CN110208400A - 一种测定红枣中多种单体酚含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种测定红枣中多种单体酚含量的方法，包括：S1：将粉末样品制备为待提取溶液，待提取溶液的溶剂包括甲醇溶液、溶有抗坏血酸的超纯水、盐酸；S2：对待提取溶液进行超声波处理；S3：在避光的第一温度实验环境下，对S2后的溶液进行第一次提取；S4：对第一次提取后的溶液进行离心处理，以获得上清液；S5：在第二温度实验环境下，对上清液进行第二次提取；S6：将第二次提取后的物质制备为待测溶液，待测溶液的溶剂为色谱甲醇；S7：过滤；S8：对过滤后的待测溶液进行高效液相色谱测定，以得到待测溶液中多种单体酚的含量。
Description
技术领域
本发明涉及酚类物质测定领域，特别是一种测定红枣中多种单体酚含量的方法。
背景技术
酚类物质是一种天然的代谢产物，其种类及含量对果蔬的色泽、口感、风味等影响较为直接。酚类物质的组分及含量与酶促褐变息息相关。例如：研究表明绿原酸和儿茶素就是苹果多酚氧化酶的最适底物。同时酚类物质会影响果蔬的贮藏及加工过程。酚类物质在不同的生长时期，酚类的种类及含量也会在不停的变化。人们研究关注酚类化合物主要为其具有较高的抗氧化活性，同时和其具有抗炎症、抗衰老、抗癌变以及预防心脑血管疾病等多种功能有关。红枣内的酚类物质种类丰富，因而红枣果内的单体酚研究价值更进一步的提升。
新疆红枣种植总面积较全国其他地区相比占巨大比例并逐年增长，近年来对于这些单体酚的生物功能研究颇多[15]。红枣单体酚的含量测定成为具有研究价值的课题。本试验通过检测分析新疆主栽品种骏枣不同生长时期随着贮藏时间的增加，单体酚的组分及含量差异，了解骏枣生长发育及贮藏过程中酚类物质含量的差异性变化，为后续研究骏枣贮藏加工过程中酚类物质与褐变程度的关系打下理论基础。
目前国内外关于红枣酚类物质的研究集中在总酚含量的测定及其抗氧化活性的研究方面，而在用HPLC测定红枣单体酚含量变化方面研究较少。酚类物质是引起酶促褐变的主要因素，目前对红枣单体酚的研究甚少，研究红枣内多酚组分具有较大的研究价值，不同生长期贮藏期间的单体酚差异可为后续研究单体酚与酶促褐变之间的联系打下理论基础。
发明内容
本发明的一个目的是要提供一种测定红枣中多种单体酚含量的方法，以准确获得任一个生长阶段红枣中单体酚的具体含量。
特别地，本发明提供了一种测定红枣中多种单体酚含量的方法，从选定生长阶段的红枣中制备得到红枣的粉末样品，对所述粉末样品的单体酚进行测定，包括：
S1：将所述粉末样品制备为待提取溶液，所述待提取溶液的溶剂包括甲醇溶液、溶有抗坏血酸的超纯水、盐酸；
S2：对所述待提取溶液进行超声波处理；
S3：在避光的第一温度实验环境下，对S2后的溶液进行第一次提取；
S4：对第一次提取后的溶液进行离心处理，以获得上清液；
S5：在第二温度实验环境下，对所述上清液进行第二次提取；
S6：将第二次提取后的物质制备为待测溶液，所述待测溶液的溶剂为色谱甲醇；
S7：过滤；
S8：对过滤后的待测溶液进行高效液相色谱测定，以得到所述待测溶液中多种单体酚的含量。
优选的，S1中各个溶剂的剂量和浓度为：25mL70％的甲醇溶液、15mL溶有80mg抗坏血酸的超纯水、10mL浓度为6mol/L的盐酸。
优选的，各个溶剂的添加顺序为：所述粉末样品溶解于所述甲醇溶液，再加入所述超纯水，再加入所述盐酸。
优选的，所述超声波处理时长范围为8～12min。
优选的，所述第一温度实验环境为35℃密闭环境，所述第一次提取为静置11～13h。
优选的，所述离心处理为12000r/min 4℃进行离心20min。
优选的，所述第二温度实验环境为40℃。
优选的，所述第二次提取包括以下步骤：
S5a：在所述第二温度实验环境下，旋转蒸发除去所述上清液中的甲醇；
S5b：对S5a后的溶液进行多次萃取，萃取溶剂为乙酸乙酯，以分别获得多次萃取液；
S5c：混合S5b中得到的多次萃取液，以获得萃取液混合溶液；
S5d：在第二温度实验环境下，将所述萃取液混合溶液蒸发至近干。
优选的，S5b中，利用所述乙酸乙酯对溶液萃取三次，分别得到容量为30mL的第一次萃取液、20mL的第二次萃取液、20mL的第三次萃取液。
优选的，所述色谱甲醇的容量为5mL。
本发明测定红枣中多种单体酚含量的方法由于洗脱条件的溶剂及步骤设定，因此能够很好地将红枣中11中单体酚分类出来，为高效液相色谱测定做准备。酚类物质是引起酶促褐变的主要因素，目前对红枣单体酚的研究甚少，研究红枣内多酚组分具有较大的研究价值，不同生长期贮藏期间的单体酚差异可为后续研究单体酚与酶促褐变之间的联系打下理论基础。
根据下文结合附图对本发明具体实施例的详细描述，本领域技术人员将会更加明了本发明的上述以及其他目的、优点和特征。
附图说明
后文将参照附图以示例性而非限制性的方式详细描述本发明的一些具体实施例。附图中相同的附图标记标示了相同或类似的部件或部分。本领域技术人员应该理解，这些附图未必是按比例绘制的。附图中：
图1为11种单体酚混合标准样品色谱图。
图2为不同生长时期单体酚的含量。
具体实施方式
选取新疆主栽品种骏枣，对枣果的四个不同生长期：白熟期、脆熟期、完熟期、后熟期、贮藏期间11种单体酚含量进行研究，旨在了解不同生长期的骏枣，随着贮藏时间的增加，枣果内单体酚的变化差异。
取个头匀称不同成熟时期(白熟期、脆熟期、完熟期、后熟期)四个成熟度的骏枣，将枣果冲洗干净，放入50℃的鼓风干燥箱中干燥72h，取出后将枣果去核并粉碎果肉，过60目筛，将其混合均匀后，准确称取四个不同生长期的骏枣干粉末5g。在本实施例中，粉末样品取为5g，后续实施步骤中相应的剂量都是围绕5g红枣粉末样品来确定的。但是，本发明的剂量并不局限于5g，粉末样品也可以取为3g、8g、10g、15g等任意便于测量的剂量。
首先，对粉末样品进行单体酚的提取。提取过程总的分为：制备待提取溶液、超声波处理、第一次提取、离心处理、第二次提取、制备待测溶液。具体步骤为：
S1：将所述粉末样品制备为待提取溶液，所述待提取溶液的溶剂包括甲醇溶液、溶有抗坏血酸的超纯水、盐酸；
S2：对所述待提取溶液进行超声波处理；
S3：在避光的第一温度实验环境下，对S2后的溶液进行第一次提取；
S4：对第一次提取后的溶液进行离心处理，以获得上清液；
S5：在第二温度实验环境下，对所述上清液进行第二次提取；
S6：将第二次提取后的物质制备为待测溶液，所述待测溶液的溶剂为色谱甲醇。
以本实施例的5g粉末样品为例。取5g骏枣粉末，将其溶于25mL70％的甲醇溶液中，加入15mL溶有80mg抗坏血酸的超纯水，再加入10mL浓度为6mol/L的盐酸，将混合后的溶液装进100mL的丝扣瓶中，超声波处理8～12min，35℃密闭避光条件下静置提取11～13h。其中，一个优选的时间是，超声波处理10min，35℃密闭避光条件下提取12h。
将提取后的溶液放入离心机，12000r/min 4℃进行离心20min取上清液。
在40℃的条件下旋转蒸发除去甲醇，然后用乙酸乙酯萃取三次，分别为30mL、20mL、20mL，混合所有萃取液，继续在40℃的条件下将萃取液旋转蒸发至近干，溶于5mL色谱甲醇中，置于20℃条件下避光保存备用。
然后，对提取后的样品进行过滤。在本实施例中，采用的过滤方式为0.45μm微孔滤膜过滤。过滤后的溶液可以进行高效液相色谱(HPLC)测定。
接着，对过滤后的待测溶液进行高效液相色谱测定。高效液相色谱测定中需要有标准曲线。因此，分别称取一定量表儿茶素、没食子酸等11种单体酚，用乙腈溶解并定容在50mL棕色容量瓶中，作为混合标准母液，然后配成6个浓度梯度的标准溶液，置于-40℃的冰箱中备用。
采用高效液相色谱仪：Agilent1260infinity(包括在线脱气机，四元泵，自动进样器，柱温箱，紫外检测器，CLASS-VP色谱工作站)；色谱柱；AgilentZORBAX SB-C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，紫外检测波长为280nm，柱温30℃，进样量10μL，以峰面积外标法进行定量。选用二元高压梯度洗脱程序，流动相A：冰醋酸水溶液；流动相B：乙腈；流速为1mL/min。
梯度洗脱程序如表1所示：
表1液相色谱流动相梯度程序
Table 1 The gradient flow volume of HPLC mobile phase
将准确配制的6个不同浓度的标准品混合液在确定的色谱条件下进样，以峰面积为横坐标，浓度为纵坐标，通过计算得到各个单体酚的标准曲线见表2。
表2 11种单体酚的标准曲线方程
Table 2Standard curvilinear equation of 11 Mono-phenols
本方法确定的洗脱条件能够很好的将11种单体酚分离，结果如图1所示。表2可知丁香酸标准品的浓度与峰面积相关性最好，相关系数为0.9983。将经过前处理的样品在确定的色谱条件下进样，根据标准曲线法定量。得出不同生长时骏枣贮藏期间的11种单体酚含量。
对刚采摘回来的骏枣进行分析测定，图2为4种不同成熟度初期11种单体酚含量的测定结果。柱状图显示，不同成熟度酚类物质含量存在显著差异。儿茶素，绿原酸，表儿茶素，芦丁为主要酚类物质。白熟期，脆熟期初期骏枣中酚类物质含量较高(表儿茶素含量最高)，白熟期表儿茶素含量为578.672mg/L，脆熟期588.561mg/L，其次是儿茶素，绿原酸，芦丁。完熟期时表儿茶素含量(9.201mg/L)锐减；没食子酸，安香息酸和丁香酸不同成熟度初期含量依次增加，其中白熟期时未检出没食子酸含量，脆熟期至后熟期生长阶段没食子酸含量呈增加(7.176mg/L-8.204mg/L)；部分单体酚含量无明显变化，如肉桂酸。分析认为应该是采摘后枣果自身的有氧呼吸与其内部其他相关物质的代谢、转化等原因使其含量在减少；不同生长期发育程度不同，存在含量增加的情况。
至此，本领域技术人员应认识到，虽然本文已详尽示出和描述了本发明的多个示例性实施例，但是，在不脱离本发明精神和范围的情况下，仍可根据本发明公开的内容直接确定或推导出符合本发明原理的许多其他变型或修改。因此，本发明的范围应被理解和认定为覆盖了所有这些其他变型或修改。
Claims (10)
1.一种测定红枣中多种单体酚含量的方法，从选定生长阶段的红枣中制备得到红枣的粉末样品，对所述粉末样品的单体酚进行测定，包括：
S1：将所述粉末样品制备为待提取溶液，所述待提取溶液的溶剂包括甲醇溶液、溶有抗坏血酸的超纯水、盐酸；
S2：对所述待提取溶液进行超声波处理；
S3：在避光的第一温度实验环境下，对S2后的溶液进行第一次提取；
S4：对第一次提取后的溶液进行离心处理，以获得上清液；
S5：在第二温度实验环境下，对所述上清液进行第二次提取；
S6：将第二次提取后的物质制备为待测溶液，所述待测溶液的溶剂为色谱甲醇；
S7：过滤；
S8：对过滤后的待测溶液进行高效液相色谱测定，以得到所述待测溶液中多种单体酚的含量。
2.根据权利要求1所述的测定红枣中多种单体酚含量的方法，在获得所述粉末样品为5g的条件下，其特征在于，S1中各个溶剂的剂量和浓度为：25mL70％的甲醇溶液、15mL溶有80mg抗坏血酸的超纯水、10mL浓度为6mol/L的盐酸。
3.根据权利要求1或2所述的测定红枣中多种单体酚含量的方法，其特征在于，各个溶剂的添加顺序为：所述粉末样品溶解于所述甲醇溶液，再加入所述超纯水，再加入所述盐酸。
4.根据权利要求1所述的测定红枣中多种单体酚含量的方法，其特征在于，所述超声波处理时长范围为8～12min。
5.根据权利要求1所述的测定红枣中多种单体酚含量的方法，其特征在于，所述第一温度实验环境为35℃密闭环境，所述第一次提取为静置11～13h。
6.根据权利要求1所述的测定红枣中多种单体酚含量的方法，其特征在于，所述离心处理为12000r/min4℃进行离心20min。
7.根据权利要求1所述的测定红枣中多种单体酚含量的方法，其特征在于，所述第二温度实验环境为40℃。
8.根据权利要求1或7所述的测定红枣中多种单体酚含量的方法，其特征在于，所述第二次提取包括以下步骤：
S5a：在所述第二温度实验环境下，旋转蒸发除去所述上清液中的甲醇；
S5b：对S5a后的溶液进行多次萃取，萃取溶剂为乙酸乙酯，以分别获得多次萃取液；
S5c：混合S5b中得到的多次萃取液，以获得萃取液混合溶液；
S5d：在第二温度实验环境下，将所述萃取液混合溶液蒸发至近干。
9.根据权利要求8所述的测定红枣中多种单体酚含量的方法，其特征在于，S5b中，利用所述乙酸乙酯对溶液萃取三次，分别得到容量为30mL的第一次萃取液、20mL的第二次萃取液、20mL的第三次萃取液。
10.根据权利要求1所述的测定红枣中多种单体酚含量的方法，其特征在于，所述色谱甲醇的容量为5mL。
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