JP2024028778A

JP2024028778A - 単一の光源、２光学チャネル配列決定

Info

Publication number: JP2024028778A
Application number: JP2023200836A
Authority: JP
Inventors: ラングロイスロバート; ビエセリジョン; リウシャオハイ
Original assignee: イルミナインコーポレイテッド; イルミナケンブリッジリミテッド
Priority date: 2017-03-07
Filing date: 2023-11-28
Publication date: 2024-03-05
Also published as: KR20190103267A; AU2021269291A1; KR102246285B1; BR112019014683A2; NZ754255A; JP2020507758A; CA3046015A1; MX2019008347A; EP3592865A1; WO2018165099A1; ZA202106656B; AU2018231017B2; RU2736384C1; IL267051A; KR102373741B1; KR20210047980A; JP2022088444A; US20200080142A1; AU2018231017A1; JP7041684B2

Abstract

【課題】ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するためのシステムを提供する。【解決手段】一態様において、本発明のシステムは、蛍光の発生を刺激するように構成された単一の光源；ヌクレオチドに付着された異なる発蛍光団からの異なる４つの蛍光発光を検出するように構成された少なくとも１つの検出器；プロセッサであって、該光源からヌクレオチド上に光を発生させる工程；第１、第２、第３および第４の蛍光発光がそれぞれ該少なくとも１つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドをそれぞれ第１、第２、第３および第４のタイプとして識別すること、を包含する方法を行う命令を実行するように構成されたプロセッサを含み、該第１の蛍光発光、該第２の蛍光発光、該第３の蛍光発光および該第４の蛍光発光の検出が、４つの異なる波長に基づいて決定される。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、２０１７年３月７日に出願された米国仮出願第６２／４６８２４２号に対する優先権を主張する。この関連出願の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。

背景
分野
本開示は一般に、ＤＮＡ配列決定の分野に関し、より詳細には、単一の光源および少なくとも２種の色素（例えば、２種の蛍光標識）を利用するＤＮＡ配列決定のためのシステムおよび方法に関する。

関連分野の説明
既存のＤＮＡ配列決定システムおよび方法は、２つまたはこれより多くの光源を利用して、蛍光標識と結合体化したデオキシリボ核酸アナログを励起する。しかし、実施中は、光源の電力消費は高く、散逸させる必要のある相当な量の熱を発生させ得る。１つの光源によって効率的に励起され得る蛍光標識は、クロストークを受けやすい可能性があり、それによって各標識は、他の標識と重なり合う波長の光を発する。補正されない場合、このクロストークは、ＤＮＡ配列決定システムが、配列決定実行の間に正確なヌクレオチド塩基を適切に呼び出す（ｃａｌｌ）ことを困難にし得る。

要旨
本明細書に開示されるのは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するためのシステムおよび方法である。一例では、システムは、所定の波長の光などの光を発生させるように構成された、レーザーまたは発光ダイオードなどの単一の光源；ヌクレオチドに付着された発蛍光団からの蛍光発光を検出するように構成された少なくとも１つの検出器であって、該少なくとも１つの検出器は、第１の波長および第２の波長にある該蛍光発光を検出するように構成される、少なくとも１つの検出器；プロセッサであって、以下の工程：該光源からヌクレオチド上に光を発生させる工程；蛍光発光が該少なくとも１つの検出器によって検出されない場合に、該ヌクレオチドを第１のタイプとして識別すること；光の該第１の波長にある蛍光発光が該少なくとも１つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第２のタイプとして識別すること；光の該第２の波長にある蛍光発光が該少なくとも１つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第３のタイプとして識別すること；および光の該第１の波長および該第２の波長にある蛍光発光が該少なくとも１つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第４のタイプとして識別すること、を包含する方法を行う命令を実行するように構成されたプロセッサを含む。

別の例は、コンピューター実行方法であり、該方法は、光源を使用してヌクレオチドに付着された発蛍光団上に光を発生させる工程；少なくとも１つの検出器を使用して、第１の波長および第２の波長にある該ヌクレオチドに付着された発蛍光団からの蛍光発光を検出する工程；ならびに該ヌクレオチドを識別する工程であって、該工程は、蛍光発光が該少なくとも１つの検出器によって検出されない場合に、該ヌクレオチドを第１のタイプとして識別すること；光の該第１の波長にある蛍光発光が該少なくとも１つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第２のタイプとして識別すること；光の該第２の波長にある蛍光発光が該少なくとも１つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第３のタイプとして識別すること；および光の該第１の波長および該第２の波長にある蛍光発光が該少なくとも１つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第４のタイプとして識別すること、を包含する工程、を包含する。

別の例では、システムは、光を発生させるように構成された単一の光源；ヌクレオチドに付着された異なる発蛍光団からの実質的に異なる４つの蛍光発光を検出するように構成された少なくとも１つの検出器；プロセッサであって、以下の工程：該光源からヌクレオチド上に光を発生させる工程；第１の蛍光発光が該少なくとも１つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第１のタイプとして識別すること；第２の蛍光発光が該少なくとも１つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第２のタイプとして識別すること；第３の蛍光発光が該少なくとも１つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第３のタイプとして識別すること；および第４の蛍光発光が該少なくとも１つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第４のタイプとして識別すること、を包含する方法を行う命令を実行するように構成されたプロセッサ、を含み、ここで、前記第１の蛍光発光、前記第２の蛍光発光、前記第３の蛍光発光、および前記第４の蛍光発光は、実質的に異なる波長を有する。
特定の態様では例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するためのシステムであって、該システムは、
蛍光の発光を刺激するように構成された単一の光源；
ヌクレオチドに付着された発蛍光団からの蛍光発光を検出するように構成された少なくとも１つの検出器であって、該少なくとも１つの検出器は、第１の波長および第２の波長にある該蛍光発光を検出するように構成される、少なくとも１つの検出器；
プロセッサであって、以下の工程：
該光源からヌクレオチド上に光を発生させる工程；
蛍光発光が該少なくとも１つの検出器によって検出されない場合に、該ヌクレオチドを第１のタイプとして識別すること；
光の該第１の波長にある蛍光発光が該少なくとも１つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第２のタイプとして識別すること；
光の該第２の波長にある蛍光発光が該少なくとも１つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第３のタイプとして識別すること；および
光の該第１の波長および該第２の波長にある蛍光発光が該少なくとも１つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第４のタイプとして識別すること、
を包含する方法を行う命令を実行するように構成されたプロセッサ、
を含むシステム。
（項目２）
前記プロセッサは、１またはこれより多くの前記蛍光発光の強度を決定するようにさらに構成される、項目１に記載のシステム。
（項目３）
前記プロセッサは、１またはこれより多くの前記蛍光発光の強度を、該強度を色補正する工程によって決定するようにさらに構成される、項目２に記載のシステム。
（項目４）
前記強度を色補正する工程は、カラーマトリクスを推測することを包含する、項目３に記載のシステム。
（項目５）
前記カラーマトリクスを推測する工程は、
２つのチャネルにおいて観察された強度の散布図から区域重み付け角度ヒストグラムを生成すること；および
該区域重み付け角度ヒストグラムにおける２つの外側極大値θ_１およびθ_２の角度を推測することであって、ここで該カラーマトリクスは、
である工程、
を包含する、項目４に記載のシステム。
（項目６）
前記システムは、少なくとも１つの流体チャネルを有するフローセルのための取り付けステージを含む、項目１に記載のシステム。
（項目７）
前記光源はレーザーであり、該レーザーによって発生した光の所定の波長は、４００ｎｍ～８００ｎｍの間である、項目１に記載のシステム。
（項目８）
前記光源は、発光ダイオードであり、該発光ダイオードによって発生した光の所定の波長は、４００ｎｍ～８００ｎｍの間である、項目１に記載のシステム。
（項目９）
前記少なくとも１つの検出器は、同じ蛍光標識からの光の少なくとも２つの波長を検出するように構成される、項目１に記載のシステム。
（項目１０）
前記第１の波長および前記第２の波長は、互いから少なくとも１０ｎｍ離れている、項目１に記載のシステム。
（項目１１）
前記第１の波長および前記第２の波長は、互いから大きくても１００ｎｍ離れている、項目１に記載のシステム。
（項目１２）
前記プロセッサは、前記蛍光発光における前記第１の波長と前記第２の波長との間のクロストークを識別するようにさらに構成される、項目１に記載のシステム。
（項目１３）
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するためのコンピューター実行方法であって、該方法は、
光源を使用してヌクレオチドに付着された発蛍光団上に蛍光発光を発生させる工程；
少なくとも１つの検出器を使用して、第１の波長および第２の波長にある該ヌクレオチドに付着された発蛍光団からの該蛍光発光を検出する工程；ならびに
該ヌクレオチドを識別する工程であって、該工程は、
蛍光発光が該少なくとも１つの検出器によって検出されない場合に、該ヌクレオチドを第１のタイプとして識別すること；
光の該第１の波長にある蛍光発光が該少なくとも１つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第２のタイプとして識別すること；
光の該第２の波長にある蛍光発光が該少なくとも１つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第３のタイプとして識別すること；および
光の該第１の波長および該第２の波長にある蛍光発光が該少なくとも１つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第４のタイプとして識別すること、
を包含する工程、
を包含する方法。
（項目１４）
蛍光発光を検出する工程は、該蛍光発光を色補正することを包含する、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記光源はレーザーであり、該レーザーによって発生した光の所定の波長は、４５０ｎｍ～４９０ｎｍの間である、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記光源は、発光ダイオードであり、該発光ダイオードによって発生した光の所定の波長は、４５０ｎｍ～４９０ｎｍの間である、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記第１の波長および前記第２の波長は、互いから少なくとも２０ｎｍ離れている、項目１３に記載の方法。
（項目１８）
前記第１の波長および前記第２の波長は、互いから大きくても２００ｎｍ離れている、項目１３に記載の方法。
（項目１９）
蛍光発光を検出する工程は、第１の蛍光画像および第２の蛍光画像を受け取ることを包含し、該第１の蛍光画像は、第１の蛍光標識によって生成され、該第２の蛍光画像は、第２の蛍光標識によって生成される、項目１３に記載の方法。
（項目２０）
前記第１の蛍光標識は、Ａｌｅｘａ４８８、３，６－ビス（エチルアミン）－２，７－ジメチル－［２－カルボキシラト－５－（３－カルボキシプロピルオキシ）フェニル］キンサンチリウムベタイン（色素Ｉ－３）、または３，６－ビス（エチルアミン）－２，７－ジメチル－［２－カルボキシラト－４－（３－カルボキシプロピルオキシ）フェニル］キンサンチリウムベタイン（色素Ｉ－４）を含み、前記第２の蛍光標識は、色素ＮＲ５２０ＬＳを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記第１の蛍光標識はＣｙ３色素を含み、前記第２の蛍光標識はＣｙ３－Ｃｙ５色素ペアを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記蛍光画像から強度を抽出して、抽出した強度を生成する工程；および
該抽出した強度を補正して、補正した強度を生成する工程、
をさらに包含し、ここで該抽出した強度を補正する工程は、該抽出した強度を色補正する工程を包含し、前記ヌクレオチドを識別する工程は、該補正した強度に基づいて該ヌクレオチドを識別する工程を包含する、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記蛍光画像から強度を抽出する工程の前に：
位置テンプレートを生成する工程；および
該位置テンプレートにおける位置を該蛍光画像に記録する工程、
をさらに包含する、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記抽出した強度を補正する工程は、
該抽出した強度を空間的に正規化すること；および
該抽出した強度を位相補正すること、
をさらに包含する、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記抽出した強度を位相補正する工程は、
位相同期マトリクスを決定すること；および
該位相同期マトリクスを該抽出した強度に適用すること；
を包含する、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記位置テンプレートを生成する工程は、前記蛍光画像における前記第１の蛍光標識と前記第２の蛍光標識との間のクロストークを検出することを包含する、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
前記第１の蛍光標識および前記第２の蛍光標識は、クロストークを受けやすい、項目１９に記載の方法。
（項目２８）
前記第１のタイプのヌクレオチドは、前記第１の蛍光標識または前記第２の蛍光標識に結合体化されず、前記第２のタイプのヌクレオチドは、該第１の蛍光標識に結合体化され、前記第３のタイプのヌクレオチドは、該第２の蛍光標識に結合体化され、前記第４のタイプのヌクレオチドは、該第１の蛍光標識および該第２の蛍光標識に結合体化されない、項目１９に記載の方法。
（項目２９）
前記第１のタイプのヌクレオチドは、ｄＧＴＰのアナログであり、前記第２のタイプのヌクレオチドは、ｄＴＴＰのアナログであり、前記第３のタイプのヌクレオチドは、ｄＣＴＰのアナログであり、前記第４のタイプのヌクレオチド三リン酸は、ｄＡＴＰのアナログである、項目１３に記載の方法。
（項目３０）
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するためのシステムであって、該システムは、
蛍光の発生を刺激するように構成された単一の光源；
ヌクレオチドに付着された異なる発蛍光団からの実質的に異なる４つの蛍光発光を検出するように構成された少なくとも１つの検出器；
プロセッサであって、以下の工程：
該光源からヌクレオチド上に光を発生させる工程；
第１の蛍光発光が該少なくとも１つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第１のタイプとして識別すること；
第２の蛍光発光が該少なくとも１つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第２のタイプとして識別すること；
第３の蛍光発光が該少なくとも１つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第３のタイプとして識別すること；および
第４の蛍光発光が該少なくとも１つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第４のタイプとして識別すること、
を包含する方法を行う命令を実行するように構成されたプロセッサ、
を含むシステム。
（項目３１）
前記第１の蛍光発光、前記第２の蛍光発光、前記第３の蛍光発光、および前記第４の蛍光発光は、実質的に異なる波長を有する、項目３０に記載のシステム。
（項目３２）
前記プロセッサは、１またはこれより多くの前記蛍光発光の強度を決定するようにさらに構成される、項目３０に記載のシステム。
（項目３３）
前記プロセッサは、１またはこれより多くの前記蛍光発光の強度を、該強度を色補正する工程によって決定するようにさらに構成される、項目３２に記載のシステム。
（項目３４）
前記強度を色補正する工程は、カラーマトリクスを推測する工程を包含する、項目３３に記載のシステム。
（項目３５）
前記光源はレーザーであり、該レーザーによって発生した光の所定の波長は、４００ｎｍ～８００ｎｍの間である、項目３０に記載のシステム。
（項目３６）
前記光源は、発光ダイオードであり、該発光ダイオードによって発生した光の所定の波長は、４００ｎｍ～８００ｎｍの間である、項目３０に記載のシステム。
（項目３７）
前記第１のタイプのヌクレオチドは、前記単一の光源によって励起可能な発蛍光団に付着されず、前記第１の蛍光発光は、発光なしを含む、項目３０に記載のシステム。
（項目３８）
前記第１のタイプのヌクレオチドは、２種の異なる発蛍光団に付着され、前記第１の蛍光発光は、該２種の異なる発蛍光団からの発光を含む、項目３０に記載のシステム。
（項目３９）
前記第１の蛍光発光は、前記第１のタイプの第１のヌクレオチドに付着された第１の発蛍光団に由来し、前記第２の蛍光発光は、前記第２のタイプの第２のヌクレオチドに付着された第２の発蛍光団に由来し、前記第３の蛍光発光は、前記第３のタイプの第３のヌクレオチドに付着された第３の発蛍光団に由来し、前記第４の蛍光発光は、前記第４のタイプの第４のヌクレオチドに付着された第４の発蛍光団に由来する、項目３０に記載のシステム。
（項目４０）
前記第１の発蛍光団、前記第２の発蛍光団、前記第３の発蛍光団、および前記第４の発蛍光団の全４種は異なる、項目３９に記載のシステム。
（項目４１）
前記第１の発蛍光団、前記第２の発蛍光団、前記第３の発蛍光団、および前記第４の発蛍光団のうちの３種は異なる、項目３９に記載のシステム。
（項目４２）
前記第１の発蛍光団、前記第２の発蛍光団、前記第３の発蛍光団、および前記第４の発蛍光団のうちの２種は同一である、項目３９に記載のシステム。

図１は、例示的な単一の光源・２光学チャネル配列決定機を示す模式図である。

図２は、単一の光源・２光学チャネル配列決定を実行するための例示的なコンピューターシステムの機能的ブロック図を示す。

図３は、単一の光源・２光学チャネル配列決定を利用する、合成しながら配列決定を行うための例示的方法のフローチャートである。

図４は、単一の光源・２光学チャネル配列決定の塩基呼び出しを行うための例示的方法のフローチャートである。

図５は、単一の光源・２光学チャネル配列決定を行うための例示的方法のフローチャートである。

図６は、単一の光源・２光学チャネル配列決定を使用する核酸クラスターおよびそれらの配列決定の概説を示す。

図７Ａ～Ｄは、単一の光源・２光学チャネル配列決定のための色補正および位相補正を示す模式的プロットである。

詳細な説明
以下の詳細な説明において、添付の図面に対して参照が行われる。添付の図面は、本明細書の一部を形成する。図面において、類似記号は、状況が別段規定しなければ、代表的には類似の構成要素を識別する。詳細な説明、図面、および特許請求の範囲において記載される例証的実施形態は、限定することを意味しない。他の実施形態が利用され得、本明細書に示される主題の趣旨または範囲から逸脱することなく他の変更が行われ得る。本開示の局面が、本明細書で一般的に記載されかつ図面の中で図示されるように、広く種々の異なる構成で取り合わせられ得、置き換えられ得、組み合わされ得、分離され得、そして設計され得、これらの全てが、本明細書中で明示的に企図されることは、容易に理解される。

本発明の実施形態は、単一の光源およびわずか２つの異なる光学チャネルを使用して全４種のヌクレオチド塩基を識別し得る次世代ヌクレオチド配列決定システムに関する。その配列決定システムは、合成しながら配列決定するプロセスを利用し得る。各配列決定サイクルの間に、４タイプのヌクレオチドアナログが、配列決定されているポリヌクレオチドにハイブリダイズした成長中のプライマー上に組み込まれ得る。いくつかの実施形態において、その４タイプのヌクレオチドアナログは、いかなる蛍光色素ともに結合体化していないデオキシグアノシン三リン酸三リン酸（ｄＧＴＰ）アナログ、第１の蛍光色素と結合体化したデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）アナログ、第２の蛍光色素と結合体化したデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）アナログ、およびその両方の蛍光色素と結合体化したデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）アナログ（または２種のｄＡＴＰアナログ（一方はその第１の蛍光色素を有するｄＡＴＰおよびもう一方はその第２の蛍光色素を有するｄＡＴＰアナログ）の混合物）を含み得る。その４タイプのヌクレオチドアナログに結合体化したその蛍光色素は、例示に過ぎず、限定ではないことが意図される。例えば、そのｄＴＴＰアナログは、いかなる蛍光色素とも結合体化しなくてもよく、そのｄＣＴＰアナログは、第１の蛍光色素と結合体化されてもよく、そのｄＡＴＰアナログは、第２の蛍光色素と結合体化されてもよく、そのｄＧＴＰアナログは、その蛍光色素の両方（または２つのｄＧＴＰアナログ（一方は、第１の蛍光色素を有するｄＧＴＰアナログおよびもう一方は第２の蛍光色素を有するｄＧＴＰアナログ）の混合物）と結合体化されてもよい。別の例として、そのｄＣＴＰアナログは、いかなる蛍光色素と結合体化していなくてもよく、そのｄＡＴＰアナログは、第１の蛍光色素と結合体化していてもよく、そのｄＴＴＰアナログは、第２の蛍光色素と結合体化していてもよく、そのｄＧＴＰアナログは、その蛍光色素の両方（または２つのｄＧＴＰアナログ（一方は第１の蛍光色素を有するｄＧＴＰアナログおよびもう一方は第２の蛍光色素を有するｄＧＴＰアナログ）の混合物）と結合体化されていてもよい。さらに別の例として、そのいかなる蛍光色素とも結合体化していないヌクレオチドアナログは、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、またはｄＡＴＰであり得る。その第１の蛍光色素またはその第２の蛍光色素と結合体化したヌクレオチドアナログは、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、またはｄＡＴＰであり得る。２種の蛍光色素と結合体化したそのヌクレオチドアナログは、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、またはｄＡＴＰであり得る。そのｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、またはｄＡＴＰアナログは、２つのアナログ（一方は第１の蛍光色素を有するアナログおよびもう一方は第２の蛍光色素を有するアナログ）の混合物を含み得る。

その光源（例えば、レーザーまたは発光ダイオード）は、その２種の蛍光色素を励起し得る。その第１の蛍光色素は、第１の波長で蛍光を発し、第１の蛍光画像において捕捉され得る。その第２の蛍光色素は、第２の波長で蛍光を発し、第２の蛍光画像において捕捉され得る。その捕捉された蛍光発光の強度は、その２つの蛍光画像から抽出される。いくつかの実施形態において、その２種の蛍光色素は、クロストークを受けやすくてもよく、そのｄＴＴＰアナログおよびそのｄＣＴＰアナログの蛍光発光は、その蛍光画像の両方において捕捉され得る。従って、その抽出した強度は、例えば、色補正によって補正される必要がある。いくつかの実施形態において、その２種の蛍光色素は、大きなストークスシフトを有していてもよく、その蛍光発光は、最小のストークスシフトを有していても、またはクロストークを有していなくてもよい。

いくつかの実施形態において、その２種の蛍光色素のうちの一方は、通常のストークスシフト色素であり得、その蛍光色素のうちの他方は、長ストークスシフト色素であり得る。通常のストークスシフト色素の非限定的な例としては、米国特許第８，７５４，２４４号（その内容は、その全体において本明細書に参考として援用される）に開示されるＡｌｅｘａ４８８またはその色素アナログ（例えば、３，６－ビス（エチルアミン）－２，７－ジメチル－［２－カルボキシラト－５－（３－カルボキシプロピルオキシ）フェニル］キンサンチリウムベタイン（色素Ｉ－３）、および３，６－ビス（エチルアミン）－２，７－ジメチル－［２－カルボキシラト－４－（３－カルボキシプロピルオキシ）フェニル］キンサンチリウムベタイン（色素Ｉ－４）が挙げられる。その通常のストークスシフト色素は、４８８ｎｍの波長を有するレーザーまたは発光ダイオード（ＬＥＤ）光源で励起され得、５２０ｎｍにおいて発光ピークを有し得る。長ストークスシフト色素は、ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１６／０５１４７４（その内容は、その全体において本明細書に参考として援用される）における色素ＮＲ５２０ＬＳであり得る。その長ストークスシフト色素は、５９０ｎｍにおいて発光ピークを有し得る。いくつかの実施形態において、その２種の蛍光色素は、Ｃｙ３（発光ピークは５７５ｎｍあたり）および蛍光共鳴エネルギー移転（ＦＲＥＴ）ペア色素Ｃｙ３－Ｃｙ５（発光ピークは６７０ｎｍ）であり得る。

色補正は、各蛍光画像内の根底にある強度分布の特性を利用して、その抽出した強度を調整するために、カラーマトリクスを利用し得る。そのカラーマトリクスは、その第１の蛍光画像からの抽出した強度を、位置（ｘ_ｉ，ｙ_ｉ）でのその第２の蛍光画像における相当する位置からの抽出した強度に対してプロットすることによって、推測され得る。ｘ_ｉおよびｙ_ｉは、それぞれ、その第２の蛍光画像およびその第１の蛍光画像における成長中のプライマー－ポリヌクレオチドの位置ｉから抽出された強度を示す。位置（ｘ_ｉ，ｙ_ｉ）におけるそのプロットされた強度は、極座標（ｒ_ｉ， θ_ｉ）へと変換され、そして角度θ_ｉの区域重み付けヒストグラムが計算される。その区域重み付けヒストグラムにおける２つの極大値、θ_１およびθ_２は、そのカラーマトリクスを推測するために使用され得る。そのカラーマトリクスは、以下であり得る：

そのカラーマトリクスの逆を、位置（ｘ_ｉ，ｙ_ｉ）におけるプロットした強度に適用した後、組み込まれたヌクレオチドの塩基が決定され得る。例えば、蛍光発光が検出されない場合、その組み込まれたヌクレオチドは、ｄＧＴＰアナログであり得る。蛍光発光がその第２の蛍光画像において検出され、その第１の蛍光画像において検出されない場合、その組み込まれたヌクレオチドは、ｄＴＴＰアナログであり得る。蛍光発光がその第１の蛍光画像において検出され、その第２の蛍光画像において検出されない場合、その組み込まれたヌクレオチドは、ｄＣＴＰアナログであり得る。蛍光発光が両方の蛍光画像において検出される場合、その組み込まれたヌクレオチドは、ｄＡＴＰアナログであり得る。

定義
別段定義されなければ、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，ＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ第２版，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ１９９４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ１９８９）を参照のこと。本開示の目的のために、以下の用語が以下で定義される。

単一の光源・２光学チャネル配列決定機
単一の光源（例えば、レーザーまたはＬＥＤ）を使用してポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するためのシステムおよび方法が、本明細書で開示される。一実施形態において、少なくとも２種の色素がポリヌクレオチドを配列決定するために使用される。図１は、例示的な単一の光源・２光学チャネル配列決定システム１００を示す模式図である。その単一の光源・２光学チャネル配列決定システム１００は、２種の色素、例えば、第１の蛍光標識および第２の蛍光標識に基づく配列決定法を利用するように構成され得る。利用される配列決定法の非限定的な例としては、逐次合成配列決定を行う方法およびＨｅｌｉｓｃｏｐｅ単一分子配列決定法を含み得る。単一の光源・２光学チャネル配列決定システム１００は、単一の光源・２光学チャネル配列決定システム１００の一部である流体システム１０４によって供給される配列決定試薬を使用して、生の配列決定データを生成するように構成された光学システム１０２を含み得る。その生の配列決定データは、光学システム１０２によって捕捉される蛍光画像を含み得る。単一の光源・２光学チャネル配列決定システム１００の一部であるコンピューターシステム１０６は、通信チャネル１０８Ａおよび１０８Ｂを介して、光学システム１０２および流体システム１０４を制御するように構成され得る。例えば、光学システム１０２のコンピューターインターフェース１１０は、コンピューターシステム１０６と通信チャネル１０８Ａを通じて通信するように構成され得る。

配列決定反応の間に、流体システム１０４は、１またはこれより多くの試薬チューブ１１２を通じて、取り付けステージ１１６上に配置されたフローセル１１４へのおよびそのフローセル１１４からの試薬の流れを方向付け得る。その試薬は、例えば、蛍光標識されたヌクレオチド、緩衝液、酵素、および切断試薬であり得る。フローセル１１４は、少なくとも１つの流体チャネルを含み得る。フローセル１１４は、パターン化アレイフローセルまたはランダムアレイフローセルであり得る。フローセル１１４は、少なくとも１つの流体チャネルにおいて配列決定されるべき一本鎖ポリヌクレオチドの複数のクラスターを含み得る。そのポリヌクレオチドの長さは、例えば、２００塩基から１０００塩基までの範囲に及んで変動し得る。そのポリヌクレオチドは、フローセル１１４の１またはこれより多くの流体チャネルに付着され得る。いくつかの実施形態において、フローセル１１４は、複数のビーズを含み得、ここで各ビーズは、配列決定されるべきポリヌクレオチドの複数のコピーを含み得る。取り付けステージ１１６は、光学システム１０２の他の構成要素と関連して、フローセル１１４の適切なアラインメントおよび動きを可能にするように構成され得る。一実施形態において、取り付けステージ１１６は、フローセル１１４をレンズ１１８と整列させるために使用され得る。

光学システム１０２は、所定の波長（例えば、５３２ｎｍ）にある光を生成するように構成された単一のレーザーまたは単一のＬＥＤ源などの単一の光源１２０を含み得る。光源１２０によって生成される光は、光ファイバーケーブル１２２を通過して、フローセル１１４において蛍光標識を励起し得る。レンズ１１８（フォーカサー１２４に取り付けられる）は、ｚ軸に沿って動き得る。そのフォーカスした蛍光発光は、検出器１２６、例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）センサまたは相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）センサによって検出され得る。

光学システム１０２のフィルタアセンブリ１２８は、フローセル１１４において蛍光標識の蛍光発光をフィルタにかけるように構成され得る。フィルタアセンブリ１２８は、第１のフィルタおよび第２のフィルタを含み得る。各フィルタは、システムにおいて使用されている蛍光分子のタイプに依存して、ロングパスフィルタ、ショートパスフィルタ、またはバンドパスフィルタであり得る。第１のフィルタは、検出器１２６によって第１の蛍光標識の蛍光発光を検出するように構成され得る。第２のフィルタは、検出器１２６によって第２の蛍光標識の蛍光発光を検出するように構成され得る。フィルタアセンブリ１２８において２つのフィルタがあると、検出器１２６は、２種の異なる波長の光を検出し得る。光の２つの波長は、同じ蛍光標識に由来し得るか、または異なる蛍光標識に由来し得る。光の２つの波長は、例えば、少なくとも２０ｎｍ離れていてもよい。

いくつかの実施形態において、光学システム１０２は、蛍光発光を分割するように構成されたダイクロイック要素（ｄｉｃｈｒｏｉｃ）を含み得る。光学システム１０２は、２つの検出器（第１の波長にある蛍光発光を検出するための第１のフィルタを連結した第１の検出器、および第２の波長にある蛍光発光を検出するための第２のフィルタを連結した第２の検出器）を含み得る。その蛍光発光をダイクロイック要素で分割した後、その光学システム１０２は、種々のフィルタと連結されたその２つの検出器を使用して、２つの波長において、蛍光発光を同時に（または時間的に近接して）検出し得る。その構成は、その画像化プロセスを加速し得る。よって、複数のフローセルは、同時に処理され得、ヌクレオチドアナログが、その１またはこれより多くの他のフローセルのポリヌクレオチドクラスターへと組み込まれる間に、１つのフローセルは画像化を受ける。

使用時に、配列決定されるべきポリヌクレオチドを有するサンプルは、フローセル１１４の中に載せられ、取り付けステージ１１６に配置される。コンピューターシステム１０６は、次いで、流体システム１０４を作動して、配列決定サイクルを開始する。配列決定反応の間に、コンピューターシステム１０６は、通信インターフェース１０８Ｂを通じて流体システム１０４に命令して、試薬（例えば、ヌクレオチドアナログ）をフローセル１１４へと供給する。通信インターフェース１０８Ａおよびコンピューターインターフェース１１０を通じて、コンピューターシステム１０６は、光学システム１０２の光源１２０を制御して、所定の波長にある光を発生させ、配列決定されている最中のポリヌクレオチドにハイブリダイズされる成長中のプライマーへと組み込まれるヌクレオチドアナログ上で光るように構成される。コンピューターシステム１０６は、光学システム１０２の検出器１２６を制御して、蛍光画像中のヌクレオチドアナログの発光スペクトルを捕捉する。コンピューターシステム１０６は、検出器１２６からの蛍光画像を受け取り、その受け取った蛍光画像を処理して、配列決定されている最中のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する。

光源およびフィルタ
その単一の光源・２光学チャネル配列決定システム１００は、十分に重なり合わない発光スペクトルを有する２種の蛍光標識を励起し得る１つの光源（例えば、レーザーまたはＬＥＤ）を利用し得る。その光源１２０によって発生した光の波長は、例えば、４００ｎｍ～８００ｎｍの範囲に及んで変動し得る。いくつかの実施形態において、その光源１２０によって発生した光の波長は、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００ｎｍ、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の値もしくは範囲であり得るか、またはそのあたりであり得る。いくつかの実施形態において、その光源１２０によって発生した光の波長は、少なくとも、または多くても、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、または８００ｎｍであり得る。

検出器１２６は、フィルタアセンブリ１２８とともに、２つの異なる波長（例えば、第１の波長および第２の波長）の光またはそのあたりの波長を検出するように構成され得る。その第１の波長およびその第２の波長は、互いから、例えば、１０ｎｍ～１００ｎｍの範囲に及んで、離れていてもよい。いくつかの実施形態において、その第１の波長およびその第２の波長は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｎｍ、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の値もしくは範囲で離れていてもよく、またはそのあたりで離れていてもよい。いくつかの実施形態において、その第１の波長およびその第２の波長は、少なくとも、または多くても、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｎｍ離れていてよい。

そのフィルタアセンブリ１２８におけるフィルタの数は、１～１０の範囲に及んで変動し得る。いくつかの実施形態において、そのフィルタアセンブリ１２８におけるフィルタの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の範囲であり得るか、またはそのあたりであり得る。いくつかの実施形態において、そのフィルタアセンブリ１２８におけるフィルタの数は、少なくとも、または多くても、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり得る。

フィルタは、バンドパスフィルタであり得、４００ｎｍ～８００ｎｍの範囲に及んで、変動する波長のピーク透過率を有し得る。いくつかの実施形態において、ピーク透過率は、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００ｎｍ、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の値もしくは範囲であり得るか、またはそのあたりであり得る。いくつかの実施形態において、ピーク透過率は、少なくとも、または多くても、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、または８００ｎｍであり得る。そのフィルタの幅は、例えば、１ｎｍ～５０ｎｍの範囲に及んで、変動し得る。いくつかの実施形態において、そのフィルタの幅は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０ｎｍ、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の値もしくは範囲であり得るか、またはそのあたりであり得る。いくつかの実施形態において、そのフィルタの幅は、少なくとも、または多くても、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、または５０ｎｍであり得る。

蛍光標識
本明細書で開示されるシステムおよび方法によって利用される蛍光標識は、例えば、４００ｎｍ～８００ｎｍの範囲に及んで、種々のピーク吸収波長を有し得る。いくつかの実施形態において、蛍光標識のピーク吸収波長は、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００ｎｍ、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の値もしくは範囲であり得るか、またはそのあたりであり得る。いくつかの実施形態において蛍光標識のピーク吸収波長は、少なくとも、または多くても、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、または８００ｎｍであり得る。

その蛍光標識は、例えば、４００ｎｍ～８００ｎｍの範囲に及んで、種々のピーク発光波長を有し得る。いくつかの実施形態において、その蛍光標識のピーク発光波長は、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００ｎｍ、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の値もしくは範囲であり得るか、またはそのあたりであり得る。いくつかの実施形態において、その蛍光標識のピーク発光波長は、少なくとも、または多くても、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、または８００ｎｍであり得る。

その蛍光標識は、例えば、１０ｎｍ～２００ｎｍの範囲に及んで、種々のストークスシフトを有し得る。いくつかの実施形態において、ストークスシフトは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００ｎｍ、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の値もしくは範囲であり得るか、またはそのあたりであり得る。いくつかの実施形態において、ストークスシフトは、少なくとも、または多くても、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ｎｍであり得る。

本明細書で開示されるシステムおよび方法は、２種の蛍光標識を利用し得、例えば、第１の蛍光標識および第２の蛍光標識は、重なり合う発光スペクトルを有し得、クロストークを受けやすい可能性がある。いくつかの実施形態において、その２種の蛍光標識のピーク発光波長は、例えば、１０ｎｍ～２００ｎｍの範囲に及んで、変動し得る。いくつかの実施形態において、その２種の蛍光標識のピーク発光波長は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００ｎｍ、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の値もしくは範囲であり得るか、またはそのあたりであり得る。いくつかの実施形態において、その２種の蛍光標識のピーク発光波長は、少なくとも、または多くても、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ｎｍであり得る。その検出器１２６は、そのフィルタアセンブリ１２８におけるフィルタのうちの１つとともに、その第１の蛍光標識の蛍光発光を検出し得る。その検出器１２６は、そのフィルタアセンブリ１２８における別のフィルタとともに、その第２の蛍光標識の蛍光発光を検出し得る。

いくつかの実施形態において、その２種の蛍光色素のうちの一方は、通常のストークスシフト色素であり得、その蛍光色素のうちの他方は、長ストークスシフト色素であり得る。通常のストークスシフト色素の非限定的な例としては、米国特許第８，７５４，２４４号におけるＡｌｅｘａ４８８またはその色素アナログ（例えば、３，６－ビス（エチルアミン）－２，７－ジメチル－［２－カルボキシラト－５－（３－カルボキシプロピルオキシ）フェニル］キンサンチリウムベタイン（色素Ｉ－３）、および３，６－ビス（エチルアミン）－２，７－ジメチル－［２－カルボキシラト－４－（３－カルボキシプロピルオキシ）フェニル］キンサンチリウムベタイン（色素Ｉ－４）が挙げられる。その通常のストークスシフト色素は、４８８ｎｍの波長を有するレーザーまたは発光ダイオード（ＬＥＤ）光源で励起され得、５２０ｎｍにおいて発光ピークを有し得る。長ストークスシフト色素は、ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１６／０５１４７４における色素ＮＲ５２０ＬＳであり得る。その長ストークスシフト色素は、５９０ｎｍにおいて発光ピークを有し得る。いくつかの実施形態において、その２種の蛍光色素は、Ｃｙ３（発光ピークは５７５ｎｍあたり）および蛍光共鳴エネルギー移転（ＦＲＥＴ）ペア色素Ｃｙ３－Ｃｙ５（発光ピークは６７０ｎｍ）であり得る。

コンピューターシステム
単一の光源・２光学チャネル配列決定システム１００のコンピューターシステム１０６は、上記で考察されるように、光学システム１０２および流体システム１０４を制御するように構成され得る。コンピューターシステム１０６に関しては多くの構成が可能であるが、一実施形態は、図２に図示される。図２に示されるように、コンピューターシステム１０６は、メモリ２０４、記憶装置２０６、および通信インターフェース２０８と電子的に通信状態にあるプロセッサ２０２を含み得る。

プロセッサ２０２は、流体システム１０４に、配列決定反応の間に試薬をフローセル１１４へと供給させる命令を実行するように構成され得る。プロセッサ２０２は、光学システム１０２の光源１２０を制御して、所定の波長にある光を生成する命令を実行し得る。プロセッサ２０２は、光学システム１０２の検出器１２６を制御し、データを検出器１２６から受け取る命令を実行し得る。プロセッサ２０２は、検出器１２６から受け取ったデータ（例えば、蛍光画像）を処理し、検出器１２６から受け取ったデータに基づいて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する命令を実行し得る。

メモリ２０４は、単一の光源・２光学チャネル配列決定システム１００の電源が入っているときに、コンピューターシステム１０６の機能を発揮するようにプロセッサ２０２を構成するための命令を保存するように構成され得る。単一の光源・２光学チャネル配列決定システム１００の電源が切られているときには、記憶装置２０６が、コンピューターシステム１０６の機能を発揮するようにプロセッサ２０２を構成するための命令を保存し得る。通信インターフェース２０８は、コンピューターシステム１０６と、光学システム１０２、流体システム１０４の間の通信を促進するように構成され得る。

コンピューターシステム１０６は、単一の光源・２光学チャネル配列決定システム１００の配列決定結果をディスプレイするためのディスプレイデバイス（示さず）と通信するように構成されたユーザーインターフェース２１０を含み得る。ユーザーインターフェース２１０は、単一の光源・２光学チャネル配列決定システム１００のユーザーからの入力を受け取るように構成され得る。コンピューターシステム１０６の光学システムインターフェース２１２および流体システムインターフェース２１４は、光学システム１０２および流体システム１０４を、図１に図示される通信リンク１０８Ａおよび１０８Ｂを通じて制御するように構成され得る。例えば、光学システムインターフェース２１２は、光学システム１０２のコンピューターインターフェース１１０と、通信リンク１０８Ａを通じて通信し得る。

コンピューターシステム１０６は、検出器１２６から受け取ったデータを使用して、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するように構成された核塩基決定機２１６を含み得る。その核塩基決定機２１６は、以下のうちの１またはこれより多くを含み得る：テンプレート生成器２１８、位置記録器２２０、強度抽出器２２２、強度補正器２２４、塩基呼び出し側２２６、および品質スコア決定器２２８。テンプレート生成器２１８は、検出器１２６によって捕捉された蛍光画像を使用して、フローセル１１４におけるポリヌクレオチドクラスターの位置のテンプレートを生成するように構成され得る。位置記録器２２０は、テンプレート生成器２１８によって生成された位置テンプレートに基づいて、検出器１２６によって捕捉された蛍光画像においてフローセル１１４におけるポリヌクレオチドクラスターの位置を記録するように構成され得る。強度抽出器２２２は、蛍光画像から蛍光発光の強度を抽出して、抽出された強度を生成するように構成され得る。その強度補正器２２４は、例えば、抽出した強度を色補正して、補正した強度を生成することによって、その蛍光標識の間のクロストークを低減または排除するように構成され得る。いくつかの実施形態において、その強度補正器２２４は、抽出した強度を位相補正または事前位相補正し得る。その塩基呼び出し側２２６は、その補正した強度からそのポリヌクレオチドの塩基を決定するように構成され得る。その塩基呼び出し側２２６によって決定されたそのポリヌクレオチドの塩基は、その品質スコア決定器２２８によって決定される品質スコアと関連し得る。

逐次合成配列決定を行う方法
図３は、配列決定システム１００を利用して逐次合成配列決定を行うための例示的方法３００のフローチャートである。方法３００がブロック３０５で開始した後、フラグメント化ポリヌクレオチドフラグメント（例えば、フラグメント化一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドフラグメント）を含むフローセル１１４は、ブロック３１０で受け取られる。そのフラグメント化二本鎖ポリヌクレオチドフラグメントは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）サンプルから生成され得る。そのＤＮＡサンプルは、種々の供給源、例えば、生物学的サンプル、細胞サンプル、環境サンプル、またはこれらのうちのいずれかの組み合わせに由来し得る。ＤＮＡサンプルは、患者に由来する生物学的流体、組織、および細胞のうちの１またはこれより多くを含み得る。例えば、そのＤＮＡサンプルは、血液、尿、脳脊髄液、胸膜液、羊水、精液、唾液、骨髄、生検サンプル、またはこれらのうちのいずれかの組み合わせから採取され得るか、またはこれらを含み得る。

ＤＮＡサンプルは、目的の細胞に由来するＤＮＡを含み得る。その目的の細胞は、変動し得、いくつかの実施形態では、悪性表現型を発現し得る。いくつかの実施形態において、その目的の細胞は、腫瘍細胞、骨髄細胞、がん細胞、幹細胞、内皮細胞、ウイルス感染した細胞、病原性の、寄生生物の細胞、またはこれらのうちのいずれかの組み合わせを含み得る。

フラグメント化ポリヌクレオチドフラグメントの長さは、２００塩基から１０００塩基までの範囲に及び得る。フラグメント化ポリヌクレオチドフラグメントを含むフローセル１１４がブロック３１０において一旦受け取られると、プロセス３００は、ブロック３２０へと移動し、このブロックにおいてそのポリヌクレオチドフラグメントは、フローセル（例えば、フローセル１１４）の１またはこれより多くのチャネルの内表面に付着されたポリヌクレオチドフラグメントのクラスターへとブリッジ増幅される。フローセルの１またはこれより多くのチャネルの内表面は、２タイプのプライマー（例えば、第１のプライマータイプ（Ｐ１）および第２のプライマータイプ（Ｐ２））を含み得、そのＤＮＡフラグメントは、周知の方法によって増幅され得る。

フローセル１１４内でクラスターを生成した後、プロセス３００は、逐次合成配列決定を行うプロセスを開始し得る。その逐次合成配列決定を行うプロセスは、一本鎖ポリヌクレオチドフラグメントのクラスターのヌクレオチド配列を決定する工程を包含し得る。配列５’－Ｐ１－Ｆ－Ａ２Ｒ－３’を有する一本鎖ポリヌクレオチドフラグメントのクラスターの配列を決定するために、配列Ａ２Ｆ（これは、配列Ａ２Ｒに相補的である）を有するプライマーは、ブロック３２５において、０個、１個、または２個の標識を有するヌクレオチドアナログとともに添加されてＤＮＡポリメラーゼによって伸長されて、成長中のプライマー－ポリヌクレオチドを形成し得る。

各配列決定サイクルの間に、４タイプのヌクレオチドアナログは、その成長中のプライマー－ポリヌクレオチドへと添加されて組み込まれ得る。その４タイプのヌクレオチドアナログは、異なる改変を有し得る。例えば、第１のタイプのヌクレオチドは、いかなる蛍光標識とも結合体化していないデオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）のアナログであり得る。第２のタイプのヌクレオチドは、第１のタイプの蛍光標識とリンカーを介して結合体化したデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のアナログであり得る。第３のタイプのヌクレオチドは、第２のタイプの蛍光標識とリンカーを介して結合体化したデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）のアナログであり得る。第４のタイプのヌクレオチドは、第１のタイプの蛍光標識および第２のタイプの蛍光標識の両方と、１またはこれより多くのリンカーを介して結合体化したデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）のアナログであり得る。リンカーは、１またはこれより多くの切断基を含み得る。その後の配列決定サイクルの前に、蛍光標識は、ヌクレオチドアナログから除去され得る。例えば、蛍光標識をヌクレオチドアナログに付着させるリンカーは、そのリンカーが、ホスフィン試薬によって各組み込みサイクル後に切断され得、それによって、その蛍光標識をその後の配列決定サイクルから放出するように、例えば、炭素上にアジドおよび／またはアルコキシ基を含み得る。

ヌクレオチド三リン酸は、配列決定が制御され、僅か１個のヌクレオチドアナログが各サイクルにおいて各伸長中のプライマー－ポリヌクレオチド上に付加され得るように、３’位において可逆的にブロックされ得る。例えば、ヌクレオチドアナログの３’リボース位は、アルコキシおよびアジド官能基の両方を含み得、これらは、ホスフィン試薬での切断によって除去可能であり得、それによって、さらに伸長され得るヌクレオチドを作り得る。ヌクレオチドアナログの組み込みの後に、流体システム１０４は、任意の組み込まれていないヌクレオシドアナログおよび酵素を除去するために、フローセル１１４の１またはこれより多くのチャネルを洗浄し得る。その後の配列決定サイクルの前に、可逆的な３’ブロックは、別のヌクレオチドアナログが各伸長中のプライマー－ポリヌクレオチド上に付加され得るように、除去され得る。

ブロック３３０において、単一の光源（例えば、レーザー１２０またはＬＥＤ源）は、所定の波長で２種の蛍光標識を励起し得る。レーザーまたはＬＥＤ源は調節不可能であり得る。ブロック３３５において、その蛍光標識からのシグナルは、検出され得る。蛍光標識を検出する工程は、例えば、２種のフィルタを使用する検出器１２６によって、第１の波長および第２の波長において、２種の蛍光画像で蛍光発光を捕捉する工程を包含し得る。第１の蛍光標識の蛍光発光は、第１の波長にまたはその付近にあり得、第２の蛍光標識の蛍光発光は、第２の波長にまたはその付近にあり得る。その蛍光画像は、後にオフラインで処理するために保存され得る。いくつかの実施形態において、その蛍光画像は、各クラスターにおいて成長中のプライマー－ポリヌクレオチドの配列をリアルタイムで決定するために処理され得る。

決定ブロック３４０において、例えば、シグナルの品質に基づいて、または所定の塩基数の後に、より多くのヌクレオチドを検出するか否か、決定が行われ得る。より多くのヌクレオチドが検出されるべきである場合、次の配列決定サイクルのヌクレオチド決定は、ブロック３２５において再び開始して行われ得、０、１、または２種の標識を有するヌクレオチドアナログが添加されて、そのプライマー－ポリヌクレオチドを伸長する。次の配列決定サイクルの前に、蛍光標識は、組み込まれたヌクレオチドアナログから除去され得、その可逆的な３’ブロックは、別のヌクレオチドアナログが各伸長中のプライマー－ポリヌクレオチド上に付加され得るように除去され得る。

オフライン蛍光画像化処理において、決定ブロック３４０において検出されるべきさらなるヌクレオチドが存在しない場合、検出される蛍光シグナルを含む蛍光画像がブロック３４５において処理され得、組み込まれたそのヌクレオチドの塩基が決定され得る。決定した各ヌクレオチド塩基に関して、品質スコアは、ブロック３５０において決定され得る。その蛍光画像全てが処理された後、そのプロセス３００は、ブロック３５５において終結し得る。

塩基呼び出し
塩基呼び出しは、米国特許第８，９６５，０７６号（その内容は、その全体において本明細書に参考として援用される）に記載されている。簡潔にまとめると、塩基呼び出しは、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、またはアデニン（Ａ）であると配列決定されている最中の、成長中のプライマー－ポリヌクレオチドのクラスターへと組み込まれたヌクレオチドの塩基を決定するプロセスをいい得る。図４は、配列決定システム１００を利用して、塩基呼び出しを行うための例示的方法４００のフローチャートである。図３で図示されるブロック３４５において検出されたシグナルを処理する工程は、方法４００の塩基呼び出しを行う工程を包含し得る。ブロック４０５において開始した後、所定の波長の光が、光源を使用して生成され得、ブロック４１０においてヌクレオチドアナログ上で光り得る。例えば、コンピューターシステム１０６は、その光学システムインターフェース２１２および通信チャネル１０８Ａを通じて、光源１２０に所定の波長にある光を生成させ得る。

光源で生成された光は、フローセル（例えば、フローセル１１４）の１またはこれより多くのチャネルの内表面上に付着された成長中のプライマー－ポリヌクレオチドへと組み込まれたヌクレオチドアナログ上で光り得る。プライマー－ポリヌクレオチドは、配列決定プライマーにハイブリダイズされた一本鎖ポリヌクレオチドフラグメントのクラスターを含み得る。ヌクレオチドアナログは各々、０個、１個、または２個の蛍光標識を含み得る。その２個の蛍光標識は、第１の蛍光標識および第２の蛍光標識であり得る。その蛍光標識は、光源で生成された光によって励起された後、蛍光発光を発し得る。例えば、第１の蛍光標識は、例えば、第１の蛍光画像において捕捉され得る第１の波長にある蛍光発光を生じ得る。第２の蛍光標識は、例えば、第２の蛍光画像において捕捉され得る第２の波長にある蛍光発光を生じ得る。

ヌクレオチドアナログは、第１のタイプのヌクレオチド、第２のタイプのヌクレオチド、第３のタイプのヌクレオチド、および第４のタイプのヌクレオチドを含み得る。その第１のタイプのヌクレオチド、例えば、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）のアナログは、第１の蛍光標識にも第２の蛍光標識にも結合体化されない。第２のタイプのヌクレオチド、例えば、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のアナログは、第１のタイプの蛍光標識と結合体化され得るが、第２のタイプの蛍光標識には結合体化されない。第３のタイプのヌクレオチド、例えば、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）のアナログは、第２のタイプの蛍光標識と結合体化され得るが、第１のタイプの蛍光標識とは結合体化されない。第４のタイプのヌクレオチド、例えば、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）のアナログは、第１の蛍光標識および第２のタイプの蛍光標識の両方と結合体化され得る。

ブロック４１５において、第１の波長および第２の波長にあるヌクレオチドアナログの蛍光発光は、少なくとも１つの検出器を使用して検出され得る。例えば、検出器１２６は、２つの蛍光画像（第１の波長にある第１の蛍光画像および第２の波長にある第２の蛍光画像）を捕捉し得る。その２つの蛍光画像を光学システム１０２から受け取った後、核塩基決定機２１６は、その２つの蛍光画像において蛍光発光の存在または非存在を決定し得る。

第１のタイプのヌクレオチドは、第１の蛍光標識にも第２の蛍光標識にも結合体化されていないので、その第１のタイプのヌクレオチドは、第１の波長にあるかまたは第２の波長にある蛍光発光を、全くまたは最小限にしか生成できない。決定ブロック４２０において、蛍光発光が検出されない場合、そのヌクレオチドは、第１のタイプのヌクレオチド（例えば、ｄＧＴＰ）であると決定され得る。何らかのまたは最小限を超える蛍光発光が検出される場合、方法４００は、決定ブロック４２５へと進み得る。

第２のタイプのヌクレオチドは、第１のタイプの蛍光標識と結合体化され、第２のタイプの蛍光標識とは結合体化されないので、その第２のタイプのヌクレオチドは、第１の波長にある蛍光発光を生成し得、第２の波長にある蛍光発光を全くまたは最小限にしか生成できない。決定ブロック４２５において、第２の波長にある蛍光発光は、第２の蛍光画像において検出されず、かつ決定ブロック４２０から、第１の波長にある蛍光発光が第１の蛍光画像において検出される場合、ヌクレオチドは、第２のタイプのヌクレオチド（例えば、ｄＴＴＰ）であると決定され得る。蛍光発光が第２波長において検出される場合、方法４００は、決定ブロック４３０へと進み得る。

第３のタイプのヌクレオチドは、第２のタイプの蛍光標識と結合体化され、第１のタイプの蛍光標識とは結合体化されないので、その第３のタイプのヌクレオチドは、第２の波長にある蛍光発光を生成し得、第１の波長にある蛍光発光を全くまたは最小限にしか生成できない。決定ブロック４３０において、第１の波長にある蛍光発光が第１の蛍光画像において検出されず、かつ決定ブロック４２５から、第２の波長にある蛍光発光が第２の蛍光画像において検出される場合、ヌクレオチドは、第３のタイプのヌクレオチド（例えば、ｄＣＴＰ）であると決定され得る。

第４のタイプのヌクレオチドは、第１のタイプの蛍光標識および第２のタイプの蛍光標識の両方と結合体化されるので、その第４のタイプのヌクレオチドは、第１の波長または第２の波長にある蛍光発光を生成し得る。決定ブロック４３０において、蛍光発光が第１の蛍光画像で第１の波長において検出され、かつ決定ブロック４２５から、蛍光発光が第２の蛍光画像で第２の波長において検出され得る場合、ヌクレオチドは、第４のタイプのヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ）であると決定され得る。

フローセル１１４は、配列決定されるべき成長中のプライマー－ポリヌクレオチドのクラスターを含み得る。決定ブロック４３５において、所定の配列決定サイクルに対して処理されるべき蛍光発光を有する少なくとももう１個のクラスターが存在する場合、方法４００は、ブロック４１５において継続し得る。一本鎖ポリヌクレオチドのクラスターがそれ以上処理されるべきではない場合、方法４００は、ブロック４４０において終了し得る。

単一の光源・２光学チャネル配列決定の作業フロー
サイクル１：テンプレート生成、位置記録、および強度抽出
図５は、単一の光源・２光学チャネル配列決定を行うための例示的方法５００のフローチャートである。その単一の光源・２光学チャネル配列決定システム１００は、その方法５００を行い得る。ブロック５０５において始まった後、光源は、ブロック５１０においてヌクレオチド上へと所定の波長の光を発生させ得る。ブロック５１５において、第１の波長における第１の蛍光標識からのおよび第２の波長における第２の蛍光標識からの蛍光発光は、第１の蛍光画像および第２の蛍光画像を生成するために、例えば、少なくとも１つの検出器を使用して検出され得る。蛍光発光を検出することは、蛍光発光の強度を決定することを包含し得る。その２つの蛍光画像を受け取った後、位置テンプレートは、例えば、テンプレート生成器２１８によって、ブロック５２０において生成され得る。

位置テンプレートを生成することは、１本鎖ポリヌクレオチドのクラスターの位置を決定するために、第１の配列決定サイクルの間に必要であり得る。図６は、単一の光源・２光学チャネル配列決定を使用する、核酸クラスターおよびそれらの配列決定の概説を示す。その第１の配列決定サイクルの間に、そのクラスターの位置は未知である。フローセルは、４つのクラスター、クラスター１～４を含み得る。その第１の配列決定サイクルの間に、そのテンプレート生成器２１８は、そのフローセルにおいて、クラスター１、２、および４の存在を決定し得る。

その第１の配列決定サイクルの間に、第１の状態６０６（第１の配列決定サイクルに相当する）におけるフローセルの第１の蛍光画像６０２および第２の蛍光画像６０４は、生成され得る。成長中のプライマー－ポリヌクレオチドのクラスターへと組み込まれるヌクレオチドアナログは、変動し得る。例えば、クラスター１へと組み込まれるヌクレオチドは、蛍光標識の第１のタイプおよび蛍光標識の第２のタイプの両方と結合体化したデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）のアナログであり得る。その第１の蛍光画像６０２は、そのｄＡＴＰアナログ上の蛍光標識の第１のタイプの蛍光発光を捕捉し得る。その第２の蛍光画像６０４は、そのｄＡＴＰアナログ上の蛍光標識の第２のタイプの蛍光発光を捕捉し得る。そのテンプレート生成器２１８は、その第１の蛍光画像６０２またはその第２の蛍光画像６０４から、特定のクラスター１の位置におけるそのクラスター１の存在を決定し得る。

クラスター２へと組み込まれるヌクレオチドは、蛍光標識の第２のタイプと結合体化され、蛍光標識の第１のタイプとは結合体化されないデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）のアナログであり得る。その第２の蛍光画像は、そのｄＣＴＰアナログ上の蛍光標識の第２のタイプの蛍光発光を捕捉し得る。その第１の蛍光標識およびその第２の蛍光標識がクロストークを受けやすい場合、そのクラスター２は、その第１の蛍光画像上でいくらかの蛍光発光を有し得る。そのテンプレート生成器２１８は、第２の蛍光画像６０４から、特定のクラスター２の位置におけるクラスター２の存在を決定し得る。

クラスター３へと組み込まれるヌクレオチドは、第１の蛍光標識または第２の蛍光標識に結合体化されないデオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）のアナログであり得る。その第１の蛍光画像６０２およびその第２の蛍光画像６０４は従って、クラスター３からの蛍光発光を有しないか、または最小限に有する。そのテンプレート生成器２１８は、その第１の蛍光画像６０２およびその第２の蛍光画像６０４から、特定のクラスター３の位置におけるクラスター３の存在を決定できないことがある。

クラスター４へと組み込まれるヌクレオチドは、蛍光標識の第１のタイプと結合体化され、蛍光標識の第２のタイプとは結合体化されないデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のアナログであり得る。その第１の蛍光画像６０２は、そのｄＴＴＰアナログ上の蛍光標識の第１のタイプの蛍光発光を捕捉し得る。その第１の蛍光標識およびその第２の蛍光標識がクロストークを受けやすい場合、そのクラスター４は、その第２の蛍光画像６０４上でいくらかの蛍光発光を有し得る。そのテンプレート生成器２１８は、第１の蛍光画像から、特定のクラスター４の位置におけるクラスター４の存在を決定し得る。

そのテンプレート生成器２１８は、その第１の配列決定サイクルにおいて第１の蛍光画像６０２および第２の蛍光画像６０４に基づいて、そのクラスター１、２、および４の位置テンプレートを生成し得る。いくつかの実施形態において、その位置テンプレートを生成することは、その第１の蛍光標識とその第２の蛍光標識との間のクロストークを検出することを包含し得る。そのクロストークは、有利なことには、画像記録を、特に低い多様性状況においてより強力にし得る。なぜならその蛍光標識の発光は、その第１の蛍光画像６０２およびその第２の蛍光画像６０４の両方において捕捉され得るからである。

サイクル２：テンプレート生成および位置記録
位置テンプレートを生成することは、ランダムフローセルが使用される場合、１本鎖ポリヌクレオチドのクラスターの位置を決定するために、第２の配列決定サイクルの間に必要であり得る。その第１の配列決定サイクルの後に、クラスター３の位置は未知であり得る。その第２の配列決定サイクルの間にクラスター３に組み込まれるヌクレオチドは、その蛍光標識の第１のタイプと結合体化し、その蛍光標識の第２のタイプとは結合体化しないデオキシシチジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のアナログであり得る。第１の蛍光画像６１２は、そのｄＴＴＰアナログ上の蛍光標識の第１のタイプの蛍光発光を捕捉し得る。その第２の配列決定サイクルの間に、そのテンプレート生成器２１８は、その第１の蛍光画像６１２から、特定のクラスター３の位置におけるクラスター３の存在を決定し得る。パターン化したフローセルが使用される場合のテンプレート生成は、米国特許出願第１４／５３０，２９９号（その内容は、その全体において本明細書に参考として援用される）に記載されている。

位置記録および強度抽出
図５を参照すると、ブロック５２５において、位置テンプレートにおけるクラスターの位置は、その第１の配列決定サイクルおよびその後の配列決定サイクルに関して捕捉した蛍光画像に対して記録され得る。記録された位置、例えば、位置１、２および４における成長中のプライマー－ポリヌクレオチドのクラスターの蛍光強度は、ブロック５３０において抽出され得る。その抽出した強度は、補正した強度を生成するために、５３５において補正され得る。例えば、その強度補正器２２４によって抽出した強度を抽出することは、ブロック５４０における空間的正規化、ブロック５４５における色補正、またはブロック５５０における位相同期補正のうちの１またはこれより多くを含み得る。

空間的正規化、色補正、および位相同期補正
空間的正規化は、空間的に正規化された強度を生成するために、配列決定サイクルの異なる蛍光画像における蛍光発光の強度を正規化することを包含し得る。例えば、各配列決定サイクルにおいて、その第１の蛍光画像およびその第２の蛍光画像の強度の５％および９５％が、０および１に正規化され得る。配列決定サイクルがインデックス付加されたリード（ｉｎｄｅｘｅｄｒｅａｄ）内にある場合、インデックス付加されなかったリードの最後のサイクルからの９５パーセンタイルは、正規化に使用され得る。空間的正規化は、サイクル依存性強度バリエーションを低減し得る。

図７Ａ～Ｄは、単一の光源・２光学チャネル配列決定のための色補正および位相補正を示す模式的プロットである。図７Ａは、その第１の蛍光標識とその第２の蛍光標識との間にクロストークが存在しない場合に、その第１の蛍光画像からの抽出した強度または空間的に正規化した強度の、位置（ｘ_ｉ，ｙ_ｉ）における第２の蛍光画像における相当する位置からの抽出した強度に対する散布図である。ｘ_ｉは、その第２の蛍光画像における成長中のプライマー－ポリヌクレオチドのクラスターｉの空間的に正規化した強度を示す。ｙ_ｉは、その第１の蛍光画像における成長中のプライマー－ポリヌクレオチドのクラスターｉの空間的に正規化した強度を示す。ｄＧＴＰアナログは、第１の蛍光標識も第２の蛍光標識もいずれも含まないので、その第１の蛍光画像またはその第２の蛍光画像において蛍光発光を有しない。従って、ｄＧＴＰアナログの集団は、その散布図の位置（０，０）にある。ｄＴＴＰアナログは、第１の蛍光標識を含むので、その第１の蛍光画像において蛍光発光を有し、その第２の蛍光画像において有しない。従って、ｄＴＴＰアナログの集団は、その散布図の位置（０，１）にある。ｄＣＴＰアナログは、第２の蛍光標識を含むので、その第２の蛍光画像において蛍光発光を有し、その第１の蛍光画像において有しない。従って、ｄＣＴＰアナログの集団は、その散布図の位置（１，０）にある。ｄＡＴＰアナログは、その第１の蛍光標識およびその第２の蛍光標識を含むので、その第１の蛍光画像およびその第２の蛍光画像において、蛍光発光を有する。ｄＡＴＰアナログの集団は、その第１の蛍光標識およびその第２の蛍光標識の間にクロストークが存在しないので、その散布図の位置（１，１）にある。

図７Ｂは、その２種の蛍光標識が重なり合う発光スペクトルを有しかつクロストークを受けやすい場合の散布図の模式図を示す。その第１の蛍光標識およびその第２の蛍光標識はクロストークを受けやすいので、ｄＴＴＰアナログは、その第１の蛍光画像においてより強い発光を、およびその第２の蛍光画像においてより弱い発光を有する。従って、ｄＴＴＰアナログの集団からの蛍光発光に相当する点の集合体（ｃｌｏｕｄ）は、（０，１）あたりの位置、例えば、（０．２，０．８）にある。ｄＣＴＰアナログは、その第２の蛍光画像においてより強い発光を、およびその第１の蛍光画像においてより弱い発光を有する。従って、ｄＣＴＰアナログの集団からの蛍光発光に相当する点の集合体は、（１，０）あたりの位置、例えば、（０．８，０．２）にある。ｄＡＴＰアナログの集団からの蛍光発光に相当する点の集合体は、（１，１）あたりの位置、例えば、（０．９，０．９）にある。

その第１の蛍光標識とその第２の蛍光標識との間のクロストークを低減または排除するために、その抽出した強度またはその空間的に正規化した強度を、５４５において色補正し得る。色補正は、各蛍光画像内の根底にある強度分布の特性を利用して、その抽出した強度を調整するために、カラーマトリクスを利用し得る。

２チャネルカラーマトリクスは、２チャネル捕捉、例えば、第１のチャネルおよび第２のチャネルの間のクロストークを補正するために使用される２×２マトリクスであり得る。その第１のチャネルは、配列決定サイクルにおいて、その第１の蛍光画像およびその第２の蛍光画像を捕捉し得る。例えば、クラスターが、その第１の蛍光画像に相当するその第１のチャネルにおいて明るくなる場合、その発光のうちのいくらかはまた、その第２の蛍光画像に相当する第２のチャネルにおいて集められる。色補正は、その２チャネルカラーマトリクスを使用して、そのクロストークを低減または排除し得るマトリクス補正した強度を生成することを包含し得る。そのカラーマトリクスはまた、カラーチャネルの間の強度全体における任意の差異のバランスをとり得る。そのカラーマトリクスＭ、
は、蛍光標識ｋによるその蛍光発光を捕捉するチャネルｊにおいて観察された強度の量を示すクロストーク係数Ｍ_ｊ，ｋを有する。例えば、Ｍ_１，１は、第１の蛍光標識（すなわち、蛍光標識１）によるその蛍光発光を捕捉する第１の蛍光画像（すなわち、チャネル１）において観察された強度の量を示す。例えば、Ｍ_１，２は、その第１の蛍光標識およびその第２の蛍光標識（すなわち、蛍光標識２）の間の重なり合う発光スペクトルのために、その第２の蛍光標識によるその蛍光発光を捕捉する第１の蛍光画像（すなわち、チャネル１）において観察された強度の量を示す。

そのカラーマトリクスは、初期の配列決定サイクル、例えば、配列決定サイクル１～１０の構成可能なセットに対して集められたクラスター強度に基づいて推測され得る。このカラーマトリクスは、サイクル依存性である相対的強度の正規化とともに、その配列決定サイクルの残りに使用され得る。

そのカラーマトリクスは、そのチャネルの対の間のクロストークを推測するために使用され得る。なぜならそれらは、重なり合う発光スペクトルを有するからである。いくつかの実施形態において、そのカラーマトリクスを推測することは、位置（ａ_{ｉ，チャネル２}，ａ_{ｉ，チャネル１}）においてプロットされた強度を極座標へと変換することを包含し得る（ここでｉは、クラスター番号を示し、ａ_{ｉ，チャネル１}は、第１のチャネルにおけるｉ番目のクラスターの強度を示し、ａ_{ｉ，チャネル２}は、第２のチャネルにおけるｉ番目のクラスターの強度を示す）。そのカラーマトリクスを推測することは、位置（ａ_{ｉ，チャネル２}，ａ_{ｉ，チャネル１}）においてプロットされた強度からの範囲［０，９０］において角度θ_ｉの区域重み付けヒストグラムを計算することを包含し得る。その第２の蛍光画像におけるａ_{ｉ，チャネル２}の強度およびその第１の蛍光画像におけるａ_{ｉ，チャネル１}の強度を有するクラスターｉに関して、規模ｒ_ｉは、強度ａ_{ｉ，チャネル１}およびａ_{ｉ，チャネル２}に基づき得る（例えば、（ａ_{ｉ，チャネル１} ^２
＋ａ_{ｉ，チャネル２} ^２）^１／２）。角度θ_ｉは、ｔａｎ^－１（ａ_{ｉ，チャネル１}／ａ_{ｉ，チャネル２}）であり得る。図７Ｃは、その２種の蛍光標識が重なり合う発光スペクトルを有しかつクロストークを受けやすい場合の区域重み付けヒストグラムの模式図を示す。図７Ｂの位置（ａ_{ｉ，チャネル１}，ａ_{ｉ，チャネル２}）における強度は、図７Ｃの区域重み付け角度ヒストグラムへと変換され得る。単一の光源・２チャネル配列決定に関して、その区域重み付け角度ヒストグラムは、図７Ｂにおいて、ｄＴＴＰアナログ、ｄＡＴＰアナログ、およびｄＣＴＰアナログの点の集合体にそれぞれ相当する３つのピークを含む。ｄＡＴＰアナログの点の集合体に相当する中央のピークは、およそ４５°という角度にある。

そのカラーマトリクスを推測することは、その区域重み付けヒストグラムにおいて、２つの外側極大値θ_１およびθ_２を識別することを包含し得る。クロストークを有しないチャネルに関しては、θ_１は０°であり、θ_２は９０°である。そのマトリクスにおけるクロストーク係数Ｍ_１，２は、例えば、ｔａｎ（θ_１）であり得る。そのマトリクスにおけるクロストーク係数Ｍ_２，１は、例えば、ｔａｎ（９０－θ_２）であり得る。いくつかの実施形態において、不十分な数のクラスターが、その４つのヌクレオチドのうちの１つとともに呼び出され得る場合、カラーマトリクス推測は、理想的ではない可能性があり、識別マトリクスが代わりに使用され得る。そのマトリクスの対角線の要素は、１であり得、そのカラーマトリクスは、
であり得る。

そのカラーマトリクスは、１という行列式（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を有するように正規化され得る。いくつかの実施形態において、初期の配列決定サイクルのカラーマトリクスは、その後の配列決定サイクルに使用され得る。その補正した強度は、色補正された強度を生成するために、図７Ｂにおいてプロットされた強度にそのカラーマトリクスの逆をかけることによって計算され得る。図７Ｄは、色補正後の図７Ｂの強度の散布図の模式図を示す。補正した強度を用いると、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＡＴＰに相当する個々のクラスターは、より良好に分離され得る。いくつかの実施形態において、蛍光画像は、複数のタイルへと分けられ得、カラーマトリクスは、各タイルに関して推測され得る。いくつかの実施形態において、カラーマトリクスは、多くの配列決定サイクルの強度を使用して推測され得る。図７Ｂおよび７Ｄの蛍光発光の点の集合体のサイズおよび形状は、例証のために過ぎない。例えば、図７Ｄの色補正後のｄＡＴＰアナログの集団に相当する点の集合体は、図７Ｂの色補正前のｄＡＴＰアナログの集団に相当する点の集合体より大きい可能性がある。

図５を参照すると、その色補正した強度は、ブロック５５０において位相補正され得る。合成しながら配列決定するプロセスの間に、プライマー－ポリヌクレオチドのクラスターにおける各プライマーまたは伸長したプライマーは、１塩基／サイクル伸長し得る。鎖の小さな割合が、塩基を遅らせる（位相同期）または塩基を前に進める（事前位相同期）のいずれかで、現在の配列決定サイクルに伴って位相がずれることがある。配列決定の各サイクルに関して、位相同期補正は、データ品質を最大化するために、例えば、位相同期マトリクスを決定し、その位相同期マトリクスをその抽出した強度に適用することによって、計算され得る。

塩基呼び出し
ブロック５５５において、成長中のプライマー－ヌクレオチドのクラスターへと組み込まれるヌクレオチドの塩基は、例えば、塩基呼び出し側２２６によって決定され得る。品質スコアは、呼び出された各塩基に対して決定され得る。図６を参照すると、第１の配列決定サイクルにおいて、クラスター１は第１の蛍光画像および第２の蛍光画像の両方において蛍光発光を有するので、その組み込まれるヌクレオチドは、ｄＡＴＰアナログである。クラスター２は、第２の蛍光画像のみにおいて蛍光発光を有するので、その組み込まれるヌクレオチドは、ｄＣＴＰアナログである。クラスター４は、第１の蛍光画像のみにおいて蛍光発光を有するので、その組み込まれるヌクレオチドは、ｄＴＴＰアナログである。

第２の配列決定サイクルにおいて、クラスター１～４に組み込まれるヌクレオチドは、それぞれ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＡＴＰであり得る。クラスター３の存在を決定した後に、その第１の配列決定サイクルの間にクラスター３に組み込まれるヌクレオチドは、その第１の蛍光画像またはその第２の蛍光画像において蛍光発光を有しないｄＧＴＰであり得る。第３の配列決定サイクルの後に、そのクラスター１～４は、それぞれ、ＡＧＴ、ＣＣＡ、ＧＴＡ、およびＴＡＧのヌクレオチド配列を有すると決定され得る。

いくつかの実施形態において、ブロック５５５における塩基呼び出しは、ブロック５３５からの補正した強度に基づき得る。ヌクレオチドと図７Ｄの散布図上の集団との間の対応は、以下のように定義され得る：集団がその第１のチャネルにおいてオフであり、その第２のチャネルにおいてオフである場合、その組み込まれるヌクレオチドは、ｄＧＴＰアナログである；集団がその第２のチャネルにおいてオフであり、その第１のチャネルにおいてオンである場合、その組み込まれるヌクレオチドは、ｄＴＴＰアナログである；集団がその第２のチャネルにおいてオンであり、その第１のチャネルにおいてオフである場合、その組み込まれるヌクレオチドは、ｄＣＴＰアナログである；そして集団がその第１のチャネルにおいてオンであり、その第２のチャネルにおいてオンである場合、その組み込まれるヌクレオチド塩基呼び出しは、ｄＡＴＰアナログである。

塩基呼び出しは、その補正された強度を（０，１）へと、５パーセンタイルおよび９５パーセンタイルによって正規化することを含み得る。４つのガウス分布（ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＡＴＰの各々につき１つ）は、期待値最大化アルゴリズム（ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を介して補正されかつ正規化された強度のデータにフィットされ得る。その期待値最大化アルゴリズムは、どの手段および分布がそのデータにベストフィットするかを決定し得る。そのガウス分布を計算した後に、各集団に関して、各ガウス分布に属する集団の尤度を計算し得る。塩基呼び出しは、特定のガウス分布に属する集団の最大尤度に基づき得る。低多様性サンプルに関しては、その期待値最大化アルゴリズムは、共分散マトリクスを識別して、過剰適合データを回避するために使用され得る。標的をサブサンプリングすることは、正確性のために多量のデータをサンプリングするために増大され得る。

いくつかの実施形態において、その集団は、簡素評価基準（ｃｈａｓｔｉｔｙｍｅｔｒｉｃ）によってフィルタにかけられ得る。簡素評価基準は、例えば、Ｄ１／（Ｄ１＋Ｄ２）であり得る。Ｄ１は、最も近いガウス平均までの距離であり得、Ｄ２は、次の最も近い距離までの距離であり得る。その距離は、例えば、各ガウスセントロイド（Ｇａｕｓｓｉａｎｃｅｎｔｒｉｏｄ）および考慮中の点によって定義される直線に沿った分布の幅を考慮に入れることができるマハラノビス法を使用して測定され得る。

ブロック５６０において、１またはこれより多くの品質評価基準は、ブロック５６５においてその方法が終了する前に決定され得る。配列決定品質評価基準は、このプロセスにおける各工程（ライブラリー調製、塩基呼び出し、リードアラインメント、およびバリアント呼び出しを含む）の正確性についての重要な情報を提供し得る。塩基呼び出しの正確性（Ｐｈｒｅｄ品質スコア（Ｑスコア）によって測定される）は、配列決定プラットフォームの正確性を評価するために使用され得る。それは、所定の塩基が配列決定機によって不正確に呼び出される確率を示し得る。そのＱスコアは、１０ｌｏｇ_１０Ｐであり得、ここでＰは、塩基呼び出しエラー確率である。

クラスタースケーリング
いくつかの実施形態において、強度を補正することは、クラスタースケーリングを包含し得る。クラスターは、変動する明るさを有し得る。例えば、いくつかのクラスターは明るい可能性があり、いくつかのクラスターは薄暗い可能性がある。そのクラスターの明るさは、そのサンプルのフラグメント長分布によって引き起こされ得る。そのクラスター集団の変動する明るさは、塩基呼び出し散布図における「オン」集団を延ばすという効果を有し得る。各クラスターの強度を最初の１０サイクルにおけるその平均強度によって正規化して、集団強度バリエーションを低減することは有利であり得る。例えば、その最初の１０サイクルにおいて、全ての非グアニン（Ｇ）塩基呼び出しに関して、２つの区域が計算され得る：起源からの集団強度の距離、および起源からの相当するガウス平均の距離。クラスタースケーリングは、例えば、その最初の１０サイクルに対して平均したこれら２つの区域の比の平均に正規化する工程を包含し得る。全てのクラスター強度は、位相補正および塩基呼び出しが行われる前に、このスケーリング因子によって正規化され得る。クラスタースケーリングは、有利なことには、スループットを増大し得、例えば、大きなフラグメント長分布を有するサンプルに関して、エラー率を減少させ得る。

単一の光源・複数光学チャネル配列決定機
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するためのシステムまたは方法の実施形態が本明細書で開示される。一実施形態において、そのシステムは、光（例えば、所定の波長にある光）を発生させるように構成された単一の光源（例えば、レーザーまたはＬＥＤ光源）を含み得るか、またはこれと連絡状態にあり得る。そのシステムは、ヌクレオチドに付着された異なる発蛍光団から４つの実質的に異なる蛍光発光を検出するように構成された少なくとも１つの検出器を含み得るか、またはこれと連絡状態にあり得る。そのシステムは、その光源に、ヌクレオチド上への光を発生させ得る。そのヌクレオチドは、第１の蛍光発光がその少なくとも１つの検出器によって検出される場合に、第１のタイプとして識別され得る。そのヌクレオチドは、第２の蛍光発光がその少なくとも１つの検出器によって検出される場合に、第２のタイプとして識別され得る。そのヌクレオチドは、第３の蛍光発光がその少なくとも１つの検出器によって検出される場合に、第３のタイプとして識別され得る。そのヌクレオチドは、第４の蛍光発光がその少なくとも１つの検出器によって検出される場合に、第４のタイプとして識別され得る。その第１の蛍光発光、その第２の蛍光発光、その第３の蛍光発光、およびその第４の蛍光発光のうちの少なくとも２つは、実質的に異なる波長を有し得る。

異なるタイプのヌクレオチドは、異なる発蛍光団に付着されることがあるか、または発蛍光団に付着されないことがある。例えば、第１のタイプのヌクレオチドは、単一の光源によって励起可能な発蛍光団に付着されてなくてもよく、第１の蛍光発光は、発光なしを含む。別の例では、第１のタイプのヌクレオチドは、２種の異なる発蛍光団に付着されていてよく、第１の蛍光発光は、２種の異なる発蛍光団からの発光を含む。

なお別の例では、第１の蛍光発光は、第１のタイプの第１のヌクレオチドに付着された第１の発蛍光団に由来し、第２の蛍光発光は、第２のタイプの第２のヌクレオチドに付着された第２の発蛍光団に由来し、第３の蛍光発光は、第３のタイプの第３のヌクレオチドに付着された第３の発蛍光団に由来し、第４の蛍光発光は、第４のタイプの第４のヌクレオチドに付着された第４の発蛍光団に由来する。その４つの発蛍光団は、光源を使用して励起され得る。一つの実行において、その第１の発蛍光団、その第２の発蛍光団、その第３の発蛍光団、およびその第４の発蛍光団のうちの４つ全てが異なる。例えば、そのヌクレオチド配列は、４つの異なる波長における４種の色素による発光に基づいて決定され得る。別の実行において、その第１の発蛍光団、その第２の発蛍光団、その第３の発蛍光団、およびその第４の発蛍光団のうちの３つは異なる。例えば、そのヌクレオチド配列は、３つの異なる波長における３種の色素による発光に基づいて決定され得る。別の実行において、その第１の発蛍光団、その第２の発蛍光団、その第３の発蛍光団、およびその第４の発蛍光団のうちの２つは同一である。例えば、そのヌクレオチド配列は、２つの異なる波長における２種の色素による発光に基づいて決定され得る。

配列決定法
本明細書で記載される方法は、種々の核酸配列決定技術とともに使用され得る。特に適用可能な技術は、核酸がアレイの中の固定された位置に付着され、その結果、それらの相対的な位置が変化せず、そしてそのアレイが反復して画像化されるものである。画像が異なるカラーチャネルにおいて、例えば、一方のヌクレオチド塩基タイプを別のものから区別するために使用される異なる標識が同時に存在して得られる実施形態は、特に適用可能である。いくつかの実施形態において、標的核酸のヌクレオチド配列を決定するプロセスは、自動化プロセスであり得る。好ましい実施形態としては、逐次合成配列決定を行う（「ＳＢＳ」）技術が挙げられる。

「逐次合成配列決定を行う（「ＳＢＳ」）技術」は、一般に、テンプレート鎖に対するヌクレオチドの反復付加を通じて、発生しようとしている核酸鎖の酵素による伸長を包含する。ＳＢＳの旧来の方法において、単一のヌクレオチドモノマーは、各送達においてポリメラーゼの存在下で標的ヌクレオチドに提供され得る。しかし、本明細書で記載される方法において、１種より多くのタイプのヌクレオチドモノマーが、送達においてポリメラーゼの存在下で標的核酸に提供され得る。

以前に記載された実施形態のうちの少なくともいくつかにおいて、ある実施形態において使用される１またはこれより多くの要素は、このような置き換えが技術的に可能でないのでなければ、別の実施形態において交換可能に使用され得る。種々の他の省略、追加および改変が、特許請求された主題の範囲から逸脱することなく、上記の方法および構造に対して行われ得ることは、当業者によって認識される。全てのこのような改変および変更は、添付の特許請求の範囲によって規定されるように、主題の範囲内に入ることが意図される。

本明細書での実質的に任意の複数形および／または単数形の用語の使用に関しては、当業者は、状況および／または適用に適している場合には、複数形から単数形および／または単数形から複数形へと解釈し得る。種々の単数形／複数形の入れ替えは、明瞭性のために、本明細書で明示的に示され得る。

一般に、本明細書で使用される用語、および特に添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求項の範囲の本体部分）において使用される用語が、概して「非限定の（ｏｐｅｎ）」用語として意図される（例えば、用語「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「が挙げられるが、これらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｂｕｔｎｏｔｌｉｍｉｔｅｄｔｏ）」と解釈されるべきであり、用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、「少なくとも有する（ｈａｖｉｎｇａｔｌｅａｓｔ）」と解釈されるべきであり、用語「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は、「が挙げられるが。これらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｅｓｂｕｔｉｓｎｏｔｌｉｍｉｔｅｄｔｏ）」と解釈されるべきである、など）は、当業者によって理解される。導入された請求項の記載の具体的数字が意図される場合、このような意図が請求項の中で明示的に記載され、そしてこのような記載がない場合には、このような意図が存在しないことは、当業者によってさらに理解される。例えば、理解の助けとして、以下の添付の特許請求の範囲は、請求項の記載を導入するために導入句「少なくとも１（ａｔｌｅａｓｔｏｎｅ）」および「１またはこれより多く（ｏｎｅｏｒｍｏｒｅ）」の使用を含み得る。しかし、このような語句の使用は、不定冠詞「１つの、ある（ａ）」または「１つの、ある（ａｎ）」による請求項の記載の導入が、同じ請求項が導入句「１またはこれより多く」または「少なくとも１」、および「１つの、ある（ａ）」または「１つの、ある（ａｎ）」のような不定冠詞を含む場合にすら、このような導入された請求項の記載を含む任意の特定の請求項を、１つのみのこのような記載を含む実施形態に限定することを示唆するとは解釈されるべきでない（例えば、「１つの、ある（ａ）」および／または「１つの、ある（ａｎ）」は、「少なくとも１」または「１またはこれより多く」を意味すると解釈されるべきである）；請求項の記載を導入するために使用される定冠詞の使用に関しても同じことが当てはまる。さらに、導入された請求項の記載の具体的な数が明示的に記載されている場合ですら、当業者は、このような記載が少なくともその記載された数を意味すると解釈されるべきであることを認識する（例えば、「２つの記載（ｔｗｏｒｅｃｉｔａｔｉｏｎｓ）」というそのままの記載は、他の修飾語がなければ、少なくとも２つの記載、または２またはこれより多くの記載を意味する）。さらに、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つなど（ａｔｌｅａｓｔｏｎｅｏｆＡ，Ｂ，ａｎｄＣ，ｅｔｃ．）」に類似の慣例が使用されるそれらの場合には、概してこのような解釈は、当業者がその慣例を理解する意味において意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つを有するシステム（ａｓｙｓｔｅｍｈａｖｉｎｇａｔｌｅａｓｔｏｎｅｏｆＡ，Ｂ，ａｎｄＣ）」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡおとびＢを一緒に、ＡおよびＣを一緒に、ＢおよびＣを一緒に、ならびに／またはＡ、Ｂ、およびＣを一緒に有するシステムが挙げられるがこれらに限定されない、など）。「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つなど」に類似の慣例が使用されるそれらの場合において、概してこのような解釈は、当業者がその慣例を理解する意味において意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡおとびＢを一緒に、ＡおよびＣを一緒に、ＢおよびＣを一緒に、ならびに／またはＡ、Ｂ、およびＣを一緒に有するシステムが挙げられるがこれらに限定されない、など）。実質的に任意の離節語、および／または２またはこれより多くの選択肢的な用語を表す語句は、説明の中であろうが、請求項の中であろうが、図面の中であろうが、その用語のうちの一方、その用語のうちのいずれか、または両方の用語を含むという可能性を企図することが理解されるべきであることは、当業者によってさらに理解される。例えば、語句「ＡまたはＢ（ＡｏｒＢ）」は、「Ａ」もしくは「Ｂ」、または「ＡおよびＢ」の可能性を含むことが理解される。

さらに、本開示の特徴および局面が、マーカッシュグループに関して記載される場合、当業者は、本開示がまたそれによって、マーカッシュグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーの下位グループに関して記載されることを認識する。

当業者によって理解されるように、任意のおよび全ての目的のために、例えば、書面による説明を提供するという点から、本明細書で開示される全ての範囲はまた、任意のおよび全ての考えられる部分範囲およびその部分範囲の組み合わせを包含する。任意の列挙された範囲は、十分に記載されておりかつその同じ範囲が少なくとも１／２、１／３、１／４、１／５、１／１０などへと分解されることを可能にすると容易に理解され得る。非限定的な例として、本明細書で考察される各範囲は、下１／３、中央１／３、および上１／３などへと容易に分解され得る。同様に当業者によって理解されるように、「まで」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」などのような全ての文言は、記載される数字を含み、上記で考察されるように部分範囲へとその後に分解され得る範囲に言及する。最後に、当業者によって理解されるように、範囲は、各個々のメンバーを含む。従って、例えば、１～３個の物品を有する群は、１個、２個、または３個の物品を有する群に言及する。同様に、１～５個の物品を有する群は、１個、２個、３個、４個または５個の物品を有する群に言及するなど。

種々の局面および実施形態が本明細書で開示されてきたが、他の局面および実施形態が当業者に明らかである。本明細書で開示される種々の局面および実施形態は、例証目的であり、限定するとは意図されず、その真の範囲および趣旨は、以下の特許請求の範囲によって示される。

Claims

明細書に記載の発明。