测细胞转染效率、细胞计数和细胞活率。

材料和方法

使用含10％胎牛血清DMEM培养基，在二氧化碳培养箱(5％CO ₂，37℃)内培养稳定表达GFP的HEK293细胞。将细胞消化后，向100μl HEK293细胞中加入4μl PI染色液，混合均匀后加入进样管中，并放置在光学检测设备的进样口，光学检测设备可以通过移液装置将样品自动加入未染料的耗材中，并使用成像装置和相关程序检测细胞转染效率、细胞计数和细胞活率。PI是膜不渗透性染料，仅染色死细胞。在明场通道下，所有细胞被成像并识别，在蓝色通道下，GFP转染细胞被激发出绿色荧光，在绿色通道下，死细胞被激发出红色荧光。

结果

活细胞转染效率＝GFP转染细胞/(明场细胞数量-死细胞数量)*100％

细胞转染效率＝GFP转染细胞/明场细胞*100％

细胞活率＝(明场细胞数量-死细胞数量)/明场细胞*100％

2)RFP转染细胞转染效率和细胞计数

CHO细胞是一种中国仓鼠卵巢细胞，本实施例中用融合了CMV启动子的RFP转染。用RFP检测转染细胞，图像识别所有细胞，检测转染效率和细胞计数。

材料和方法

使用含10％胎牛血清DMEM培养基，在二氧化碳培养箱(5％CO ₂，37℃)内培养稳定表达GFP的HEK293细胞。将细胞消化后，混合均匀后加入进样管中，并放置在光学检测设备的进样口，光学检测设备通过移液装置将样品自动加入未染料的耗材中，并使用成像装置和相关程序检测细胞转染效率和细胞计数。在明场通道下，所有细胞被成像并识别，在绿色通道下，RFP转染细胞被激发出红色荧光。

结果

细胞转染效率＝RFP转染细胞/明场细胞*100％

实施例3：细胞凋亡

1)Annexin V-FITC，7AAD的细胞凋亡分析

健康的、未凋亡细胞中磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)主要位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，细胞膜还是完整的，此时PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin V是一种分子量为35～36KD的钙依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合，Annexin V已被证实为检测细胞凋亡的有用工具。将Annexin V进行荧光素FITC标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，可检测细胞凋亡的发生。

7-AAD(7-amino-actinomycin D)或PI是核酸染料，不能通过正常质膜，随着细胞凋亡、细胞死亡过程，此类细胞的细胞膜失去完整性，质膜对染料的通透性逐渐增加，结合细胞凋亡中DNA的有控降解，在合适波长激发光的激发下可发出明亮的红色荧光，通过7-AAD标记DNA的强弱，将细胞分群。将Annexin V与7-AAD或PI匹配使用，就可以将早期凋亡、晚期凋亡及坏死细胞区分开来。

材料和方法

CHO细胞接种在6孔板中，密度为200,000细胞/孔，随后将使用含10％胎牛血清DMEM培养基，于二氧化碳培养箱(5％CO ₂，37℃)内静置培养24小时。24小时后，去除旧培养基并加入含有一定浓度诺考达唑的新鲜细胞培养液以诱导细胞凋亡。在37℃、5％CO ₂培养箱中继续孵育培养板6小时，消化收集细胞。根据细胞凋亡试剂盒操作说明，进行Annexin V-FITC和7-AAD或PI染色。将染色样本混合均匀后加入进样管中，并放置在光学检测设备的进样口，光学检测设备可以通过移液装置将样品自动加入未染料的耗材中，并使用本发明的光学检测设备、方法和相关程序进行细胞凋亡分析。在明场通道下，所有细胞被成像并识别，在蓝色通道下，Annexin V-FITC染色细胞被激发出绿色荧光，在绿色通道下，晚期凋亡和坏死细胞被激发出红色荧光。

结果

用本发明的光学检测设备和方法，通过成像识别所有细胞。在该装置下发现三种细胞：未被染色的细胞为活细胞，不包含PI染色(红色荧光)但被Annexin V-FITC染色(绿色荧光)的细胞为早期凋亡细胞，被PI和Annexin V-FITC染色的细胞为凋亡或坏死细胞。通过公式计算可获得早期凋亡率、晚期凋亡率和细胞活率结果。

2)检测线粒体膜电位变化检测早期凋亡

线粒体膜电势的破坏是细胞凋亡早期发生的一个标志性事件。细胞受到凋亡诱导后线粒体膜电位的变化使得膜的通透性发生改变。正常线粒体内，JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物，聚合物发出强烈的红色荧光；不健康的线粒体由于膜电位的下降或丧失，JC-1只能以单体的形式存在于胞浆中，产生绿色荧光。因此颜色的变化非常直接的反映出线粒体膜电位的变化。

为了分析线粒体膜电位变化和由此产生的凋亡，用选定的阳离子染料(如JC-1)培养细胞并用本发明装置在对应波长下进行分析。

材料与方法

CHO细胞接种在6孔板中，密度为200,000细胞/孔，随后将使用含10％胎牛血清DMEM培养基，于二氧化碳培养箱(5％CO ₂，37℃)内静置培养24小时。24小时后，去除旧培养基并加入含有一定浓度诺考达唑的新鲜细胞培养液以诱导细胞凋亡。在37℃、5％CO ₂培养箱中继续孵育培养板6小时，消化收集细胞。根据线粒体膜电位试剂盒操作说明，使用JC-1使细胞染色10分钟，用PBS重悬待用。将染色样本混合均匀后加入进样管中，并放置在光学检测设备的进样口，光学检测设备可以通过移液装置将样品自动加入未染料的耗材中，并使用本发明的光学检测设备和方法进行细胞凋亡分析。

结果

通过对红色和绿色荧光定量以鉴别凋亡细胞，同时明场成像识别所有细胞。本发明的光学检测设备和方法可用于鉴别处于凋亡早期的细胞。

实施例4：抗原的检测和定量

放大率低的荧光显微装置对在细胞种群中获得准确的有关抗原(如细胞内和细胞表面蛋白)表达水平的信息很有用。

1)细胞表面标记物(例如CD marker)的检测和定量

可以直接使用识别抗原的荧光偶联一级抗体(如FITC标记的抗体)孵育细胞表面蛋白表达水平，孵育后未结合的抗体被清洗干净，并检测和定量细胞表面标记物荧光。荧光信号的强度与细胞表面的抗原量成比例。如CD分子，包括T细胞的CD3、CD4和CD8，MSC细胞的CD11、CD34、CD45、CD44、CD73、CD90、CD105等；除了评估抗原，还可与其他试剂同时使用获得细胞数量、活率等信息检测。

材料与方法

取培养T细胞进行细胞表面蛋白检测，取出6*105个细胞样本用于CD染色分析。400g离心3min，去上清并加入100微升Cell staining buffer重悬，加入3μl带FITC标记的CD3特异性抗体染色，轻轻混匀，避光孵育30min，400g离心3min，去上清，加入 100微升Cell staining buffer，重悬细胞后进行上样检测。将染色样本混合均匀后加入进样管中，并放置在光学检测设备进样口，光学检测设备可以通过移液装置将样品自动加入未染料的耗材中，并使用本发明的光学检测设备、方法和相关程序进行细胞表面标记物的检测和定量分析。在明场通道下，所有细胞被成像并识别，在蓝色通道下，T细胞被染色激发出绿色荧光。

结果

用所述装置分析检测T细胞CD3表面标记物，接近100％细胞均呈现绿色荧光，与预期结果一致，本发明的光学检测设备和方法可用于细胞表面标记物的检测和定量。

2)抗体亲和力检测和定量

免疫荧光法测定细胞水平的抗体亲和力大小是评价抗体效果非常重要的指标。可通过间接免疫荧光法检测不同抗原抗体反应呈现的平均荧光强度直接定量评价抗体亲和力大小，同时也可检测细胞浓度、活率。

材料与方法

使用经改良的CHO细胞系稳定表达X蛋白，用于评价仿制药(一级抗体)的亲和力大小。将CHO细胞消化，测定细胞浓度，调整细胞浓度至1000000个细胞/每个反应，400g离心3min，弃上清，并加入200μl staining buffer重悬细胞。分别使用不同浓度梯度的一级抗体在37℃下孵育1h，孵育后未结合的抗体离心清洗，弃上清，并加入200μl staining buffer重悬细胞，向溶液中加入识别一级抗体的荧光偶联的二级抗体，如Alexa 488，室温避光孵育30分钟，孵育后离心弃上清，将未结合的二级抗体被冲洗干净，并用200μl staining buffer重悬后，将样本一分为二，每组分别有100μl细胞样品，其中一组使用PBS补充至500μl体积，并用流式细胞分析仪进行分析，另外一组加入进样管中，并放置在光学检测设备进样口，光学检测设备通过移液装置将样品自动加入未染料的耗材中，进行细胞表面标记物的检测和定量分析细胞荧光强度。

结果

在明场通道下，所有细胞被成像并识别，在蓝色通道下不同浓度一级抗体与细胞结合，产生不同强度荧光。用光学检测设备分析抗体亲和力，与流式细胞分析仪检测结果一致。

3)细胞内抗原表达的检测和定量

将细胞用识别抗原的一级抗体孵育，孵育后未结合的抗体被清洗干净，并向溶液中加入识别一级抗体的荧光偶联的二级抗体(如FITC标记的抗体)。未结合的二级抗体被冲洗干净并用本发明装置检测和定量细胞内荧光。通过类似的方法，将细胞进行固定和渗透化处理后用对应抗体孵育，可以检测细胞内抗原，检测细胞是否存在因退化或者基因突变导致部分阳性克隆丢失，导致MAb的产量退化严重，进行细胞株稳定性鉴定评估。荧光信号的强度与细胞内的抗原量成比例。此方法可用于检测和定量不同的细胞内抗原。除了评估抗原，还可与其他试剂同时使用获得细胞数量、活率等信息检测。

材料与方法

使用可稳定表达X蛋白的CHO细胞株，测定细胞浓度2*106个/反应，400g 3min离心去上清，加入1000μlPBS清洗一遍，离心，弃上清；使用BD Cytofix/CytopermTM Fixation/Permeabilization Solution Kit进行固定和打孔，按Protocal处理30min；样品离心，弃上清，加入PBS清洗一遍，再各加入PBS重悬，每组细胞加入固定体积抗体anti-Fab‘-FITC，4℃避光孵育30分钟；离心，弃上清，加入1000μlPBS重悬，混匀后一分为二，一组进行流式细胞分析仪检测，另外一组样品浓缩至200μl后加入进样管中，并放置在光学检测设备的进样口，光学检测设备可以通过移液装置将样品自动加入未染料的耗材中，并进行检测和定量分析细胞荧光强度。

结果

在明场通道下，所有细胞被成像并识别，在蓝色通道下抗体与细胞结合产生荧光，已退化细胞不产生荧光，计算可产生荧光细胞所占比例，即为阳性细胞株所占比例。用光学检测设备进行细胞内抗原表达的检测和定量，与流式细胞分析仪检测结果一致。

实施例5：细胞杀伤

通过使用无毒、非放射性CFSE或Calcein AM染色或GFP靶向肿瘤细胞，监测CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。活靶向癌细胞在荧光装置下呈现绿色荧光，死靶向癌细胞不能保留绿色荧光，靶向细胞与效应细胞作用预定时间后，加入PI染料，即可染色死细胞(T细胞和肿瘤细胞)。

材料与方法

收集靶标细胞(K562)，细胞个数为4*107个；将细胞浓度调至为1×106/mL，向细胞溶液中加入一定浓度CFSE染色液，并在37℃，5％CO ₂培养箱中间歇混合孵育30分钟；300g离心3分钟，去除上清，加入约18mL含血清培养基，测试细胞浓度至2*106个/mL；向12孔板中种入1×106个靶标细胞/孔(约500μl靶标细胞)，按效：靶比例 (E:T比率)分别为5:1，1:1和0.5:1，每孔加入相应数量的效应细胞，即效应细胞个数5×106，1×106和0.5×106(若原效应细胞浓度为1*107/mL，则分别加入效应细胞500μl，100μl，50μl，并用培养基定容至每孔终体积为1mL)，每个组重复3个孔，同时，仅含培养基和细胞的组作为对照组。在加入效应细胞4h后进行细胞收集；取出细胞悬液，100μl体积细胞悬液中加入1μlPI染色液；吹打均匀，将样品加入进样管中，并放置在光学检测设备进样口，光学检测设备可以通过移液装置将样品自动加入未染料的耗材中，进行检测分析。其中，在明场通道下，所有细胞被成像并识别，在蓝色通道下，活靶向癌细胞被激发出绿色荧光，在绿色通道下，死细胞被激发出红色荧光。

结果

通过染色PI的细胞为死细胞以排除死细胞产生自发荧光，绿色荧光细胞个数可准确代表活靶向癌细胞个数，计算不同效靶比下活靶向癌细胞个数与对照组活靶向癌细胞之间的差值，可精准获得细胞杀伤的细胞个数，通过公式细胞杀伤率＝(对照组活靶向癌细胞个数-样品组活靶向癌细胞个数)/对照组活靶向癌细胞个数*100％。用所述光学检测设备进行细胞杀伤检测可有效避免荧光素无法完全释放，离心等引入的检测误差。

实施例6：细胞周期

1)量化哺乳动物细胞中的DNA含量

碘化丙啶(PropidiumIodide，简称PI)是一种双链DNA的荧光染料。PI和双链DNA结合后可以产生荧光，PI染色细胞的整体荧光强度与DNA的含量有化学计量关系。细胞内的DNA被碘化丙啶染色后，可以对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可以进行细胞周期分析。

本实施例中，使用PI作为DNA染色剂以测量黏附细胞系、悬浮细胞系、MCF-7、Jurket等细胞中DNA的含量，并分析细胞周期结果。

材料与方法

使用含10％胎牛血清DMEM培养基，于二氧化碳培养箱(5％CO ₂，37℃)内静置培养HEK293细胞，当细胞生长到汇合度90％左右，用PBS清洗细胞，使用胰蛋白酶进行细胞消化离心收集。

每个细胞样品收集约100万个细胞于1.5mL离心管内；400g离心3-5分钟，沉淀细胞。吸除上清，加入约500μl冰浴预冷的PBS，重悬细胞。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，轻弹离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。加入500μl冰浴预冷60％乙醇于离心管中，轻轻吹打混匀，4℃固定2小时及以上。

以400g左右离心3-5分钟，沉淀细胞，加入约200μl冰浴预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清后将细胞重悬于PI染色溶液(200μl含0.1％(V/V)Triton X-100的PBS中加入20ugRNA酶和2ug碘化丙啶)，于37℃下避光孵育30分钟，然后将样本混合均匀后一分为二，每组分别有100μl细胞样品，其中一组使用PBS补充至500μl体积，并用流式细胞分析仪进行分析，另外一组加入进样管中，并放置在光学检测设备进样口，光学检测设备可以通过移液装置将样品自动加入未染料的耗材中，并使用本发明光学检测设备、方法和相关程序进行分析。

结果

用本申请的光学检测设备分析PI染色的HEK293细胞，在使用流式软件分析的基础上，可获得准确的细胞内DNA含量数据，并进一步形成细胞周期结果。该结果与流式细胞分析仪结果相当。因此该光学检测设备可用于细胞周期分析。

2)药物对哺乳动物细胞中的DNA含量的影响

材料与方法

HEK293细胞在培养至汇合度约50％时，通过血清饥饿或使用一定浓度诺考达唑或喜树碱等作用后，使用胰蛋白酶进行细胞消化离心收集。使用PI染色定量细胞中DNA含量的方式进行细胞分析。

结果

与哺乳动物细胞细胞周期检测方法一致，用本发明的光学检测设备分析药物哺乳动物细胞周期影响，在使用流式软件分析的基础上，可获得准确的细胞内DNA含量数据，其结果与流式细胞分析仪结果相当。因此本发明的光学检测设备能用于研究不同药物作用对细胞周期的影响。

在这里示出和讨论的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。

在说明书及权利要求中的词语“前”、“后”、“顶”、“底”、“之上”、“之下”等，如果存在的话，用于描述性的目的而并不一定用于描述不变的相对位置。应当理解，这样使用的词语在适当的情况下是可互换的，使得在此所描述的本公开的实施例，例如，能够在与在此所示出的或另外描述的那些取向不同的其他取向上操作。

如在此所使用的，词语“示例性的”意指“用作示例、实例或说明”，而不是作为将被精确复制的“模型”。在此示例性描述的任意实现方式并不一定要被解释为比其它实现方式优选的或有利的。而且，本公开不受在上述技术领域、背景技术、发明内容或具体实施方式中所给出的任何所表述的或所暗示的理论所限定。

如在此所使用的，词语“基本上”意指包含由设计或制造的缺陷、器件或元件的容差、环境影响和/或其它因素所致的任意微小的变化。词语“基本上”还允许由寄生效应、噪音以及可能存在于实际的实现方式中的其它实际考虑因素所致的与完美的或理想的情形之间的差异。

上述描述可以指示被“连接”或“耦合”在一起的元件或节点或特征。如在此所使用的，除非另外明确说明，“连接”意指一个元件/节点/特征与另一种元件/节点/特征在电学上、机械上、逻辑上或以其它方式直接地连接(或者直接通信)。类似地，除非另外明确说明，“耦合”意指一个元件/节点/特征可以与另一元件/节点/特征以直接的或间接的方式在机械上、电学上、逻辑上或以其它方式连结以允许相互作用，即使这两个特征可能并没有直接连接也是如此。也就是说，“耦合”意图包含元件或其它特征的直接连结和间接连结，包括利用一个或多个中间元件的连接。

还应理解，“包括/包含”一词在本文中使用时，说明存在所指出的特征、整体、步骤、操作、单元和/或组件，但是并不排除存在或增加一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、单元和/或组件以及/或者它们的组合。

本领域技术人员应当意识到，在上述操作之间的边界仅仅是说明性的。多个操作可以结合成单个操作，单个操作可以分布于附加的操作中，并且操作可以在时间上至少部分重叠地执行。而且，另选的实施例可以包括特定操作的多个实例，并且在其他各种实施例中可以改变操作顺序。但是，其它的修改、变化和替换同样是可能的。因此，本说明书和附图应当被看作是说明性的，而非限制性的。

虽然已经通过示例对本公开的一些特定实施例进行了详细说明，但是本领域的技术人员应该理解，以上示例仅是为了进行说明，而不是为了限制本公开的范围。在此公开的各实施例可以任意组合，而不脱离本公开的精神和范围。本领域的技术人员还应理解，可以对实施例进行多种修改而不脱离本公开的范围和精神。本公开的范围由所附权利要求来限定。

Claims

一种光源装置，其特征在于，所述光源装置包括：

照明光源，所述照明光源被配置为产生照明光；以及

光阑，所述光阑设于所述照明光源的出射光路上，所述光阑包括：

遮光屏，所述遮光屏被配置为遮挡部分照明光；

第一透光部，所述第一透光部开设在所述遮光屏上，且所述第一透光部覆盖所述光阑的中心，所述第一透光部被配置为使部分照明光透过以形成明场照明；以及

第二透光部，所述第二透光部开设在所述遮光屏上，且所述第二透光部位于所述第一透光部的外围，所述第二透光部被配置为使部分照明光透过以形成暗场照明。
根据权利要求1所述的光源装置，其特征在于，所述第一透光部的外侧边缘与所述光阑的中心之间的距离R1、所述光阑与所述样品位置之间的距离l以及被配置为与所述光源装置配合使用的物镜的数值孔径n之间满足以下关系：

R1≤l·tg[arcsin(n)/3]。
根据权利要求1所述的光源装置，其特征在于，所述第二透光部的内侧边缘与所述光阑的中心之间的距离R2、所述光阑与所述样品位置之间的距离l以及被配置为与所述光源装置配合使用的物镜的数值孔径n之间满足以下关系：

R2＞l·tg[arcsin(n)]。
根据权利要求1所述的光源装置，其特征在于，所述遮光屏包括围绕所述光阑的中心的环状遮光部。
根据权利要求1所述的光源装置，其特征在于，所述第一透光部包括从所述光阑的中心向外扩展的圆形通光孔。
根据权利要求1所述的光源装置，其特征在于，所述第二透光部包括围绕所述光阑的中心布置的一个或多个通光缝。
根据权利要求6所述的光源装置，其特征在于，通光缝包括弧形通光缝。
根据权利要求6所述的光源装置，其特征在于，多个通光缝围绕所述光阑的中心呈环状布置。
根据权利要求1所述的光源装置，其特征在于，所述第二透光部包括围绕所述光阑的中心布置的一个或多个通光孔。
根据权利要求9所述的光源装置，其特征在于，通光孔包括圆形通光孔。
根据权利要求9所述的光源装置，其特征在于，多个通光孔围绕所述光阑的中心均匀分布。
根据权利要求1所述的光源装置，其特征在于，所述光阑包括可调光阑，所述可调光阑的第一透光部和第二透光部中的至少一者的透光范围能够被改变。
根据权利要求1所述的光源装置，其特征在于，所述光源装置还包括：

第一透镜，所述第一透镜设于所述照明光源的出射光路上，且所述第一透镜被配置为将照明光会聚在所述样品位置处。
根据权利要求13所述的光源装置，其特征在于，所述第一透镜设于所述光阑和所述样品位置之间。
根据权利要求14所述的光源装置，其特征在于，所述光源装置还包括：

光衰减件，所述光衰减件设于所述照明光源的出射光路上，且所述光衰减件被配置为减小照明光的亮度。
根据权利要求15所述的光源装置，其特征在于，所述光衰减件包括以下中的至少一种：

磨玻璃片；以及

偏振片。
根据权利要求15所述的光源装置，其特征在于，所述光衰减件设于以下位置中的至少一处：

在所述照明光源和所述光阑之间；以及

在所述光阑和所述第一透镜之间。
根据权利要求1所述的光源装置，其特征在于，所述照明光源包括热辐射光源和发光二极管中的至少一种。
一种光源装置，其特征在于，所述光源装置包括：

第一光源组件，所述第一光源组件被配置为产生沿第一方向传播的第一出射光；

第二光源组件，所述第二光源组件被配置为产生沿第二方向传播的第二出射光，其中，所述第二方向与所述第一方向彼此相交；以及

第一二向色镜，所述第一二向色镜设于所述第一方向与所述第二方向相交的位置处，且所述第一二向色镜被配置为使所述第一出射光的至少一部分透射以继续沿所述第一方向传播，并将所述第二出射光的至少一部分反射成沿所述第一方向传播，其中，所述第一出射光的被透射的一部分处于第一波段，所述第二出射光的被反射的一部分处于第二波段，且所述第一波段与所述第二波段彼此分离。
根据权利要求19所述的光源装置，其特征在于，所述第一出射光为照明光，所述第一光源组件为照明光源组件，且所述第二出射光为激发光，所述第二光源组件为激发光源组件；或者

所述第一出射光为激发光，所述第一光源组件为激发光源组件，且所述第二出射光为照明光，所述第二光源组件为照明光源组件。
根据权利要求20所述的光源装置，其特征在于，当所述第一出射光为照明光、所述第二出射光为激发光时，所述第一波段的最小波长大于所述第二波段的最大波长；以及

当所述第一出射光为激发光、所述第二出射光为照明光时，所述第一波段的最大波长小于所述第二波段的最小波长。
根据权利要求20所述的光源装置，其特征在于，所述照明光源组件包括：

照明光源；以及

光阑，所述光阑设于所述照明光源和所述第一二向色镜之间，所述光阑被配置为遮挡所述照明光源所产生的光的至少一部分。
根据权利要求22所述的光源装置，其特征在于，所述照明光源组件还包括：

第二透镜，所述第二透镜设于所述照明光源和所述光阑之间，所述第二透镜被配置为使所述照明光源所产生的光准直。
根据权利要求22所述的光源装置，其特征在于，所述照明光源包括热辐射光源和发光二极管中的至少一种。
根据权利要求22所述的光源装置，其特征在于，所述光阑包括遮光屏以及开设在所述遮光屏上的多个通光孔，其中，所述多个通光孔中的一个通光孔开设在所述遮光屏的中心位置，所述多个通光孔中的其它通光孔围绕处于中心位置的通光孔均匀分布。
根据权利要求22所述的光源装置，其特征在于，所述光阑包括遮光屏以及开设在所述遮光屏上的通光狭缝，其中，所述通光狭缝围绕所述遮光屏的中心位置呈环状分布。
根据权利要求26所述的光源装置，其特征在于，所述光阑还包括开设在所述遮光屏的中心位置的通光孔。
根据权利要求22所述的光源装置，其特征在于，所述光阑包括可调光阑，所述可调光阑被配置为使所述照明光源所产生的光的通过所述光阑的部分能够被改变。
根据权利要求20所述的光源装置，其特征在于，所述激发光源组件包括：

激发光源；以及

第一滤光件，所述第一滤光件设于所述激发光源和所述第一二向色镜之间，所述第一滤光件被配置为对所述激发光源所产生的光进行滤光。
根据权利要求29所述的光源装置，其特征在于，所述激发光源组件还包括：

第三透镜，所述第三透镜设于所述激发光源和所述第一滤光件之间，所述第三透镜被配置为使所述激发光源所产生的光准直。
根据权利要求29所述的光源装置，其特征在于，所述激发光源包括发光二极管和激光器中的至少一种。
根据权利要求29所述的光源装置，其特征在于，所述第一滤光件包括带通滤光片。
根据权利要求19所述的光源装置，其特征在于，所述第一方向与所述第二方向彼此垂直。
根据权利要求19所述的光源装置，其特征在于，所述第一出射光和所述第二出射光相对于所述第一二向色镜的入射角均为45度。
根据权利要求19所述的光源装置，其特征在于，所述光源装置还包括：

第四透镜，所述第四透镜设于所述第一二向色镜和样品位置之间，所述第四透镜被配置为将所述第一出射光会聚到所述样品位置，和/或将所述第二出射光会聚到所述样品位置。
一种显微设备，其特征在于，所述显微设备包括根据权利要求1至35中任一项所述的光源装置。
根据权利要求36所述的显微设备，其特征在于，所述显微设备还包括物镜，所述物镜与所述光源装置关于所述样品位置相对地设置。
一种光学检测设备，其特征在于，所述光学检测设备包括根据权利要求1至35 中任一项所述的光源装置。
一种光学检测设备，其特征在于，所述光学检测设备包括：

光源装置，所述光源装置被配置为产生激发光，所述激发光的至少一部分能够激发出处于第三波段的第一光信号和处于第四波段的第二光信号，其中，所述第三波段与所述第四波段彼此分离，且所述第三波段的最大波长小于所述第四波段的最小波长；

第二滤光件，所述第二滤光件设于所述第一光信号和所述第二光信号所在的光路上，且所述第二滤光件被配置为使处于所述第三波段和所述第四波段的光通过，并滤除其它波段的光；以及

检测装置，所述检测装置设于所述第二滤光件的出射光路上，且所述检测装置被配置为响应于所述第一光信号和所述第二光信号产生检测信号。
根据权利要求39所述的光学检测设备，其特征在于，所述光源装置包括：

激发光源，所述激发光源被配置为产生所述激发光；以及

第一滤光件，所述第一滤光件设于所述激发光源和样品位置之间，所述第一滤光件被配置为使所述激发光中的处于第五波段的光通过，并滤除所述激发光中的其它波段的光；

其中，所述第五波段的最大波长小于或等于所述第三波段的最小波长。
根据权利要求40所述的光学检测设备，其特征在于，所述第三波段被包括在500～550nm的范围中，所述第四波段被包括在600～650nm的范围中，以及所述第五波段被包括在450～500nm的范围中。
根据权利要求40所述的光学检测设备，其特征在于，所述光源装置还包括：

照明光源，所述照明光源被配置为产生照明光，所述照明光能够对处于所述样品位置的待测样品进行照明；以及

光阑，所述光阑设于所述照明光源和所述样品位置之间，所述光阑能够遮挡所述照明光的一部分以形成相衬照明。
根据权利要求42所述的光学检测设备，其特征在于，所述照明光与所述激发光彼此呈角度；

所述光源装置还包括：

第一二向色镜，所述第一二向色镜设于所述照明光与所述激发光相交的位置处；

其中，所述第一二向色镜被配置为使所述照明光的至少一部分透射，并将所述激发光的至少一部分反射到所述照明光所在的方向上；或者所述第一二向色镜被配置为使所述激发光的至少一部分透射，并将所述照明光的至少一部分反射到所述激发光所在的方向上。
根据权利要求39所述的光学检测设备，其特征在于，所述光源装置包括热辐射光源、发光二极管和激光器中的至少一者。
根据权利要求39所述的光学检测设备，其特征在于，所述光学检测设备还包括：

转向装置，所述转向装置设于所述光源装置和所述检测装置之间，且所述转向装置被配置为改变光的传播方向。
根据权利要求45所述的光学检测设备，其特征在于，所述转向装置包括：

反射镜，所述反射镜设于所述光源装置和所述样品位置之间，且所述反射镜被配置为将所述激发光反射到所述样品位置上。
根据权利要求45所述的光学检测设备，其特征在于，所述转向装置包括：

第二二向色镜，所述第二二向色镜被配置为将所述激发光反射到所述样品位置上，并使所述第一光信号和所述第二光信号透射到所述检测装置上。
根据权利要求47所述的光学检测设备，其特征在于，所述第二滤光件设于所述第二二向色镜和检测装置之间。
根据权利要求47所述的光学检测设备，其特征在于，所述第二二向色镜呈长方体块状设置。
根据权利要求49所述的光学检测设备，其特征在于，所述第二滤光件贴合于所述第二二向色镜的第一表面上，所述光源装置的第一滤光件贴合于所述第二二向色镜的垂直于所述第一表面的第二表面上。
根据权利要求50所述的光学检测设备，其特征在于，所述第二二向色镜的反射面与所述第一表面和所述第二表面均呈45度角。
根据权利要求39所述的光学检测设备，其特征在于，所述检测装置包括成像装置，所述成像装置被配置为基于所述第一光信号和所述第二光信号成像。
根据权利要求52所述的光学检测设备，其特征在于，所述成像装置包括电荷耦合器件和互补金属氧化物半导体器件中的至少一种。
根据权利要求39所述的光学检测设备，其特征在于，所述光学检测设备还包括：

存储器，所述存储器与所述检测装置通信地连接，所述存储器被配置为存储检测信号；和/或

处理器，所述处理器与所述检测装置通信地连接，所述处理器被配置为对所述检测信号进行处理。
一种光学检测方法，其特征在于，所述光学检测方法包括：

采用处于第五波段的光激发待测样品，其中，处于第五波段的光能够激发出处于第三波段的第一光信号和处于第四波段的第二光信号，所述第三波段与所述第四波段彼此分离，且所述第三波段的最大波长小于所述第四波段的最小波长，所述第五波段的最大波长小于或等于所述第三波段的最小波长；以及

检测来自所述待测样品的第一光信号和第二光信号。
根据权利要求55所述的光学检测方法，其特征在于，在采用处于第五波段的光激发待测样品之前，所述光学检测方法还包括：

采用预定染料对待测样品进行染色。