BR112019014683A2 - Sequenciamento com dois canais óticos, com fonte de luz única - Google Patents

Abstract

é revelado um sistema para determinar a sequência de nucleotídeo de polinucleotídeos. o sistema pode compreender uma fonte de luz, tal como um laser ou um led, configurada para gerar luz em um comprimento de onda predeterminado. um detector do sistema pode detectar emissões fluorescentes em um primeiro comprimento de onda e um segundo comprimento de onda. um processador do sistema identifica o nucleotídeo como um primeiro tipo, se nenhuma emissão fluorescente for detectada por pelo menos um detector; identifica o nucleotídeo como um segundo tipo, se uma emissão fluorescente no primeiro comprimento de onda de luz for detectada por pelo menos um detector; identifica o nucleotídeo como um terceiro tipo, se uma emissão fluorescente no segundo comprimento de onda de luz for detectada por pelo menos um detector; e identifica o nucleotídeo como um quarto tipo, se emissões fluorescentes no primeiro comprimento de onda e no segundo comprimento de onda de luz forem detectadas por pelo menos um detector.

Description

“SEQUENCIAMENTO COM DOIS CANAIS ÓTICOS,

COM FONTE DE LUZ ÚNICA”

RELATÓRIO DESCRITIVO

PEDIDOS RELACIONADOS [0001] O presente pedido reivindica prioridade para o Pedido Provisório US 62/468242, depositado em 07 de março de 2017. O conteúdo deste pedido relacionado é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES

Campo [0002] A presente revelação se refere, em geral, ao campo do sequenciamento de DNA e, mais particularmente, se refere a sistemas e métodos para sequenciamento de DNA utilizando uma fonte de luz única e pelo menos dois corantes com dois marcadores fluorescentes.

Descrição da Técnica Relacionada [0003] Sistemas e métodos de sequenciamento de DNA existentes utilizam duas ou mais fontes de luz para excitar análogos ao ácido desoxirribonucleico conjugados com marcadores fluorescentes. Entretanto, em operação, as fontes de luz têm consumo de energia alto e podem gerar uma quantidade substancial de calor que precisa ser dissipado. Marcadores fluorescentes que podem ser excitados de forma eficiente por uma fonte de luz podem ser submetidos à cross-talk, por meio de que cada marcador emite luz em um comprimento de onda que se sobrepõe com outros marcadores. Quando não corrigido, esse crosstalk pode tornar difícil para sistemas de sequenciamento de DNA para chamar adequadamente a base de nucleotídeo correta durante uma

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2/44 série de sequenciamento.

SUMÁRIO [0004] São revelados neste documento sistemas e métodos para determinação da sequência de nucleotídeo de polinucleotídeos. Em um exemplo, um sistema inclui uma fonte de luz única, tal como um laser ou um diodo emissor de luz, configurado para gerar luz, tal como luz em um comprimento de onda predeterminado; pelo menos um detector configurado para detectar emissões fluorescentes de um fluoróforo ligado a um nucleotídeo, pelo menos um detector sendo configurado para detectar as emissões fluorescentes em um primeiro comprimento de onda e um segundo comprimento de onda; um processador configurado para executar instruções que realize um método compreendendo: gerar luz da fonte de luz em direção a um nucleotídeo; identificar o nucleotídeo como um primeiro tipo, quando nenhuma emissão fluorescente for detectada por pelo menos um detector; identificar o nucleotídeo como um segundo tipo, quando uma emissão fluorescente no primeiro comprimento de onda de luz for detectada por pelo menos um detector; identificar o nucleotídeo como um terceiro tipo, quando uma emissão fluorescente no segundo comprimento de onda de luz for detectado por pelo menos um detector; e identificar o nucleotídeo como um quarto tipo, quando as emissões fluorescentes no primeiro comprimento de onda e no segundo comprimento de onda de luz forem detectadas por pelo menos um detector.

[0005] Outro exemplo é um método implementado por computador, que inclui a geração de luz usando uma fonte de luz em direção a um fluoróforo ligado a um nucleotídeo; detectar as emissões fluorescentes do fluoróforo ligado ao nucleotídeo em um primeiro comprimento de onda e um segundo comprimento de onda usando pelo menos um detector; e identificar o nucleotídeo, compreendendo a identificação do nucleotídeo como um primeiro tipo, quando nenhuma

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3/44 emissão fluorescente for detectada por pelo menos um detector; identificar o nucleotídeo como um segundo tipo, quando uma emissão fluorescente no primeiro comprimento de onda de luz for detectada por pelo menos um detector; identificar o nucleotídeo como um terceiro tipo, quando uma emissão fluorescente no segundo comprimento de onda de luz for detectado por pelo menos um detector; e identificar o nucleotídeo como um quarto tipo, quando as emissões fluorescentes no primeiro comprimento de onda e no segundo comprimento de onda de luz forem detectadas por pelo menos um detector.

[0006] Em outro exemplo, um sistema inclui uma fonte de luz única configurada para gerar luz; pelo menos um detector configurado para detectar quatro emissões fluorescentes substancialmente diferentes de fluoróforos diferentes ligados a nucleotídeos; um processador configurado para executar instruções que realizam um método compreendendo: a geração de luz da fonte de luz em direção a um nucleotídeo; identificação do nucleotídeo como um primeiro tipo quando uma primeira emissão fluorescente for detectada por pelo menos um detector; identificação do nucleotídeo como um segundo tipo, quando uma segunda emissão fluorescente for detectada por pelo menos um detector; identificação do nucleotídeo como um terceiro tipo, quando uma terceira emissão fluorescente for detectada por pelo menos um detector; e identificação do nucleotídeo como um quarto tipo, quando uma quarta emissão fluorescente for detectada por pelo menos um detector, em que a primeira emissão fluorescente, a segunda emissão fluorescente, a terceira emissão fluorescente e as quartas emissões fluorescentes têm comprimentos de onda substancialmente diferentes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0007] A FIG. 1 é uma ilustração esquemática mostrando um sequenciador de dois canais óticos, com fonte de luz única

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4/44 exemplificativo.

[0008] A FIG. 2 apresenta um diagrama em bloco funcional de um sistema de computador exemplificativo para realizar sequenciamento com dois canais óticos, com fonte de luz única.

[0009] A FIG. 3 é um fluxograma de um método exemplificativo para o sequenciamento através de síntese utilizando sequenciamento com dois canais óticos, com fonte de luz única.

[0010] A FIG. 4 é um fluxograma de um método exemplificativo para realizar a chamada de bases para sequenciamento com dois canais óticos, com fonte de luz única.

[0011] A FIG. 5 é um fluxograma de um método exemplificativo para realizar sequenciamento com dois canais óticos, com fonte de luz única.

[0012] A FIG. 6 apresenta os contornos dos aglomerados de ácido nucleico e seu sequenciamento, usando sequenciamento com dois canais óticos, com fonte de luz única.

[0013] As FIGS. 7A-D são gráficos esquemáticos apresentando correção de cor e correção de fase para sequenciamento com dois canais óticos, com fonte de luz única.

DESCRIÇÃO DETALHADA [0014] Na seguinte descrição detalhada, é feita referência aos desenhos em anexo, que forma uma parte da mesma. Nos desenhos, símbolos similares tipicamente identificam componentes similares, a menos que o contexto dite de outro modo. As realizações ilustrativas descritas na descrição detalhada, desenhos e reivindicações não se destinam a serem limitadoras. Outras realizações podem ser utilizadas e outras mudanças podem ser feitas, sem se distanciar do espírito ou escopo do assunto apresentado neste documento. Será facilmente entendido que os aspectos da presente revelação, como descrito em geral neste documento e ilustrado nas Figuras, podem ser arranjados,

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5/44 substituídos, combinados, separados e projetados em uma ampla variedade de configurações diferentes, todas as quais são explicitamente contempladas neste documento.

[0015] Realizações da invenção se relacionam com sistemas de sequenciamento de nucleotídeo de próxima geração, que pode identificar todas as quatro bases de nucleotídeo usando uma única fonte de luz e apenas dois canais óticos diferentes. Os sistemas de sequenciamento podem fazer uso de um processo de Sequenciamento por Síntese. Durante cada ciclo de sequenciamento, quatro tipos de análogos de nucleotídeo podem ser incorporados em primers em crescimento hibridizados em polinucleotídeos sendo sequenciados. Em algumas realizações, os quatro tipos de análogos de nucleotídeo podem incluir um análogo de desoxiguanosina trifosfato (dGTP) não conjugado com qualquer corante fluorescente, um análogo de desoxitmidina trifosfato (dTTP) conjugado com um primeiro corante fluorescente, um análogo de desoxicitidina trifosfato (dCTP) conjugado com um segundo corante fluorescente e um análogo de desoxiadenosina trifosfato (dATP) conjugado com ambos os corantes fluorescentes (ou uma mistura de dois análogos de dATP, um análogo de dATP com o primeiro corante fluorescente e outro análogo de dATP com o segundo corante fluorescente). Os corantes fluorescentes conjugados aos quatro tipos de análogos de nucleotídeo são apenas ilustrativos e não se destinam a serem limitadores. Por exemplo, o análogo de dTTP pode não ser conjugado com qualquer corante fluorescente, o análogo de dCTP pode ser conjugado com um primeiro corante fluorescente, o análogo de dATP pode ser conjugado com um segundo corante fluorescente e o análogo de dGTP pode ser conjugado com ambos os corantes fluorescentes (ou uma mistura de dois análogos de dGTP, um análogo de dGTP com o primeiro corante fluorescente e outro análogo de dGTP com o segundo corante fluorescente). Como outro exemplo, o análogo de dCTP pode não ser conjugado com qualquer corante fluorescente, o análogo de dATP pode ser conjugado com um primeiro corante fluorescente, o análogo de

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6/W dTTP pode ser conjugado com um segundo corante fluorescente e o análogo de dGTP pode ser conjugado com ambos os corante fluorescentes (ou uma mistura de dois análogos de dGTP, um análogo de dGTP com o primeiro corante fluorescente e outro análogo de dGTP com o segundo corante fluorescente). Como ainda outro exemplo, o análogo de nucleotídeo não conjugado com qualquer corante fluorescente pode ser dGTP, dTTP, dCTP, ou dATP. O análogo de nucleotídeo conjugado com o primeiro corante fluorescente ou o segundo corante fluorescente pode ser dGTP, dTTP, dCTP, ou dATP. O análogo de nucleotídeo conjugado com dois corantes fluorescentes pode ser dGTP, dTTP, dCTP,ou dATP. O análogo de dGTP,dTTP, dCTP, ou dATP pode compreender uma mistura de dois análogos, um análogo com o primeiro corante fluorescente e outro análogo com o segundo corante fluorescente.

[0016] A fonte de luz (por exemplo, um laser ou um diodo emissor de luz) pode excitar os dois corantes fluorescentes. O primeiro corante fluorescente fluoresce em um primeiro comprimento de onda e pode ser capturado em uma primeira imagem fluorescente. O segundo corante fluorescente fluoresce em um segundo comprimento de onda e pode ser capturado em uma segunda imagem fluorescente. As intensidades das emissões fluorescentes capturadas são extraídas das duas imagens fluorescentes. Em algumas realizações, dos dois corantes fluorescentes podem ser submetidos à cross-talk e as emissões fluorescentes do análogo de dTTP e do análogo de dCTP podem ser capturadas em ambas as imagens fluorescentes. Assim, as intensidades extraídas precisam ser corrigidas através de, por exemplo, correção de cor. Em algumas realizações, os dois corantes fluorescentes podem ter um Stoke’s shift grande e as emissões fluorescentes podem ter cross-talk mínimo, ou nenhum cross-talk.

[0017] Em algumas realizações, um dos dois corantes fluorescentes pode ser um corante de Stoke’s shift normal e o outro dos corantes fluorescentes pode ser um corante de Stoke’s shift longo.

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Exemplos não limitadores de um corante de Stoke’s shift normal incluem Alexa 488 ou seus análogos de corante (tais como 3,6Bis(etilamino)-2,7-dimetil-[2-carboxilato-5-(3-carboxipropilóxi)fenil]xantílio betaína (corante 1-3) e 3,6-Bis(etilamino)-2,7-dimetil-[2-carboxilato4-(3-carboxipropilóxi)fenil]xantílio betaína (corante 1-4) revelados na Patente US 8.754.244, cujo teor é incorporado neste documento em sua totalidade. O corante de Stoke’s shift normal pode ser excitado com um laser ou uma fonte de luz de diodo emissor de luz (LED) com um comprimento de onda de 488 nm e pode ter um pico de emissão em 520 nm. Um corante de Stoke’s shift longo pode ser corante NR520LS no Pedido de Patente PCT PCT/GB2016/051474, cujo teor é incorporado neste documento em sua totalidade. O corante de Stoke’s shift longo pode ter um pico de emissão em 590 nm. Em algumas realizações, os dois corantes fluorescentes podem ser Cy3 (com pico de emissão em torno de 575 nm) e um par de corante de transferência de energia ressonante por fluorescência (FRET) Cy3-Cy5 (com pico de emissão em 670 nm).

[0018] A correção de cor pode utilizar uma matriz de cor para condicionar as intensidades extraídas utilizando propriedades da distribuição subjacente de intensidades dentro de cada imagem fluorescente. A matriz de cor pode ser estimada por plotagem das intensidades extraídas da primeira imagem fluorescente contra as intensidades extraídas das posições correspondentes na segunda imagem fluorescente em posições (xí, yj. x/ e y; denotam a intensidade extraída de uma posição i dos polinucleotídeos primer em crescimento na segunda imagem fluorescente e na primeira imagem fluorescente, respectivamente. As intensidades plotadas nas posições (xí, yj são convertidas em coordenadas polares (η, θί) e um histograma com ponderação de raio de ângulos θί é computado. As duas máximas locais θι e 02, no histograma com ponderação de raio, podem ser usadas para estimar a matriz de cor. A matriz de cor pode ser

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8/44 / A \[tan(90 - ê']2.) 1 J.

[0019] Após aplicar o inverso da matriz de cor às intensidades plotadas nas posições (x/, y/), as bases de nucleotídeos incorporadas podem ser determinadas. Por exemplo, se nenhuma emissão fluorescente for detectada, o nucleotídeo incorporado pode ser o análogo de dGTP. Se emissão fluorescente for detectada na segunda imagem fluorescente e não na primeira imagem fluorescente, o nucleotídeo incorporado pode ser o análogo de dTTP. Se a emissão fluorescente for detectada na primeira imagem fluorescente e não na primeira imagem fluorescente, o nucleotídeo incorporado pode ser o análogo de dCTP. Se as emissões fluorescentes forem detectadas em ambas as imagens fluorescentes, o nucleotídeo incorporado pode ser o análogo de dATP.

Definições [0020] A menos que de outro modo definido, os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que comumente entendido por uma pessoa de conhecimento comum na técnica à qual a presente revelação pertence. Ver, por exemplo, Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY 1989). Para fins da presente revelação, os seguintes termos são definidos abaixo.

Sequencíador com dois canais óticos, com fonte de luz única [0021] São revelados neste documento sistemas e métodos para determinar a sequência de nucleotídeo de polinucleotídeos utilizando uma única fonte de luz (por exemplo, um laser ou um LED). Em uma realização, há pelo menos duas tintas usadas para sequenciar um polinucleotideo. A FIG. 1 é uma ilustração esquemática apresentando

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9/44 um sistema de sequenciamento com dois canais óticos, com fonte de luz única 100. O sistema de sequenciamento com dois canais óticos, com fonte de luz única 100 pode ser configurado para utilizar métodos de sequenciamento com base em dois corantes, por exemplo, um primeiro marcador fluorescente e um segundo marcador fluorescente. Exemplos não limitadores dos métodos de sequenciamento utilizados podem incluir o sequenciamento por síntese e sequenciamento de molécula única Heliscope. O sistema de sequenciamento com dois canais óticos, com fonte de luz única 100 pode incluir um sistema ótico 102 configurado para gerar dados de sequenciamento brutos utilizando reagentes de sequenciamento fornecidos por um sistema de fluidos 104, que é parte do sistema de sequenciamento com dois canais óticos, com fonte de luz única 100. Os dados de sequenciamento brutos podem incluir imagens fluorescentes capturadas pelo sistema ótico 102. Um sistema de computador 106, que é parte do sistema de sequenciamento com dois canais óticos, com fonte de luz única 100, pode ser configurado para controlar o sistema ótico 102 e o sistema de fluidos 104, por meio de canais de comunicação 108A e 108B. Por exemplo, uma interface de computador 110 do sistema ótico 102 pode ser configurada para se comunicar com o sistema de computador 106 através do canal de comunicação 108A.

[0022] Durante as reações de sequenciamento, o sistema de fluidos 104 pode direcionar o fluxo de reagentes através de um ou mais tubos reagentes 112 para e de uma célula de fluxo 114 posicionada em um estágio de montagem 116. Os reagentes podem ser, por exemplo, nucleotídeos marcados de forma fluorescente, tampões, enzimas e reagentes de clivagem. A célula de fluxo 114 pode incluir pelo menos um canal de fluidos. A célula de fluxo 114 pode ser uma célula de fluxo em conjunto ordenado padronizado ou uma célula de fluxo em conjunto ordenado de forma aleatória. A célula de fluxo 114 pode incluir múltiplos aglomerados de polinucleotideos de filamento único a serem sequenciados em pelo menos um canal de fluidos. Os comprimentos

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10/44 dos polinucleotídeos podem variar a extensão, por exemplo, de 200 bases a 1000 bases. Os polinucleotídeos podem ser ligados a um ou canais de fluidos da célula de fluxo 114. Em algumas realizações, a célula de fluxo 114 pode incluir uma pluralidade de esferas, em que cada esfera pode incluir múltiplas cópias de um polinucleotideo a ser sequenciado. O estágio de montagem 116 pode ser configurado para permitir alinhamento adequado e movimento da célula de fluxo 114 em relação aos outros componentes do sistema ótico 102. Em uma realização, o estágio de montagem 116 pode ser usado para alinhar a célula de fluxo 114 com uma lente 118.

[0023] O sistema ótico 102 pode incluir uma fonte de luz única 120, tal como uma fonte de laser única ou de LED única, configurada para gerar luz em um comprimento de onda predeterminado, por exemplo, 532 nm. A luz gerada pela fonte de luz 120 pode passar através de um cabo de fibra ótica 122 para excitar marcadores fluorescentes na célula de fluxo 114. A lente 118, montada sobre um focalizador 124, pode se mover ao longo do eixo z. As emissões fluorescentes focadas podem ser detectadas por um detector 126, por exemplo, um sensor de dispositivo de carga acoplada (CCD) ou um sensor Metal-Óxido Semicondutor Complementares (CMOS).

[0024] Uma montagem de filtro 128 do sistema ótico 102 pode ser configurada para filtrar as emissões fluorescentes dos marcadores fluorescentes na célula de fluxo 114. A montagem de filtro 128 pode incluir um primeiro filtro e um segundo filtro. Cada filtro pode ser um filtro passa-longo, um filtro passa-curto, ou um filtro passa-faixa, dependendo dos tipos de moléculas fluorescentes sendo usadas no sistema. O primeiro filtro pode ser configurado para detectar as emissões fluorescentes dos primeiros marcadores fluorescentes pelo detector 126. O segundo filtro pode ser configurado para detectar as emissões fluorescentes dos segundos marcadores fluorescentes pelo detector 126. Com dois filtros na montagem de filtro 128, o detector 126 pode detectar dois comprimentos de onda diferentes de luz. Os dois

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11/44 comprimentos de onda de luz podem ser do mesmo marcador fluorescente ou de marcadores fluorescentes diferentes. Os dois comprimentos de onda de luz podem estar distantes, por exemplo, pelo menos 20 nm.

[0025] Em algumas realizações, o sistema ótico 102 pode incluir um dicroico configurado para dividir as emissões fluorescentes. O sistema ótico 102 pode incluir dois detectores, um primeiro detector acoplado com um primeiro filtro para detectar emissões fluorescentes em um primeiro comprimento de onda e um segundo detector acoplado com um segundo filtro para detectar emissões fluorescentes em um segundo comprimento de onda. Após a divisão das emissões fluorescentes com um dicroico, o sistema ótico 102 pode detectar emissões fluorescentes simultaneamente (ou em momentos próximos) em dois comprimentos de onda usando dois detectores acoplados com filtros diferentes. Essa configuração pode acelerar o processo de geração de imagens. Consequentemente, múltiplas células de fluxo podem ser processadas simultaneamente, com uma célula de fluxo passando por geração de imagem, enquanto análogos de nucleotídeo são incorporados em aglomerados de polinucleotideo de uma ou mais outras células de fluxo.

[0026] Em uso, uma amostra tendo um polinucleotideo a ser sequenciado é carregada na célula de fluxo 114 e colocada no estágio de montagem 116. O sistema de computador 106, então, ativa o sistema de fluidos 104 para iniciar um ciclo de sequenciamento. Durante as reações de sequenciamento, o sistema de computador 106 instrui o sistema de fluidos 104, através da interface de comunicação 108B, para fornecer reagentes, por exemplo, análogos de nucleotídeo, à célula de fluxo 114. Através da interface de comunicação 108A e da interface de computador 110, o sistema de computador 106 é configurado para controlar a fonte de luz 120 do sistema ótico 102, para gerar luz em um comprimento de onda e brilho predeterminado em direção aos análogos de nucleotídeo incorporados em primers em crescimento hibridizados

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12/44 em polinucleotideos sendo sequenciados. O sistema de computador 106 controla o detector 126 do sistema ótico 102, para capturar os espectros de emissão dos análogos de nucleotídeo em imagens fluorescentes. O sistema de computador 106 recebe as imagens fluorescentes do detector 126 e processa as imagens fluorescentes recebidas, para determinar a sequência de nucleotídeo dos polinucleotideos sendo sequenciados.

Fonte de Luz e Filtros [0027] O sistema de sequenciamento com dois canais óticos, com fonte de luz única 100 pode utilizar uma fonte de luz, tal como um laser ou um LED, capaz de excitar dois marcadores fluorescentes com espectros de emissão que são suficientemente não sobrejacentes. O comprimento de onda da luz gerada pela fonte de luz 120 pode variar, por exemplo, variando de 400 nm a 800 nm. Em algumas realizações, o comprimento de onda da luz gerada pela fonte de luz 120 pode ser, ou ser cerca de, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800 nm, ou um número ou uma extensão entre quaisquer dois destes valores. Em algumas realizações, o comprimento de onda da luz gerada pela fonte de luz 120 pode ser pelo menos, ou no máximo, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, ou 800 nm.

[0028] O detector 126, com a montagem de filtro 128, pode ser configurado para detectar luz de, ou cerca de, dois comprimentos de onda diferentes, por exemplo, um primeiro comprimento de onda e um segundo comprimento de onda. O primeiro comprimento de onda e o segundo comprimento de onda podem estar separados uns dos outros, por exemplo, variando de 10 nm a 100 nm. Em algumas realizações, o

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13/44 primeiro comprimento de onda e o segundo comprimento de onda podem estar, ou ser cerca de, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 nm, ou um número ou uma extensão entre quaisquer dois destes valores, separados. Em algumas realizações, o primeiro comprimento de onda e o segundo comprimento de onda podem estar pelo menos, ou no máximo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100 nm separados.

[0029] O número de filtros na montagem de filtro 128 pode variar se estendendo de 1 a 10. Em algumas realizações, o número de filtros na montagem de filtro 128 pode ser, ou ser cerca de, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou uma extensão entre quaisquer dois destes valores. Em algumas realizações, o número de filtros na montagem de filtro 128 pode ser pelo menos, ou no máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10.

[0030] Um filtro pode ser um filtro passa-faixa e pode ter pico de transmitância de comprimento de onda variante, variando de 400 nm a 800 nm. Em algumas realizações, o pico de transmitância pode ser, ou ser cerca de, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800 nm, ou um número ou uma extensão entre quaisquer dois destes valores. Em algumas realizações, o pico de transmitância pode ser pelo menos, ou no máximo, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, ou 800 nm. A largura do filtro pode variar, por exemplo, variando de 1 nm a 50 nm. Em algumas realizações, a largura do filtro pode ser, ou ser cerca de, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 nm, ou um número ou uma extensão entre quaisquer dois destes valores. Em algumas realizações, a largura do filtro pode ser pelo menos, ou no máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, ou 50 nm.

Marcadores Fluorescentes

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14/44 [0031] Marcadores fluorescentes utilizados pelos sistemas e métodos revelados neste documento têm comprimentos de onda de pico de absorção diferentes, por exemplo, variando de 400 nm a 800 nm. Em algumas realizações, os comprimentos de onda de pico de absorção dos marcadores fluorescentes podem ser, ou ser cerca de, 400, 410, 420,

430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560,

570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700,

710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800 nm, ou um número ou uma extensão entre quaisquer dois destes valores. Em algumas realizações, os comprimentos de onda de pico de absorção dos marcadores fluorescentes podem ser pelo menos, ou no máximo, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, ou 800 nm.

[0032] Os marcadores fluorescentes podem ter comprimentos de onda de pico de emissão, por exemplo, variando de 400 nm a 800 nm. Em algumas realizações, os comprimentos de onda de pico de emissão dos marcadores fluorescentes podem ser, ou ser cerca de, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800 nm, ou um número ou uma extensão entre quaisquer dois destes valores. Em algumas realizações, os comprimentos de onda de pico de emissão dos marcadores fluorescentes podem ser pelo menos, ou no máximo, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, ou 800 nm.

[0033] Os marcadores fluorescentes podem ter diferentes Stoke’s shift, por exemplo, variando de 10 nm a 200 nm. Em algumas realizações, o Stoke’s shift pode ser, ou ser cerca de, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 nm, ou um número ou uma extensão entre quaisquer dois destes

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15/44 valores. Em algumas realizações, o Stoke’s shift pode ser pelo menos, ou no máximo, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ou 200 nm.

[0034] Os sistemas e métodos revelados neste documento podem utilizar dois marcadores fluorescentes, por exemplo, um primeiro marcador fluorescente e um segundo marcador fluorescente, podem ter espectros de emissão sobrejacentes e podem ser submetidos a crosstalk. Em algumas realizações, os comprimentos de onda de pico de emissão dos dois marcadores fluorescentes podem variar, por exemplo, se estendendo de 10 nm a 200 nm. Em algumas realizações, os comprimentos de onda de pico de emissão dos dois marcadores fluorescentes podem ser, ou ser cerca de, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 nm, ou um número ou uma extensão entre quaisquer dois destes valores. Em algumas realizações, os comprimentos de onda de pico de emissão dos dois marcadores fluorescentes podem ser pelo menos, ou no máximo, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ou 200 nm. O detector 126, com um dos filtros na montagem de filtro 128, pode detectar emissões fluorescentes do primeiro marcador fluorescente. O detector 126, com outro filtro na montagem de filtro 128, pode detectar emissões fluorescentes do segundo marcador fluorescente.

[0035] Em algumas realizações, um dos dois corantes fluorescentes pode ser um corante de Stoke’s shift normal e o outro dos corantes fluorescentes pode ser um corante de Stoke’s shift longo. Exemplos não limitadores de um corante de Stoke’s shift normal incluem Alexa 488 ou seus análogos corantes (tais como 3,6Bis(etilamino)-2,7-dimetil-[2-carboxilato-5-(3-carboxipropilóxi)fenil]xantílio betaína (corante 1-3) e 3,6-Bis(etilamino)-2,7-dimetil-[2-carboxilato4-(3-carboxipropilóxi)fenil]xantílio betaína (corante 1-4) na Patente US 8.754.244). O corante de Stoke’s shift normal pode ser excitado com uma fonte de luz laser ou um LED com um comprimento de onda de

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488 nm e pode ter um pico de emissão em 520 nm. Um corante de Stoke’s shift longo pode ser um corante NR520LS, no Pedido de Patente PCT PCT/GB2016/051474. O corante de Stoke’s shift longo pode ter um pico de emissão em 590 nm. Em algumas realizações, os dois corantes fluorescentes pode ser Cy3 (com pico de emissão em torno de 575 nm) e um par de corante de transferência de energia ressonante por fluorescência (FRET) Cy3-Cy5 (com pico de emissão em 670 nm).

(CH₂)₃CO₂H

I

c₂h₅ c₂h₅

1-3

c₂h₅ c₂h₅

1-4

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Sistema de computador [0036] O sistema de computador 106 do sistema de sequenciamento com dois canais óticos, com fonte de luz única 100 pode ser configurado para controlar o sistema ótico 102 e o sistema de fluidos 104, como discutido acima. Enquanto muitas configurações são possíveis para o sistema de computador 106, uma realização é ilustrada na FIG. 2. Como mostrado na FIG. 2, o sistema de computador 106 pode incluir um processador 202, que está em comunicação elétrica com uma memória 204, um armazenamento 206 e uma interface de comunicação 208.

[0037] O processador 202 pode ser configurado para executar instruções que fazem com que o sistema de fluidos 104 forneça reagentes à célula de fluxo 114 durante as reações de sequenciamento. O processador 202 pode executar instruções que controlam a fonte de luz 120 do sistema ótico 102, para gerar luz em um comprimento de onda predeterminado. O processador 202 pode executar instruções que controlem o detector 126 do sistema ótico 102 e recebam dados do detector 126. O processador 202 pode executar instruções para processar dados, por exemplo, imagens fluorescentes, recebidas do detector 126 e para determinar a sequência de nucleotídeo de

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18/44 polinucleotídeos baseados nos dados recebidos a partir do detector 126. [0038] A memória 204 pode ser configurada para armazenar instruções para configuração do processador 202 para executar as funções do sistema de computador 106, quando o sistema de sequenciamento com dois canais óticos, com fonte de luz única 100 está ligado. Quando o sistema de sequenciamento com dois canais óticos, com fonte de luz única 100 está desligado, o armazenamento 206 pode armazenar as instruções para configuração do processador 202 para executar as funções do sistema de computador 106. A interface de comunicação 208 pode ser configurada para facilitar as comunicações entre o sistema de computador 106, o sistema ótico 102 e o sistema de fluidos 104.

[0039] O sistema de computador 106 pode incluir uma interface de usuário 210 configurada para se comunicar com um dispositivo de exibição (não mostrado) para exibição dos resultados de sequenciamento do sistema de sequenciamento com dois canais óticos, com fonte de luz única 100. A interface de usuário 210 pode ser configurada para receber entradas de usuários do sistema de sequenciamento com dois canais óticos, com fonte de luz única 100. Uma interface de sistema ótico 212 e uma interface do sistema de fluidos 214 do sistema de computador 106 podem ser configuradas para controlar o sistema ótico 102 e o sistema de fluidos 104 através do enlace de comunicação 108A e 108B ilustrado na FIG. 1. Por exemplo, a interface do sistema ótico 212 pode se comunicar com a interface de computador 110 do sistema ótico 102 através do enlace de comunicação 108A.

[0040] O sistema de computador 106 pode incluir um determinador de base nucleica 216, configurado para determinar a sequência de nucleotídeo de polinucleotídeos usando os dados recebidos do detector 126. O determinador de base nucleica 216 pode incluir um ou mais de: um gerador de modelo 218, um registrador de localização 220, um extrator de intensidade 222, um corretor de

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19/44 intensidade 224, um chamador de base 226 e um determinador de pontuação de qualidade 228. O gerador de modelo 218 pode ser configurado para gerar um modelo das localizações dos aglomerados de polinucleotídeos na célula de fluxo 114 usando as imagens fluorescentes capturadas pelo detector 126. O registrador de localização 220 pode ser configurado para registrar as localizações dos aglomerados de polinucleotídeos na célula de fluxo 114 nas imagens fluorescentes capturadas pelo detector 126 com base no modelo de localização gerado pelo gerador de modelo 218. O extrator de intensidade 222 pode ser configurado para extrair intensidades das emissões fluorescentes das imagens fluorescentes para gerar intensidades extraídas. O corretor de intensidade 224 pode ser configurado para reduzir ou eliminar o crosstalk entre os marcadores fluorescentes através de, por exemplo, correção de cor das intensidades extraídas, para gerar intensidades corrigidas. Em algumas realizações, o corretor de intensidade 224 pode corrigir a fase ou corrigir pré-fase das intensidades extraídas. O chamador de base 226 pode ser configurado para determinar as bases do polinucleotideo a partir das intensidades corrigidas. As bases dos polinucleotídeos determinadas pelo chamador de base 226 podem ser associadas com pontuações de qualidade determinadas pelo determinador de pontuação de qualidade 228.

Sequenciamento por Síntese [0041] A FIG. 3 é um fluxograma de um método exemplificativo 300 para sequenciamento por síntese, utilizando o sistema de sequenciamento 100. Após o método 300 iniciar no bloco 305, uma célula de fluxo 114 incluindo fragmentos de polinucleotideo fragmentado (por exemplo, fragmentos de polinucleotideo de filamento único ou duplo fragmentado) é recebida no bloco 310. Os fragmentos de polinucleotideo fragmentado podem ser gerados a partir de uma amostra de ácido desoxirribonucleico (DNA). A amostra de DNA pode ser

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20/44 de várias fontes, por exemplo, uma amostra biológica, uma amostra celular, uma amostra ambiental, ou qualquer combinação do mesmo. A amostra de DNA pode incluir um ou mais de um fluido biológico, um tecido e células de um paciente. Por exemplo, a amostra de DNA pode ser tirada de, ou incluir, sangue, urina, fluido cerebroespinhal, fluido pleural, fluido amniótico, sêmen, saliva, medula óssea, uma amostra de biópsia, ou qualquer combinação das mesmas.

[0042] A amostra de DNA pode incluir DNA de células de interesse. As células de interesse podem variar e, em algumas realizações, expressa um fenótipo maligno. Em algumas realizações, as células de interesse podem incluir células tumorais, células de medula óssea, células cancerígenas, células-tronco, células endoteliais, patogênico de células infectadas de forma viral, células de organismo parasítico, ou qualquer combinação dos mesmos.

[0043] Os comprimentos de fragmentos de polinucleotideo fragmentado podem variar de 200 bases a 1000 bases. Uma vez que a célula de fluxo 114 incluindo os fragmentos de polinucleotideo fragmentado é recebida no bloco 310, o processo 300 se move para o bloco 320, em que os fragmentos de polinucleotideo são amplificados em ponte em aglomerados de fragmentos de polinucleotideo ligados à superfície interna de um ou mais canais de uma célula de fluxo, por exemplo, a célula de fluxo 114. A superfície interna de um ou mais canais da célula de fluxo pode incluir dois tipos de primers, por exemplo, um primeiro tipo de primer (Pl) e um segundo tipo de primer (P2) e os fragmentos de DNA podem ser amplificados através de métodos bem conhecidos.

[0044] Após a geração de aglomerados dentro da célula de fluxo 114, o processo 300 pode iniciar um processo de Sequenciamento por Síntese. O processo de Sequenciamento por Síntese pode incluir a determinação da sequência de nucleotídeo de aglomerados de fragmentos de polinucleotideo de filamento único. Para determinar a sequência de um aglomerado dos fragmentos de polinucleotideo de

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21/44 filamento único com a sequência 5-P1-F-A2R-3’, primers com a sequência A2F, que são complementares da sequência A2R, podem ser adicionados e estendidos no bloco 325 com análogos de nucleotídeo com zero, um ou dois marcadores através de uma DNA polimerase para formar polinucleotídeos primer em crescimento.

[0045] Durante cada ciclo de sequenciamento, quatro tipos de análogos de nucleotídeo podem ser adicionados e incorporados aos polinucleotídeos primer em crescimento. Os quatro tipos de análogos de nucleotídeo podem ter diferentes modificações. Por exemplo, o primeiro tipo de nucleotídeo pode ser um análogo de desoxiguanosina trifosfato (dGTP) não conjugado com qualquer marcador fluorescente. O segundo tipo de nucleotídeo pode ser um análogo de desoxitimidina trifosfato (dTTP) conjugado com o primeiro tipo de marcador fluorescente por meio de um ligante. O terceiro tipo de nucleotídeo pode ser um análogo de desoxicitidina trifosfato (dCTP) conjugado com o segundo tipo de marcador fluorescente por meio de um ligante. O quarto tipo de nucleotídeo pode ser um análogo de desoxiadenosina trifosfato (dATP) conjugado com ambos o primeiro tipo de marcador fluorescente e o segundo tipo de marcador fluorescente por meio de um ou mais ligantes. Os ligantes podem incluir um ou mais grupos de clivagem. Antes do ciclo de sequenciamento subsequente, os marcadores fluorescentes podem ser removidos dos análogos de nucleotídeo. Por exemplo, um ligante ligando um marcador fluorescente a um análogo de nucleotídeo pode incluir um grupo azida e/ou alcóxi, por exemplo, no mesmo carbono, tal que o ligante por ser clivado após cada ciclo de incorporação por um reagente fosfina, liberando, assim, o marcador fluorescente dos ciclos de sequenciamento subsequentes.

[0046] O nucleotídeo trifosfatos podem ser reversivelmente bloqueados na posição 3’, de modo que o sequenciamento é controlado e não mais do que um único análogo de nucleotídeo pode ser adicionado em cada polinucleotídeos primer se estendendo em cada ciclo. Por exemplo, a posição 3’ ribose de um análogo de nucleotídeo

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22/44 pode incluir tanto funcionalidades de alcóxi, quanto de azido, que podem ser removíveis por clivagem com um reagente fosfina, criando, assim, um nucleotídeo que pode ser adicionalmente estendido. Após a incorporação de análogos de nucleotídeo, o sistema de fluidos 104 pode lavar um ou mais canais da célula de fluxo 114, a fim de remover quaisquer análogos de nucleosídeo e enzima não incorporados. Antes do ciclo de sequenciamento subsequente, os blocos 3’ reversíveis podem ser removidos, de modo que outro análogo de nucleotídeo pode ser adicionado em cada primer-polinucleotídeo em extensão.

[0047] No bloco 330, uma fonte de luz única, tal como o laser 120 ou uma fonte de LED, pode excitar os dois marcadores fluorescentes em um comprimento de onda predeterminado. Em algumas realizações, o laser ou fonte de LED única pode ser não sintonizável. No bloco 335, sinais dos marcadores fluorescentes podem ser detectados. A detecção dos marcadores fluorescentes pode incluir a captura de emissões fluorescentes em duas imagens fluorescentes em um primeiro comprimento de onda e um segundo comprimento de onda, por exemplo, pelo detector 126 usando dois filtros. As emissões fluorescentes do primeiro marcador fluorescente podem estar em, ou em torno, do primeiro comprimento de onda e as emissões fluorescentes do segundo marcador fluorescente podem estar em, ou em torno, do segundo comprimento de onda. As imagens fluorescentes podem ser armazenadas para processamento off-line posterior. Em algumas realizações, as imagens fluorescentes podem ser processadas para determinar a sequência dos polinucleotídeos primer em crescimento em cada aglomerado em tempo real.

[0048] Uma determinação pode ser feita no bloco de decisão 340, seja para detectar mais nucleotídeos baseados, por exemplo, na qualidade do sinal ou após um número predeterminado de bases. Se mais nucleotídeos devem ser detectados, então, a determinação de nucleotídeo do ciclo de sequenciamento seguinte pode ser realizada iniciando novamente no bloco 325 com análogos de nucleotídeo com

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23/44 zero, um ou dois marcadores adicionados para estender os polinucleotídeos primer. Antes do próximo ciclo de sequenciamento, os marcadores fluorescentes podem ser removidos dos análogos de nucleotídeo incorporados e os blocos 3’ reversíveis podem ser removidos, de modo que outro análogo de nucleotídeo pode ser adicionado em cada przmer-polinucleotídeo se estendendo.

[0049] No processamento de geração de imagem fluorescente offline, se não há nucleotídeo adicional a ser detectado no bloco de decisão 340, as imagens fluorescentes compreendendo os sinais fluorescentes detectados podem ser processadas no bloco 345 e as bases dos nucleotídeos incorporados podem ser determinadas. Para cada base de nucleotídeo determinada, uma pontuação de qualidade pode ser determinada no bloco 350. Após todas as imagens fluorescentes serem processadas, o processo 300 pode terminar no bloco 355.

Chamada de Base [0050] Chamada de base foi descrita na Patente US 8.965.076, cujo teor é incorporado neste documento em sua totalidade. Brevemente, chamada de base pode se referir ao processo de determinação de bases dos nucleotídeos incorporados nos aglomerados de polinucleotídeos primer em crescimento sendo sequenciados para serem guanina (G), timina (T), citosina (C), ou adenina (A). A FIG. 4 é um fluxograma de um método exemplificativo 400 para realizar chamada de base utilizando o sistema de sequenciamento 100. O processamento de sinais detectados no bloco 345 ilustrado na FIG. 3 pode incluir a realização da chamada de base do método 400. Após iniciar no bloco 405, luz de um comprimento de onda predeterminado pode ser gerada usando uma fonte de luz e pode brilhar nos análogos de nucleotídeos no bloco 410. Por exemplo, o sistema de computador 106, através de sua interface do sistema ótico 212 e do canal de comunicação 108A, pode fazer a fonte de luz 120 gerar luz no

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24/44 comprimento de luz predeterminado.

[0051] A luz gerada pela fonte de luz pode brilhar em análogos de nucleotideos incorporados em polinucleotídeos primer em crescimento ligados na superfície interna de um ou mais canais de uma célula de fluxo, por exemplo, a célula de fluxo 114. Os polinucleotídeos primer podem incluir aglomerados de fragmentos de polinucleotideo de filamento único hibridizado para sequenciamento de primers. Os análogos de nucleotídeo podem, cada um, incluir zero, um ou dois marcadores fluorescentes. Os dois marcadores fluorescentes podem ser um primeiro marcador fluorescentes e um segundo marcador fluorescente. Os marcadores fluorescentes, após serem excitados pela luz gerada pela fonte de luz, podem emitir emissões fluorescentes. Por exemplo, o primeiro marcador fluorescente pode produzir emissões fluorescentes no primeiro comprimento de onda, que pode ser capturado, por exemplo, na primeira imagem fluorescente. O segundo marcador fluorescente pode produzir emissões fluorescentes no segundo comprimento de onda, que pode ser capturado, por exemplo, em uma segunda imagem fluorescente.

[0052] Os análogos de nucleotídeo podem incluir um primeiro tipo de nucleotídeo, um segundo tipo de nucleotídeo, um terceiro tipo de nucleotídeo e um quarto tipo de nucleotídeo. O primeiro tipo de nucleotídeo, por exemplo, um análogo de desoxiguanosina trifosfato (dGTP), não é conjugado com o primeiro marcador fluorescente ou com o segundo marcador fluorescente. O segundo tipo de nucleotídeo, por exemplo, um análogo de desoxitimidina trifosfato (dTTP), pode ser conjugado com o primeiro tipo de marcador fluorescente e não com o segundo marcador fluorescente. O terceiro tipo de nucleotídeo, por exemplo, um análogo de desoxicitidina trifosfato (dCTP), pode ser conjugado com o segundo tipo de marcador fluorescente e não com o primeiro tipo de marcador fluorescente. O quarto tipo de nucleotídeo, por exemplo, um análogo de desoxiadenosina trifosfato (dATP), pode ser conjugado com ambos o primeiro tipo de marcador fluorescente e o

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25/44 segundo tipo de marcador fluorescente.

[0053] No bloco 415, emissões fluorescentes dos análogos de nucleotídeo no primeiro comprimento de onda e no segundo cumprimento de onda podem ser detectadas usando pelo menos um detector. Por exemplo, o detector 126 pode capturar duas imagens fluorescentes, uma primeira imagem fluorescente no primeiro cumprimento de onda e uma segunda imagem fluorescente no segundo comprimento de onda. Após receber as duas imagens fluorescentes do sistema ótico 102, o determinador de base nucleica 216 pode determinar a presença ou a ausência de emissões fluorescentes nas duas imagens fluorescentes.

[0054] Porque o primeiro tipo de nucleotídeo não é conjugado com o primeiro marcador fluorescente ou com o segundo marcador fluorescente, o primeiro tipo de nucleotídeo pode produzir nenhuma, ou mínima, emissão fluorescente no primeiro comprimento de onda ou no segundo comprimento de onda. No bloco de decisão 420, se nenhuma emissão fluorescente for detectada, o nucleotídeo pode ser determinado como sendo o primeiro tipo de nucleotídeo, por exemplo, dGTP. Se alguma ou mais do que mínima emissão fluorescente for detectada, o método 400 pode proceder para o bloco de decisão 425.

[0055] Porque o segundo tipo de nucleotídeo é conjugado com o primeiro tipo de marcador fluorescente e não com o segundo tipo de marcador fluorescente, o segundo tipo de nucleotídeo pode produzir emissões fluorescentes no primeiro comprimento de onda e nenhuma, ou mínima, emissão fluorescente no segundo comprimento de onda. No bloco de decisão 425, se nenhuma emissão fluorescente no segundo comprimento de onda for detectado na segunda imagem fluorescente, e, do bloco de decisão, 420, emissões fluorescentes no primeiro comprimento de onda forem detectados na primeira imagem fluorescente, então, o nucleotídeo pode ser determinado como sendo o segundo tipo de nucleotídeo, por exemplo, dTTP. Se emissões fluorescentes são detectadas no segundo comprimento de onda, o

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26/44 método 400 pode proceder para o bloco de decisão 430.

[0056] Porque o terceiro tipo de nucleotídeo for conjugado com o segundo tipo de marcador fluorescente e não com o primeiro tipo de marcador fluorescente, o terceiro tipo de nucleotídeo pode produzir emissões fluorescentes no segundo comprimento de onda e nenhuma, ou mínima, emissão fluorescente no primeiro comprimento de onda. No bloco de decisão 430, se nenhuma emissão fluorescente no primeiro comprimento de onda for detectada na primeira imagem fluorescente e do bloco de decisão 425, emissões fluorescentes no segundo comprimento de onda forem detectadas na segunda imagem fluorescente, então, o nucleotídeo pode ser determinado como sendo o terceiro tipo de nucleotídeo, por exemplo, dCTP.

[0057] Porque o quarto tipo de nucleotídeo é conjugado tanto com o primeiro tipo de marcador fluorescente, quanto com o segundo tipo de marcador fluorescente, o quarto tipo de nucleotídeo pode produzir emissões fluorescentes no primeiro comprimento de onda ou no segundo comprimento de onda. No bloco de decisão 430, se emissões fluorescentes forem detectadas no primeiro comprimento de onda na primeira imagem fluorescente, e, do bloco de decisão 425, emissões fluorescentes puderem ser detectadas no segundo comprimento de onda na segunda imagem fluorescente, então, o nucleotídeo pode ser determinado como sendo o quarto tipo de nucleotídeo, por exemplo, dATP.

[0058] A célula de fluxo 114 pode incluir aglomerados de polinucleotídeos primer em crescimento a serem sequenciados. No bloco de decisão 435, se há pelo menos mais um aglomerado com emissões fluorescentes a serem processadas para um dado ciclo de sequenciamento, o método 400 pode continuar no bloco 415. Se mais nenhum aglomerado de polinucleotideo de filamento único está para ser processado, o método 400 pode terminar no bloco 440.

Fluxo de trabalho para Sequenciamento com dois canais óticos, com

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27/44 fonte de luz única

Ciclo 1: Geração de modelo, Registro de Localização e Extração de intensidade [0059] A FIG. 5 é um fluxograma de um método exemplificativo 500 para realização de sequenciamento com dois canais óticos, com fonte de luz única. O sistema de sequenciamento com dois canais óticos, com fonte de luz única 100 pode realizar o método 500. Após iniciar no bloco 505, uma fonte de luz pode gerar luz em um comprimento de onda predeterminado em nucleotídeos no bloco 510. No bloco 515, as emissões fluorescentes de um primeiro marcador fluorescente em um primeiro comprimento de onda e de um segundo marcador fluorescente em um segundo comprimento de onda podem ser detectadas usando, por exemplo, pelo menos um detector, para gerar uma primeira imagem fluorescente e uma segunda imagem fluorescente. A detecção de emissões fluorescentes pode incluir a determinação das intensidades de emissões fluorescentes. Apões receber as duas imagens fluorescentes, um modelo de localização pode ser gerado no bloco 520, por exemplo, pelo gerador de modelo 218.

[0060] A geração de um modelo de localização pode ser necessária durante o primeiro ciclo de sequenciamento, para determinar as localizações dos aglomerados de polinucleotídeos de filamento único. A FIG. 6 apresenta os contornos dos aglomerados de ácido nucleico e seu sequenciamento usando o sequenciamento com dois canais óticos, com fonte de luz única. Durante o primeiro ciclo de sequenciamento, as localizações dos aglomerados são desconhecidas. Uma célula de fluxo pode incluir quatro aglomerados, aglomerados 1-4. Durante o primeiro ciclo de sequenciamento, o gerador de modelo 218 pode determinar a existência dos aglomerados 1, 2 e 4 na célula de fluxo.

[0061] Durante o primeiro ciclo de sequenciamento, uma primeira imagem fluorescente 602 e uma segunda imagem fluorescente 604 de

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28/44 uma célula de fluxo em um primeiro estágio 606, correspondente ao primeiro ciclo de sequenciamento, podem ser geradas. Os análogos de nucleotídeo incorporados nos aglomerados de polinucleotídeos primer em crescimento podem variar. Por exemplo, o nucleotídeo incorporado no aglomerado 1 pode ser um análogo de desoxiadenosina trifosfato (dATP) conjugado tanto com o primeiro tipo de marcador fluorescente, quanto com o segundo tipo de marcador fluorescente. A primeira imagem fluorescente 602 pode capturar as emissões fluorescentes do primeiro tipo de marcador fluorescente no análogo de dATP. A segunda imagem fluorescente 604 pode capturar as emissões fluorescentes do segundo tipo de marcador fluorescente no análogo de dATP. O gerador de modelo 218 pode determinar a partir da primeira imagem fluorescente 602 ou da segunda imagem fluorescente 604 a existência do aglomerado 1 na localização particular do aglomerado 1.

[0062] O nucleotídeo incorporado no aglomerado 2 pode ser um análogo de desoxicitidina trifosfato (dCTP) conjugado com o segundo tipo de marcador fluorescente e não com o primeiro tipo de marcador fluorescente. A segunda imagem fluorescente pode capturar as emissões fluorescentes do segundo tipo de marcador fluorescentes no análogo de dCTP. Se o primeiro marcador fluorescente e o segundo marcador fluorescente forem submetidos a cross-talk, o aglomerado 2 pode ter algumas emissões fluorescentes na primeira imagem fluorescente. O gerador de modelo 218 pode determinar a partir da segunda imagem fluorescente 604 a existência do aglomerado 2 na localização particular do aglomerado 2.

[0063] O nucleotídeo incorporado no aglomerado 3 pode ser um análogo de desoxiguanosina trifosfato (dGTP) não conjugado com o primeiro marcador fluorescente ou com o segundo marcador fluorescente. A primeira imagem fluorescente 602 e a segunda imagem fluorescente 604, assim, têm nenhuma, ou mínima, emissão fluorescente do aglomerado 3. O gerador de modelo 218 pode ser incapaz de determinar a partir da primeira imagem fluorescente 602 e

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29/44 da segunda imagem fluorescente 604 a existência do aglomerado 3 na localização particular do aglomerado 3.

[0064] O nucleotídeo incorporado no aglomerado 4 pode ser um análogo de desoxitimidina trifosfato (dTTP) conjugado com o primeiro tipo de marcador fluorescente e não com o segundo tipo de marcador fluorescente. A primeira imagem fluorescente 602 pode capturar as emissões fluorescentes do primeiro tipo de marcador fluorescente no análogo de dTTP. Se o primeiro marcador fluorescente e o segundo marcador fluorescente forem submetidos à cross-talk, o aglomerado 4 pode ter algumas emissões fluorescentes na segunda imagem fluorescente 604. O gerador de modelo 218 pode determinar a partir da primeira imagem fluorescente a existência do aglomerado 4 na localização particular do aglomerado 4.

[0065] O gerador de modelo 218 pode gerar um modelo de localização dos aglomerados 1, 2 e 4 com base na primeira imagem fluorescente 602 e na segunda imagem fluorescente 604 no primeiro ciclo de sequenciamento. Em algumas realizações, a geração de modelo de localização pode incluir a detecção de cross-talk entre o primeiro marcador fluorescente e o segundo marcador fluorescente. O cross-talk pode vantajosamente tornar o registro de imagem mais robusto, especialmente no contexto de baixa diversidade, porque as emissões dos marcadores fluorescentes podem ser capturadas tanto na primeira imagem fluorescente 602, quanto na segunda imagem fluorescente 604.

Ciclo 2: Geração de modelo e Registro de Localização [0066] A geração de um modelo de localização pode ser necessária durante o segundo ciclo de sequenciamento, quando células de fluxo aleatórias são usadas, para determinar as localizações dos aglomerados de polinucleotídeos de filamento único. Após o primeiro ciclo de sequenciamento, as localizações do aglomerado 3 podem ser desconhecidas. O nucleotídeo incorporado no aglomerado 3 durante o

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30/44 segundo ciclo de sequenciamento pode ser um análogo de desoxicitidina trifosfato (dTTP) conjugado com o primeiro tipo de marcador fluorescente e não com o segundo tipo de marcador fluorescente. Uma primeira imagem fluorescente 612 pode capturar as emissões fluorescentes do primeiro tipo de marcador fluorescente no análogo de dTTP. Durante o segundo ciclo de sequenciamento, o gerador de modelo 218 pode determinar a partir da primeira imagem fluorescente 612 a existência do aglomerado 3 na localização particular do aglomerado 3. A geração de modelo, quando células de fluxo padronizadas são usadas, foi descrita no Pedido de Patente US 14/530.299, cujo teor é incorporado neste documento em sua totalidade.

Registro de Localização e Extração de Intensidade [0067] Referindo-se à FIG. 5, no bloco 525, as localizações do aglomerado no modelo de localização podem ser registradas para as imagens fluorescentes capturadas para o primeiro ciclo de sequenciamento e os ciclos de sequenciamento subsequentes. As intensidades fluorescentes dos aglomerados de polinucleotídeos primer em crescimento nas localizações registradas, por exemplo, as localizações 1, 2 e 4, podem ser extraídas no bloco 530. As intensidades extraídas podem ser corrigidas no 535, para gerar intensidades corrigidas. A correção de intensidades extraídas através, por exemplo, do corretor de intensidade 224 pode incluir um ou mais de normalização espacial no bloco 540, correção de cor no bloco 545, ou correção de faseamento no bloco 550.

Normalização Espacial, Correção de Cor e Correção de Faseamento [0068] A normalização espacial pode incluir a normalização das intensidades de emissões fluorescentes em diferentes imagens fluorescentes de um ciclo de sequenciamento, para gerar intensidades espacialmente normalizadas. Por exemplo, em cada ciclo de

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31/44 sequenciamento, os 5% e os 95% das intensidades da primeira imagem fluorescente e da segunda imagem fluorescente podem ser normalizados para zero e um. Se um ciclo de sequenciamento estiver dentro de uma leitura indexada, então, o 95° percentil do último ciclo de uma leitura não indexada pode ser usado para normalização. Normalização espacial pode reduzir a variação de intensidade dependente do ciclo.

[0069] As FIGS. 7A-D são gráficos esquemáticos apresentando correção de cor e correção de fase para sequenciamento com dois canais óticos, com fonte de luz única. A FIG. 7A é um gráfico de dispersão das intensidades extraídas ou das intensidades espacialmente normalizadas da primeira imagem fluorescente contra as intensidades extraídas das posições correspondentes na segunda imagem fluorescente nas posições (xí, y_z), quando não há cross-talk entre o primeiro marcador fluorescente e o segundo marcador fluorescente. x/ denota a intensidade espacialmente normalizada de um aglomerado i dos polinucleotideos primer em crescimento na segunda imagem fluorescente, y/ denota a intensidade espacialmente normalizada do aglomerado i dos polinucleotideos primer em crescimento na primeira imagem fluorescente. Porque um análogo de dGTP não inclui nem o primeiro marcador fluorescente, nem o segundo marcador fluorescente, ele não tem emissão fluorescente na primeira imagem fluorescente, nem na segunda imagem fluorescente. Assim, a população de análogos de dGTP está na posição (0, 0) do gráfico de dispersão. Porque um análogo de dTTP inclui o primeiro marcador fluorescente, ele tem emissões fluorescentes na primeira imagem fluorescente e não na segunda imagem fluorescente. Assim, a população de análogos de dTTP está na posição (0, 1) do gráfico de dispersão. Porque um análogo de dCTP inclui o segundo marcador fluorescente, ele tem emissões fluorescentes na segunda imagem fluorescente e não na primeira imagem fluorescente. Assim, a população de análogos de dCTP está na posição (1, 0) do gráfico de dispersão. Porque um análogo de dATP inclui o primeiro marcador fluorescente e o segundo marcador fluorescente, ele

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32/44 tem emissões fluorescentes na primeira imagem fluorescente e na segunda imagem fluorescente. A população de análogos de dATP está na posição (1, 1) do gráfico de dispersão, porque não há cross-talk entre o primeiro marcador fluorescente e o segundo marcador fluorescente. [0070] A FIG. 7B apresenta uma ilustração esquemática de um gráfico de dispersão, quando os dois marcadores fluorescentes têm espectros de emissão sobrejacentes e estão submetidos a cross-talk. Porque o primeiro marcador fluorescente e o segundo marcador fluorescente estão submetidos a cross-talk, os análogos de dTTP têm emissões mais fortes na primeira imagem fluorescente e emissões mais fracas na segunda imagem fluorescente. Assim, a nuvem que corresponde às emissões fluorescentes da população de análogos de dTTP está em uma posição em torno de (0, 1), por exemplo, (0,2, 0,8). Análogos de dCTP têm emissões mais fortes na segunda imagem fluorescente e emissões mais fracas na primeira imagem fluorescente. Assim, a nuvem que corresponde às emissões fluorescentes da população de análogos de dCTP está em uma posição em torno de (1, 0), por exemplo, (0,8, 0,2). A nuvem que corresponde às emissões fluorescentes da população de análogos de dATP está em uma posição em torno de (1, 1), por exemplo, (0,9, 0,9).

[0071] Para reduzir ou eliminar o cross-talk entre o primeiro marcador fluorescente e o segundo marcador fluorescente, as intensidades extraídas ou as intensidades espacialmente normalizadas podem ser corrigidas na cor em 545. A correção de cor pode utilizar uma matriz de cor para condicionar as intensidades extraídas, utilizando propriedades de distribuição subjacente de intensidades dentro de cada imagem fluorescente.

[0072] Uma matriz de cor de dois canais pode ser uma matriz 2x2, que seja usada para corrigir o cross-talk entre dois canais capturando, por exemplo, um primeiro canal e um segundo canal. O primeiro canal pode capturar as primeiras imagens fluorescentes e as segundas imagens fluorescentes nos ciclos de sequenciamento. Por exemplo,

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33/44 quando um aglomerado se ilumina no primeiro canal correspondente à primeira imagem fluorescente, algumas das emissões também são coletadas no segundo canal correspondente à segunda imagem fluorescente. A correção de cor pode incluir o uso da matriz de cor de dois canais para gerar intensidades corrigidas por matriz, que podem reduzir ou eliminar o cross-talk. A matriz de cor pode também equilibrar qualquer diferença na intensidade global entre os canais de cor. A matriz de cor, M

tem coeficientes de cross-talk Mj,k indicando a quantidade de intensidade observada no canal j capturando as emissões fluorescentes pelo marcador fluorescente k. Por exemplo, Μι,ι indica a quantidade de intensidade observada na primeira imagem fluorescente (isto é, canal um) capturando as emissões fluorescentes pelo primeiro marcador fluorescente (isto é, o marcador fluorescente um). Por exemplo, Mi,2 indica a quantidade de intensidade observada na primeira imagem fluorescente (isto é, canal um) capturando as emissões fluorescentes pelo segundo marcador fluorescente (isto é, marcador fluorescente dois), devido à sobreposição dos espectros de emissão entre o primeiro marcador fluorescente e o segundo marcador fluorescente.

[0073] A matriz de cor pode ser estimada com base nas intensidades do aglomerado coletadas durante um conjunto configurável de ciclos de sequenciamento iniciais, por exemplo, ciclos de sequenciamento 1-10. Esta matriz de cor pode ser usada para o restante dos ciclos de sequenciamento com normalização para intensidade relativa, que é dependente do ciclo.

[0074] A matriz de cor pode ser usada para estimar o cross-talk entre o par de canais, porque eles têm sobreposição de espectros de emissão. Em algumas realizações, a estimativa da matriz de cor pode

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34/44 incluir a conversão das intensidades plotadas nas posições (a/, canal 2, ã-i, canai i) em coordenadas polares, em que i denota o número do aglomerado, a/, canai 1 denota a intensidade do z° aglomerado no primeiro canal e um a/, canai 2 denota a intensidade do z° aglomerado no segundo canal. A estimativa da matriz de cor pode incluir computar um histograma com ponderação de raio de ângulos 0/ na extensão [0, 90] a partir das intensidades plotadas na posição (a/, canai 2, a.i, canai 1). Para um aglomerado i com uma intensidade de a/, canai 2 na segunda imagem fluorescente e uma intensidade de a/, canai 1 na primeira imagem fluorescente, a magnitude r/ pode ser baseada nas intensidades a/, canai 1 e ai, canai 2, por exemplo, (a_I; canai i ² + aI; canai 2 ²)^1/2. O ângulo θί pode ser tan-^aí, canai i / az, canai 2). A FIG. 7C apresenta uma ilustração esquemática de um histograma com ponderação de raio quando os dois marcadores fluorescentes têm sobreposição de espectros de emissão e estão submetidos a cross-talk. As intensidades nas posições (a/, canal 7, aí, canai 2) na FIG. 7B podem ser convertidas no histograma angular com ponderação de raio na FIG. 7C. Para sequenciamento com dois canais, com fonte de luz única, o histograma angular com ponderação de raio inclui três picos, correspondentes às nuvens de análogos de dTTP, análogos de dATP e análogos de dCTP, respectivamente, na FIG. 7B. O pico de centro correspondente às nuvens de análogos de dATP estão em um ângulo de aproximadamente 45°.

[0075] Estimar a matriz de cor pode incluir a identificação das duas máximas locais exteriores, θί e θ2, no histograma com ponderação de raio. Para canais que não têm cross-talk, θί é 0^o e θ2 é 90°. O coeficiente de cross-talk Mi,2 na matriz pode ser, por exemplo, tan(Oi). O coeficiente de cross-talk Ma,i na matriz pode ser, por exemplo, tan(90Θ2). Em algumas realizações, se um número insuficiente de aglomerados pode ser chamado com um dos quatro nucleotídeos, a estimativa de matriz de cor pode não ser ideal e a matriz de identidade pode ser usada ao invés disso. Os elementos diagonais da matriz podem ser 1 e a matriz de cor pode ser

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35/44 / ia \[tan(90 - β] ₂) 1 J [0076] A matriz de cor pode ser normalizada para ter um determinante de 1. Em algumas realizações, a matriz de cor de um ciclo de sequenciamento anterior pode ser usada para um ciclo de sequenciamento subsequente. As intensidades corrigidas podem ser calculadas através da multiplicação das intensidades plotadas na FIG. 7B pelo inverso da matriz de cor, para gerar intensidades corrigidas na cor. A FIG. 7D apresenta uma ilustração esquemática de um gráfico de dispersão das intensidades na FIG. 7B após a correção da cor. Com as intensidades corrigidas, os aglomerados individuais correspondentes a dGTP, dTTP, dCTP e dATP podem ser mais bem separados. Em algumas realizações, uma imagem fluorescente pode ser dividida em blocos e uma matriz de cor pode ser estimada para cada bloco. Em algumas realizações, uma matriz de cor pode ser estimada usando intensidades de um número de ciclos de sequenciamento. O tamanho e a forma das nuvens de emissões fluorescentes nas FIGS. 7B e 7D são apenas para ilustração. Por exemplo, a nuvem que corresponde à população de análogos de dATP após a correção de cor na FIG. 7D pode ser maior do que a nuvem que corresponde à população de análogos de dATP antes da correção de cor na FIG. 7B.

[0077] Referindo-se à FIG. 5, as intensidades com a cor corrigida podem ter a fase corrigida no bloco 550. Durante o processo de Sequenciamento por Síntese, cada primer ou primer estendido em um aglomerado de polinucleotídeos primer pode se estender em uma base por ciclo. Uma pequena proporção de filamentos pode ficar fora de fase com o ciclo de sequenciamento corrente, tanto ficando uma base atrás (faseamento) ou se adiantando em uma base (pré-faseamento). Para cada ciclo de sequenciamento, as correções de faseamento podem ser calculadas para maximizar a qualidade dos dados, por exemplo, determinando uma matriz de faseamento e aplicando a matriz de

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36/44 faseamento às intensidades extraídas.

Chamada de base [0078] No bloco 555, as bases de nucleotídeos incorporadas nos aglomerados dos primer-nucleotideos em crescimento podem ser determinadas, por exemplo, pelo chamador de base 226. Uma pontuação de qualidade pode ser determinada para cada base chamada. Referindo-se à FIG. 6, no primeiro ciclo de sequenciamento, porque o aglomerado 1 tem emissões fluorescentes tanto na primeira imagem fluorescente, quanto na segunda imagem fluorescente, o nucleotídeo incorporado é um análogo de dATP. Porque o aglomerado 2 tem emissões fluorescentes apenas na segunda imagem fluorescente, o nucleotídeo incorporado é um análogo de dCTP. Porque o aglomerado 4 tem emissões fluorescentes apenas na primeira imagem fluorescente, o nucleotídeo incorporado é um análogo de dTTP.

[0079] No segundo ciclo de sequenciamento, os nucleotídeos incorporados nos aglomerados 1-4 podem ser dGTP, dCTP, dTTP e dATP, respectivamente. Após a determinação da existência do aglomerado 3, o nucleotídeo incorporado no aglomerado 3 durante o primeiro ciclo de sequenciamento pode ser dGTP, que não tem emissão fluorescente na primeira imagem fluorescente, ou na segunda imagem fluorescente. Após o terceiro ciclo de sequenciamento, os aglomerados

1-4 podem ser determinados como tendo sequência de nucleotídeo de AGT, CCA, GTA e TAG, respectivamente.

[0080] Em algumas realizações, a chamada de base no bloco 555 pode ser baseada nas intensidades corrigidas a partir do bloco 535. A correspondência entre os nucleotídeos e as populações no gráfico de dispersão na FIG. 7D pode ser definida como se segue: se uma população está desligada no primeiro canal e desligada no segundo canal, o nucleotídeo incorporado é um análogo de dGTP; se uma população estiver desligada no segundo canal e ligada no primeiro

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37/44 canal, o nucleotídeo incorporado é um análogo de dTTP; se uma população estiver ligada no segundo canal e desligada no primeiro canal, o nucleotídeo incorporado é um análogo de dCTP; e, se uma população estiver ligada no primeiro canal e ligada no segundo canal, a chamada de base do nucleotídeo incorporado é um análogo de dATP.

[0081] A chamada de base pode incluir a normalização das intensidades corrigidas para (0, 1) pelos 5^o e 95° percentis. Quatro distribuições Gaussianas, uma para cada de dGTP, dTTP, dCTP e dATP, podem ser ajustadas aos dados de intensidades corrigidas e normalizadas por meio de um algoritmo de maximização de expectativa. O algoritmo de maximização de expectativa pode determinar quais meios e distribuições mais bem se ajustam aos dados. Após o cálculo das distribuições Gaussianas, para cada população, a probabilidade da população pertencer a cada Gaussiano pode ser calculada. A chamada de base pode ser baseada na maior probabilidade de a população pertencer a um Gaussiano particular. Para amostras de baixa diversidade, o algoritmo de maximização da expectativa pode ser usado para identificar matrizes de covariância, para evitar sobreajuste de dados. Alvos de subamostragem podem ser incriados para tirar maiores quantidades de amostras de dados por precisão.

[0082] Em algumas realizações, as populações podem ser filtradas através de uma métrica de pureza. Uma métrica de pureza pode ser, por exemplo, Dl / (Dl + D2). Dl pode ser a distância para o meio Gaussiano mais próximo e D2 pode ser a distância para a distância mais próxima seguinte. A distância pode ser medida usando, por exemplo, o método de Mahalanobis, que pode levar em consideração a largura da distribuição ao longo da linha definida por cada centroide Gaussiano e o ponto sob consideração.

[0083] No bloco 560, uma ou mais métricas de qualidade podem ser determinadas antes de o método terminar no bloco 565. As métricas de qualidade de sequenciamento podem fornecer informação importante sobre a precisão de cada etapa neste processo, incluindo a preparação

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38/44 de biblioteca, chamada de base, alinhamento de leitura e chamada de variante. A precisão da chamada de base, medida através da pontuação de qualidade de Phred (Pontuação Q), pode ser usada para avaliar a precisão de uma plataforma de sequenciamento. Ela pode indicar a probabilidade de uma dada base ser chamada incorretamente pelo sequenciador. A pontuação Q pode ser - 10 logio P, em que P é a probabilidade de erro da chamada de base.

Dimensionamento de Aglomerado [0084] Em algumas realizações, corrigir as intensidades pode incluir o dimensionamento de aglomerado. Os aglomerados podem ter brilhos variáveis. Por exemplo, alguns aglomerados podem ser brilhantes e alguns aglomerados podem ser escuros. O brilho do aglomerado pode ser causado pela distribuição do comprimento de fragmento da amostra. O brilho variável da população do aglomerado pode ter o efeito de alongar as populações “ligadas” no gráfico de dispersão da chamada de base. Pode ser vantajoso normalizar a intensidade de cada aglomerado pela sua intensidade média nos primeiros 10 ciclos, para reduzir a variação de intensidade da população. Por exemplo, nos primeiros dez ciclos, para cada chamada de base não-guanina(G), dois raios podem ser calculados: a distância da intensidade de população a partir da origem e a distância do meio Gaussiano correspondente a partir da origem. O dimensionamento de aglomerado pode incluir a normalização para a média do raio destes dois raios ponderados sobre, por exemplo, os primeiros 10 ciclos. Todas as intensidades de aglomerados podem ser normalizadas por este fator de dimensionamento, antes de a correção de fase e chamada de base serem realizadas. O dimensionamento de aglomerado pode vantajosamente aumentar taxas de transferência e de diminuição de erro, por exemplo, para amostras com distribuições de comprimento de fragmento grandes.

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Sequencíador com Múltiplos Canais Óticos, com Fonte de Luz Única [0085] São reveladas neste documento realizações de um sistema ou um método para determinar a sequência de nucleotídeo dos polinucleotídeos. Em uma realização, o sistema inclui, ou está em comunicação com, uma fonte de luz única, tal como um laser ou uma fonte de luz LED, configurada para gerar luz, tal como luz em um comprimento de onda predeterminado. O sistema pode incluir, ou estar em comunicação com, pelo menos um detector configurado para detectar quatro emissões fluorescentes substancialmente diferentes de fluoróforos diferentes ligados a nucleotídeos. O sistema pode fazer a fonte de luz gerar luz em um nucleotídeo. O nucleotídeo pode ser identificado como um primeiro tipo, quando uma primeira emissão fluorescente for detectada por pelo menos um detector. O nucleotídeo pode ser identificado como um segundo tipo, quando uma segunda emissão fluorescente for detectada por pelo menos um detector. O nucleotídeo pode ser identificado como um terceiro tipo, quando uma terceira emissão fluorescente for detectada por pelo menos um detector. O nucleotídeo pode ser identificado como um quarto tipo, quando uma quarta emissão fluorescente for detectada por pelo menos um detector. Pelo menos duas das primeira emissão fluorescente, segunda emissão fluorescente, terceira emissão fluorescente e quarta emissão fluorescente podem ter comprimentos de onda substancialmente diferentes.

[0086] Tipos diferentes de nucleotídeos podem ser ligados a fluoróforos diferentes ou a nenhum fluoróforo. Por exemplo, um nucleotídeo do primeiro tipo pode não ser ligado a um fluoróforo excitável pela fonte de luz única e a primeira emissão fluorescente compreende nenhuma emissão. Em outro exemplo, um nucleotídeo do primeiro tipo pode ser ligado a dois fluoróforos diferentes e a primeira emissão fluorescente compreende emissões dos dois fluoróforos diferentes.

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40/44 [0087] Em ainda outro exemplo, a primeira emissão fluorescente é de um primeiro fluoróforo ligado a um primeiro nucleotídeo do primeiro tipo, a segunda emissão fluorescente é de um segundo fluoróforo ligado a um segundo nucleotídeo do segundo tipo, a terceira emissão fluorescente é de um terceiro fluoróforo ligado a um terceiro nucleotídeo do terceiro tipo e a quarta emissão fluorescente é de um quarto fluoróforo ligado a um quarto nucleotídeo do quarto tipo. Os quatro fluoróforos podem ser excitados usando uma fonte de luz. Em uma implementação, todos os quatro dos primeiro fluoróforo, segundo fluoróforo, terceiro fluoróforo e quarto fluoróforo são diferentes. Por exemplo, a sequência de nucleotídeo pode ser determinada com base em emissões por quatro corantes em quatro comprimentos de onda diferentes. Em outra implementação, três dos primeiro fluoróforo, segundo fluoróforo, terceiro fluoróforo e quarto fluoróforo são diferentes. Por exemplo, a sequência de nucleotídeo pode ser determinada com base em emissões por três corantes em três comprimentos de onda diferentes. Em outra implementação, dois do primeiro fluoróforo, do segundo fluoróforo, do terceiro fluoróforo e do quarto fluoróforo são idênticos. Por exemplo, a sequência de nucleotídeo pode ser determinada com base em emissões por dois corantes em dois comprimentos de onda diferentes.

Métodos de Sequenciamento [0088] Os métodos descritos neste documento podem ser usados em conjunção com uma variedade de técnicas de sequenciamento de ácido nucleico. Técnicas particularmente aplicáveis são aquelas, em que os ácidos nucleicos são ligados em localizações fixas em um conjunto ordenado, tal que suas posições relativas não mudam e, em que o conjunto ordenado é repetidamente representado em imagem. Realizações em que as imagens são obtidas em canais de cor diferentes, por exemplo, coincidindo com marcadores diferentes usados para

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41/44 distinguir um tipo de base de nucleotídeo do outro são particularmente aplicáveis. Em algumas realizações, o processo para determinar a sequência de nucleotídeo de um ácido nucleico alvo pode ser um processo automatizado. Realizações preferidas incluem técnicas de sequenciamento por síntese (“SBS”).

[0089] “Técnicas de Sequenciamento por Síntese (“SBS”)” geralmente envolve a extensão enzimática de um filamento de ácido nucleico nascente através da adição iterativa de nucleotídeos contra um filamento modelo. Em métodos tradicionais de SBS, um monômero de nucleotídeo único pode ser fornecido a um nucleotídeo alvo na presença de uma polimerase em cada suprimento. Entretanto, nos métodos descritos neste documento, mais do que um tipo de monômero de nucleotídeo pode ser fornecido a um ácido nucleico alvo na presença de uma polimerase em um suprimento.

Terminologia [0090] Em pelo menos algumas das realizações anteriormente descritas, um ou mais elementos usados em uma realização pode ser usado de forma intercambiável em outra realização, a menos que tal substituição não seja tecnicamente possível. Será apreciado por aqueles versados na técnica, que várias outras omissões, adições e modificações podem ser feitas aos métodos e estruturas descritos acima, sem se distanciar do escopo da matéria reivindicada. Todas tais modificações e mudanças se destinam a estar dentro do escopo da matéria, como definido pelas reivindicações em apenso.

[0091] Com relação ao uso de substancialmente quaisquer termos no plural e/ou no singular neste documento, aqueles tendo conhecimento na técnica podem traduzir do plural para o singular e/ou do singular para o plural como apropriado ao contexto e/ou aplicação. As várias permutações singular/plural podem ser expressamente estabelecidas neste documento por uma questão de clareza.

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42/44 [0092] Será entendido por aqueles dentro da técnica, que, em geral, os termos usados neste documento, e, especialmente, nas realizações apensadas (por exemplo, corpos das reivindicações apensadas), são geralmente pretendidos como termos “abertos” (por exemplo, o termo “incluindo” deve ser interpretado como “incluindo, mas não limitado a”, o termo “tendo” deve ser interpretado como “tendo pelo menos”, o termo “inclui” deve ser interpretado como “inclui, mas não limitado a”, etc). Será ainda entendido por aqueles dentro da técnica, que, se um número específico de uma declaração de reivindicação introduzida for pretendido, tal pretensão será explicitamente declarada na reivindicação, e, na ausência de tal declaração, tal pretensão não está presente. Por exemplo, como um auxílio ao entendimento, as seguintes realizações em apenso podem conter o uso das frases introdutórias “pelo menos um” e “um ou mais” para introduzir declarações de reivindicação. Entretanto, o uso de tais frases não deve ser interpretado como implicando que a introdução de uma declaração de reivindicação pelos artigos indefinidos “um” ou “uma” limita qualquer reivindicação em particular contendo tal declaração de reivindicação introduzida a realizações contendo apenas uma tal declaração, mesmo quando a mesma reivindicação inclui as frases introdutórias “um ou mais” ou “pelo menos um” e artigos indefinidos tais como “um” ou “uma” (por exemplo, “um” e/ou “uma” deve ser interpretado como significando “pelo menos um” ou “um ou mais”); o mesmo vale para o uso de artigos definidos usados para introduzir declarações de reivindicação. Além disso, mesmo se um número específico de uma declaração de reivindicação introduzida for explicitamente enumerado, aqueles versados na técnica reconhecerão que tal enumeração deve ser interpretada como significando pelo menos o número enumerado (por exemplo, a simples declaração de “duas declarações”, sem outros modificadores, significa pelo menos duas declarações, ou duas ou mais declarações). Ademais, naqueles casos, em que uma convenção análoga a “pelo menos um de A, B e C, etc.” for

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43/44 usada, em geral, tal construção é pretendida no sentido de uma pessoa tendo conhecimento na técnica entendería a convenção (por exemplo, “um sistema tendo pelo menos um de A, B e C” incluiría, mas não seria limitado a sistemas que têm apenas A, apenas B, apenas C, A e B juntos, A e C juntos, B e C juntos, e/ou A, B e C juntos, etc.). Naqueles casos em que a convenção análoga a “pelo menos um de A, B, ou C, etc.” for usada, em geral, tal construção é pretendida no sentido de que uma pessoa tendo conhecimento na técnica, entendería a convenção (por exemplo, um sistema tendo pelo menos um de A, B, ou C” incluiría, mas não seria limitado a sistemas que têm apenas A, apenas B, apenas C, A e B juntos, A e C juntos, B e C juntos, e/ou A, B e C juntos, etc.). Será ainda entendido por aqueles dentro da técnica, que virtualmente qualquer palavra e/ou frase disjuntiva apresentando dois ou mais termos alternativos, seja na descrição, nas reivindicações, ou nos desenhos, deve ser entendida como para contemplar as possibilidades de incluir um dos termos, qualquer dos termos, ou ambos os termos. Por exemplo, a frase “A ou B” será entendida para incluir as possibilidades de “A” ou “B” ou “A e B”.

[0093] Além disso, onde características ou aspectos da revelação são descritos nos termos de grupos de Markush, aqueles versados na técnica reconhecerão que a revelação é também, desse modo, descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo de Markush.

[0094] Como será entendido por uma pessoa versada na técnica, para qualquer e todos os fins, tal como em termos de fornecimento de uma descrição escrita, todas as extensões reveladas neste documento também englobam qualquer e todas as possíveis subextensões e combinações de subextensões das mesmas. Qualquer extensão listada pode ser facilmente reconhecida como descrevendo e permitindo suficientemente a mesma extensão sendo quebrada em pelo menos metades, terços, quartos, quintos, décimos, etc. iguais. Como um exemplo não limitador, cada extensão discutida neste documento pode

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44/44 ser facilmente quebrada em um terço inferior, terço médio e terço superior, etc. Como também será entendido por uma pessoa versada na técnica, toda linguagem tal como “até”, “pelo menos”, “maior do que”, “menos do que” e semelhantes inclui o número enumerado e se refere a extensões que podem ser subsequentemente quebradas em subextensões, como discutido acima. Finalmente, como será entendido por uma pessoa versada na técnica, uma extensão inclui cada membro individual. Assim, por exemplo, um grupo tendo 1-3 artigos se refere a grupos tendo 1, 2 ou 3 artigos. De forma similar, um grupo tendo 1-5 artigos se refere a grupos tendo 1, 2, 3, 4 ou 5 artigos e assim sucessivamente.

[0095] Enquanto vários aspectos e realizações foram revelados neste documento, outros aspectos e realizações estarão aparentes para aqueles versados na técnica. Os vários aspectos e realizações revelados neste documento são para fins de ilustração e não se destinam a serem limitadores, com o verdadeiro escopo e espírito sendo indicados pelas reivindicações seguintes.

Claims (42)

1. Sistema Para Determinação da Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, caracterizado por que compreende:

uma fonte de luz única configurada para estimular a emissão de luz fluorescente;

pelo menos um detector configurado para detectar emissões fluorescentes de um fluoróforo ligado a um nucleotídeo, pelo menos um detector sendo configurado para detectar as emissões fluorescentes em um primeiro comprimento de onda e um segundo comprimento de onda;

um processador configurado para executar instruções que realizam um método compreendendo:

gerar luz da fonte de luz em um nucleotídeo;

identificar o nucleotídeo como um primeiro tipo, quando nenhuma emissão fluorescente for detectada por pelo menos um detector;

identificar o nucleotídeo como um segundo tipo, quando uma emissão fluorescente no primeiro comprimento de onda de luz for detectado por pelo menos um detector;

identificar o nucleotídeo como um terceiro tipo, quando uma emissão fluorescente no segundo comprimento de onda for detectado por pelo menos um detector; e identificar o nucleotídeo como um quarto tipo, quando emissões fluorescentes no primeiro comprimento de onda e no segundo comprimento de onda de luz forem detectadas por pelo menos um detector.

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2. Sistema Para Determinação da Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o processo é ainda configurado para determinar a intensidade de uma ou mais das emissões fluorescentes.

3. Sistema Para Determinação da Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 2, caracterizado por que o processador é ainda configurado para determinar a intensidade de uma ou mais emissões fluorescentes através de correção de cor da intensidade.

4. Sistema Para Determinação da Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 3, caracterizado por que a correção de cor da intensidade compreende a estimativa de uma matriz de cor.

5. Sistema Para Determinação da Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 4, caracterizado por que a estimativa da matriz de cor compreende:

gerar um histograma angular com ponderação de raio a partir de um gráfico de dispersão de intensidades observadas em dois canais; e estimar ângulos de duas máximas locais exteriores e no histograma angular com ponderação de raio ia em que a matriz de cor é

6. Sistema Para Determinação da Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o sistema compreende um estágio de montagem para uma célula de fluxo tendo pelo menos um canal de fluidos.

7. Sistema Para Determinação da Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado

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3/10 por que a fonte de luz é um laser e em que o comprimento de onda de luz predeterminado gerado pelo laser está entre 400 nm e 800 nm.

8. Sistema Para Determinação da Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a fonte de luz é um diodo emissor de luz e, em que o comprimento de onda de luz predeterminado gerado pelo diodo emissor de luz está entre 400 nm e 800 nm.

9. Sistema Para Determinação da Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que pelo menos um detector é configurado para detectar pelo menos dois comprimentos de onda de luz do mesmo marcador fluorescente.

10. Sistema Para Determinação da Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o primeiro comprimento de onda e o segundo comprimento de onda estão pelo menos 10 nm de distância um do outro.

11. Sistema Para Determinação da Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o primeiro comprimento de onda e o segundo comprimento de onda estão no máximo 100 nm de distância um do outro.

12. Sistema Para Determinação da Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o processador é ainda configurado para identificar cross-talk entre o primeiro comprimento de onda e o segundo comprimento de onda nas emissões fluorescentes.

13. Método Implementado por Computador Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, caracterizado por que compreende:

gerar emissões de luz fluorescentes usando uma fonte de luz em um fluoróforo ligado a um nucleotídeo;

detectar as emissões de luz fluorescentes do fluoróforo

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4/10 ligado ao nucleotídeo em um primeiro comprimento de onda e um segundo comprimento de onda usando pelo menos um detector; e identificar o nucleotídeo, compreendendo identificar o nucleotídeo como um primeiro tipo, quando nenhuma emissão fluorescente for detectada por pelo menos um detector;

identificar o nucleotídeo como um segundo tipo, quando uma emissão fluorescente no primeiro comprimento de onda de luz for detectado por pelo menos um detector;

identificar o nucleotídeo como um terceiro tipo, quando uma emissão fluorescente no segundo comprimento de onda de luz for detectado por pelo menos um detector; e identificar o nucleotídeo como um quarto tipo, quando emissões fluorescentes no primeiro comprimento de onda e o segundo comprimento de onda de luz forem detectados por pelo menos um detector.

14. Método Implementado por Computador Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 13, caracterizado por que detectar as emissões fluorescentes compreende a correção de cor das emissões fluorescentes.

15. Método Implementado por Computador Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 13, caracterizado por que a fonte de luz é um laser e em que o comprimento de onda de luz predeterminado gerado pelo laser está entre 450 nm e 490 nm.

16. Método Implementado por Computador Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 13, caracterizado por que a fonte de luz é um diodo

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5/10 emissor de luz e em que o comprimento de onda de luz predeterminado gerado pelo diodo emissor de luz está entre 450 nm e 490 nm.

17. Método Implementado por Computador Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 13, caracterizado por que o primeiro comprimento de onda e o segundo comprimento de onda estão pelo menos 20 nm de distância um do outro.

18. Método Implementado por Computador Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 13, caracterizado por que o primeiro comprimento de onda e o segundo comprimento de onda estão pelo menos 200 nm de distância um do outro.

19. Método Implementado por Computador Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 13, caracterizado por que detectar as emissões fluorescentes compreende receber uma primeira imagem fluorescente e uma segunda imagem fluorescente e, em que a primeira imagem fluorescente é gerada por um primeiro marcador fluorescente e, em que a segunda imagem fluorescente é gerada por um segundo marcador fluorescente.

20. Método Implementado por Computador Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 19, caracterizado por que o primeiro marcador fluorescente compreende Alexa 488, 3,6-Bis(etilamino)-2,7-dimetil-[2carboxilato-5-(3-carboxipropilóxi)fenil]xantílio betaína (corante 1-3) e 3,6-Bis(etilamino)-2,7-dimetil-[2-carboxilato-4-(3-carboxipropilóxi)fenil]xantílio betaína (corante 1-4) e em que o segundo marcador fluorescente compreende o corante NR520LS.

21. Método Implementado por Computador Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 19, caracterizado por que o primeiro marcador fluorescente compreende um corante Cy3 e em que o segundo marcador

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6/10 fluorescente compreende um par de corante Cy3-Cy5.

22. Método Implementado por Computador Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 19, compreendendo ainda:

extração das intensidades a partir das imagens fluorescentes para gerar intensidades extraídas; e correção das intensidades extraídas para gerar intensidades corrigidas, caracterizado por que a correção das intensidades extraídas compreende a correção da cor das intensidades extraídas e em que a identificação do nucleotídeo compreende a identificação do nucleotídeo com base nas intensidades corrigidas.

23. Método Implementado por Computador Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 22, caracterizado por que compreende ainda, antes da extração as intensidades das imagens fluorescentes:

gerar um modelo de local; e registrar localizações no modelo de localização para as imagens fluorescentes.

24. Método Implementado por Computador Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 23, caracterizado por que a correção das intensidades extraídas compreende ainda:

normalizar espacialmente as intensidades extraídas; e correção de fase das intensidades extraídas.

25. Método Implementado por Computador Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a

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Reivindicação 24, caracterizado por que a correção de fase das intensidades extraídas compreende:

determinar uma matriz de faseamento; e aplicar a matriz de faseamento às intensidades extraídas;

26. Método Implementado por Computador Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotideos, de acordo com a Reivindicação 23, caracterizado por que a geração do modelo de localização compreende detectar cross-talk entre o primeiro marcador fluorescente e o segundo marcador fluorescente nas imagens fluorescentes.

27. Método Implementado por Computador Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotideos, de acordo com a Reivindicação 19, caracterizado por que o primeiro marcador fluorescente e o segundo marcador fluorescente estão submetidos a cross-talk.

28. Método Implementado por Computador Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotideos, de acordo com a Reivindicação 19, caracterizado por que o primeiro tipo de nucleotídeo não é conjugado com o primeiro marcador fluorescente ou com o segundo marcador fluorescente, o segundo tipo de nucleotídeo é conjugado com o primeiro marcador fluorescente, o terceiro tipo de nucleotídeo é conjugado com o segundo marcador fluorescente e o quarto tipo de nucleotídeo não é conjugado com o primeiro marcador fluorescente, nem com o segundo marcador fluorescente.

29. Método Implementado por Computador Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotideos, de acordo com a Reivindicação 13, caracterizado por que o primeiro tipo de nucleotídeo é um análogo de dGTP, o segundo tipo de nucleotídeo é um análogo de dTTP, o terceiro tipo de nucleotídeo é um análogo de dCTP e o quarto tipo de nucleotídeo trifosfato é um análogo de dATP.

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30. Sistema Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, caracterizado por que compreende:

uma fonte de luz única configurada para estimular a geração de luz fluorescente;

pelo menos um detector configurado para detectar quatro emissões fluorescentes substancialmente diferentes de fluoróforos diferentes ligados a nucleotídeos;

um processador configurado para executar instruções que realizam um método compreendendo:

gerar luz de uma fonte de luz em um nucleotídeo;

identificar o nucleotídeo como um primeiro tipo, quando uma primeira emissão fluorescente for detectada por pelo menos um detector;

identificar o nucleotídeo como um segundo tipo, quando uma segunda emissão fluorescente for detectada por pelo menos um detector;

identificar o nucleotídeo como um terceiro tipo, quando uma terceira emissão fluorescente for detectada por pelo menos um detector; e identificar o nucleotídeo como um quarto tipo, quando uma quarta emissão fluorescente for detectada por pelo menos um detector,

31. Sistema Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 30, caracterizado por que a primeira emissão fluorescente, a segunda emissão fluorescente, a terceira emissão fluorescente e as quartas emissões

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9/10 fluorescentes têm comprimentos de onda substancialmente diferentes.

32. Sistema Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 30, caracterizado por que o processador é ainda configurado para determinar a intensidade de um ou mais das emissões fluorescentes.

33. Sistema Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 32, caracterizado por que o processador é ainda configurado para determinar a intensidade de uma ou mais das emissões fluorescentes através da correção de cor da intensidade.

34. Sistema Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 33, caracterizado por que a correção de cor da intensidade compreende estimar uma matriz de cor.

35. Sistema Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 30, caracterizado por que a fonte de luz é um laser e em que o comprimento de onda de luz predeterminado gerado pelo laser está entre 400 nm e 800 nm.

36. Sistema Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 30, caracterizado por que a fonte de luz é um diodo emissor de luz e em que o comprimento de onda de luz predeterminado gerado pelo diodo emissor de luz está entre 400 nm e 800 nm.

37. Sistema Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 30, caracterizado por que um nucleotídeo do primeiro tipo não é ligado a um fluoróforo excitável pela fonte de luz única, e, em que a primeira emissão fluorescente compreende nenhuma emissão.

38. Sistema Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 30, caracterizado por que um nucleotídeo do primeiro tipo é ligado a dois fluoróforos diferentes, e, em que a primeira emissão fluorescente compreende

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10/10 emissões dos dois fluoróforos diferentes.

39. Sistema Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 30, caracterizado por que a primeira emissão fluorescente é de um primeiro fluoróforo ligado a um primeiro nucleotídeo do primeiro tipo, em que a segunda emissão fluorescente é de um segundo fluoróforo ligado a um segundo nucleotídeo do segundo tipo, em que a terceira emissão fluorescente é de um terceiro fluoróforo ligado a um terceiro nucleotídeo do terceiro tipo e em que a quarta emissão fluorescente é de um quarto fluoróforo ligado a um quarto nucleotídeo do quarto tipo.

40. Sistema Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 39, caracterizado por que todos os quatro dos primeiro fluoróforo, segundo fluoróforo, terceiro fluoróforo e quarto fluoróforo são diferentes.

41. Sistema Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 39, caracterizado por que três dos primeiro fluoróforo, segundo fluoróforo, terceiro fluoróforo e quarto fluoróforo são diferentes.

42. Sistema Para Determinar Sequência de Nucleotídeo de Polinucleotídeos, de acordo com a Reivindicação 39, caracterizado por que dois dos primeiro fluoróforo, segundo fluoróforo, terceiro fluoróforo e quarto fluoróforo são idênticos.