JP7041684B2 - 単一の光源、2光学チャネル配列決定 - Google Patents
単一の光源、2光学チャネル配列決定 Download PDFInfo
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Description
本出願は、2017年3月7日に出願された米国仮出願第62/468242号に対する優先権を主張する。この関連出願の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
分野
本開示は一般に、DNA配列決定の分野に関し、より詳細には、単一の光源および少なくとも2種の色素(例えば、2種の蛍光標識)を利用するDNA配列決定のためのシステムおよび方法に関する。
既存のDNA配列決定システムおよび方法は、2つまたはこれより多くの光源を利用して、蛍光標識と結合体化したデオキシリボ核酸アナログを励起する。しかし、実施中は、光源の電力消費は高く、散逸させる必要のある相当な量の熱を発生させ得る。1つの光源によって効率的に励起され得る蛍光標識は、クロストークを受けやすい可能性があり、それによって各標識は、他の標識と重なり合う波長の光を発する。補正されない場合、このクロストークは、DNA配列決定システムが、配列決定実行の間に正確なヌクレオチド塩基を適切に呼び出す(call)ことを困難にし得る。
本明細書に開示されるのは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するためのシステムおよび方法である。一例では、システムは、所定の波長の光などの光を発生させるように構成された、レーザーまたは発光ダイオードなどの単一の光源;ヌクレオチドに付着された発蛍光団からの蛍光発光を検出するように構成された少なくとも1つの検出器であって、該少なくとも1つの検出器は、第1の波長および第2の波長にある該蛍光発光を検出するように構成される、少なくとも1つの検出器;プロセッサであって、以下の工程:該光源からヌクレオチド上に光を発生させる工程;蛍光発光が該少なくとも1つの検出器によって検出されない場合に、該ヌクレオチドを第1のタイプとして識別すること;光の該第1の波長にある蛍光発光が該少なくとも1つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第2のタイプとして識別すること;光の該第2の波長にある蛍光発光が該少なくとも1つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第3のタイプとして識別すること;および光の該第1の波長および該第2の波長にある蛍光発光が該少なくとも1つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第4のタイプとして識別すること、を包含する方法を行う命令を実行するように構成されたプロセッサを含む。
特定の態様では例えば以下の項目が提供される:
(項目1)
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するためのシステムであって、該システムは、
蛍光の発光を刺激するように構成された単一の光源;
ヌクレオチドに付着された発蛍光団からの蛍光発光を検出するように構成された少なくとも1つの検出器であって、該少なくとも1つの検出器は、第1の波長および第2の波長にある該蛍光発光を検出するように構成される、少なくとも1つの検出器;
プロセッサであって、以下の工程:
該光源からヌクレオチド上に光を発生させる工程;
蛍光発光が該少なくとも1つの検出器によって検出されない場合に、該ヌクレオチドを第1のタイプとして識別すること;
光の該第1の波長にある蛍光発光が該少なくとも1つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第2のタイプとして識別すること;
光の該第2の波長にある蛍光発光が該少なくとも1つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第3のタイプとして識別すること;および
光の該第1の波長および該第2の波長にある蛍光発光が該少なくとも1つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第4のタイプとして識別すること、
を包含する方法を行う命令を実行するように構成されたプロセッサ、
を含むシステム。
(項目2)
前記プロセッサは、1またはこれより多くの前記蛍光発光の強度を決定するようにさらに構成される、項目1に記載のシステム。
(項目3)
前記プロセッサは、1またはこれより多くの前記蛍光発光の強度を、該強度を色補正する工程によって決定するようにさらに構成される、項目2に記載のシステム。
(項目4)
前記強度を色補正する工程は、カラーマトリクスを推測することを包含する、項目3に記載のシステム。
(項目5)
前記カラーマトリクスを推測する工程は、
2つのチャネルにおいて観察された強度の散布図から区域重み付け角度ヒストグラムを生成すること;および
該区域重み付け角度ヒストグラムにおける2つの外側極大値θ 1 およびθ 2 の角度を推測することであって、ここで該カラーマトリクスは、
である工程、
を包含する、項目4に記載のシステム。
(項目6)
前記システムは、少なくとも1つの流体チャネルを有するフローセルのための取り付けステージを含む、項目1に記載のシステム。
(項目7)
前記光源はレーザーであり、該レーザーによって発生した光の所定の波長は、400nm~800nmの間である、項目1に記載のシステム。
(項目8)
前記光源は、発光ダイオードであり、該発光ダイオードによって発生した光の所定の波長は、400nm~800nmの間である、項目1に記載のシステム。
(項目9)
前記少なくとも1つの検出器は、同じ蛍光標識からの光の少なくとも2つの波長を検出するように構成される、項目1に記載のシステム。
(項目10)
前記第1の波長および前記第2の波長は、互いから少なくとも10nm離れている、項目1に記載のシステム。
(項目11)
前記第1の波長および前記第2の波長は、互いから大きくても100nm離れている、項目1に記載のシステム。
(項目12)
前記プロセッサは、前記蛍光発光における前記第1の波長と前記第2の波長との間のクロストークを識別するようにさらに構成される、項目1に記載のシステム。
(項目13)
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するためのコンピューター実行方法であって、該方法は、
光源を使用してヌクレオチドに付着された発蛍光団上に蛍光発光を発生させる工程;
少なくとも1つの検出器を使用して、第1の波長および第2の波長にある該ヌクレオチドに付着された発蛍光団からの該蛍光発光を検出する工程;ならびに
該ヌクレオチドを識別する工程であって、該工程は、
蛍光発光が該少なくとも1つの検出器によって検出されない場合に、該ヌクレオチドを第1のタイプとして識別すること;
光の該第1の波長にある蛍光発光が該少なくとも1つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第2のタイプとして識別すること;
光の該第2の波長にある蛍光発光が該少なくとも1つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第3のタイプとして識別すること;および
光の該第1の波長および該第2の波長にある蛍光発光が該少なくとも1つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第4のタイプとして識別すること、
を包含する工程、
を包含する方法。
(項目14)
蛍光発光を検出する工程は、該蛍光発光を色補正することを包含する、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記光源はレーザーであり、該レーザーによって発生した光の所定の波長は、450nm~490nmの間である、項目13に記載の方法。
(項目16)
前記光源は、発光ダイオードであり、該発光ダイオードによって発生した光の所定の波長は、450nm~490nmの間である、項目13に記載の方法。
(項目17)
前記第1の波長および前記第2の波長は、互いから少なくとも20nm離れている、項目13に記載の方法。
(項目18)
前記第1の波長および前記第2の波長は、互いから大きくても200nm離れている、項目13に記載の方法。
(項目19)
蛍光発光を検出する工程は、第1の蛍光画像および第2の蛍光画像を受け取ることを包含し、該第1の蛍光画像は、第1の蛍光標識によって生成され、該第2の蛍光画像は、第2の蛍光標識によって生成される、項目13に記載の方法。
(項目20)
前記第1の蛍光標識は、Alexa 488、3,6-ビス(エチルアミン)-2,7-ジメチル-[2-カルボキシラト-5-(3-カルボキシプロピルオキシ)フェニル]キンサンチリウムベタイン(色素I-3)、または3,6-ビス(エチルアミン)-2,7-ジメチル-[2-カルボキシラト-4-(3-カルボキシプロピルオキシ)フェニル]キンサンチリウムベタイン(色素I-4)を含み、前記第2の蛍光標識は、色素NR520LSを含む、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記第1の蛍光標識はCy3色素を含み、前記第2の蛍光標識はCy3-Cy5 色素ペアを含む、項目19に記載の方法。
(項目22)
前記蛍光画像から強度を抽出して、抽出した強度を生成する工程;および
該抽出した強度を補正して、補正した強度を生成する工程、
をさらに包含し、ここで該抽出した強度を補正する工程は、該抽出した強度を色補正する工程を包含し、前記ヌクレオチドを識別する工程は、該補正した強度に基づいて該ヌクレオチドを識別する工程を包含する、項目19に記載の方法。
(項目23)
前記蛍光画像から強度を抽出する工程の前に:
位置テンプレートを生成する工程;および
該位置テンプレートにおける位置を該蛍光画像に記録する工程、
をさらに包含する、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記抽出した強度を補正する工程は、
該抽出した強度を空間的に正規化すること;および
該抽出した強度を位相補正すること、
をさらに包含する、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記抽出した強度を位相補正する工程は、
位相同期マトリクスを決定すること;および
該位相同期マトリクスを該抽出した強度に適用すること;
を包含する、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記位置テンプレートを生成する工程は、前記蛍光画像における前記第1の蛍光標識と前記第2の蛍光標識との間のクロストークを検出することを包含する、項目23に記載の方法。
(項目27)
前記第1の蛍光標識および前記第2の蛍光標識は、クロストークを受けやすい、項目19に記載の方法。
(項目28)
前記第1のタイプのヌクレオチドは、前記第1の蛍光標識または前記第2の蛍光標識に結合体化されず、前記第2のタイプのヌクレオチドは、該第1の蛍光標識に結合体化され、前記第3のタイプのヌクレオチドは、該第2の蛍光標識に結合体化され、前記第4のタイプのヌクレオチドは、該第1の蛍光標識および該第2の蛍光標識に結合体化されない、項目19に記載の方法。
(項目29)
前記第1のタイプのヌクレオチドは、dGTPのアナログであり、前記第2のタイプのヌクレオチドは、dTTPのアナログであり、前記第3のタイプのヌクレオチドは、dCTPのアナログであり、前記第4のタイプのヌクレオチド三リン酸は、dATPのアナログである、項目13に記載の方法。
(項目30)
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するためのシステムであって、該システムは、
蛍光の発生を刺激するように構成された単一の光源;
ヌクレオチドに付着された異なる発蛍光団からの実質的に異なる4つの蛍光発光を検出するように構成された少なくとも1つの検出器;
プロセッサであって、以下の工程:
該光源からヌクレオチド上に光を発生させる工程;
第1の蛍光発光が該少なくとも1つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第1のタイプとして識別すること;
第2の蛍光発光が該少なくとも1つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第2のタイプとして識別すること;
第3の蛍光発光が該少なくとも1つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第3のタイプとして識別すること;および
第4の蛍光発光が該少なくとも1つの検出器によって検出される場合に、該ヌクレオチドを第4のタイプとして識別すること、
を包含する方法を行う命令を実行するように構成されたプロセッサ、
を含むシステム。
(項目31)
前記第1の蛍光発光、前記第2の蛍光発光、前記第3の蛍光発光、および前記第4の蛍光発光は、実質的に異なる波長を有する、項目30に記載のシステム。
(項目32)
前記プロセッサは、1またはこれより多くの前記蛍光発光の強度を決定するようにさらに構成される、項目30に記載のシステム。
(項目33)
前記プロセッサは、1またはこれより多くの前記蛍光発光の強度を、該強度を色補正する工程によって決定するようにさらに構成される、項目32に記載のシステム。
(項目34)
前記強度を色補正する工程は、カラーマトリクスを推測する工程を包含する、項目33に記載のシステム。
(項目35)
前記光源はレーザーであり、該レーザーによって発生した光の所定の波長は、400nm~800nmの間である、項目30に記載のシステム。
(項目36)
前記光源は、発光ダイオードであり、該発光ダイオードによって発生した光の所定の波長は、400nm~800nmの間である、項目30に記載のシステム。
(項目37)
前記第1のタイプのヌクレオチドは、前記単一の光源によって励起可能な発蛍光団に付着されず、前記第1の蛍光発光は、発光なしを含む、項目30に記載のシステム。
(項目38)
前記第1のタイプのヌクレオチドは、2種の異なる発蛍光団に付着され、前記第1の蛍光発光は、該2種の異なる発蛍光団からの発光を含む、項目30に記載のシステム。
(項目39)
前記第1の蛍光発光は、前記第1のタイプの第1のヌクレオチドに付着された第1の発蛍光団に由来し、前記第2の蛍光発光は、前記第2のタイプの第2のヌクレオチドに付着された第2の発蛍光団に由来し、前記第3の蛍光発光は、前記第3のタイプの第3のヌクレオチドに付着された第3の発蛍光団に由来し、前記第4の蛍光発光は、前記第4のタイプの第4のヌクレオチドに付着された第4の発蛍光団に由来する、項目30に記載のシステム。
(項目40)
前記第1の発蛍光団、前記第2の発蛍光団、前記第3の発蛍光団、および前記第4の発蛍光団の全4種は異なる、項目39に記載のシステム。
(項目41)
前記第1の発蛍光団、前記第2の発蛍光団、前記第3の発蛍光団、および前記第4の発蛍光団のうちの3種は異なる、項目39に記載のシステム。
(項目42)
前記第1の発蛍光団、前記第2の発蛍光団、前記第3の発蛍光団、および前記第4の発蛍光団のうちの2種は同一である、項目39に記載のシステム。
以下の詳細な説明において、添付の図面に対して参照が行われる。添付の図面は、本明細書の一部を形成する。図面において、類似記号は、状況が別段規定しなければ、代表的には類似の構成要素を識別する。詳細な説明、図面、および特許請求の範囲において記載される例証的実施形態は、限定することを意味しない。他の実施形態が利用され得、本明細書に示される主題の趣旨または範囲から逸脱することなく他の変更が行われ得る。本開示の局面が、本明細書で一般的に記載されかつ図面の中で図示されるように、広く種々の異なる構成で取り合わせられ得、置き換えられ得、組み合わされ得、分離され得、そして設計され得、これらの全てが、本明細書中で明示的に企図されることは、容易に理解される。
別段定義されなければ、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Singletonら, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 第2版, J. Wiley & Sons(New York, NY 1994);Sambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor, NY 1989)を参照のこと。本開示の目的のために、以下の用語が以下で定義される。
単一の光源(例えば、レーザーまたはLED)を使用してポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するためのシステムおよび方法が、本明細書で開示される。一実施形態において、少なくとも2種の色素がポリヌクレオチドを配列決定するために使用される。図1は、例示的な単一の光源・2光学チャネル配列決定システム100を示す模式図である。その単一の光源・2光学チャネル配列決定システム100は、2種の色素、例えば、第1の蛍光標識および第2の蛍光標識に基づく配列決定法を利用するように構成され得る。利用される配列決定法の非限定的な例としては、逐次合成配列決定を行う方法およびHeliscope単一分子配列決定法を含み得る。単一の光源・2光学チャネル配列決定システム100は、単一の光源・2光学チャネル配列決定システム100の一部である流体システム104によって供給される配列決定試薬を使用して、生の配列決定データを生成するように構成された光学システム102を含み得る。その生の配列決定データは、光学システム102によって捕捉される蛍光画像を含み得る。単一の光源・2光学チャネル配列決定システム100の一部であるコンピューターシステム106は、通信チャネル108Aおよび108Bを介して、光学システム102および流体システム104を制御するように構成され得る。例えば、光学システム102のコンピューターインターフェース110は、コンピューターシステム106と通信チャネル108Aを通じて通信するように構成され得る。
その単一の光源・2光学チャネル配列決定システム100は、十分に重なり合わない発光スペクトルを有する2種の蛍光標識を励起し得る1つの光源(例えば、レーザーまたはLED)を利用し得る。その光源120によって発生した光の波長は、例えば、400nm~800nmの範囲に及んで変動し得る。いくつかの実施形態において、その光源120によって発生した光の波長は、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800nm、またはこれらの値のうちのいずれか2つの間の値もしくは範囲であり得るか、またはそのあたりであり得る。いくつかの実施形態において、その光源120によって発生した光の波長は、少なくとも、または多くても、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、または800nmであり得る。
本明細書で開示されるシステムおよび方法によって利用される蛍光標識は、例えば、400nm~800nmの範囲に及んで、種々のピーク吸収波長を有し得る。いくつかの実施形態において、蛍光標識のピーク吸収波長は、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800nm、またはこれらの値のうちのいずれか2つの間の値もしくは範囲であり得るか、またはそのあたりであり得る。いくつかの実施形態において蛍光標識のピーク吸収波長は、少なくとも、または多くても、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、または800nmであり得る。
単一の光源・2光学チャネル配列決定システム100のコンピューターシステム106は、上記で考察されるように、光学システム102および流体システム104を制御するように構成され得る。コンピューターシステム106に関しては多くの構成が可能であるが、一実施形態は、図2に図示される。図2に示されるように、コンピューターシステム106は、メモリ204、記憶装置206、および通信インターフェース208と電子的に通信状態にあるプロセッサ202を含み得る。
図3は、配列決定システム100を利用して逐次合成配列決定を行うための例示的方法300のフローチャートである。方法300がブロック305で開始した後、フラグメント化ポリヌクレオチドフラグメント(例えば、フラグメント化一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドフラグメント)を含むフローセル114は、ブロック310で受け取られる。そのフラグメント化二本鎖ポリヌクレオチドフラグメントは、デオキシリボ核酸(DNA)サンプルから生成され得る。そのDNAサンプルは、種々の供給源、例えば、生物学的サンプル、細胞サンプル、環境サンプル、またはこれらのうちのいずれかの組み合わせに由来し得る。DNAサンプルは、患者に由来する生物学的流体、組織、および細胞のうちの1またはこれより多くを含み得る。例えば、そのDNAサンプルは、血液、尿、脳脊髄液、胸膜液、羊水、精液、唾液、骨髄、生検サンプル、またはこれらのうちのいずれかの組み合わせから採取され得るか、またはこれらを含み得る。
塩基呼び出しは、米国特許第8,965,076号(その内容は、その全体において本明細書に参考として援用される)に記載されている。簡潔にまとめると、塩基呼び出しは、グアニン(G)、チミン(T)、シトシン(C)、またはアデニン(A)であると配列決定されている最中の、成長中のプライマー-ポリヌクレオチドのクラスターへと組み込まれたヌクレオチドの塩基を決定するプロセスをいい得る。図4は、配列決定システム100を利用して、塩基呼び出しを行うための例示的方法400のフローチャートである。図3で図示されるブロック345において検出されたシグナルを処理する工程は、方法400の塩基呼び出しを行う工程を包含し得る。ブロック405において開始した後、所定の波長の光が、光源を使用して生成され得、ブロック410においてヌクレオチドアナログ上で光り得る。例えば、コンピューターシステム106は、その光学システムインターフェース212および通信チャネル108Aを通じて、光源120に所定の波長にある光を生成させ得る。
サイクル1:テンプレート生成、位置記録、および強度抽出
図5は、単一の光源・2光学チャネル配列決定を行うための例示的方法500のフローチャートである。その単一の光源・2光学チャネル配列決定システム100は、その方法500を行い得る。ブロック505において始まった後、光源は、ブロック510においてヌクレオチド上へと所定の波長の光を発生させ得る。ブロック515において、第1の波長における第1の蛍光標識からのおよび第2の波長における第2の蛍光標識からの蛍光発光は、第1の蛍光画像および第2の蛍光画像を生成するために、例えば、少なくとも1つの検出器を使用して検出され得る。蛍光発光を検出することは、蛍光発光の強度を決定することを包含し得る。その2つの蛍光画像を受け取った後、位置テンプレートは、例えば、テンプレート生成器218によって、ブロック520において生成され得る。
位置テンプレートを生成することは、ランダムフローセルが使用される場合、1本鎖ポリヌクレオチドのクラスターの位置を決定するために、第2の配列決定サイクルの間に必要であり得る。その第1の配列決定サイクルの後に、クラスター3の位置は未知であり得る。その第2の配列決定サイクルの間にクラスター3に組み込まれるヌクレオチドは、その蛍光標識の第1のタイプと結合体化し、その蛍光標識の第2のタイプとは結合体化しないデオキシシチジン三リン酸(dTTP)のアナログであり得る。第1の蛍光画像612は、そのdTTPアナログ上の蛍光標識の第1のタイプの蛍光発光を捕捉し得る。その第2の配列決定サイクルの間に、そのテンプレート生成器218は、その第1の蛍光画像612から、特定のクラスター3の位置におけるクラスター3の存在を決定し得る。パターン化したフローセルが使用される場合のテンプレート生成は、米国特許出願第14/530,299号(その内容は、その全体において本明細書に参考として援用される)に記載されている。
図5を参照すると、ブロック525において、位置テンプレートにおけるクラスターの位置は、その第1の配列決定サイクルおよびその後の配列決定サイクルに関して捕捉した蛍光画像に対して記録され得る。記録された位置、例えば、位置1、2および4における成長中のプライマー-ポリヌクレオチドのクラスターの蛍光強度は、ブロック530において抽出され得る。その抽出した強度は、補正した強度を生成するために、535において補正され得る。例えば、その強度補正器224によって抽出した強度を抽出することは、ブロック540における空間的正規化、ブロック545における色補正、またはブロック550における位相同期補正のうちの1またはこれより多くを含み得る。
空間的正規化は、空間的に正規化された強度を生成するために、配列決定サイクルの異なる蛍光画像における蛍光発光の強度を正規化することを包含し得る。例えば、各配列決定サイクルにおいて、その第1の蛍光画像およびその第2の蛍光画像の強度の5%および95%が、0および1に正規化され得る。配列決定サイクルがインデックス付加されたリード(indexed read)内にある場合、インデックス付加されなかったリードの最後のサイクルからの95パーセンタイルは、正規化に使用され得る。空間的正規化は、サイクル依存性強度バリエーションを低減し得る。
塩基呼び出し
いくつかの実施形態において、強度を補正することは、クラスタースケーリングを包含し得る。クラスターは、変動する明るさを有し得る。例えば、いくつかのクラスターは明るい可能性があり、いくつかのクラスターは薄暗い可能性がある。そのクラスターの明るさは、そのサンプルのフラグメント長分布によって引き起こされ得る。そのクラスター集団の変動する明るさは、塩基呼び出し散布図における「オン」集団を延ばすという効果を有し得る。各クラスターの強度を最初の10サイクルにおけるその平均強度によって正規化して、集団強度バリエーションを低減することは有利であり得る。例えば、その最初の10サイクルにおいて、全ての非グアニン(G)塩基呼び出しに関して、2つの区域が計算され得る:起源からの集団強度の距離、および起源からの相当するガウス平均の距離。クラスタースケーリングは、例えば、その最初の10サイクルに対して平均したこれら2つの区域の比の平均に正規化する工程を包含し得る。全てのクラスター強度は、位相補正および塩基呼び出しが行われる前に、このスケーリング因子によって正規化され得る。クラスタースケーリングは、有利なことには、スループットを増大し得、例えば、大きなフラグメント長分布を有するサンプルに関して、エラー率を減少させ得る。
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するためのシステムまたは方法の実施形態が本明細書で開示される。一実施形態において、そのシステムは、光(例えば、所定の波長にある光)を発生させるように構成された単一の光源(例えば、レーザーまたはLED光源)を含み得るか、またはこれと連絡状態にあり得る。そのシステムは、ヌクレオチドに付着された異なる発蛍光団から4つの実質的に異なる蛍光発光を検出するように構成された少なくとも1つの検出器を含み得るか、またはこれと連絡状態にあり得る。そのシステムは、その光源に、ヌクレオチド上への光を発生させ得る。そのヌクレオチドは、第1の蛍光発光がその少なくとも1つの検出器によって検出される場合に、第1のタイプとして識別され得る。そのヌクレオチドは、第2の蛍光発光がその少なくとも1つの検出器によって検出される場合に、第2のタイプとして識別され得る。そのヌクレオチドは、第3の蛍光発光がその少なくとも1つの検出器によって検出される場合に、第3のタイプとして識別され得る。そのヌクレオチドは、第4の蛍光発光がその少なくとも1つの検出器によって検出される場合に、第4のタイプとして識別され得る。その第1の蛍光発光、その第2の蛍光発光、その第3の蛍光発光、およびその第4の蛍光発光のうちの少なくとも2つは、実質的に異なる波長を有し得る。
本明細書で記載される方法は、種々の核酸配列決定技術とともに使用され得る。特に適用可能な技術は、核酸がアレイの中の固定された位置に付着され、その結果、それらの相対的な位置が変化せず、そしてそのアレイが反復して画像化されるものである。画像が異なるカラーチャネルにおいて、例えば、一方のヌクレオチド塩基タイプを別のものから区別するために使用される異なる標識が同時に存在して得られる実施形態は、特に適用可能である。いくつかの実施形態において、標的核酸のヌクレオチド配列を決定するプロセスは、自動化プロセスであり得る。好ましい実施形態としては、逐次合成配列決定を行う(「SBS」)技術が挙げられる。
Claims (27)
- ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するためのシステムであって、該システムは、
蛍光の発光を刺激するように構成された単一の光源;
ヌクレオチドに付着された発蛍光団からの蛍光発光を検出するように構成された少なくとも1つの検出器であって、該少なくとも1つの検出器は、第1の波長および第2の波長にある該蛍光発光を検出するように構成される、少なくとも1つの検出器;ならびに
プロセッサであって、各配列決定サイクルにおいて、以下の工程:
該光源からヌクレオチド上に光を発生させる工程;
該少なくとも1つの検出器から該第1の波長および該第2の波長における蛍光発光の強度を受け取る工程;
2チャネルカラーマトリクスを用い、該第1の波長および該第2の波長における該蛍光発光の強度を色補正して、色補正された強度を生成する工程;
光の該第1の波長および該第2の波長において実質的な色補正された強度が生成されない場合に、該ヌクレオチドを第1のタイプとして識別すること;
光の該第1の波長において色補正された強度が生成され、かつ、光の該第2の波長において生成される色補正された強度よりも大きい場合に、該ヌクレオチドを第2のタイプとして識別すること;
光の該第2の波長において色補正された強度が生成され、かつ、光の該第1の波長において生成される色補正された強度よりも大きい場合に、該ヌクレオチドを第3のタイプとして識別すること;および
光の該第1の波長および該第2の波長において色補正された強度が生成される場合に、該ヌクレオチドを第4のタイプとして識別すること、
を包含する方法を行う命令を実行するように構成されたプロセッサ、
を含むシステム。 - 前記強度を色補正する工程は、カラーマトリクスを推測することを包含する、請求項1に記載のシステム。
- 前記システムは、少なくとも1つの流体チャネルを有するフローセルのための取り付けステージを含む、請求項1に記載のシステム。
- 前記光源はレーザーであり、該レーザーによって発生した光の所定の波長は、400nm~800nmの間である、請求項1に記載のシステム。
- 前記光源は、発光ダイオードであり、該発光ダイオードによって発生した光の所定の波長は、400nm~800nmの間である、請求項1に記載のシステム。
- 前記第1の波長および前記第2の波長は、互いから少なくとも10nm離れている、請求項1に記載のシステム。
- 前記第1の波長および前記第2の波長は、互いから大きくても100nm離れている、請求項1に記載のシステム。
- 前記プロセッサは、前記蛍光発光における前記第1の波長と前記第2の波長との間のクロストークを識別するようにさらに構成される、請求項1に記載のシステム。
- ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するためのコンピューター実行方法であって、該方法は、各配列決定サイクルにおいて、
光源を使用してヌクレオチドに付着された発蛍光団上に蛍光発光を発生させる工程;
少なくとも1つの検出器を使用して、第1の波長および第2の波長にある該ヌクレオチドに付着された発蛍光団からの該蛍光発光の強度を検出する工程;
2チャネルカラーマトリクスを用い、該第1の波長および該第2の波長にある該蛍光発光の強度を色補正して、色補正された強度を生成する工程;ならびに
該ヌクレオチドを識別する工程であって、該工程は、
光の該第1の波長および該第2の波長において実質的な色補正された強度が生成されない場合に、該ヌクレオチドを第1のタイプとして識別すること;
光の該第1の波長において色補正された強度が生成され、かつ、光の該第2の波長において生成される色補正された強度よりも大きい場合に、該ヌクレオチドを第2のタイプとして識別すること;
光の該第2の波長において色補正された強度が生成され、かつ、光の該第1の波長において生成される色補正された強度よりも大きい場合に、該ヌクレオチドを第3のタイプとして識別すること;および
光の該第1の波長および該第2の波長において色補正された強度が生成される場合に、該ヌクレオチドを第4のタイプとして識別すること、
を包含する工程、
を包含する方法。 - 前記光源はレーザーであり、該レーザーによって発生した光の所定の波長は、450nm~490nmの間である、請求項10に記載の方法。
- 前記光源は、発光ダイオードであり、該発光ダイオードによって発生した光の所定の波長は、450nm~490nmの間である、請求項10に記載の方法。
- 前記第1の波長および前記第2の波長は、互いから少なくとも20nm離れている、請求項10に記載の方法。
- 前記第1の波長および前記第2の波長は、互いから大きくても200nm離れている、請求項10に記載の方法。
- 前記発蛍光団が第1の蛍光標識または第2の蛍光標識を含み、前記蛍光発光の強度を検出する工程は、第1の蛍光画像および第2の蛍光画像を受け取ることを包含し、該第1の蛍光画像は、前記第1の波長において捕捉され、該第2の蛍光画像は、前記第2の波長において捕捉される、請求項10に記載の方法。
- 前記第1の蛍光標識は、Alexa 488、3,6-ビス(エチルアミン)-2,7-ジメチル-[2-カルボキシラト-5-(3-カルボキシプロピルオキシ)フェニル]キンサンチリウムベタイン(色素I-3)、または3,6-ビス(エチルアミン)-2,7-ジメチル-[2-カルボキシラト-4-(3-カルボキシプロピルオキシ)フェニル]キンサンチリウムベタイン(色素I-4)を含み、前記第2の蛍光標識は、色素NR520LSを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記第1の蛍光標識はCy3色素を含み、前記第2の蛍光標識はCy3-Cy5 色素ペアを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記強度を色補正する工程の前に、
前記第1および第2の蛍光画像から、前記発蛍光団からの前記第1の波長および前記第2の波長における蛍光発光の強度を抽出する工程
をさらに包含する、請求項15に記載の方法。 - 前記第1および第2の蛍光画像から強度を抽出する工程の前に:
位置テンプレートを生成する工程;および
該位置テンプレートにおける位置を該第1および第2の蛍光画像に記録する工程、
をさらに包含する、請求項18に記載の方法。 - 前記第1および第2の蛍光画像から強度を抽出する工程の後でかつ、前記強度を色補正する工程の前に、
前記強度を空間的に正規化すること;および
該強度を位相補正すること、
をさらに包含する、請求項19に記載の方法。 - 前記強度を位相補正する工程は、
位相同期マトリクスを決定すること;および
該位相同期マトリクスを該強度に適用すること;
を包含する、請求項20に記載の方法。 - 前記位置テンプレートを生成する工程は、前記第1および第2の蛍光画像における前記第1の蛍光標識と前記第2の蛍光標識との間のクロストークを検出することを包含する、請求項19に記載の方法。
- 前記第1の蛍光標識および前記第2の蛍光標識は、クロストークを受けやすい、請求項15に記載の方法。
- 前記第1のタイプのヌクレオチドは、前記第1の蛍光標識にも前記第2の蛍光標識にも結合体化されず、前記第2のタイプのヌクレオチドは、該第1の蛍光標識に結合体化され、前記第3のタイプのヌクレオチドは、該第2の蛍光標識に結合体化され、前記第4のタイプのヌクレオチドは、該第1の蛍光標識および該第2の蛍光標識の両方に結合体化される、請求項15に記載の方法。
- 前記第1のタイプのヌクレオチドは、dGTPのアナログであり、前記第2のタイプのヌクレオチドは、dTTPのアナログであり、前記第3のタイプのヌクレオチドは、dCTPのアナログであり、前記第4のタイプのヌクレオチド三リン酸は、dATPのアナログである、請求項10に記載の方法。
- 前記強度を色補正する工程は、
前記カラーマトリクスを逆にして、逆カラーマトリクスを得ること;および
該逆カラーマトリクスに、前記強度を含むベクトルをかけて、前記色補正された強度を含むベクトルを生成すること
をさらに包含する、請求項2に記載のシステム。 - 前記区域重み付け角度ヒストグラムが3つの極大値を有する、請求項3に記載のシステム。
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