CN104813160A - 细菌的实时光学检测 - Google Patents

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CN104813160A CN201380040862.0A CN201380040862A CN104813160A CN 104813160 A CN104813160 A CN 104813160A CN 201380040862 A CN201380040862 A CN 201380040862A CN 104813160 A CN104813160 A CN 104813160A
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Wei Ruitai Get Co Ltd
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Abstract

用于检测样品上细菌的系统和方法，利用样品的光谱分析和细菌或与细菌相关联的其他物质或物体的荧光特性以确定在样品上的细菌的存在。检测器响应于照亮分析从样品发射的光。检测器5被布置为分析两个波段上发射光谱，第一波段包含与待检测的细菌种类或其他物质或物体的荧光特性相关联的波长，并且第二波段不包括这些波长但是也与第一波段具有重叠区域。

Description

细菌的实时光学检测
技术领域
本发明涉及细菌的检测和列举(enumeration)，具体涉及用于检测肉表面上的细菌的光谱方法、系统和设备。
背景技术
食源性细菌的早期检测和消除对于延长零售商货架期和防止消费冲击至关重要。用于通过依靠细菌种类的荧光性确定肉的新鲜性的光谱设备是已知的。在这类设备中，样品通常暴露于具有某些激发波长的光信号，并且光检测器从样品中检测较长波长的发射光(荧光)以识别细菌的存在。光谱仪经常是实时的、非侵入性的、非破坏性的和非化学的。通过细菌的激发和发射光谱的仔细检查，能够构建针对细菌种类检测和识别的“指纹”。因为发射强度与细菌浓度成比例，所以也可以估计细菌污染的水平。
已知的细菌检测设备利用窄带滤波器隔离并且分析在发射信号中的指纹波长。窄带滤波器通常更昂贵并且比长通滤波器具有更大的衰减系数。
在已经制成对专利说明书、其他外国文献或其他信息源的参考的本说明书中，这主要是为了提供用于讨论本发明特征的上下文。除非具体地陈述，否则对这类外国文献的参考不解释为这类文献、或这类信息源在任何司法权中是现有技术或构成现有技术的公知常识的承认。
本发明的目的是提供用于检测细菌的光谱方法、系统或设备，或至少提供有用选择的公开，以朝着减少一些如以上列出的已知设备的缺点的某种方法发展。
发明内容
在第一方面，本发明可以广泛地由用于检测在照亮的样品中或上的细菌的存在的方法组成，该方法包括以下步骤：
接收第一波段上表示从样品发射的光强度的第一信号，第一波段包含与待检测的细菌的荧光特性相关联的一个或多个波长，
接收第二波段上表示从样品发射的光强度的第二信号，第二波段不包括与细菌的荧光特性相关联的一个或多个波长，所述第一和第二波段具有重叠区域，
比较第一信号和第二信号，以及
当比较的输出符合预定阀值标准时，确定细菌种类的存在。
优选地，比较第一信号和第二信号的步骤包括：
确定表示第一信号的强度的第一值，
确定表示第二信号的强度的第二值，以及
第一值除以第二值，其中，当除法的输出大于预定阀值时，确定细菌种类的存在。
优选地，确定第一和第二值的步骤包括分别在第一和第二波段上对第一和第二信号积分。
优选地，在接收第一和第二信号之前，该方法进一步包括以下步骤：
用第一和第二波段外的激发波长的光照亮样品，
响应于照亮接收从样品发射的光，以及
将发射光滤波为分别在第一和第二波段内的第一和第二滤波光信号。
优选地，第一波段具有比第二波段更短的带下限波长(lower bandlimit wavelength)。
优选地，激发波长短于第一波段的带下限波长。
样品可以是肉、蔬菜或水果样品。可替换地，样品是诸如长椅、工具或其他设备的无生命的样品或表面。
在第一实施方式中，细菌种类是假单胞菌。替换地，或附加地，细菌种类是大肠杆菌。
优选地，样品是肉样品。
优选地，激发波长为大约405nm。
优选地，第一波段为大约450-800nm并且第二波段为大约580-800nm。
在可选实施方式中，细菌种类是丁香假单胞菌猕猴桃致病变种。
优选地，样品是水果样品。
优选地，激发波长为大约430nm。
优选地，第一波段的下限截止(lower cut-off limit)为大约600nm并且第二波段的下限截止为大约850nm。
在第二方面，本发明可以广泛地由用于检测样品上细菌的存在的设备组成，该设备包括：
存储器部件，用于存储表示与细菌相关联的预定阀值标准的数据，以及
处理器，被配置为：
接收第一波段上表示从样品发射的光强度的第一信号，第一波段包含与待检测的细菌的荧光特性相关联的一个或多个波长，
接收第二波段上表示从样品发射的光强度的第二信号，第二波段不包括与细菌的荧光特性相关联的一个或多个波长，所述第一和第二波段具有重叠区域，
比较第一信号和第二信号比较，以及
当比较的输出符合存储在存储器中的预定阀值标准时，确定细菌的存在。
优选地，处理器被配置为通过表示第一信号的强度的第一值除以表示第二信号的强度的第二值开比较第一信号和第二信号，其中，当除法的输出大于预定阀值时，通过处理器确定细菌的存在。
优选地，第一波段具有比第二波段更短的带下限波长。
优选地，激发波长短于第一波段的带下限波长。
优选地，设备进一步包括：
被布置为对光束滤波并且具有第一有效波段(operative waveband)的第一长通滤波器，以及
被布置为对光束滤波并且具有第二有效波段的第二长通滤波器，其中，第一和第二波段具有不同的下限截止波长并且重叠。
优选地，设备进一步包括分别相邻于第一和第二滤波器的第一和第二光电倍增管，用于从第一和第二滤波器接收经滤波的光束并且将表示光强度的第一和第二信号分别输出至处理器。
优选地，设备进一步包括分束器，该分束器相邻于第一和第二滤波器，被布置为接收光束并且将波束分为分别沿朝向第一和第二滤波器的不同方向横穿的两个波束。
优选地，设备进一步包括用于产生光束的光源。
优选地，设备进一步包括耦接至光源的光纤电缆，用于将光传输出该设备并且传输到样品上。
优选地，电缆包括纤维束，用于将光从检测器传输至样品并且从样品将光接收回至检测器。优选地，波束包括用于将光从光源传输至样品从而照亮样品的中心激发纤维、以及用于响应于照明将从样品发射的光传输至检测器的包围中心激发纤维的发射纤维阵列。
优选地，激发纤维光学耦接至光源，发射纤维光学耦接至分束器，电缆光学耦接至相邻于样品的透镜元件。
优选地，透镜被布置为在一个方向上将来自中心激发纤维的激发光束产生到样品上的感兴趣区域，并且在反方向上将从样品发射的发射光束产生到发射纤维中。
样品可以是肉、蔬菜或水果样品。可替换地，样品是诸如长椅、工具或其他设备的无生命的样品或表面。
在第一实施方式中，细菌种类是假单胞菌。替换地，或附加地，细菌种类包括大肠杆菌。
优选地，样品是肉样品。
优选地，激发波长为大约405nm。
优选地，第一波段的下限截止为大约450nm，第二波段的下限截止为大约580nm。
在可选实施方式中，细菌种类是丁香假单胞菌猕猴桃致病变种。
优选地，样品是水果样品。
优选地，激发波长为大约430nm。
优选地，第一波段的下限截止为大约600nm，第二波段的下限截止为大约850nm。
在第三方面，本发明可以广泛地由用于检测样品上细菌的存在的系统组成，该系统包括：
光源，用于以激发光照亮样品，以及
光检测器，用于在照亮之后基于从样品发射的光检测细菌的存在，检测器具有：
存储器部件，用于存储表示与细菌相关联的预定阀值标准的数据，以及
处理器，被配置为：
接收第一波段上表示从样品发射的光的强度的第一信号，第一波段包含与待检测的细菌的荧光特性相关联的一个或多个波长，
接收第二波段上表示从样品发射的光的强度的第二信号，第二波段不包括与细菌的荧光特性相关联的一个或多个波长，第一和第二波段具有重叠区域，
比较第一信号和第二信号，以及
当比较的输出符合存储在存储器中的预定阀值标准时，确定细菌的存在。
优选地，处理器被配置为通过表示第一信号的强度的第一值除以表示第二信号的强度的第二值比较第一信号和第二信号，其中，当该除法的输出大于预定阀值时，通过处理器确定细菌的存在。
优选地，第一波段具有比第二波段更短的带下限波长。
优选地，激发波长短于第一波段的带下限波长。
优选地，设备进一步包括：
被布置为对光束滤波并且具有第一有效波段的第一长通滤波器，以及
被布置为对光束滤波并且具有第二有效波段的第二长通滤波器，其中，第一和第二波段具有不同的下限截止波长并且重叠。
优选地，光检测器进一步包括分别相邻于第一和第二滤波器的第一和第二光电倍增管，用于从第一和第二滤波器接收经滤波的光束，并且将表示光强度的第一和第二信号分别输出至处理器。
优选地，光检测器进一步包括分束器，相邻于第一和第二滤波器，被布置为接收光束并且将波束分为分别沿朝向第一和第二滤波器的不同方向横穿的两个波束。
优选地，系统进一步包括一个或多个光纤电缆，光学耦接至光源用于将光从该设备传输出到样品上，并且光学耦接至检测器用于将从样品发射的光传输到检测器。
优选地，系统包括一种电缆，具有用于将激发光从光源传输至样品并且将发射光从样品接收回至检测器的纤维束。优选地，波束包括用于将激发光从光源传输至样品从而照亮样品的中心激发纤维、以及用于响应于照明将从样品发射的光传输至检测器的包围中心激发纤维的的发射纤维阵列。
优选地，激发纤维光学耦接至光源，发射纤维光地耦接至检测器的分束器。
优选地，系统进一步包括一侧光学耦接至电缆并且另一侧光学耦接至样品的透镜。
优选地，透镜被布置为在一个方向上将来自中心激发纤维的激发光束产生到样品上的感兴趣区域，并且在反方向上将从样品发射的发射光束产生到发射纤维中。
在第一实施方式中，细菌种类是假单胞菌。替换地，或附加地，细菌种类包括大肠杆菌。
优选地，样品是肉样品。
优选地，激发波长为大约405nm。
优选地，第一波段的下限截止为大约450nm，第二波段的下限截止为大约580nm。
在可选实施方式中，细菌种类是丁香假单胞菌猕猴桃致病变种。
优选地，样品是水果样品。
优选地，激发波长为大约430nm。
优选地，第一波段的下限截止为大约600nm，第二波段的下限截止为大约850nm。
在第四方面，本发明可以广泛地由用于检测在照亮的样品中或上的物质的存在的方法组成，该方法包括以下步骤：接收第一波段上表示从样品发射的光的强度的第一信号，第一波段包含与待检测的物质的荧光特性相关联的一个或多个波长，接收第二波段上表示从样品发射的光的强度的第二信号，第二波段不包括与物质的荧光特性相关联的一个或多个波长，第一和第二波段具有重叠区域，
比较第一信号和第二信号，以及
当比较的输出符合预定阀值标准时，确定物质的存在。
样品可以是肉、蔬菜或水果样品。可替换地，样品是诸如长椅、工具或其他设备的无生命的样品或表面。
在第一实施方式中，物质是细菌。
优选地，细菌种类是假单胞菌。替换地，或附加地，细菌种类包括大肠杆菌。
优选地，样品是肉样品。
优选地，激发波长为大约405nm。
优选地，第一波段的下限截止为大约450nm，第二波段的下限截止为大约580nm。
在第二实施方式中，物质是叶绿素，或叶绿素的代谢产物，或两者。
样品可以是肉、蔬菜或水果样品。
优选地，激发波长在大约350nm和650nm之间。激发波长可以是大约365nm、或大约405nm、或大约450nm、或大约635nm、或大约650nm。
最优选地，激发波长为大约450nm。
优选地，第一波段的下限截止为大约650nm，第二波段的下限截止为大约720nm。
在第五方面，本发明可以广泛地由用于检测在照亮的样品中或上的细菌的存在的方法组成，该方法包括以下步骤：
接收第一波段上表示从样品发射的光的强度的第一信号，第一波段包含与待检测的细菌或与细菌关联的物质的荧光特性相关联的一个或多个波长，
接收第二波段上表示从样品发射的光的强度的第二信号，第二波段不包括与荧光特性相关联的一个或多个波长，第一和第二波段具有重叠区域，
比较第一信号和第二信号，以及
当比较的输出符合预定阀值标准时，确定细菌的存在。
优选地，比较第一信号和第二信号包括：
确定表示第一信号的强度的第一值，
确定表示第二信号的强度的第二值，以及
第一值除以第二值，其中，当除法的输出大于预定阀值时，确定细菌的存在。
优选地，确定第一和第二值的步骤包括分别在第一和第二波段上对第一和第二信号进行积分。
优选地，在接收第一和第二信号之前，该方法进一步包括以下步骤：
用第一和第二波段外的激发波长的光照亮样品，
响应于该照亮接收从样品发射的光，以及
使用第一波段对发射光滤波以获得第一信号，以及
使用第二波段对发射光滤波以获得第二信号。
优选地，第一波段具有比第二波段的较低带限制波长的更短的较低带限制波长。
优选地，激发波长短于或等于第一波段的较低带限制波长。
样品可以是肉、蔬菜或水果样品。可替换地，样品是诸如长椅、工具或其他设备的无生命的样品或表面。
在第一实施方式中，第一波段包含关联于细菌的荧光性能的一个或多个波长，并且细菌是假单胞菌。
优选地，照亮的样品是肉样品。
优选地，激发波长为大约405nm。
优选地，第一波段的下限截止为大约450nm，第二波段的下限截止为大约500nm。优选地，第一波段在大约450nm和800nm之间，第二波段在大约500nm和800nm之间。
在第二实施方式中，第一波段包含与跟细菌相关联的物质的荧光特性相关联的一个或多个波长，其中，物质是叶绿素，或叶绿素的代谢产物，或两者。
样品可以是肉、蔬菜或水果样品。
优选地，激发波长在大约350nm和650nm之间。激发波长可以是大约365nm、或大约405nm、或大约450nm、或大约635nm、或大约650nm。
最优选地，激发波长为大约450nm。
优选地，第一波段的下限截止为大约650nm，第二波段的下限截止为大约720nm。
在第六方面，本发明可以广泛地由用于检测样品上细菌的存在的设备组成，该设备包括：
存储器部件，用于存储表示与细菌相关联或与表示细菌的物质相关联的预定阀值标准的数据，以及
处理器，被配置为：
接收第一波段上表示从样品发射的光的强度的第一信号，第一波段包含与细菌或物质的荧光特性相关联的一个或多个波长，
接收第二波段上表示从样品发射的光的强度的第二信号，第二波段不包括与细菌的荧光特性相关联的一个或多个波长，第一和第二波段具有重叠区域，
比较第一信号和第二信号，以及
当比较的输出符合存储在存储器中的预定阀值标准时，确定细菌的存在。
在第七方面，本发明可以广泛地由用于检测样品上细菌的存在的系统组成，该系统包括：
光源，用于以激发光照亮样品，以及
光检测器，用于在照亮之后基于从样品发射的光检测细菌的存在，检测器具有：
存储器部件，用于存储表示与细菌相关联或与跟细菌相关联的物质相关联的预定阀值标准的数据，以及
处理器，被配置为：
接收第一波段上表示从样品发射的光的强度的第一信号，第一波段包含与细菌或物质的荧光特性相关联的一个或多个波长，
接收第二波段上表示从样品发射的光的强度的第二信号，第二波段不包括与细菌或物质的荧光特性相关联的一个或多个波长，所述第一和第二波段具有重叠区域，
比较第一信号和第二信号比较，以及
当比较的输出符合存储在存储器中的预定阀值标准时，确定细菌的存在。
应当理解，以上方面的任一个或多个能够以与上优选或替换实施方式或特征的任一个或多个相结合的方式提供。
当在本说明书和根据权利要求中使用时，术语“长通”涉及滤波器、波段、通带或任何其他光谱部件意指在目标光谱的有源区上相对更短波长的衰减和相对更长波长的传输。术语“长通”包括宽带通而不是窄带滤波器或波段。
如在本说明书和权利要求中使用，术语“包括”意指“至少部分地由……组成”。当在本说明书和权利要求中解释包括术语“包括(comprising)”的每个状态时，也可以存在特征而不是由术语开始的一个或那些特征。诸如“包括”和“包含”的相关术语以相同方式解释。
预期对本文中公开的数值范围(例如，1至10)的参考也结合对在那个范围(例如，1，1.1，2，3，3.9，4，5，6，6.5，7，8，9和10)内所有合理数值的参考也以及在那个范围内合理数值的任何范围(例如，2至8、1.5至5.5、和3.1至4.7)，因此，由此明确公开了本文中明确公开的所有范围的所有子范围。这些仅是具体预期的实例并且在最低值和最高值之间的数值的所有可能组合视为以类似方式在本申请中明确陈述。
本发明在于上述并且也设想以下仅给出实例的结构。
附图说明
将参考附图并且仅通过实例描述本发明的优选实施方式，其中：
图1是示出了本发明的优选形式细菌检测系统的部件的示意图，
图2是示出了拆开后马上检测以及在室温下53个小时之后检测的13天陈肉(old meat)样品中假单胞菌的发射光谱的曲线图，
图3是示出了在羊肉样品上细菌污染的积分光强度比和对应检测器输出的曲线图，
图4是示出了相对于检测器输出(x轴)在老羊肉样品表面上的假单胞菌的列举(以cfu/cm2为单位)的图表，
图5是在没有任何检测延迟的情况下根据本发明第二优选实施方式的渣滓物的发射光谱的曲线图，以及
图6是示出了在13μs的检测延迟之后第二实施方式的渣滓物的发射光谱的曲线图。
具体实施方式
1.细菌检测系统
参考图1，示出了本发明的优选形式细菌检测系统100的示意图。系统100包括细菌检测设备110(在下文中“检测器”100)、光源120、光传输介质130以及准直透镜140。系统100是光谱的并且利用细菌或其他物质(substance)或物体(matter)识别在样品或目标产品200内或上的一个或多个细菌种类的存在。系统100通过使用来自光源120的光束照亮样品200并响应于该照亮在检测器110上分析从样品200发射的光而运行。光传输介质130提供光源和样品之间以及样品和检测器之间的光学通信。在优选实施方式中，光传输介质130是光纤电缆130，更优选地是包括如将进一步更详细说明的纤维束的电缆。待分析的样品200相邻于透镜140定位以将激发束产生到待分析的样品的区域210上。在优选实施方式中的透镜还接收从样品发射的光并且沿朝向用于分析的检测器110的相反方向产生发射波束。
样品200可以来自有生命或无生命的种类或表面。例如，如在优选实施方式的情况下，样品来自诸如肉样品、水果样品或蔬菜样品的有生命的种类。可替换地，样品200可以是或可以来自诸如长椅、工具、设备的非生命的表面或结构或可能期望进行细菌检测的任何其他非生命的表面。
检测器110被布置为接收从样品200的照亮区域210发射的光并且分析发射光谱，以通过优选地识别一个或多个细菌种类的存在、或可替换地识别表示细菌的存在或与细菌的存在相关联的一个或多个其他物质或物体的存在而确定细菌的存在。具体地，检测器110被布置为分析两个波段上的光谱，第一波段包含与待检测的细菌种类或其他物质或物体的荧光性能相关联的波长，并且第二波段不包括这些波长但是也具有与第一波段重叠的区域。通过比较所述两个波段上的发射光的光谱强度，检测器110能够识别一个或多个细菌种类或其他物质或物质200的存在。
本发明描述的方法和系统并非旨在限制于任何具体应用。主要用于描述本发明特征的优选实施方式是检测在肉或其他食品样品上的细菌。然而，应注意的是，当照亮样品时，用于检测的方法和系统能够应用于各种替换的应用中以在表现荧光性能的样品上检测任何种类或物质或物体的存在。并非旨在从本发明的范围排除这类替换应用。
1.1.检测器
在图1中示出的是本发明的优选形式检测器110的示意图。检测器110包括分束器111、两个滤波器112和113以及与滤波器相关联的两个光电倍增管(PMT)114和115。
检测器110被配置为接收从样品200的照亮区域210发射的光。在优选实施方式中，系统100使用具有与检测器110的分束器111光学耦接的发射光分支131的光缆130传输光。电缆130优选地固定耦接至检测器110与分束器111相邻，用于将发射光传输到分束器111。
在工作期间，从样品200发射的光(响应于照亮)穿过朝向检测器110的光缆130并且穿过连接分束器111的分支131。分束器111在分支131的输出部将光束A分为沿不同方向传播的两个波束A1和A2。可以使用在光学领域已知的多个设计中的任一个形成分束器111。
与分束器111相邻的是两个光学滤波器112和113，被配置处于分束器111的输出波束的光路。滤波器112和113具有不同的光学特性。换言之，滤波器112被布置为选择性地传输第一波段内的光，滤波器113被布置为选择性地传输不同于第一波段的第二波段内的光。在优选实施方式中，两个滤波器112和113是具有长于(或基本上等于)从光源120传输的激发束的波长的下限截止波长的长通滤波器。滤波器112包括在其通带中与待识别的细菌种类或其他物质或物体的荧光性能相关联的一个或多个波长，但滤波器113不包括。换言之，滤波器113具有长于与细菌种类或其他物质或物体的荧光性能相关联的一个或多个波长的下限截止波长。
参考图2，例如，在优选实施方式中，检测器110被布置为检测假单胞菌细菌的存在。当被大约405nm的光激发时，假单胞菌发荧光并发射大约497nm的光。因此，在这个优选实施方式中的滤波器112和113具有长于405nm的下限截止波长，此外滤波器113具有长于497nm的下限截止波长。在这个优选实施方式中，滤波器112具有450nm的下限截止(‘信号’光谱)，然而滤波器113具有580nm的下限截止(‘基准’光谱)。
参考图6，例如，在另一优选实施方式中，检测器110被布置为检测肉、水果或蔬菜样品200表面上渣滓物的存在。渣滓物的存在表示在样品200上一个或多个细菌种类的存在。当通过光激发时，叶绿素和它们的代谢产物存在于吃植物的动物的渣滓物中并且表现出荧光性能。因此，叶绿素是检查和识别渣滓污染的适宜标志并且能够与这类样品/食品200上细菌的存在相关联。当通过具有在350nm和650nm之间的波长的光激发时，叶绿素或叶绿素的代谢产物以大约650-750nm的光谱波段发荧光。在这个实施方式中，滤波器112和113具有长于或等于650nm的下限截止波长。滤波器112具有大约650nm的下限截止波长(‘信号’光谱)，滤波器113具有大约720nm的截止波长(‘基准’光谱)。
应注意的是，针对不同细菌、物质、样品和/或应用，在不偏离本发明范围的前提下针对滤波器112和113可以使用不同的截止频率。尤其当从离样品相对大的距离收集光时，会减弱发射光的光致荧光强度(PL)。窄带滤波器使得在存在弱强度的情况下光发射检测变困难。长通滤波器(与窄带滤波器相反)的使用增强了发射光的检测。
返回参考图1，然后，从滤波器112和113传输的光被输入到两个相应的PMT 114和115。管114/115具有响应于输入的光能量输出电能的功能。换言之，PMT 114和115将从滤波器112和113传输的所接收的光束转换为电流信号。然后，PMT可以处理电流信号或输出该信号用于外部处理。在优选实施方式中，PMT 114/115确定表示其相应光谱上的电流信号强度的电压值。通过与检测器110相关联的处理器利用并且比较PMT114/115输出的电压，检测细菌或其他种类、物质或物体的存在。
再次参考图2和6，每个PMT 114/115将从相应的滤波器112/113接收到的PL强度光谱转换为可表示的电流信号。两个电流信号通过处理器接收并且比较，以确定细菌、叶绿素或物质或物体的存在。在优选实施方式中，每个PMT 114/115在将相关联的PL强度光谱转换为电流信号之后，确定该信号在其关联波段上的积分。这导致处理器的电压输出，以比较然后基于比较检测细菌、叶绿素或其他物质或物体的存在。在优选实施方式中，处理器确定从两个PMT 114/115输出的两个电压的比。这个比与表示待识别的细菌、叶绿素或其他物质或物体的存在的预定阀值标准相比较。在图2的第一优选实施方式中，利用以下等式1分析PMT 114/115的电流信号并且检测细菌的存在：
在第二优选实施方式中，利用以下等式2分析PMT 114/115的电流信号并且检测叶绿素/渣滓物的存在：
通常，利用以下等式2以分析PMT 114/115的电流信号并且检测在样品中待识别的细菌、叶绿素或物质或物体的存在：
其中，PL是通过相应的PMT确定的PL强度，R是PMT 114/115的波长相关响应水平(A/W)，并且Vsig和Vref是通过每个PMT转换的输出电压。积分(integration)的上下限通过用于检测的光学滤波器112/113的有效波段和检测器110的关联部件(诸如PMT 114/115)的实际极限给定。换言之，Smin和Smax是第一滤波器112的下限截止波长和上限截止波长，并且Rmin和Rmax是第二滤波器113的下限截止波长和上限截止波长。
应注意的是，比较从滤波器112/113输出的PL强度的替换方法能够根据具体应用的需要用于检测细菌、叶绿素或其他物质或物体的存在，并且本发明并非旨在限制于以上优选的方法。
此外，PL强度的处理能够通过系统100的一个或多个部件完成。在优选实施方式中，PMT 114和115用于将PL波束转换为电信号，具体地转换为表示跨相应光谱的信号强度的绝对电压。无论容纳在检测器110内还是远程的外部处理器接收并且比较从PMT输出的电压信号(Vsig和Vref)以检测细菌、叶绿素或其他物质或物体的存在。在另外的实施方式中，PMT114/115可以输出电流信号，其光谱通过外部处理器(例如，通过积分)分析以确定细菌叶绿素或其他物质或物体的存在。
在优选实施方式中，检测器110被配置为实时运行。检测器110被配置为实时或以离激发时刻最小延迟的接近实时接收、过滤并且处理从样品200的照亮区域210发射的光。处理器利用的分析与两个滤波光束相关联的电信号的方法不需要高处理能力或资源消耗，因此较好地适于实时或接近实时的检测和相关应用。因此，这类检测器110能够用于实时检测是必要的或高度有利的多种应用，诸如在大量的产品可能需要细菌检查并且迅速有效地运输至另一位置的食品产品工业。
在第一优选实施方式中，检测器被配置为确定肉产品上细菌的存在，具体地确定假单胞菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和芽孢杆菌孢子中的任一个或多个的存在。因此，检测器110可以包括具有如确定一个或多个细菌种类的存在需要的工作(operating)特性的一个或多个分束器、滤波器对和PMT对。细菌种类间的区别可以通过加入滤波轮以为其他细菌种类选择不同检测区域来实现。可替换地或附加地，因为细菌中分子的激发态的寿命根据微生物的环境稍微不同，所以调制光源120的电流和选通检测器110将进一步提供细菌的区别。
在一个实施方式中，检测器110被配置为检测大肠杆菌细菌的存在。在这样一个实施方式中，利用产生具有大约405nm的激发波长的光束的光源120照亮样品200。大肠杆菌以500nm左右相对宽的光谱发荧光，所以检测器可以包括具有大约450nm的截止波长的第一长通滤波器112和具有大约600nm的截止波长的第二长通滤波器。
在另一个实施方式中，检测器110被配置为检测水果样品200中的丁香假单胞菌，具体地，检测猕猴桃样品200中的丁香假单胞菌猕猴桃致病变种。丁香假单胞菌猕猴桃致病变种以大约650-750nm的光谱波段发荧光。在这样一个实施方式中，利用产生具有大约430nm的激发波长的光束的光源120照亮样品200。检测器可以包括具有大约600nm的截止波长的第一长通滤波器112和具有大约850nm的截止波长的第二长通滤波器。
参考图6，在第二优选实施方式中，检测器110被配置为检测肉、水果或蔬菜样品200表面上的渣滓物的存在。在食物产品上的渣滓物表示细菌的存在。叶绿素和它们的代谢产物存在于吃植物的动物的渣滓物中并且适于作检查和识别这类样品/食品200上的渣滓污染的标记。渣滓污染是肉、水果和蔬菜上的微生物污染的主要来源。叶绿素和/或叶绿素的代谢产物以大约650-750nm的光谱波段发荧光。在这样一个实施方式中，利用产生具有大约在350nm和650nm之间的持续或调制的激发波长的光束的光源120照亮样品200。光束可以包括大约365nm、大约405nm、大约450nm或大约650nm的激发波长。激发波长最优选地为450nm。检测器可以包括具有在大约650nm和670nm之间的截止波长的第一长通滤波器112和具有在大约720nm和750nm之间的截止波长的第二长通滤波器113。第一长通滤波器112优选地具有大约650nm的截止波长，但是可替换地可以具有大约670nm的截止波长。第二长通滤波器优选地具有大约720nm的截止波长，但是可替换地可以具有大约750nm的截止波长。
在以上实施方式的任一个中，检测器可以接收持续、实时或延迟的光学信号。能够通过机械断路器或电子选通系统实现延迟检测。在第二优选实施方式中，例如，延迟检测能够消除仅在激发后发生短时间段的强宽肉发射，并且将挑出相对窄的渣滓发射。参考图5和6，能够看出，没有延迟，宽的肉发射主导发射信号。激发后施加13μs的检测延迟基本上消除了强宽肉发射，允许更容易检测渣滓发射。施加的延迟可以在1μs和1ms之间的任何位置，更优选地在5μs和50μs之间并且最优选地在10μs和15μs之间。
在一些实施方式中，光子计数能够用于从检测器收集输出信号。在这类实施方式中，当调制激发波长时，锁定放大器能够用于挑出检测信号的AC成分。
1.2.光源
光源120是能够根据由具体应用需要产生一个或多个激发波长的光的任何设备。光源120可以是被配置为以大约405nm的波长输出激发束的二极管激光器。可以具体定位偏振光源以优化发射。405nm光束在肉应用中特别有利，具体地，对于如在以上第一优选实施方式中经由细菌发射进行细菌检测，因为在激发包含造成细菌发射的荧光团的黄素的同时，其不显著地激发油脂。可替换地或附加地，根据如上所述的本发明的其他实施方式，光源可以以大约450nm或650nm的波长、或在大约350nm和650nm之间的任何波长输出激发光束。光源120的操作模式可以是持续的、调制的或脉冲的。
光源120可以容纳在如在优选实施方式中示出的检测器110内，或可替换地与检测器110分开。光源120通过纤维光缆130的激发分支132与相邻于样品200的透镜140光学通信。
应注意的是，可以根据具体应用的需要使用替换的光源和激发波长。光源120可以被配置为输出一个或多个激发光束。
也应意识到，在检测期间可以改变光源120的功率。可以通过改变到光源120的电流水平或在光源120的光路中放置中性密度滤波器改变该功率。
1.3.光传输介质
如先前所述，优选形式的光学传输介质130是具有用于分别光学耦接检测器110和光源的分支端131/132的光纤电缆130。电缆130另一端光学耦接待通过透镜进行分析的样品200的区域210。
在优选形式中，光缆130包括一束光纤132a-f和133。这些光纤132/133被配置为允许电缆分别传输激发和发射波束。具体地，优选形式的电缆130包括由发射纤维元件132a-f的阵列包围的中心激发纤维元件133。应注意的是，在替换的实施方式中，在电缆130内的纤维元件的数量和分布可以是不同。来自光源120的激发光通过激发纤维133传播到透镜140，在透镜140激发光投影到待分析的区域210。从该区域发射的光通过透镜140投射到周围的纤维元件132a-f阵列，然后通过电缆130传输到检测器110的分束器111。
在优选实施方式中，准直透镜140被配置在光纤电缆130的样品端，以产生大约1cm直径的激发束。应注意的是，透镜的特性取决于具体应用需要的取样区域。
额外的电流镜(Galvano mirror)系统能够附接在透镜140附近以扩展样品的区域。在一些实施方式中，起偏振器可以安装在介质130的头部以仅提供优选偏振的收集。
2.实验
2.1.设置
对于该研究，因为对检测信号感兴趣而对解析细菌发射不感兴趣，所以省略了光分散元件。应当理解的是，在本发明的一些实施方式中，可以利用光分散元件。采用两个相同的光电倍增管(PMT)114/115；各光电倍增管分别被特别指定检测信号和基准。使用405nm二极管激光器120。405nm是有利的，因为其不显著地激发油脂，但激发包含造成细菌发射的荧光团的黄素。肉表面上残留的水的拉曼信号预期处于～470nm或在低于497nm的检测高峰波长的相当于3400cm-1。然后期望抑制由于水引起的错误检测。
来自激光器120的光学激发通过纤维束130传递。在纤维的一端使用准直透镜140以产生相当于取样区域的直径～1cm的波束。然后，细菌发射从相同的透镜140以如图1所示的背向散射几何结构收集并且传递到束131的另一端。BK7分束器111用于将细菌/肉的全部发射均分到两个通道A1/A2。如通过凯瑞分光光度计所测量，分束器以45°的透射率给出从450nm至650nm的5％波动。然后，被分配为信号的反射波束由允许长于450nm的波长的长通滤波器112滤波以待PMT 114检测。被分配为基准的传输波束A2也在113滤波，使得长于580nm的波长通过另一PMT 115检测。可见PMT的典型响应在～800nm消失。因此，分别针对信号和基准，PMT 114/115测量在800nm–450nm和800nm-580nm上积分的光致发光强度。
LabView程序用于从每个PMT 114/115获取电压。以6.67Hz的速度使用信号和基准电压的比率产生任意输出量。当输出量超过80.00时限定积极结果(positive result)，在计算机屏幕上的虚拟红色LED或者绿色LED点亮引起注意。
2.2.实验
羊肉样品从新西兰坎特伯雷的屠宰场和当地肉店两者提供。然后，在测试之前，所有样品存储在家用冰箱中。监测冰箱内部的温度24hr以上并且冰箱内部的温度测量为平均-0.62℃。因为目标细菌期望随着时间传播，所以没有执行接种。在测试之前，将样品切离至5.0cm2大小并且置入皮氏培养皿。然后，样品留在空调实验室直至三天。实验室内的监测温度是21.1℃±0.3℃。连续地完成样品制备以允许细菌生长随时间的良好分布。
为了验证细菌检测器，同时使用配备CCD的光谱仪300进行比较。如图1所示，额外的纤维310以垂直于取样表面210的～45度放置。从这个光纤310收集的信号以f/4.1的f量传输到光谱仪300，然后解析的光谱通过配备在光谱仪的末端微缝处的CCD记录。两个光纤130/310使用磁性贴耦接，使得细菌检测器110和CCD将观察来自相同激发点的相同发射。
在观察发射光谱和检测器读数之后，对相同的样品执行标准细菌列举。针对列举，样品在测量的半小时内发送至新西兰克赖斯特彻奇的环境科学与研究学院。每个样品置于肉汤溶液内并且机械地摇晃。然后，生成的溶液散入为假单胞菌优化的营养琼脂平板上。在23℃下保温24小时之后，以菌落形成单位(cfu)/cm2计算细菌。
2.3.结果和分析
为了验证用于检测信号和基准的光谱区域，从如在图2中示出的13天老的样品中观察细菌的发射光谱。在将样品暴露于室温和大气53小时之后，相比于紧接着拆包后获取的光谱(圆圈)，观察PL强度的急剧增加(正方形)。光谱明显地示出了增加的PL强度与肉表面上细菌的生长直接相关。PL光谱间的动态变化在整个光谱范围是非均匀的。检测细菌发射的最敏感区域在给出PL强度最大动态变化的～497nm。另一方面，给出暗示较少量细菌的PL强度的最小增加的超过～580nm的波长在这个发射范围中起作用。这些观察引导分别对用于细菌和基准检测的合适光学器件的选择。由于弱的PL强度，不使用窄带通滤波器。相反，使用长通滤波器增强对信号和基准发射的检测。对于信号检测，使用以～450nm开始的长通滤波器以确保消除激光器激发。对于基准检测，使用以～580nm开始的另一个长通滤波器。因此，用每个PMT检测发射波长的宽范围，信号和基准的比稍微类似于以上等式(1)。
在(1)中定义的检测器输出也应当类似于通过光谱仪观察到的细菌实际发射光谱率。使用Igor Pro计算细菌发射和基准的积分(integrated)PL强度。如图2所示，积分的上下限通过由检测中使用的光学滤波器和光谱仪极限给出。
为了相对于光谱测量验证检测器性能，如图3所示，对检测器输出和细菌发射与基准的比进行比较。每个数据点表示在相同的激光器激发的相同调查区域通过配备CCD的光谱仪测量的积分PL强度比和对应的检测器输出。清晰地看出，检测器输出与观察的细菌发射光谱的比成比例。指数曲线拟合使用Igor Pro执行。在检测器输出和光谱数据之间的关系最佳描述为以下等式：
y(x)＝Aexp[B(x-4)]+C   (2)
其中
y＝检测器输出
x＝通过配备CCD的光谱仪测量的积分PL强度比
A＝任意适合参数，9.99±0.37
B＝任意适合参数，0.559±0.006
C＝鲜肉的初始检测器输出，73.8±12.9。
对于鲜肉，样品x测量为～4，因此用于(2)。χ2的值是7010并且σ是25.2。可以通过CCD和PMT之间的工作机制的差异说明该非线性关系。CCD积聚由进来的光子产生的电荷，而PMT倍增(multiply)电荷。然后，PMT的动态范围更高于CCD。
通过将检测器读数与对应的细菌列举比较实现额外的实验以审视检测器110的灵敏度。能够从图4中看出，假如检测器输出越大，假单胞菌的水平较高。这仅仅因为一个事实：表面上的污染物越多，促进越多的发射强度。因此，PMT 114/115检测更多的光子。不使PMT 114/115饱和，检测器110能够检测102和102之间的细菌水平。然而，发现在～107检测器输出处实际的细菌浓度6500cfu/cm2远少于通过光谱分析预测的细菌浓度～8×107cfu/cm2。能够提出多个可能的解释。首先，骨头的一些碎片也可以给出有效的荧光发射。当购买样品时，整条肋骨使用电锯切为更小的块。一些骨头碎片可能堆积在样品的表面上从而产生错误的结果。第二，其他细菌种类可以导致相同的检测波长，但是不生长在具有假单胞菌的优化营养琼脂平板上。此外，识别研究显示多个数据点(在图4中由圆圈表示)已经将假单胞菌示出为次要种类。金黄色葡萄球菌对于这些数据点是主要的。由此，当不同种类以相同的检测波长发射时，检测器不能够在细菌种类之间进行区分。此外，扩展(development，发展)将包括优化假单胞菌寿命的具体时间帧的脉冲激励和检测。
设备能够在低至～530cfu/cm2的水平下检测羊肉表面上的假单胞菌。设备110是实时的并且每150ms给出输出。通过增加通常以最大电源电压的一半工作的PMT 114/115的管电压能够实现进一步的改进。同样，因为可用更强的版本，所以能够增加405nm激光器120的输出功率。此外，可通过加入滤波器轮选择其他细菌种类的不同检测区域区别细菌种类。最后，因为细菌中分子的激发态的寿命根据微生物环境稍微不同，所以调制检测器和激光器的电流将进一步提供细菌的区别。
设备110的进一步改进将包括采用更敏感的PMT 114/115并且具有更多的纤维束132/131以增加细菌荧光的传递(transfer)强度。此外，预期更强的激光器二极管120给出更高的敏感度。
本发明的上述描述包括其优选形式。在不偏离由所附权利要求定义的本发明的范围的情况下可以对本发明进行修改。

Claims (30)

1.一种用于检测在照亮的样品中或上的细菌的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
接收表示在第一波段的从所述样品发射的光的强度的第一信号，所述第一波段包含与所述细菌的荧光特性或跟待检测的所述细菌相关联的物质的荧光特性相关联的一个或多个波长，
接收表示在第二波段的从所述样品发射的光的强度的第二信号，所述第二波段不包括与所述荧光特性相关联的所述一个或多个波长，所述第一波段和所述第二波段具有重叠区域，
比较所述第一信号和所述第二信号，以及
当所述比较的输出符合预定阀值标准时，确定存在所述细菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，比较所述第一信号和所述第二信号的步骤包括：
确定表示所述第一信号的强度的第一值，
确定表示所述第二信号的强度的第二值，以及
所述第一值除以所述第二值，其中，当该除法运算的输出高于预定阀值时，确定存在所述细菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，确定所述第一值和所述第二值的步骤包括分别在所述第一波段和所述第二波段上对所述第一信号和所述第二信号积分。
4.根据上述权利要求中任一项所述的方法，在接收所述第一信号和所述第二信号之前，进一步包括以下步骤：
用在所述第一波段和所述第二波段外的激发波长的光照亮所述样品，
响应于所述照亮而接收从所述样品发射的光，以及
对使用所述第一波段的所发射的光滤波以获得所述第一信号，以及
对使用所述第二波段的所发射的光滤波以获得所述第二信号。
5.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述第一波段具有比所述第二波段的带下限波长更短的带下限波长。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的方法，其中，所述激发波长短于或等于所述第一波段的带下限波长。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述第一波段包含与所述细菌的所述荧光性特性相关联的一个或多个波长，并且其中，所述细菌是假单胞菌。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，照亮的所述样品是肉样品。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中，所述激发波长为大约405nm。
10.根据权利要求7至权利要求9中任一项所述的方法，其中，所述第一波段的下限截止为大约450nm，所述第二波段的下限截止为大约580nm。
11.根据权利要求4所述的方法，其中，所述第一波段包含与跟所述细菌相关联的物质的所述荧光特性相关联的一个或多个波长，并且其中，所述物质是叶绿素，或叶绿素的代谢产物，或这两者。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述样品是肉、蔬菜或水果样品，或无生命的样品或表面。
13.根据在权利要求11或权利要求12所述的方法，其中，所述激发波长在大约350nm和650nm之间。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述激发波长为大约450nm。
15.根据权利要求11至权利要求14中任一项所述的方法，其中，所述第一波段的下限截止为大约650nm，所述第二波段的下限截止为大约720nm。
16.一种用于检测样品上细菌的存在的设备，所述设备包括：
存储器部件，用于存储表示与所述细菌相关联或与表示所述细菌的物质相关联的预定阀值标准的数据，以及
处理器，被配置为：
接收表示在第一波段的从所述样品发射的光的强度的第一信号，所述第一波段包含与所述细菌或所述物质的荧光特性相关联的一个或多个波长，
接收表示在第二波段的从所述样品发射的光的强度的第二信号，所述第二波段不包括与所述细菌的所述荧光特性相关联的所述一个或多个波长，所述第一波段和所述第二波段具有重叠区域，
比较所述第一信号和所述第二信号，以及
当所述比较的输出符合存储在存储器中的所述预定阀值标准时，确定存在细菌。
17.根据权利要求16所述的设备，其中，所述处理器被配置为通过表示所述第一信号的强度的第一值除以表示所述第二信号的强度的第二值来比较所述第一信号和所述第二信号，并且其中，当该除法运算的输出高于预定阀值时，所述处理器确定存在所述细菌。
18.根据权利要求16或权利要求17所述的设备，其中，所述第一波段具有比所述第二波段更短的带下限波长。
19.根据权利要求16至权利要求18中任一项所述的设备，进一步包括：
第一长通滤波器，被布置为对光束滤波，并且具有对应于所述第一信号的所述第一波段的第一有效波段，以及
第二长通滤波器，被布置为对光束滤波，并且具有对应于所述第二信号的所述第二波段的第二有效波段。
20.根据权利要求19所述的设备，进一步包括分别相邻于第一和第二滤波器的第一和第二光电倍增管，所述第一和第二光电倍增管用于从所述第一和第二滤波器接收经滤波的光束，并且将表示光强度的所述第一信号和所述第二信号分别输出至所述处理器。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的设备，进一步包括分束器，所述分束器在所述样品与所述第一和第二滤波器之间，并且被布置为接收从所述样品发射的光束并且将该光束分为分别沿朝向所述第一和第二滤波器的不同方向横穿的两束。
22.根据权利要求21所述的设备，进一步包括用于产生光束的光源。
23.根据权利要求22所述的设备，进一步包括耦接至所述光源用于从所述光源接收光并且传输到所述样品上的一个或多个激发光纤，以及用于从所述样品接收发射光并且将所述发射光传输到所述分束器的一个或多个发射光纤。
24.根据权利要求23所述的设备，其中，所述一个或多个第一光纤和所述一个或多个第二光纤光学耦接至相邻于所述样品的透镜元件，所述透镜被布置为在一个方向上将来自所述激发光纤的激发光束生成到所述样品上的感兴趣区域上，以及在反方向上将从所述样品发射的发射光束生成到所述发射光纤内。
25.一种用于检测样品上细菌的存在的系统，所述系统包括：
光源，用于以激发光照亮所述样品，以及
光检测器，用于在所述照亮之后基于从所述样品发射的光检测细菌的存在，该检测器具有：
存储器部件，用于存储表示与所述细菌或跟所述细菌关联的物质相关联的预定阀值标准的数据，以及
处理器，被配置为：
接收表示在第一波段的从所述样品发射的光的强度的第一信号，所述第一波段包含与所述细菌或所述物质的荧光特性相关联的一个或多个波长，
接收表示在第二波段的从所述样品发射的光的强度的第二信号，所述第二波段不包括与所述细菌或所述物质的所述荧光特性相关联的所述一个或多个波长，所述第一波段和所述第二波段具有重叠区域，
比较所述第一信号和所述第二信号，以及
当所述比较的输出符合存储在存储器中的预定阀值标准时，确定存在细菌。
26.一种用于检测在照亮的样品中或上的物质的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
接收表示在第一波段的从所述样品发射的光的强度的第一信号，所述第一波段包含与待检测的所述物质的荧光特性相关联的一个或多个波长，
接收表示在第二波段的从所述样品发射的光的强度的第二信号，所述第二波段不包括与所述物质的所述荧光特性相关联的所述一个或多个波长，所述第一波段和所述第二波段具有重叠区域，
比较所述第一信号和所述第二信号，以及
当所述比较的输出符合预定阀值标准时，确定所述物质的存在。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述第一波段包含与细菌的荧光特性相关联的一个或多个波长，并且其中，所述细菌是假单胞菌。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述样品以具有低于大约450nm的激发波长的光束照亮，所述第一波段在大约450nm和800nm之间并且所述第二波段在大约580nm和800nm之间。
29.根据权利要求26所述的方法，其中，所述第一波段包含与跟细菌相关联的物质的所述荧光特性相关联的一个或多个波长，并且其中，所述物质是叶绿素，或叶绿素的代谢产物，或这两者。
30.根据权利要求11所述的方法，其中，所述样品以具有低于大约650nm的激发波长的光束照亮，所述第一波段在大约650nm和800nm之间并且所述第二波段在大约720nm和800nm之间。
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