CN110229807A - 有机磷固定化酶催化剂的制备方法和有机磷固定化酶催化剂与其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种有机磷固定化酶催化剂的制备方法和有机磷固定化酶催化剂与其应用,本发明的制备方法包括将金属有机骨架化合物直接加入到具有亲和标签的有机磷水解酶的粗酶液中,经混合,分离后得到有机磷固定化酶催化剂。本发明的有机磷固定化酶催化剂制备方法操作简单,对酶纯度要求低,载体能够定向的与酶进行结合,酶利用率高,能够克服现有技术中酶利用率低的不足,并且制备的有机磷固定化酶催化剂成本低,酶活性高,酶利用率高,能够用于有机磷农药的降解。
Description
技术领域
本发明涉及生物催化剂制备技术领域,特别涉及一种有机磷固定化酶催化剂的制备方法。本发明还涉及由该制备方法所制备的有机磷固定化酶催化剂,以及该有机磷固定化酶催化剂在有机磷农药降解中的应用。
背景技术
有机磷农药的毒性高,化学性质稳定,不易降解,伴随着其的广泛应用,环境中残留的有机磷农药不断积累,对生态环境造成了巨大污染,严重危害人们的生存环境,因此,寻找一种环保高效的降解有机磷农药的方法极为重要。
生物酶降解法是近些年发展起来的一种绿色无污染,能够快速、有效降解污染物的方法,通过利用有机磷降解酶能够实现环境中有机磷农药的降解。生物酶降解法分为游离酶降解法和固定化酶降解法,其中,固定化酶降解法由于其具有酶稳定性高、可重复利用等优点受到了更广泛的应用。然而,传统的酶固定化工艺有着载体与酶结合位点不固定,具有随机性,存在载体与酶活性位点结合的可能,降低酶的活性,酶利用率低,会限制对有机磷农药的降解能力。
发明内容
有鉴于此,本发明旨在提出一种有机磷固定化酶催化剂的制备方法,以可克服现有技术中酶利用率低的不足。
为达到上述目的,本发明的技术方案是这样实现的:
一种有机磷固定化酶催化剂的制备方法,该制备方法包括将金属有机骨架化合物直接加入到具有亲和标签的有机磷水解酶的粗酶液中,经混合,分离后得到有机磷固定化酶催化剂。
进一步的,所述金属有机骨架化合物包括网状金属和有机骨架材料、沸石咪唑酯骨架材料、莱瓦希尔骨架材料和孔、通道式骨架材料中的一种。
进一步的,所述莱瓦希尔骨架材料包括MIL-88A、MIL-53、MIL-100和MIL-101中的一种。
进一步的,所述亲和标签包括组氨酸标签、半胱氨酸标签和色氨酸标签中的一种。
进一步的,所述有机磷水解酶的基因序列来自于土壤假单胞杆菌、黄杆菌或放射性农杆菌中的一种。
进一步的,所述混合采用摇床混合或搅拌混合。
进一步的,所述混合的时间为1h-3h。
进一步的,所述分离采用离心分离或过滤分离。
相对于现有技术,本发明具有以下优势:
本发明的有机磷固定化酶催化剂的制备方法,将金属有机骨架化合物直接加入到具有亲和标签的有机磷水解酶的粗酶液中,混合、分离后即得到有机磷固定化酶催化剂。该制备方法操作简单,对酶纯度要求低,不需要对酶进行高成本的分离纯化,且载体能够定向的与酶进行结合,避免了结合过程中破坏酶活性位点情况的发生,酶利用率高,因而能够克服现有酶利用率低的不足。
本发明同时也提出了一种由以上所述的有机磷固定化酶催化剂的制备方法制备的有机磷固定化酶催化剂。
此外,本发明也提出了制备的有机磷固定化酶催化剂在有机磷农药降解中的应用。
本发明制备的有机磷固定化酶催化剂,制备方法简单,成本低,酶利用率高,可实现对有机磷农药的有效降解。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1为本发明实例1的有机磷固定化酶催化剂的制备工艺图;
图2为本发明实例1的MIL-88A的扫描电镜图。
具体实施方式
需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。同时,本发明中未注明具体条件者,按照常规条件或所用设备的制造商建议的条件进行便可,所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为采用通过市售购买获得的常规产品即可,而所涉及的技术手段或工艺方法,若未写明具体条件,则按照所属领域的现有方式方法进行。
本发明的实施例首先涉及一种有机磷固定化酶催化剂的制备方法,该制备方法包括将金属有机骨架化合物直接加入到具有亲和标签的有机磷水解酶的粗酶液中,经混合,分离后得到有机磷固定化酶催化剂。
其中,金属有机骨架化合物(Metal organic Framework,简称MOFs)是由含氧、氮等的多齿有机配体(大多是芳香多酸和多碱)与过渡金属离子自组装而形成的一类具有周期性网络结构的晶态多孔材料。金属有机骨架化合物兼有无机材料的刚性和有机材料的柔性特征,化学性质稳定,多数都具有孔隙率高,孔结构可控,表面积大的特性。在本发明中,将金属有机化合物作为载体制备有机磷固定化酶催化剂。
亲和标签是一类对特定生物或化学配体具有高度亲和力的一段氨基酸序列。亲和标签与蛋白融合后不仅便于对融合蛋白的检测和纯化,而且会对目标蛋白的物理化学性质产生影响。在本发明中,利用金属有机骨架化合物载体上的过渡金属离子(Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+等)与氨基酸残基(如组氨酸、半胱氨酸和色氨酸等的咪唑基、巯基和吲哚基)存在的相互作用,将具有亲和标签的有机磷水解酶与载体进行选择性的结合。
有机磷水解酶是一种具有有机磷水解功能的大分子蛋白,能够切断有机磷物质中的P-O键、P-F键、P-S键和P-CN键,将有毒、不溶于水的大分子有机磷物质降解成无毒、溶于水的小分子,其降解过程高效、环保,不会对环境造成二次污染,因此,利用有机磷水解酶实现对环境中有机磷物质的降解具有巨大的应用前景。在本发明中,选择有机磷降解酶与载体结合制备有机磷生物纳米催化,进而用于降解环境中的有机磷物质。
粗酶液是指微生物发酵结束后,去除细胞壁或细胞器等大分子物质之后得到的含有目的酶的混合液。现有生物催化剂的制备过程对目的酶纯度要求很高,需要对发酵得到的粗酶液进行复杂的分离纯化工艺,成本高昂。在本发明中,将载体直接与粗酶液进行结合,省去了粗酶液的纯化分离步骤,从而可大大降低生产成本。
在本发明中,以金属有机骨架化合物为载体,以具有亲和标签的有机磷水解酶作为目的酶,将载体加入到含有目的酶的粗酶液中,充分反应混合,分离后,即得到有机磷固定化酶催化剂。
由于金属有机骨架化合物材料中的有机配体与金属离子可以选择,因此,不同类型的有机连接配体与不同的过渡金属元素相结合,可以合成不同种类的MOFs材料。本发明中金属有机骨架化合物可采用网状金属和有机骨架材料(isoreticular metal-organicframeworks,简称IRMOFs)、沸石咪唑酯骨架材料(zeoliticimidazolate frameworks,简称ZIFs)、莱瓦希尔骨架材料(metarial sofistitute Lavoisierframeworks,简称MILs)和孔、通道式骨架材料(ocket-channel frameworks,简称PCNs)中的一种。
由于莱瓦希尔骨架材料具有高密度的过渡金属位点和巨大的比表面积,其在催化领域有着广泛的应用,因此本发明中金属有机骨架化合物优选为采用莱瓦希尔骨架材料。而且对于莱瓦希尔骨架材料,其具体为包括MIL-88A、MIL-53、MIL-100和MIL-101中的一种,并优选的为采用MIL-88A。当然,除了以上所列的几种,莱瓦希尔骨架材料也可采用本领域技术人员所熟知的其他莱瓦希尔骨架材料。
本发明通过对金属有机骨架化合物的种类进行限定,可选择性能更好的材料作为载体,以使得制备得到的有机磷固定化酶催化剂对酶的利用率更高,酶活性更好。而通过对莱瓦希尔骨架材料进行进一步的选择,能够进一步的提高有机磷水解酶的利用率和有机磷固定化酶催化剂的酶活性。
其中,对于优选采用的MIL-88A,其制备一般包括如下的步骤。
先超纯水置于耐压管中,加入反丁烯二酸,磁力搅拌或超声使其充分溶解,然后加入FeCl3·6H2O均匀混合,再放置于电热鼓风干燥箱中,65℃保温24h,待反应液降到室温后,离心分离,分别用超纯水和无水乙醇清洗多次得到棕红色沉淀,再将沉淀在烘箱中烘干,即得到MIL-88A。
本实施例中,亲和标签包括组氨酸标签(His-tag)、半胱氨酸标签(Cys-tag)和色氨酸标签(Trp-tag)中的一种,并优选为组氨酸标签。而通过对亲和标签的种类进行进一步的选择,可使得带有亲和标签的目的酶能够与载体结合的更加牢固,从而能够提高酶的利用率和有机磷固定化酶催化剂的酶活性。不过,除了以上几种,亲和标签采用本领域技术人员所熟知的其他能够与过渡金属离子相结合的亲和标签亦是可以的。
本实施例的具有亲和标签的有机磷水解酶中有机磷水解酶的基因序列是来自于土壤假单胞杆菌、黄杆菌或放射性农杆菌中的一种,且其优选为来自于放射性农杆菌的有机磷水解酶基因序列。通过现有基因工程的方法,在有机磷水解酶基因的N端引入亲和标签,再通过转化质粒以及由表达菌的表达,即可得到带亲和标签的有机磷水解酶。有机磷水解酶的种类多样,不同类型的有机磷水解酶其催化效率和底物范围有所区别,其中,本发明选自土壤假单胞杆菌、黄杆菌和放射性农杆菌中的有机磷水解酶,能够使得有机磷水解酶的催化效率更高,底物范围更广。
本实施例的土壤假单胞杆菌、黄杆菌和放射性农杆菌可以由市场上购买到,或者也可以自行分离到,而上述三种菌的有机磷水解酶的基因序列均从网站上可以查到(网址:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/,其中,土壤假单胞杆菌:名称opd、Genbank:AER10490.1;黄杆菌:名称opd、Genbank:AAV39527.1;放射形农杆菌:名称opdA、Genbank:AAK85308.1)。通过将上述三种菌之一的有机磷水解酶基因序列引入亲和标签并转化到质粒中,再将质粒转到表达菌、也即宿主菌(例如大肠杆菌)中进行表达,表达的结果就是本实施例所需的有机磷水解酶。
将可以表达亲和标签的重组菌株(即上述大肠杆菌),先进行发酵,发酵结束后对发酵液中的细胞进行裂解,然后再经过离心便可得到所需的具有亲和标签的有机磷水解酶的粗酶液。
在本发明中,将载体加入到粗酶液后,需要经过混合操作以将载体与目的酶充分结合,混合方式可采用摇床混合或搅拌混合,并优选采用摇床混合,或者,也可采用本领域技术人员所熟知的其他类型的混合方式进行混合。而对于摇床混合与搅拌混合,一般的,可根据载体的性能选择混合方式,比如对于结构强度较小的载体宜采用摇床混合,避免混合过程对载体的破坏,而对于结构强度较高的载体则可以适当地选择搅拌混合。
载体与目的酶进行结合需要一定的时间,载体与目的酶的混合时间影响载体与目的酶的结合程度,一般来说,在一定时间内,混合的时间越长,载体与目的酶结合的越好。本发明中的混合时间具体为1h-3h,且其例如可为1h、1.5h、2h、2.5h或3h,并优选的为2h。而通过对混合时间进行进一步的优化和调整,本发明可使得载体与目的酶能够更好的结合,以能够提高酶的利用率。
本发明中载体与目的酶经过混合充分结合后,还要经过分离,去除发酵液后才能得到有机磷固定化酶催化剂。本发明的分离方式可采用离心分离或过滤分离,或者,也可采用本领域技术人员所熟知的其他分离方法。
本发明的制备方法操作简单,对酶纯度要求低,不需要对酶进行高成本的分离纯化,且载体能够定向的与酶进行结合,避免了结合过程中破坏酶活性位点情况的发生,酶利用率高,可克服现有生物催化剂制备中酶利用率低及酶纯度要求高等不足,能够有效的用于有机磷农药的降解。
此外,本发明的实施例还涉及有通过如上的制备方法所制备得到有机磷固定化酶催化剂,以及利用该制备的有机磷固定化酶催化剂进行有机磷农药的降解。
本发明制备的有机磷固定化酶催化剂,成本低,酶活性高,是一种可对有机磷农药进行有效降解的有机磷生物纳米催化剂。
下面将通过具体的制备实例及对比例和相应的检测来对本发明做进一步的说明。
实例1
本实例的有机磷固定化酶催化剂的制备中,其制备工艺可如图1中所示,且其中金属有机骨架化合物材料采用MIL-88A,具有亲和标签的有机磷水解酶的基因序列来自于放射性农杆菌,亲和标签采用组氨酸标签,且由大肠杆菌作为表达菌,制得能够表达组氨酸标记的有机磷水解酶。
具体的制备步骤包括:
取25mL超纯水置于48mL耐压管中,加入0.121g反丁烯二酸,磁力搅拌或超声使其充分溶解,然后加入0.271g FeCl3·6H2O,均匀混合,放置于电热鼓风干燥箱中,65℃保温24h,待反应液降到室温后,离心分离,分别用超纯水和无水乙醇清洗3次,得到棕红色沉淀,将沉淀在烘箱中烘干,得到MIL-88A,该MIL-88A的扫描电镜图如图2所示。
将放射性农杆菌的有机磷水解酶基因序列引入组氨酸标签并转化到质粒中,再将质粒转到宿主大肠杆菌中,然后将大肠杆菌进行发酵,发酵结束后对发酵液中的细胞进行裂解,再经过离心即得到能够表达组氨酸标记的有机磷水解酶的粗酶液。
将一定量的MIL-88A加入到粗酶液中,摇床混合2h,离心分离,即得到有机磷固定化酶催化剂。
实例2
本实例的有机磷固定化酶催化剂的制备中,其制备工艺可参考实例1,且本实例中金属有机骨架化合物材料仍采用MIL-88A,具有亲和标签的有机磷水解酶的基因序列来自于黄杆菌,亲和标签采用组氨酸标签,并仍由大肠杆菌作为表达菌,制得能够表达组氨酸标记的有机磷水解酶。
具体的制备步骤中,MIL-88A的制备步骤同实例1。黄杆菌的有机磷水解酶基因序列引入组氨酸标签并转化到质粒中,再将质粒转到宿主大肠杆菌中,然后将大肠杆菌进行发酵,发酵结束后对发酵液中的细胞进行裂解,再经过离心得到能够表达组氨酸标记的有机磷水解酶的粗酶液。再将一定量的MIL-88A加入到粗酶液中,摇床混合2.5h,离心分离得到有机磷固定化酶催化剂。
实例3
本实例的有机磷固定化酶催化剂的制备中,其制备工艺参考实例1,且金属有机骨架化合物材料仍采用MIL-88A,具有亲和标签的有机磷水解酶的基因序列仍来自于放射性农杆菌,亲和标签采用色氨酸标签,且由大肠杆菌作为表达菌,制得能够表达色氨酸标记的有机磷水解酶。
具体制备中,MIL-88A的制备步骤同实例1。将放射性农杆菌的有机磷水解酶基因序列引入色氨酸标签并转化到质粒中,再将质粒转到宿主大肠杆菌中,然后将大肠杆菌进行发酵,发酵结束后对发酵液中的细胞进行裂解,再经过离心得到能够表达色氨酸标记的有机磷水解酶的粗酶液。接着,将一定量的MIL-88A加入到粗酶液中,摇床混合2h,离心分离得到有机磷固定化酶催化剂。
实例4
本实例的有机磷固定化酶催化剂的制备中,制备工艺参考实例1,且本实例中金属有机骨架化合物材料采用沸石咪唑酯骨架结构材料,并具体为ZIF-8,且其通过在乙醇为溶剂条件下,将醋酸锌和2-甲基咪唑混合反应24h的可到。具有亲和标签的有机磷水解酶的基因序列来自于土壤假单胞杆菌,亲和标签采用半胱氨酸标签,仍由大肠杆菌作为表达菌制得能够表达半胱氨酸标记的有机磷水解酶。
具体制备中,将土壤假单胞杆菌的有机磷水解酶基因序列引入半胱氨酸标签并转化到质粒中,将质粒转到宿主大肠杆菌中,再将大肠杆菌进行发酵,发酵结束后对发酵液中的细胞进行裂解,经过离心得到能够表达半胱氨酸标记的有机磷水解酶的粗酶液。然后将一定量的ZIF-8加入到粗酶液中,摇床混合2h,离心分离得到有机磷固定化酶催化剂。
对比例
为验证本发明所制备的有机磷固定化酶催化剂的性能,以示出其具有对有机磷农药的降解能力,发明人采用自市场上购买的现有有机磷降解酶作为对比,该市购的现有有机磷降解酶具体为天津市张大科技发展有限公司生产的商品名为有机磷降解酶生化洗消剂,型号PG-OPH-D1,主要成分为有机磷降解酶。
对以上各实例所制备的有机磷固定化酶催化剂,以及对比例所市购的有机磷降解酶进行有机磷农药降解性能的检测。具体检测中,以获得分别对蔬菜上残留的辛硫磷的降解效率来进行,且蔬菜具体为油菜,并在检测中也加入市购的蔬菜洗洁精和生活用清洁自来水作为比较。
具体检测结果如下表所示。
名称 | 实例1 | 实例2 | 实例3 | 实例4 | 对比例 | 洗洁精 | 自来水 |
降解效率(%) | 94.6 | 93.4 | 92.5 | 91.8 | 91.2 | 41.5 | 18.6 |
经由上表的检测结果可以看出,通过本发明的制备方法所制备的有机磷固定化酶催化剂,其对有机磷农药有着较好的催化转化作用,酶利用率较高,可获得较好的降解效果,从而利于在有机磷农业降解中的应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种有机磷固定化酶催化剂的制备方法,其特征在于:该制备方法包括将金属有机骨架化合物直接加入到具有亲和标签的有机磷水解酶的粗酶液中,经混合,分离后得到有机磷固定化酶催化剂。
2.根据权利要求1所述的有机磷固定化酶催化剂的制备方法,其特征在于:所述金属有机骨架化合物包括网状金属和有机骨架材料、沸石咪唑酯骨架材料、莱瓦希尔骨架材料和孔、通道式骨架材料中的一种。
3.根据权利要求2所述的有机磷固定化酶催化剂的制备方法,其特征在于:所述莱瓦希尔骨架材料包括MIL-88A、MIL-53、MIL-100和MIL-101中的一种。
4.根据权利要求1所述的有机磷固定化酶催化剂的制备方法,其特征在于:所述亲和标签包括组氨酸标签、半胱氨酸标签和色氨酸标签中的一种。
5.根据权利要求1所述的有机磷固定化酶催化剂的制备方法,其特征在于:所述有机磷水解酶的基因序列来自于土壤假单胞杆菌、黄杆菌或放射性农杆菌中的一种。
6.根据权利要求1所述的有机磷固定化酶催化剂的制备方法,其特征在于:所述混合采用摇床混合或搅拌混合。
7.根据权利要求1所述的有机磷固定化酶催化剂的制备方法,其特征在于:所述混合的时间为1h-3h。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的有机磷固定化酶催化剂的制备方法,其特征在于:所述分离采用离心分离或过滤分离。
9.一种由权利要求1至8中任一项所述的有机磷固定化酶催化剂的制备方法制备的有机磷固定化酶催化剂。
10.权利要求9所制备的有机磷固定化酶催化剂在有机磷农药降解中的应用。
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