JP2020162591A - デジタル計測のための方法 - Google Patents
デジタル計測のための方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2020162591A JP2020162591A JP2020049669A JP2020049669A JP2020162591A JP 2020162591 A JP2020162591 A JP 2020162591A JP 2020049669 A JP2020049669 A JP 2020049669A JP 2020049669 A JP2020049669 A JP 2020049669A JP 2020162591 A JP2020162591 A JP 2020162591A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- reaction
- image
- negative
- blocks
- positive
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 238000005259 measurement Methods 0.000 title abstract description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 43
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 abstract description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 11
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MLNKXLRYCLKJSS-RMKNXTFCSA-N (2e)-2-hydroxyimino-1-phenylethanone Chemical compound O\N=C\C(=O)C1=CC=CC=C1 MLNKXLRYCLKJSS-RMKNXTFCSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- -1 DNA or RNA Chemical class 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 241000353097 Molva molva Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000307 polymer substrate Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
Abstract
【課題】デジタル計測を効率的に実施する方法の提供。【解決手段】標的分子を含む反応液を複数の区画に分割する工程と、前記標的分子が存在する区画においてシグナルを生じる反応を行う工程と、前記複数の区画のシグナルを解析するための画像を取得する工程と、前記画像を用いて、陽性区画については陽性区画と陰性区画のシグナル強度比、陰性区画については陰性区画と背景のシグナル強度比からそれぞれ計数する工程と、を含んでなる方法。【選択図】図1
Description
本発明は、特定の物質を検出・定量する方法に関するものである。
1分子計測にもとづき生体分子や細胞の作動メカニズムを明らかにする1分子生物学が近年は進展しつつあり、中でもデジタル計測技術が注目されている。デジタル計測は、反応液を微小区画に分画し、微小区画毎に反応を行う。その際、1分子単位の分画が可能であり、反応後、各区画に標的分子を含むか(シグナルが陽性)、含まないか(シグナルが陰性)をシグナルの有無で計測し、それぞれの分画のシグナル数を、標的分子の数として換算することで絶対定量が可能であることから、デジタル計測は、高精度、高感度な革新的な計測技術である。しかし、微小区画に反応液を分画して、特異的な反応を行い検出するには、複雑な機器が必要になる可能性があり、コストが増大する。
デジタルPCRでは、特定の配列のDNAの混合物を、多数の微小区画に分配して、個々の微小区画で同時並行にPCRが行われる。1つ又は複数の標的分子を含む微小区画もあれば、標的分子を全く含まない微小区画も存在しており、PCR終了後に微小区画毎にPCR増幅の有無を解析し、ポアソンモデルを用いることで、特定の配列のDNAの絶対数が算出される。
特許文献1は、複数のナノリットルスケールの反応サイトとなる微細孔を有するチップを用いて、生物学的反応を行うためのシステムを開示している。少なくとも20000個の反応サイトを含むことを特徴としており、ポリメラーゼ連鎖反応による遺伝子の増幅にも利用できることが記述されている。
特許文献2は、マイクロ流路デバイスを用いて、水、油、および化学的に不活性な液体中で微小な液滴を製造し、ポリメラーゼ連鎖反応によりターゲット核酸を分析するための液滴に基づくアッセイにおける光検出および信号処理のためのシステムが開示されている。
特許文献3は、mL容量の単一蛍光液滴の正確な検出を数分以内でできる高処理能を持つ3D粒子カウンターシステムを開示しており、液滴内部に、細胞表面、細胞内及び/又は分泌マーカーをカプセル化し解析するための3D粒子ディテクターシステムについて記述されている。
特許文献2は、マイクロ流路デバイスを用いて、水、油、および化学的に不活性な液体中で微小な液滴を製造し、ポリメラーゼ連鎖反応によりターゲット核酸を分析するための液滴に基づくアッセイにおける光検出および信号処理のためのシステムが開示されている。
特許文献3は、mL容量の単一蛍光液滴の正確な検出を数分以内でできる高処理能を持つ3D粒子カウンターシステムを開示しており、液滴内部に、細胞表面、細胞内及び/又は分泌マーカーをカプセル化し解析するための3D粒子ディテクターシステムについて記述されている。
本発明の目的は、上記の課題を解決するために、微小区画内で反応を行った後、陽性区画と全区画を簡便に計数する方法を提供することにある。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の一態様は、標的分子を含む反応液を複数の区画に分割する工程と、前記標的分子が存在する区画においてシグナルを生じる反応を行う工程と、前記複数の区画のシグナルを解析するための画像を取得する工程と、前記画像を用いて、陽性区画については陽性区画と陰性区画のシグナル強度比、陰性区画については陰性区画と背景のシグナル強度比からそれぞれ計数する工程と、を含んでなる。
反応液を平面上に区画化し反応を行った後、単一の波長での蛍光観察画像を用いた解析により、迅速かつ高精度に陽性区画と陰性区画を計数することで、デジタル計測を効率的に実施することが可能となる。
以下、本発明について詳細に説明する。
(1)標的分子を含む反応液を複数の区画に分割する工程について
標的分子を含む反応液を複数の区画に分割する方法として、数万個の微細孔(極めて小さいウェル)をもった特殊なプレートを用いて、その微細孔に反応液を分配する方法(微細孔分配方式)、反応液を特別な乳化剤を用いて数万〜1,000万の微小な液滴(ドロップレット)に分割する方法(ドロップレット方式)などが挙げられる。液滴を作製するのにマイクロ流路デバイスがよく用いられている。また、マイクロ流体デバイスを用いて、2種類の液体を混合させ、液滴を作製することもできる。
標的分子を含む反応液を複数の区画に分割する方法として、数万個の微細孔(極めて小さいウェル)をもった特殊なプレートを用いて、その微細孔に反応液を分配する方法(微細孔分配方式)、反応液を特別な乳化剤を用いて数万〜1,000万の微小な液滴(ドロップレット)に分割する方法(ドロップレット方式)などが挙げられる。液滴を作製するのにマイクロ流路デバイスがよく用いられている。また、マイクロ流体デバイスを用いて、2種類の液体を混合させ、液滴を作製することもできる。
(2)標的分子が存在する区画においてシグナルを生じる反応を行う工程について
シグナルを生じる反応としては特に限定はなく、酵素反応などが例示できる。なお、標的分子がDNAやRNAなどの核酸である場合、等温反応により増幅させてもよい。
酵素反応により発生するシグナルは一般的なバイオ研究分野で使用されている標識物質を用いることで得ることができる。具体例としては、酵素、蛍光色素、金粒子、放射性物質などが挙げられる。酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ(セイヨウワサビペルオキシダーゼ等)、βガラクトシダーゼ等、公知のものを用いることができる。酵素を標識物質として用いる場合、該酵素に対応した発色基質、蛍光基質又は発光基質等の基質を該酵素と反応させ、その結果発生する発色、蛍光、発光等のシグナルを検出すればよい。
微小区画内でのDNAやRNAの増幅工程において、反応液に検出用試薬を添加しておくことで、反応液の蛍光や化学発光強度を測定することで、標的DNA及び/又はRNAを検出することができる。
検出用試薬としては、特定塩基配列に相補的な配列を有し、該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するように標識された第3の一本鎖オリゴヌクレオチド、モレキュラービーコン、FRETプローブ、TaqManプローブなどや、インターカレーター性色素などを用いることができる。
シグナルを生じる反応としては特に限定はなく、酵素反応などが例示できる。なお、標的分子がDNAやRNAなどの核酸である場合、等温反応により増幅させてもよい。
酵素反応により発生するシグナルは一般的なバイオ研究分野で使用されている標識物質を用いることで得ることができる。具体例としては、酵素、蛍光色素、金粒子、放射性物質などが挙げられる。酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ(セイヨウワサビペルオキシダーゼ等)、βガラクトシダーゼ等、公知のものを用いることができる。酵素を標識物質として用いる場合、該酵素に対応した発色基質、蛍光基質又は発光基質等の基質を該酵素と反応させ、その結果発生する発色、蛍光、発光等のシグナルを検出すればよい。
微小区画内でのDNAやRNAの増幅工程において、反応液に検出用試薬を添加しておくことで、反応液の蛍光や化学発光強度を測定することで、標的DNA及び/又はRNAを検出することができる。
検出用試薬としては、特定塩基配列に相補的な配列を有し、該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するように標識された第3の一本鎖オリゴヌクレオチド、モレキュラービーコン、FRETプローブ、TaqManプローブなどや、インターカレーター性色素などを用いることができる。
標的分子が存在する区画である陽性区画では、標識物質により発色、蛍光、発光等シグナルが発生する。反応液中の標的分子数を計数するためには、ポアソン分布にあてはめて最終濃度を算出する必要があるため、標的分子が存在しない区画である陰性区画も計数する必要がある。しかしながら、陰性区画においては、シグナルが生じないためバックグラウンドと見極めが困難であることがある。そのため、画像データを取得する際に、陰性区画に微弱なシグナルを生じるよう試薬を添加する。
例えば、蛍光色素であるテトラクロロ−6−カルボキシフルオレセイン(TET)を蛍光基とするモレキュラービーコンを核酸増幅の検出用プローブと使用した場合、微量のフルオレセインなどの蛍光基質を添加しておくことができる。
例えば、蛍光色素であるテトラクロロ−6−カルボキシフルオレセイン(TET)を蛍光基とするモレキュラービーコンを核酸増幅の検出用プローブと使用した場合、微量のフルオレセインなどの蛍光基質を添加しておくことができる。
(3)複数の区画のシグナルを解析するための画像を取得する工程について
個々のシグナルを空間的に分解するのに適切な照明および解像度を有するカメラ又はイメージング装置を用いて蛍光画像を取得する。カメラまたはイメージング装置としては、公知のものが利用でき、例えばカメラは、電荷結合素子(CCD)、電荷注入装置(CID)、フォトダイオードアレイ(PDA)または相補型金属酸化物半導体(CMOS)を含む任意の普通の半導体イメージセンサを使用することができる。また検出の際、励起/放射された光の偏光を使用することによって改善することができる。例えば、蛍光シグナルを発する液滴を検出する場合、その検出領域を大きな視野を持つ光学ユニットによって一括で撮影することで、迅速かつハイスループットなシグナル検出を行なうことが可能になる。
個々のシグナルを空間的に分解するのに適切な照明および解像度を有するカメラ又はイメージング装置を用いて蛍光画像を取得する。カメラまたはイメージング装置としては、公知のものが利用でき、例えばカメラは、電荷結合素子(CCD)、電荷注入装置(CID)、フォトダイオードアレイ(PDA)または相補型金属酸化物半導体(CMOS)を含む任意の普通の半導体イメージセンサを使用することができる。また検出の際、励起/放射された光の偏光を使用することによって改善することができる。例えば、蛍光シグナルを発する液滴を検出する場合、その検出領域を大きな視野を持つ光学ユニットによって一括で撮影することで、迅速かつハイスループットなシグナル検出を行なうことが可能になる。
(4)画像を用いて、陽性区画については陽性区画と陰性区画のシグナル強度比、陰性区画については陰性区画と背景のシグナル強度比からそれぞれ計数する工程について
陽性区画と陰性区画のシグナル強度比、陰性区画と背景のシグナル強度比は、いずれも2.0以上となると、視認性が増すため好ましい。シグナル強度比を2.0以上とするには、前述した蛍光色素の添加などが方法として挙げられる。なお、「背景のシグナル」とは、液滴がない部分のシグナルを指し、全体蛍光画像から液滴がない背景部分の蛍光強度を5箇所程度測定し、平均値を算出して用いればよい。
さらに、解析ソフトを用いて、パラメータを調整し、液滴が存在しないバックグラウンド輝度値や陰性液滴が計数されない平均輝度値を設定することで自動解析することも可能である。
陽性区画と陰性区画のシグナル強度比、陰性区画と背景のシグナル強度比は、いずれも2.0以上となると、視認性が増すため好ましい。シグナル強度比を2.0以上とするには、前述した蛍光色素の添加などが方法として挙げられる。なお、「背景のシグナル」とは、液滴がない部分のシグナルを指し、全体蛍光画像から液滴がない背景部分の蛍光強度を5箇所程度測定し、平均値を算出して用いればよい。
さらに、解析ソフトを用いて、パラメータを調整し、液滴が存在しないバックグラウンド輝度値や陰性液滴が計数されない平均輝度値を設定することで自動解析することも可能である。
以下、実施例及び比較例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例及び比較例で用いるマイクロ流路チップは、特開2019−170363号公報の実施例1に記載の方法で作製し、流路の幅、高さ、角度等も同一である。
実施例1
マイクロ流路チップ100を備えた反応装置1(図1〜3参照)を用いて、C型肝炎ウイルス(HCV)RNA(配列番号1)のデジタル等温核酸増幅に適用した。
(1)HCV遺伝子が挿入されたプラスミドから、in vitro転写によりHCV標準RNA(配列番号1)を調製した。当該標準RNAを注射用水を用いて104コピー/2μLとなるように希釈し、これをRNA試料とした。
(2)10μL中に 以下の組成を含む水溶液を調製し、これを標準RNAを含む反応液とした。なおモレキュラービーコンプローブ(配列番号7)は、標準RNAの相同鎖の5’末端側および3’末端側に、当該標準RNAと相補的二本鎖を形成しないときにはステムループ構造を形成できるようなオリゴヌクレオチドを、それぞれ6塩基付加しており(5’側の1塩基のみ重複している)、さらに5’末端側にはFAMを、3’末端側にはIDT社製IowaBlackFQをそれぞれ結合させている。
132mM Tris−HCl緩衝液(pH8.36)
5.0%(v/v) グリセロール
各0.66mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP
各4.0mM ATP、CTP、GTP、TTP
6.6mM ITP
193.2mM トレハロース
100nM モレキュラービーコンプローブ(標準RNAの相同鎖の一部[ 配列番号1の107番目から123番目まで]を含む:配列番号7)
2.0μM 第一のプライマー(配列番号3)
2.0μM 第二のプライマー(配列番号4)
2.5U Bst DNA Polymerase,Full Leng th
8.5U AMV逆転写酵素
94U T7 RNAポリメラーゼ
104コピー 標準RNA
第一のプライマー(配列番号3)は、標準RNAの相補鎖の部分配列(具体的には配列番号1の125番目から145番目まで:配列番号5)及び当該配列の5’末端側にT7プロモーター配列(配列番号6)を付加したオリゴヌクレオチドである。また第二のプライマー(配列番号4)は、標準RNAの相同鎖の部分配列(具体的には、配列番号1の1番目から16番目まで)からなるオリゴヌクレオチドである。さらに、TO(INAFプローブの合成に使用する色素)、フルオロセイン、FITC、ROXなどの色素を、TRC反応を阻害しない濃度で添加した。
マイクロ流路チップ100を備えた反応装置1(図1〜3参照)を用いて、C型肝炎ウイルス(HCV)RNA(配列番号1)のデジタル等温核酸増幅に適用した。
(1)HCV遺伝子が挿入されたプラスミドから、in vitro転写によりHCV標準RNA(配列番号1)を調製した。当該標準RNAを注射用水を用いて104コピー/2μLとなるように希釈し、これをRNA試料とした。
(2)10μL中に 以下の組成を含む水溶液を調製し、これを標準RNAを含む反応液とした。なおモレキュラービーコンプローブ(配列番号7)は、標準RNAの相同鎖の5’末端側および3’末端側に、当該標準RNAと相補的二本鎖を形成しないときにはステムループ構造を形成できるようなオリゴヌクレオチドを、それぞれ6塩基付加しており(5’側の1塩基のみ重複している)、さらに5’末端側にはFAMを、3’末端側にはIDT社製IowaBlackFQをそれぞれ結合させている。
132mM Tris−HCl緩衝液(pH8.36)
5.0%(v/v) グリセロール
各0.66mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP
各4.0mM ATP、CTP、GTP、TTP
6.6mM ITP
193.2mM トレハロース
100nM モレキュラービーコンプローブ(標準RNAの相同鎖の一部[ 配列番号1の107番目から123番目まで]を含む:配列番号7)
2.0μM 第一のプライマー(配列番号3)
2.0μM 第二のプライマー(配列番号4)
2.5U Bst DNA Polymerase,Full Leng th
8.5U AMV逆転写酵素
94U T7 RNAポリメラーゼ
104コピー 標準RNA
第一のプライマー(配列番号3)は、標準RNAの相補鎖の部分配列(具体的には配列番号1の125番目から145番目まで:配列番号5)及び当該配列の5’末端側にT7プロモーター配列(配列番号6)を付加したオリゴヌクレオチドである。また第二のプライマー(配列番号4)は、標準RNAの相同鎖の部分配列(具体的には、配列番号1の1番目から16番目まで)からなるオリゴヌクレオチドである。さらに、TO(INAFプローブの合成に使用する色素)、フルオロセイン、FITC、ROXなどの色素を、TRC反応を阻害しない濃度で添加した。
(3)10μL中に以下の組成を含む水溶液を調製し、これを開始液とした。
36.8mM 塩化マグネシウム
180.0mM 塩化カリウム
0.2%(w/v) Tween 20
18.0%(v/v)DMSO
5.0%(v/v) グリセロール
200nM モレキュラービーコンプローブ(配列番号7)
(4)マイクロ流路チップ100をサーマルサイクラー(Mastercycler nexus flat eco、Eppendorf社)の上に固定して、46℃に加熱した。
(5)マイクロ流路チップ100内にオイルを充填後、液体保持部20にオイルを100μL滴下した。
(6)反応液保持部10a/10b内のオイルを取り除いてから、反応液保持部10aには(2)で作製した反応液を、反応液保持部10bには(3)で作製した開始液を、それぞれ液温46℃の条件下で10μL滴下した。
(7)排出口80からオイルを吸引した。吸引開始後1から2分で反応合流部30付近は層流となり、液滴形成部40で反応液と開始液とが概ね1:1の液滴生成が開始された。
(8)吸引開始後3から5分後に当該吸引を停止し、そのまま46℃で20分間放置することで、液滴内等温増幅反応を完了させた。
(9)(8)の反応終了後のマイクロ流路チップ100を検出した。検出は、蛍光イメージング用の光源としてX−Cite 110LED、画像を取り込むためのCCDカメラとして、Cooling Camera System(Pacific Image Electronics社、台湾)を使用して行った。
36.8mM 塩化マグネシウム
180.0mM 塩化カリウム
0.2%(w/v) Tween 20
18.0%(v/v)DMSO
5.0%(v/v) グリセロール
200nM モレキュラービーコンプローブ(配列番号7)
(4)マイクロ流路チップ100をサーマルサイクラー(Mastercycler nexus flat eco、Eppendorf社)の上に固定して、46℃に加熱した。
(5)マイクロ流路チップ100内にオイルを充填後、液体保持部20にオイルを100μL滴下した。
(6)反応液保持部10a/10b内のオイルを取り除いてから、反応液保持部10aには(2)で作製した反応液を、反応液保持部10bには(3)で作製した開始液を、それぞれ液温46℃の条件下で10μL滴下した。
(7)排出口80からオイルを吸引した。吸引開始後1から2分で反応合流部30付近は層流となり、液滴形成部40で反応液と開始液とが概ね1:1の液滴生成が開始された。
(8)吸引開始後3から5分後に当該吸引を停止し、そのまま46℃で20分間放置することで、液滴内等温増幅反応を完了させた。
(9)(8)の反応終了後のマイクロ流路チップ100を検出した。検出は、蛍光イメージング用の光源としてX−Cite 110LED、画像を取り込むためのCCDカメラとして、Cooling Camera System(Pacific Image Electronics社、台湾)を使用して行った。
(10)画像解析ソフト(ImageJ)を利用して、前記全体蛍光画像から蛍光強度の高い陽性液滴と、蛍光強度が低い陰性液滴、液滴がない背景部分の蛍光強度を5箇所測定し、平均値を算出した。
(9)で取得した明視野像及び蛍光画像を図4に、(10)で得られた値を表1に示す。陽性と陰性との蛍光強度比および陰性と背景との蛍光強度比がどちらも高い(蛍光強度比2.0以上)と、視認性が増し、検出することが容易であった。
(9)で取得した明視野像及び蛍光画像を図4に、(10)で得られた値を表1に示す。陽性と陰性との蛍光強度比および陰性と背景との蛍光強度比がどちらも高い(蛍光強度比2.0以上)と、視認性が増し、検出することが容易であった。
実施例2
実施例1と同様の手順で液滴内等温増幅反応を完了させ、反応終了後のマイクロ流路チップ100を検出した。なお、添加した蛍光色素としてはフルオロセインを選択し、検出時の露光時間は7.5secとした。
取得した蛍光画像として全体画像を図5−A、拡大画像を図5−Bに示す。解析ソフトWinROOF2018の機能である円形図形分離機能内に存在するパラメータを操作し、下記手順に従い全体液滴数の計数、陽性液滴の計数を行った。
1)WinROOF2018の円形図形分離機能内の円の削除項目のパラメータを調整し、液滴が存在しないバックグラウンド輝度値に設定することで全体液滴数を計数した。
2)WinROOF2018の円形図形分離機能内の円の削除項目のパラメータを調整し、陰性液滴が計数されない平均輝度値を設定した。
本工程により検出した全液滴の検出拡大画像を図6A、WinROOF2018での円形図形分離パラメータを図6B、陽性液滴の検出拡大画像図7A、WinROOF2018での円形図形分離パラメータを図7Bに示す。
実施例1と同様の手順で液滴内等温増幅反応を完了させ、反応終了後のマイクロ流路チップ100を検出した。なお、添加した蛍光色素としてはフルオロセインを選択し、検出時の露光時間は7.5secとした。
取得した蛍光画像として全体画像を図5−A、拡大画像を図5−Bに示す。解析ソフトWinROOF2018の機能である円形図形分離機能内に存在するパラメータを操作し、下記手順に従い全体液滴数の計数、陽性液滴の計数を行った。
1)WinROOF2018の円形図形分離機能内の円の削除項目のパラメータを調整し、液滴が存在しないバックグラウンド輝度値に設定することで全体液滴数を計数した。
2)WinROOF2018の円形図形分離機能内の円の削除項目のパラメータを調整し、陰性液滴が計数されない平均輝度値を設定した。
本工程により検出した全液滴の検出拡大画像を図6A、WinROOF2018での円形図形分離パラメータを図6B、陽性液滴の検出拡大画像図7A、WinROOF2018での円形図形分離パラメータを図7Bに示す。
比較例1
実施例1と同様の手順で液滴内等温増幅反応を完了させ、反応終了後のマイクロ流路チップ100を検出した。なお、蛍光色素は添加せず、検出時の露光時間は10.0secとした。
取得した検出画像の拡大図を図8に示す。また、全液滴検出の検出拡大画像を図9A、WinROOF2018での円形図形分離パラメータを図9Bに示す。図中の×印が検出漏れの陰性液滴である。陽性液滴の検出拡大画像図10A、WinROOF2018での円形図形分離パラメータを図10Bに示す。
実施例1と同様の手順で液滴内等温増幅反応を完了させ、反応終了後のマイクロ流路チップ100を検出した。なお、蛍光色素は添加せず、検出時の露光時間は10.0secとした。
取得した検出画像の拡大図を図8に示す。また、全液滴検出の検出拡大画像を図9A、WinROOF2018での円形図形分離パラメータを図9Bに示す。図中の×印が検出漏れの陰性液滴である。陽性液滴の検出拡大画像図10A、WinROOF2018での円形図形分離パラメータを図10Bに示す。
1:反応装置
100:マイクロ流路チップ
101:ポリマー基板
102:カバーガラス(ガラス基板)
10:反応液保持部
11、21:流路
20:液体保持部
30:反応液合流部
40:液滴形成部
50:流路出口
60:分岐流路
70:液滴保持部
80:排出口
200:温調ブロック
300:ポンプ
100:マイクロ流路チップ
101:ポリマー基板
102:カバーガラス(ガラス基板)
10:反応液保持部
11、21:流路
20:液体保持部
30:反応液合流部
40:液滴形成部
50:流路出口
60:分岐流路
70:液滴保持部
80:排出口
200:温調ブロック
300:ポンプ
Claims (4)
- 標的分子を含む反応液を複数の区画に分割する工程と、
前記標的分子が存在する区画においてシグナルを生じる反応を行う工程と、
前記複数の区画のシグナルを解析するための画像を取得する工程と、
前記画像を用いて、陽性区画については陽性区画と陰性区画のシグナル強度比、陰性区画については陰性区画と背景のシグナル強度比からそれぞれ計数する工程と、
を含んでなる方法。 - 陽性区画と陰性区画のシグナル強度比が2.0以上、陰性区画と背景のシグナル強度比が2.0以上であることを特徴とする請求項1に記載の方法
- 標的分子がDNA及び/又はRNAである請求項1又は2に記載の方法。
- 等温反応により、標的分子であるDNA及び/又はRNAを増幅させることを特徴とする請求項3に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2019063093 | 2019-03-28 | ||
JP2019063093 | 2019-03-28 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020162591A true JP2020162591A (ja) | 2020-10-08 |
Family
ID=72716555
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020049669A Pending JP2020162591A (ja) | 2019-03-28 | 2020-03-19 | デジタル計測のための方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2020162591A (ja) |
-
2020
- 2020-03-19 JP JP2020049669A patent/JP2020162591A/ja active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR102373741B1 (ko) | 단일 광원, 2-광학 채널 서열분석 | |
US11561196B2 (en) | Systems and devices for high-throughput sequencing with semiconductor-based detection | |
CA2893908C (en) | Methods for detection and quantification of analytes in complex mixtures | |
AU2010201296B2 (en) | Random array DNA analysis by hybridization | |
US20080166720A1 (en) | Method and apparatus for rapid nucleic acid analysis | |
Gaňová et al. | Multiplexed digital polymerase chain reaction as a powerful diagnostic tool | |
AU2002327202A1 (en) | Methods for detection and quantification of analytes in complex mixtures | |
KR20100134139A (ko) | 반응에서 다중 핵산 서열의 동시 검출 | |
KR20120017033A (ko) | 반응 카트리지에서의 다중 핵산 서열의 검출 | |
US11953464B2 (en) | Semiconductor-based biosensors for base calling | |
JP2006333739A (ja) | 単分子計測による核酸分析方法 | |
CN112601825A (zh) | 核酸测序方法 | |
JP2020162591A (ja) | デジタル計測のための方法 | |
CN100463973C (zh) | 分子印章测序装置和测序方法 | |
WO2023023533A1 (en) | Digital amplification assay analysis method | |
US20200407783A1 (en) | Ultrasensitive micro rna quantification | |
JP3834519B2 (ja) | 生化学的検査方法 | |
CN115279921A (zh) | 检测sars-cov-2的方法和设备 | |
US20230099994A1 (en) | Digital polymerase chain reaction (dpcr) platforms on next generation sequencer patterned flow cell technology | |
CN113801923A (zh) | 一种可直接用于血清标志物检测的数字滚环扩增检测方法 | |
WO2023067077A1 (en) | High stokes shift fluorescence dyes for multiplex detection | |
US20230295719A1 (en) | Paired-end sequencing | |
JP2009011230A (ja) | ヌクレオチド制限伸長を利用した塩基配列解析法 | |
JP3396218B2 (ja) | 核酸検出方法 | |
WO2023175024A1 (en) | Paired-end sequencing |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230215 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20231226 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240130 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20240326 |