CN110200955A

CN110200955A - 四氢异-α酸衍生物、组合物及方法

Info

Publication number: CN110200955A
Application number: CN201910332802.5A
Authority: CN
Inventors: 布莱恩·卡罗尔; 加里·达兰德; 阿奴拉·德赛; 维拉·康达; 克林顿·J·达尔伯格; 简·厄班
Original assignee: KinDex Therapeutics LLC
Current assignee: KinDex Therapeutics LLC
Priority date: 2010-10-30
Filing date: 2011-10-28
Publication date: 2019-09-06
Also published as: ES2829388T3; CN110215442A; JP2013542225A; EP2632448B1; US8410178B2; AU2011320140B2; JP6259287B2; US20130018105A1; US20120108671A1; CA2853974A1; KR20140027910A; AU2011320140C1; CN103561730A; WO2012058649A1; EP2632448A1; AU2011320140A1; US8410179B2; JP2017101019A; US20130217781A1; EP2632448A4

Abstract

本申请提供顺式3，4‑二羟基‑2‑(3‑甲基丁酰基)‑5‑(3‑甲基丁基)‑4‑(4‑甲基戊酰基)环戊‑2‑烯‑1‑酮衍生物及其基本上对映体纯的组合物。这些衍生物包括(+)‑(4S，5R)‑3，4‑二羟基‑2‑(3‑甲基丁酰基)‑5‑(3‑甲基丁基)‑4‑(4‑甲基戊酰基)环戊‑2‑烯‑1‑酮、(‑)‑(4R，5S)‑3，4‑二羟基‑2‑(3‑甲基丁酰基)‑5‑(3‑甲基丁基)‑4‑(4‑甲基戊酰基)环戊‑2‑烯‑1‑酮，以及其盐和结晶。本申请还提供使用所公开的化合物和组合物来激活PPARγ、激活GPR120、抑制炎症和治疗对PPARγ调制有反应的病症、对GPR120调制有反应的病症，以及代谢障碍例如糖尿病的方法。

Description

四氢异-α酸衍生物、组合物及方法

本申请是2011年10月28日提交的、名称为″顺式3，4-二羟基 -2-(3-甲基丁酰基)-5-(3-甲基丁基)-4-(4-甲基戊酰基)环戊-2-烯-1-酮衍生物、基本上对映体纯的组合物和方法″、申请号为201180063785.1的中国发明专利申请的分案申请。

相关申请

本申请要求2010年10月30日提交的美国临时申请61/408,572、2011年3月1日提交的美国临时申请61/448,150和2011年7月15日提交的美国临时申请61/508,434的权利。这些临时申请的公开内容通过援引包括附图在内全文加入本文。

背景技术

α酸家族中的最丰富的成员是(-)-葎草酮。之前已报告了(-)-葎草酮的绝对构型(De Keukeleire 1970)，以及由(-)-葎草酮得到的顺式和反式异 -α酸的绝对构型的确定(De Keukeleire 1971)。

对所谓的‘还原的异-α酸’-由顺式和反式异-α酸得到的还原产物一进一步归类。此附加归类取决于饱和键的位置和饱和度。由仅将C6羰基还原成羟基而得的化合物种类被统称为rho异-α酸(RIAAs)。四氢异-α酸 (THIAA)类总体是指仅两个异戊二烯基均为饱和的那些化合物。相似地，六氢-异-α酸(HIAA)总体是指异-α酸的还原衍生物，其包含在C6的羟基和两个异戊二烯基部分的饱和。由于各种短链脂肪酸参与相应间苯三酚(phlorglucinol)的生物合成途径中，除了顺式和反式非对映体的存在之外，在这三类中的每类内还有各种同类物(Wang 2008)。间苯三酚类是作为异-α酸前体的α酸的常用前体，该异-α酸转而是还原的α异-酸的前体。

近来已表明还原的异-α酸在各种体外和鼠科模型中在肥胖症、血脂异常和炎症的治疗中具有有益效果。rho异-α酸的同类物和立体异构体的混合物-称为RIAA-呈现出在被肿瘤坏死因子α(TNF-α)-刺激的成熟3T3-L1脂肪细胞中的抗炎活性以及在分化3T3-L1脂肪细胞中的脂质形成活性(Babish 2010)。

四氢异-α酸的同类物和立体异构体的混合物-称为THIAA-在体外抑制脾酪氨酸激酶(Syk)、布鲁顿酪氨酸激酶(Btk)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI 3-激酶)和糖原合酶激酶3β(GSK3β)的活性以及β-连环蛋白的磷酸化。此外，THIAA抑制破骨细胞生成，正如RAW 264.7细胞至破骨细胞的转化减低和减低的TRAP活性以及被抑制的IL-1β-激活的前列腺素E2、以及RASF 中基质金属蛋白酶3、IL-6、IL-8和单核细胞趋化蛋白1所指示的。此外，在患有胶原诱导的关节炎(CIA)的小鼠中，同源物和立体异构体的此相同混合物(即，THIAA)显著地减小关节炎指数并减少骨、关节和软骨退化。当用 THIAA处理时这些小鼠中的血清IL-6浓度也以剂量-依赖性的方式被抑制 (Konda 2010)。

与这些研究结果一致，也已报告RIAA和THIAA分别抑制在受脂多糖-刺激的RAW264.7巨噬细胞中的前列腺素E₂(PGE₂)产生以及抑制可诱导的环氧合酶-2(COX-2)蛋白表达。除此之外，每一种混合物，即，RIAA 和THIAA，分别被报告以剂量依赖性方式减低NF-κB核易位和丰度(Tripp 2009)。

RIAA和THIAA的异质性妨碍对各种的同源物和立体异构体-存在于RIAA或THIAA混合物中-相对于它们的个体乃至相对生物活性之间的关系的理解和了解。此外，存在于RIAA和THIAA中的多种化合物之间协同作用的可能性可很大程度，若非完全地，解释这些混合物的所观察到的生物活性。

为了理解和了解各种的同源物和立体异构体相对于它们的个体乃至相对生物活性之间的关系，至关重要的是以基本上纯和对映体纯的化合物形式获得所关注的化合物，并且以基本上纯和对映体纯的形式测定它们的个体生物活性。此必要性一定是从包含不同分子的混合物的任何异质性物质(例如，THIAA、RIAA和HHIAA)的生物活性取决于组成该异质性物质的不同分子的百分比组成、立体化学、结构及其他性质得出的结论。出于这些原因，存在着制备和纯化用于药学组合物和治疗的基本上对映体纯的还原的异-α酸衍生物的需要。

除了此需要之外，还需要以适合于药物开发中常规面临的各种步骤的形式生产基本上纯和对映体纯的化合物。有潜力的候选药物的纯结晶形式的制备有利于药物开发。一个优点是候选药物的化学和物理性质的改进的表征。对结晶形式而言，通常具有比非晶形形式更有利的药物代谢动力学，并且它们通常更易于加工。改进的储藏稳定性是通常与结晶形式相关的另一优点。有潜力的候选药物的结晶形式所固有的物理性质是在选择特定的药物活性成分时的重要因素。一个实例是将有潜力的药物配制入适合的组合物中用于生产、储藏和消费。具体地，在研磨之前和之后，结晶固体的可流动性大大影响如何在加工和药剂生产过程中处理候选药物的方式。在被研磨的固体形式的颗粒不容易流动的情况中，药物制剂研究员将力图开发药物制剂以弥补此困难。这通常包括助流剂例如胶体二氧化硅、滑石和淀粉或碱式磷酸钙的使用。有潜力的药物化合物的另一种固态性质是在含水的流体中它的溶解速度。与特定的结晶多形体相关的物理性质固有地是因为组成该结晶多形体的晶胞的个个分子的空间取向和独特的构象。特定的结晶多形体具有一般不同于非晶形形式或另一多形体的独特的热性质。

多形体的热性质利用例如毛细管法熔点、热重量分析(TGA)和差示扫描量热法(DSC)进行测量。这些测量的结果用来区分和鉴定多形体形式的存在并区别它们彼此。特定的多形体形式一般具有通过包括但不限于X- 射线粉末衍射(XRPD)、单晶x-射线结晶学和红外光谱法的各种技术可检测的不同的结晶学性质和光谱性质。

发明内容

在本文中，在某些实施方式中提供顺式3，4-二羟基-2-(3-甲基丁酰基)-5-(3-甲基丁基)-4-(4-甲基戊酰基)环戊-2-烯-1-酮(″KDT500″)衍生物和基本上对映体纯的组合物以及包含这些衍生物的药学组合物。

在某些实施方式中，本文中提供的KDT500衍生物选自具有式I 所示结构的(+)-(4S，5R)-3，4-二羟基-2-(3-甲基丁酰基)-5-(3-甲基丁基)-4-(4- 甲基戊酰基)环戊-2-烯-1-酮(″(+)-KDT500″)、具有式II所示结构的(-)- (4R，5S)-3，4-二羟基-2-(3-甲基丁酰基)-5-(3-甲基丁基)-4-(4-甲基戊酰基)环戊-2-烯-1-酮(″(-)-KDT500″)，以及其盐和结晶。

在某些实施方式中，本文中提供的KDT500衍生物是(+)-KDT500 或(-)-KDT500的盐。在某些实施方式中，这些衍生物可以是(+)-KDT500或 (-)-KDT500的无机盐或有机盐，包括但不限于，钾盐、铝盐、钙盐、铜盐、胍盐、铁盐、锂盐、镁盐、钠盐、锌盐、辛可尼丁盐、辛可宁盐和二乙醇胺盐。在这些实施方式中的某些中，所述衍生物可以是具有式III所示结构的 (+)-KDT500的钾盐(″(+)-KDT501″)。

在某些实施方式中，本文中提供的KDT500衍生物是(+)-KDT500、 (-)-KDT500或其盐的结晶。在这些实施方式的某些中，所述衍生物是(+)- KDT501的结晶，并且在这些实施方式的某些中，所述结晶具有单斜晶系空间群P 21 21 2，并且晶胞尺寸为α＝90°、和γ＝90°。在某些实施方式中，所述结晶具有表2-4中所示的特征中的一种或多种。

本文中在某些实施方式中提供本文提供的KDT500衍生物的基本上对映体纯的组合物。在某些实施方式中，这些基本上对映体纯的组合物包含(+)-KDT500、(-)-KDT500，或者其盐或结晶。

本文中在某些实施方式中提供基本上对映体纯的药学组合物，其包含本文中提供的一种KDT500衍生物和一种或多种药学可接受的载体。在某些实施方式中，这些基本上对映体纯的药学组合物包含(+)-KDT500、 (-)-KDT500，或者其盐或结晶。

本文中在某些实施方式中提供使用本文中提供的KDT500衍生物一种或多种或其组合物来在体外或体内引发脂质形成(lipogenesis)、引发脂肪形成(adipogenesis)、激活PPARγ或激活GPR120的方法。在某些实施方式中，所述组合物是基本上对映体纯的药学组合物，其包含KDT500 衍生物和一种或多种药学可接受的载体。在某些实施方式中，所述方法用来治疗有此需要的对象中与减少脂质形成、减少脂肪形成或降低PPARγ或 GPR120活性相关的病症。

本文中在某些实施方式中提供一种方法，该方法通过向对象给药治疗有效量的一种或多种本文中提供的KDT500衍生物或其组合物来治疗有此需要的对象中的对PPARγ调制有反应的病症、治疗对GPR120调制有反应的病症、治疗代谢障碍、抑制炎症，或者治疗与炎症相关的病况。在这些实施方式中的某些中，所述衍生物是通过本文中提供的基本上对映体纯的药学组合物给药。在某些实施方式中，所述对PPARγ调制有反应的病症是II型糖尿病、肥胖症、高胰岛素血症、代谢综合征、非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪肝炎、自身免疫病症或增生性病症。在某些实施方式中，所述代谢障碍是糖尿病。在某些实施方式中，本文提供的化合物或组合物的给药导致葡萄糖和/或脂质水平(包括甘油三酸酯水平)下降。

附图简述

图1：(+)-KDT501的立体化学结构。从晶胞省略钾离子和水分子。

图2：(+)-KDT501结晶对其不对称单元的ORTEP图。

图3：(+)-KDT501的XRPD衍射图。

图4：(+)-KDT501的TG/DTA温度记录图。

图5：(+)-KDT501对3T3-L1脂肪细胞中脂质形成的影响。罗格列酮用作阳性对照。

图6A-B：(+)-KDT501对THP-1细胞中TNF-α-(A)和LPS-(B) 介导的MMP-9表达水平的影响。数据表示来自4次试验的平均值±SD。

图7A-B：(+)-KDT501对THP-1细胞中TNF-α-(A)和LPS-(B) 介导的IL-1β表达水平的影响。数据表示来自4次试验的平均值±SD。

图8A-B：(+)-KDT501对THP-1细胞中TNF-α-(A)和LPS-(B) 介导的MCP-1表达水平的影响。数据表示来自4次试验的平均值±SD。

图9A-B：(+)-KDT501对THP-1细胞中TNF-α-(A)和LPS-(B) 介导的RANTES表达水平的影响。数据表示来自4次试验的平均值±SD。

图10A-B：(+)-KDT501对THP-1细胞中TNF-α-(A)和LPS-(B) 介导的MIP-1α表达水平的影响。数据代表来自4次试验的平均值±SD。

图11：(+)-KDT501对RASFs中IL-1β-介导的PGE2水平的影响。

图12：(+)-KDT501对RASFs中IL-1β-介导的MMP13水平的影响。

图13：(+)-KDT501对PPARγ活性的影响。罗格列酮和替米沙坦用作阳性对照。

图14：(+)-KDT501对PPARα活性的影响。GW590735用作阳性对照并且罗格列酮用作阴性对照。

图15：(+)-KDT501对PPARδ活性的影响。GW0742用作阳性对照并且罗格列酮用作阴性对照。

图16：(+)-KDT501和(-)-KDT501对PPARγ活性的影响。罗格列酮用作阳性对照。

图17：(+)-KDT501对GPR120活性的影响。数据代表重复测定的平均值+/-标准偏差。DHA、EPA和α-LA用作对照。

图18：(+)-KDT501和(-)-KDT501在无细胞测试中对DAPK1活性的影响。

图19：KDT501对ZDF大鼠中的血糖水平的影响。

图20：KDT501对ZDF大鼠中血甘油三酸酯水平的影响。

图21：KDT501对DIO小鼠中血糖水平的影响。

图22：KDT501对DIO小鼠中血胰岛素水平的影响。

图23：KDT501对DIO小鼠中HbA1C水平的影响。

图24：KDT501对DIO小鼠中脂肪量的影响。

具体实施方式

本发明的以下描述仅旨在说明本发明的几种实施方式。因此，所讨论的具体改变不应被解释为对本发明范围的限制。对本领域技术人员而言，显然易见在不脱离本发明范围的情况下可进行各种等效、变化和修改，并且理解这样等效的实施方式应包括在本文中。

正如本文中公开的，顺式3，4-二羟基-2-(3-甲基丁酰基)-5-(3-甲基丁基)-4-(4-甲基戊酰基)环戊-2-烯-1-酮(″KDT500″)衍生物已被合成、纯化和鉴定。因此，本文中在某些实施方式中提供KDT500衍生物及其盐和结晶，包括所述盐的结晶。本文中还提供组合物，其包含这些衍生物及其盐和结晶，包括基本上对映体纯的组合物。

术语″盐″在本文中使用时可指任何药学可接受的盐，包括例如无机碱盐如钾盐、铝盐、钙盐、铜盐、胍盐、铁盐、锂盐、镁盐、钠盐和锌盐，以及有机碱盐如辛可尼丁盐、辛可宁盐和二乙醇胺盐。在例如，Berge J Pharm Sci 66：1(1977)中可查到如本发明所述的药学可接受的盐和制备物的其他实例。

在某些实施方式中，本文中提供的KDT500衍生物具有式I或式 II所示的结构：

式I和式II的化合物分别表示(+)-(4S，5R)-3，4-二羟基-2-(3-甲基丁酰基)-5-(3-甲基丁基)-4-(4-甲基戊酰基)环戊-2-烯-1-酮(本文中称为″(+)- KDT500″)和(-)-(4R，5S)-3，4-二羟基-2-(3-甲基丁酰基)-5-(3-甲基丁基)-4-(4- 甲基戊酰基)环戊-2-烯-1-酮(本文中称为″(-)-KDT500″)。因此，在某些优选的实施方式中，本文中提供的KDT500衍生物是(+)-KDT500或(-)-KDT500。

在某些实施方式中，本文中提供的KDT500衍生物是KDT500 的盐。KDT500的盐包括但不限于KDT500的钾盐、镁盐、钙盐、锌盐、铁盐、钠盐、铜盐、胍盐、辛可尼丁盐和辛可宁盐。例如，KDT500的盐可以是((+)-(4S，5R)-3，4-二羟基-2-(3-甲基丁酰基)-5-(3-甲基丁基)-4-(4-甲基戊酰基)环戊-2-烯-1-酮的钾盐(本文中称为″(+)-KDT501″)，具有式III所示的结构：

在其他实施方式中，本文中提供的KDT500衍生物是KDT500的结晶或其盐，包括例如KDT501。在这些实施方式的某些中，提供(+)- KDT501的结晶，其具有单斜晶系空间群P21 21 2，并且晶胞尺寸为和 (+)-KDT501的此结晶形式本文中称为″结晶(+)-KDT501″。

在某些实施方式中，结晶(+)-KDT501具有表2中所示的三维原子坐标、表3中所示的键长和角度，和/或表4中所示的各向异性位移参数，其中该各向异性位移因子指数采用此形式：-2π²[h²a＊²U¹¹+...+2h k a＊^b＊ U¹²]。

本文中在某些实施方式中提供组合物，其包含一种或多种本文中提供的KDT500衍生物。在这些实施方式的某些中，所述组合物是基本上对映体纯的。术语″基本上对映体纯″在本文中使用时是指一种组合物，在该组合物中90％或更多的特定化合物是第一对映体形式，而10％或更少的是第二对映体形式。例如，在基本上对映体纯的(+)-KDT500组合物中，在该组合物中90％或更多的所述KDT500是(+)-KDT500而10％或更少的是 (-)-KDT500。在某些实施方式中，化合物的″第一对映体形式″包括该对映体形式的盐和结晶。例如，在基本上对映体纯的(+)-KDT500组合物中，在该组合物中90％或更多的所述KDT500是(+)-KDT500形式或者其盐或结晶，而10％或更少的是(-)-KDT500形式或者其盐或结晶。在某些实施方式中，基本上对映体纯的组合物可包含91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.95％或99.99％或者更多的化合物的第一对映体形式。

在某些实施方式中，提供(+)-KDT500的组合物。在这些实施方式的某些中，所述组合物是基本上对映体纯的。在这些实施方式的某些中，在该组合物中一定百分比的(+)-KDT500是(+)-KDT500的盐或结晶的形式。在这些实施方式的一些中，该组合物中的所有(+)-KDT500是盐或结晶形式。因此，本文中提供(+)-KDT500盐或结晶的基本上对映体纯的组合物。在其他实施方式中，该组合物中没有(+)-KDT500是盐或结晶形式。

在某些实施方式中，提供(+)-KDT500的组合物。在这些实施方式的某些中，所述组合物是基本上对映体纯的。在这些实施方式的某些中，该组合物中一定百分比的(-)-KDT500是(-)-KDT500的盐或结晶的形式。在这些实施方式的一些中，该组合物中所有的(-)-KDT500是盐或结晶形式。因此，本文中提供(-)-KDT500盐或结晶的基本上对映体纯的组合物。在其他实施方式中，该组合物没有(-)-KDT500是盐或结晶形式。

本文中在某些实施方式中提供药学组合物，其包含本文中提供的 KDT500衍生物中的一种或多种和一种或多种药学可接受的载体。在某些实施方式中，所述药学组合物是基本上对映体纯的。在这些实施方式的某些中，所述基本上对映体纯的药学组合物包含(+)-KDT500、(-)-KDT500或者其盐或结晶。″药学可接受的载体″在本文中使用时是指参与将相关的化合物从身体的一个组织、器官或部分携带或运输到身体的另一组织、器官或部分的药学可接受的材料、组合物或载体。这样的载体可包括，例如，液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂、封装材料、稳定剂，或它们的某组合。所述载体的各组分必须是″药学可接受的″，因为它必须与所述组合物的其他组分相容，并且必须适合于接触可能接触到的任何组织、器官或身体的部分，意即它必须不具有毒性、刺激、变应性反应、免疫原性或过度超出其治疗益处的任何其他并发症的风险。

用于本文中提供的组合物中的药学可接受的载体的实例包括但不限于：(1)糖类，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖或甘露醇；(2)淀粉类，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，例如可可油和栓剂蜡；(9)油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，例如丙二醇； (11)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)崩解剂，例如琼胶或碳酸钙；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)醇，例如乙醇和丙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液； (21)石蜡；(22)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇或月桂醇硫酸酯钠盐；(23)着色剂；(24)助流剂例如胶体二氧化硅、滑石和淀粉或磷酸三钙；和(24)其他用于药学组合物中的非毒性可相容的物质例如丙酮。在一个实施方式中，在此所用的药学可接受的载体是含水的载体，例如，缓冲盐水等。在其他实施方式中，所述药学可接受的载体是极性溶剂，例如丙酮和醇。

在此提供的药学组合物还可包含一种或多种药学可接受的接近生理学状态所需的辅助性物质。例如，组合物可包含一种或多种pH调节剂、缓冲剂或毒性调节剂，包括例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。

本文中提供的药学组合物可以被配制成适合的剂型，包括，例如胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、含剂(使用有调味的基料，通常蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)、散剂、颗粒剂、在含水或不含水的液体中的溶液剂或混悬剂、水包油或油包水液体乳剂、酏剂或糖浆剂，或者锭剂(使用惰性基料，例如明胶和甘油，或者蔗糖和阿拉伯胶)和/或漱口剂等，每种包含预定量的 KDT500衍生物作为活性成分。在某些实施方式中，所述组合物可被配制成定时释放递送载体，例如定时释放胶囊剂。″定时释放载体″在本文中使用时是指在一段时间而不是给药时即时释放活性成分的任何递送载体。在其他实施方式中，所述组合物可被配制成速释递送载体。

片剂可通过压制或模塑，任选地与一种或多种辅助成分一起进行制备。压制的片剂可使用粘合剂(例如，明胶或羟丙基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，淀粉乙醇酸钠或交联的羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂进行制备。模塑片剂可通过在适合的机器中模塑粉碎的KDT500衍生物的或用惰性液体稀释剂进一步湿润的基本上对映体纯的混合物进行制备。片剂，及其他固体剂型，例如糖衣丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂，可任选地被刻痕，或者用包衣或壳例如肠溶衣及药物制剂领域中公知的其他包衣制备。它们还可被配制用以提供KDT500衍生物的缓释或控释，其中使用，例如，不同比例的羟丙基甲基纤维素以提供期望的释放曲线，其他聚合物基质、脂质体和/或微球。它们可例如，通过细菌-截留过滤器过滤，或者通过在使用之前立即添加可溶于无菌水或一些其他无菌可注射的介质的无菌固体组合物形式的杀菌剂进行杀菌。这些组合物还可任选对包含消光剂(pacifying agent)，并且可具有它们仅仅或优选地在胃肠道的某一部分任选地以延迟的方式释放KDT500衍生物的组合物。可使用的包埋组合物 (embedding composition)的实例包括聚合物物质和蜡。所述KDT500衍生物还可以是微胶囊化的形式，若适当，具有一种或多种上述赋形剂。

在本文提供的组合物中KDT500衍生物的浓度可以变化。可根据具体所选的给药模式和生物系统的需要，在流体体积、粘度、体重等的基础上选择浓度。在某些实施方式中，在本文提供的组合物中KDT500衍生物的浓度可以是约0.0001％至100％，约0.001％至约50％，约0.01％至约 30％，约0.1％至约20％，或者约1％至约10％wt/vol。

本文中还提供分析、合成、纯化和/或结晶本文提供的KDT500衍生物的方法，以及分析、结晶、纯化和/或结晶本文中提供的基本上对映体纯KDT500组合物的方法。

在某些实施方式中，本文中提供的合成方法产生KDT500衍生物的单对映体。例如，所述合成方法可产生仅仅(+)-KDT500或仅仅(-)-KDT500。在其他实施方式中，所述合成方法产生KDT500衍生物的对映体形式的混合物。在这些实施方式中，可进行一步或多步后续分离和/或纯化步骤以分离单对映体形式或者产生本文中提供的基本上对映体纯的组合物。

在本文中提供的合成和纯化方法的某些中，(+)-KDT500和/或(-)- KDT500可以用蛇麻酮作为原料进行合成(参见，例如，以下实施例11)。在这些合成/纯化方法之一中，蛇麻酮首先通过还原-脱烷基化被转化成四氢- 脱氧葎草酮，和四氢-脱氧葎草酮通过不对称氧化被转化成对映体纯的四氢 -葎草酮((+)和/或(-))。所得的对映体提供对映选择性和非对映选择性异构化被纯化和转化成相应的顺式异-葎草酮。

在另一个实施方式中，(+)-KDT500和/或(-)-KDT500可用脱氧葎草酮作为原料进行合成(参见，例如，以下实施例12)。在一个实施方式中，脱氧葎草酮首先通过不对称氧化被分别转化成(+)-葎草酮和/或(-)-葎草酮。 (+)-葎草酮通过对映选择性和非对映选择性异构化被转化成相应的对映体纯的(-)-顺式异葎草酮，然后通过氢化进一步被转化成(-)-KDT500。(-)-葎草酮通过对映选择性和非对映选择性异构化被转化成相应的对映体纯的(+)- 顺式异葎草酮，然后通过氢化进一步被转化成(+)-KDT500。

在另一个实施方式中，对映体纯的(+)-葎草酮和(-)-葎草酮可从外消旋(±)-葎草酮纯化(参见，例如，以下实施例13)。在另一个实施方式中，对映体纯的(+)-四氢葎草酮和(-)-四氢葎草酮可从外消旋(±)-四氢葎草酮纯化(参见，例如，以下实施例14)。

如在本文中公开的，对(+)-KDT501对3T3-L1鼠成纤维细胞模型中脂质形成和脂肪形成的影响进行评价。观察到(+)-KDT501均以剂量-依赖性的方式引发脂质形成和脂肪形成。3T3-L1鼠成纤维细胞能够研究前脂肪细胞繁殖、脂肪细胞分化和胰岛素敏化效应(Fasshauer 2002；Li2002；Raz 2005)。已报告促进脂肪细胞中的脂质摄取的试剂改进胰岛素敏感性。一种假说是脂肪酸从血浆被纳入脂肪细胞中致使肌肉中脂肪酸的相对减少具有伴随的葡萄糖摄取的改进(Martin 1998)。在肌肉和肝脏中游离脂肪酸的胰岛素脱敏效应可因噻唑烷二酮治疗而减低。这些体外结果已被临床证实 (Boden 1997；Stumvoll 2002)。

评价(+)-KDT501和(-)-KDT501在PPARγ、SCN2A和AGTR2 的激动剂配体存在下与这些靶竞争性结合的能力。两种分子都表现出在靶的激动剂配体存在下结合所有三种结合靶的能力，其中(+)-KDT501表现出对所有三种靶的较高的亲和性。在所述靶中，(+)-KDT501以最大的亲和性结合PPARγ。接着评价(+)-KDT501和(-)-KDT501对PPAR活性的影响。两种化合物都增大PPARγ活性而对PPARα或PPARδ活性具有小或无影响。然而，(+)-KDT501对PPARγ活性的影响在所有浓度下是(-)-KDT501 对其影响的至少3倍，表明(+)-KDT501作为PPARγ激活剂明显更有效。 PPARγ在脂肪形成、葡萄糖体内平衡和胰岛素敏感性中是主调节物，并且是噻唑烷二酮的分子靶，其使细胞对胰岛素敏感，并且在肝脏、脂肪组织和骨骼肌中具有抗糖尿病效应(Tontonoz 1994；Tontonoz 1994)。

基于本文中提供的KDT500衍生物诱导脂质形成、脂肪形成和 PPARγ活性的能力，本文中提供通过给药治疗有效量的一种或多种本文中提供的KDT500衍生物或其基本上对映体纯的药学组合物来诱导脂质形成、诱导脂肪形成和/或激活PPARγ的方法，以及治疗有此需要的对象中对 PPARγ调制有反应的病症的方法。对PPARγ调制有反应的病症的实例包括，例如，通过改进葡萄糖和能量体内平衡可治疗的病症，包括但不限于II 型糖尿病、肥胖症、高胰岛素血症、代谢综合征、非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪肝炎、自身免疫病症和增生性病症。

如上所述，以前已确定的PPARγ激动剂已表明抑制炎症反应。 PPARγ不仅激活用于脂质代谢的靶基因的转录，而且减低炎症基因的表达 (Pascual 2005)。炎症反应受PPARγ激动剂的抑制与抗糖尿病的和抗动脉粥样硬化的效应密切相关。为了评价KDT501在炎症中的作用，对(+)- KDT501评价它抑制各种TNF-α-介导的、LPS-介导的和IL-1β-介导的炎症因子的表达的能力。已观察到(+)-KDT501抑制THP-1细胞中MMP-9、IL- 1β、MCP-1、RANTES和MlP-1α的受TNF-α-介导的和LPS-介导的表达，并且抑制类风湿性关节炎滑液成纤维细胞(RASF)细胞中PGE₂和MMP-13 的受IL-1β-介导的表达。此外，已观察到(+)-KDT501和(-)-KDT501都抑制 DAPK1活性，其中(+)-KDT501显示出最大的效能。

KDT501改进胰岛素敏感性和葡萄糖调节以及减低促炎信号的能力表明影响胰岛素信号转导与炎症途径之间的相互作用的机制。此活性的一种潜在机制是通过G蛋白偶联受体的刺激。为了评价此可能性，测试(+)- KDT501对ω3脂肪酸敏化的G-蛋白偶联受体GPR120的活性的影响。 GPR120的激活通过抑制NF-κB途径来改进胰岛素敏感性并且减轻炎症 (Oh 2010；Talukdar 2011)。GPR120也已表明介导肠L细胞中的GLP-1 分泌(Hirasawa2005；Hara 2011)并且增大脂肪细胞中的脂质形成(Goth 2007)，都促进抗糖尿病的效应。已观察到(+)-KDT501以30.3μM的EC₅₀值激动GPR120活性，表明(+)-KDT501可部分地通过GRP120激活发挥它的脂质形成效应。

基于本文中提供的KDT500衍生物诱导GPR120活性的能力，本文中提供通过给药治疗有效量的一种或多种本文中提供的KDT500衍生物或其基本上对映体纯的药学组合物来治疗有此需要的对象中的对 GPR120调制有反应的病症的方法。此外，基于本文中提供的KDT500衍生物诱导GPR120和PPARγ活性并抑制各种受TNF-α-介导的、LPS-介导的和IL-1β-介导的炎症因子的表达的能力，本文中提供通过给药治疗有效量的一种或多种本文中提供的KDT500衍生物或其基本上对映体纯的药学组合物来抑制有此需要的对象中的炎症的方法。本文中还提供通过给药治疗有效量的一种或多种本文中提供的KDT500衍生物或其基本上对映体纯的药学组合物来治疗有此需要的对象中与炎症相关的各种病症和/或炎症因子MMP-9、IL-1β、MCP-1、RANTES、MIP-1α、PGE₂和MMP-13中的一种或多种的升高的水平相关的病症的方法。这样的病症包括，例如，动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块不稳定性、自身免疫性疾病例如类风湿性关节炎、软骨退化、骨关节炎、变应性病症、免疫缺陷疾病例如HIV/AIDS、肾病、肿瘤和糖尿病。

正如本文中公开的，在大鼠糖尿病模型中评价(+)-KDT501改变葡萄糖和脂质水平的能力。在每天一次200mg/kg的剂量下，观察到(+)- KDT501显著降低葡萄糖水平。此降低远远大于在用二甲双胍治疗的大鼠中观察到的，并且与在用吡格列酮治疗的大鼠中观察到的相似。相似地，已观察到(+)-KDT501使甘油三酸酯水平降低至与用吡格列酮观察到的几乎相同的程度。

在小鼠模型中，每天两次给药(+)-KDT501有效地降低循环全血葡萄糖和胰岛素水平，在口服葡萄糖耐量试验(OGTT)中降低在浓度-时间曲线下的葡萄糖和胰岛素面积(AUC)，并且减少饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠中的脂肪量。在DIO小鼠中，在30天时间段中还观察到糖化血红素(HbA1c) 百分比的降低趋势。

基于本文中提供的KDT500衍生物在大鼠和小鼠模型中降低循环葡萄糖、甘油三酸酯和胰岛素水平的能力，本文中提供方法，该方法通过给药治疗有效量的一种或多种本文中提供的KDT500衍生物或其基本上对映体纯的药学组合物来治疗代谢障碍。″代谢障碍″在本文中使用时是指导致体内平衡失去代谢控制的任何病症。代谢障碍的实例包括，例如，糖尿病、高血糖、增重、胰岛素抵抗、血脂异常和高胆固醇血症。在某些实施方式中，提供方法，该方法通过给药治疗有效量的一种或多种本文中提供的KDT500 衍生物或基本上对映体纯的药学组合物来治疗有此需要的对象中的糖尿病，包括II型糖尿病。相似地，在某些实施方式中提供方法，该方法通过给药治疗有效量的一种或多种本文中提供的KDT500衍生物或基本上对映体纯的药学组合物来降低有此需要的对象中的葡萄糖和/或脂质水平。在某些实施方式中，所述KDT500衍生物或组合物的给药导致血糖水平的降低和/或甘油三酸酯水平的降低。在某些实施方式中，所述KDT500衍生物或组合物的给药导致包括例如总胆固醇或LDL水平在内的其他脂质水平中的一种或多种的降低。

在本文中提供的方法的某些实施方式中，所述对象是哺乳动物，在这些实施方式的某些中，所述对象是人。″有此需要的对象″是指经诊断患有对PPARγ调制有反应的病症或代谢障碍的对象、表现或已表现出对 PPARγ调制有反应的病症或代谢障碍中的一种或多种症状的对象，或者基于遗传或环境因素中的一种或多种而被认为有对PPARγ调制有反应的病症或代谢障碍发病风险的对象。

术语″治疗″在本文中使用时就病症而言是指预防该病症、减缓该病症的发作或进展速度、减少罹患该病症的风险、预防或延迟与该病症相关的症状的发展、减轻或终止与该病症相关的症状、产生该病症的完全或部分的消退，或其一些组合。

KDT500衍生物或药学组合物的″治疗有效量″在本文中使用时是指在对象中产生期望的疗效的组合物的量。确切的治疗有效量是在特定的对象中就疗效而言可产生最有效的结果的该化合物或组合物的量。此量可取决于多种因素包括但不限于该治疗化合物的特征(包括，例如，活性、药物代谢动力学、药物效应动力学和生物利用度)、该对象的生理学状况(包括，例如，年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体状态、对特定剂量的反应，以及药物类型)、该组合物中的药学可接受的载体或载体的性质以及给药途径而改变。临床和药理学领域中的技术人员能够通过常规试验，即通过监测对象对服用化合物的反应并相应地调整剂量来确定治疗有效量。额外的指导，参见Remington：The Science and Practice ofPharmacy第21 版，Univ.of Sciences in Philadelphia(USIP)，Lippincott Williams&Wilkins， Philadelphia，PA，2005，其整个公开通过援引并入本文中。

在某些实施方式中，本文中提供的KDT500衍生物或组合物的治疗有效量可选自每天每对象约10^-10g至约100g、约10^-10g至约10^-3g、约10^-9g至约10^-6g、约10^-6g至约100g、约0.001g至约100g、约0.01 g至约10g，或者约0.1g至约1g的活性成分(即KDT500衍生物)。在某些实施方式中，KDT500衍生物或组合物的治疗有效量可根据对象的体重进行计算。例如，在某些实施方式中，治疗有效量可以是每天每对象约100 mg/kg或更多、约150mg/kg或更多、约200mg/kg或更多、约250mg/kg 或更多，或者约300mg/kg或更多的活性成分(即KDT500衍生物)。

在某些实施方式中，本文中提供的化合物或组合物可每天一次或多次进行给药。在其他实施方式中，所述化合物或组合物可每天小于一次进行给药。例如，所述化合物或组合物可每周一次、每月一次或者每数月一次进行给药。本文中提供的化合物或组合物的给药可在预先确定的特定治疗时间段中进行，或者可无限期地进行，或者直至达到特定的治疗基准。例如，可进行给药直至葡萄糖和/或脂质水平达到预定的阈值。在某些实施方式中，给药频率可在治疗过程中变化。例如，对象可在治疗的过程中在达到某些治疗基准时接受较低频率的给药。

本文中公开的化合物或组合物可通过本领域已知的任何给药途径包括但不限于经口、喷雾、经肠、经鼻、经眼、胃肠外或经皮(例如，局部用乳膏剂或软膏剂、贴剂)向对象给药。″肠胃外″是指给药途径，其一般与注射相关，包括眶下、输注、动脉内、囊内、心内、皮内、肌肉内、腹膜内、肺内、脊柱内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、囊下、皮下、经粘膜或经气管的给药。制备可肠胃外给药的组合物的方法是本领域技术人员已知的或显而易见的，并且在出版物例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy第21版，MackPublishing Company，Easton， Pa.(2005)中更详细地描述。组合物还可以以大丸药、药糖剂或糊剂的形式给药。

在某些实施方式中，提供药盒，其包含一种或多种本文中提供的 KDT500衍生物或其基本上对映体纯的组合物。在某些实施方式中，所述药盒提供使用说明书，例如剂量或服药说明书。在某些实施方式中，所述药盒可用来在有此需要的对象中治疗对PPARγ或GPR120调制有反应的病症、治疗代谢障碍例如糖尿病、降低葡萄糖和/或脂质水平、抑制炎症，或者治疗与炎症相关的病症。

在某些实施方式中，本文中提供的KDT500衍生物和基本上对映体纯的KDT500衍生物组合物可用作调味剂。在这些实施方式中的某些中，所述化合物用作苦味剂。

提供以下实施例以更好地说明本发明而不应理解为限制本发明的范围。具体材料提及的程度仅是出于解释说明的目的而非旨在限制本发明。本领域技术人员可在不行使创造能力并且不脱离本发明的范围的情况下开发等效的手段或反应试剂。应理解在本文中所述的方法中可进行许多变化而仍然在本发明的范围内。本发明人旨在将这样的变化包括在本发明的范围内。

实施例

实施例1：基本上对映体纯的(+)-和(-)-KDT500衍生物的结晶和表征：

(+)-KDT501的结晶(图解I)：

将100g在啤酒花处理过程中获得的主要是顺式四氢-异α酸按照已报告的方法利用高速逆流色谱法(HSCCC)进行纯化(Dahlberg 2010)。HPLC 和UV峰面积分析表明所得的产物是＞90％KDT500。将经纯化的材料通过与1当量的钾盐(例如KOH)反应转化成(+)-KDT501，重结晶多次以除色。在达到足够的均一性后，将(+)-KDT501进一步重结晶以使(+)-KDT501的结晶具有足以用于x-射线衍射试验的尺寸。

将水(450μL)和(+)-KDT501(49.5mg)加入至4mL小瓶中，并用盖子密封此小瓶，用加热器(70℃)加热直至溶解。使该溶液在2小时中冷却至35℃。在此时间中，观察结晶的现场形成。使该混合物在室温(22℃)下静置8小时，在此时观察其他结晶的形成。识别适合用于x-射线分析的单个结晶，小心地从溶液取出，安装，然后进行X-射线衍射分析。

(+)-KDT501的结晶结构的解析：

将无色块，尺寸为0.37x 0.30x 0.28mm³，与油一起固定在玻璃毛细管上。在Bruker APEX ll单晶X-射线衍射仪，Mo-辐射上在-163℃下采集数据。对于所有的组，结晶-至-检测器距离是40mm并且曝光时间是10秒/度。扫描宽度是0.5°。数据采集98.4％完成至θ25°。总计68211 (合并)次反射被采集，所覆盖的指数：h＝-26至28，k＝-34至34，l＝-16 至14。16681次反射是对称性独立的并且R_int＝0.0386表明该数据是良好的(平均质量0.07)。指标化和晶胞参数修正表明原正交晶格(primitive orthorhombic lattice)。观察到空间群是P2₁ 2₁ 2(No.18)。

利用APEX2软件包(Bruker 2007 APEX2(2.1-4版)、SAINT (7.34A版)、SADABS(2007/4版)、BrukerAXS Inc，Madison，WI)内的 SAINT、SADABS积分和按比例绘制数据。

按照直接法的解决方案(SHELXS；SIR97(Altomare J Appl Cryst 32：115(1999)，Altomare J Appl Cryst26：343(1993))产生与提议的结构一致的完全重原子定相模型。用SHELXL97(Sheldrick，″SHELXL-97： Program for the Refinement of CrystalStructures，″University of Gottingen， Germany(1997)；Mackay″MaXus：a computerprogram for the solution and refinement of crystal structures fromdiffraction data，″University of Glasgow，Scotland(1997))通过差分傅里叶合成完成该结构。散射因子是来自Waasmair和Kirfel(Waasmaier Acta Crystallogr A 51：416(1995))。氢原子被置于几何理想化的位置并且被约束依赖于它们的母原子其中C--- H距离在0.95-1.00埃范围内。固定各向同性热参数U_eq从而对于CH是它们的母原子Ueq的1.2U_eq而在甲基的情况中是它们的母原子U_eq的1.5U_eq。将所有的非氢原子通过全矩阵最小二乘法进行各向异性地精处理。(+)- KDT501的结晶结构示于图1中。晶体学数据示于表1中，三维原子坐标示于表2中，键长和角度示于表3中，以及各向异性位移参数(其中各向异性位移因子指数采用形式：-2π²[h²a＊²U¹¹+...+2h k a＊b＊U¹²])示于表4 中。

(+)-KDT501结晶形式的不对称单元由与4个钾离子络合的4个 (+)-KDT501分子组成。2个钾离子与氧桥连；无序的水分子与其他两个络合。有机部分的酮与钾离子络合产生紧密堆积模式。(+)-KDT501的不对称单元示于图2中。绝对构型从反常散射获得(绝对结构参数＝0.04(4))。

(+)-KDT501的X-射线粉末衍射(XRPD)和热分析：

使用配有Cu X-射线管和Pixcel检测器系统的Panalytical Xpert Pro衍射仪进行XRPD分析。将等温样品在传递模式中进行分析并固定在低密度聚乙烯膜之间。XRPD衍射图显示(+)-KDT501是结晶(图3)。

热重分析/差热分析仪(TG/DTA)：

热分析在Perkin Elmer Diamond上进行。校准标准是铟和锡。将样品置于铝质样品盘中，插入TG炉中并精确称重。将样品在氮气流中以 10℃/分钟的速度从30℃-300℃加热。在样品的分析之前，使该炉的温度平衡在30℃。

TG/DTA温度记录图(图4)显示出1.37％的减重，表明失去一些溶剂，是水合物或溶剂化物的指示。除了在145℃开始时的熔解吸热之外，没有其他热事件出现。

实施例2：(+)-KDT501对3T3-L1脂肪细胞中脂质形成的影响：

在3T3-L1脂肪细胞中评价(+)-KDT501对脂质形成的影响。

将鼠3T3-L1前脂肪细胞(ATCC，Rockville，MD)在补充有10％胎牛血清(FBS；ATCC)的DMEM(Invitrogen，Rockville，MD)中培养。作为前脂肪细胞，3T3-L1细胞具有成纤维细胞的外观。它们在培养液中繁殖直至它们形成融合单层，其后细胞-细胞接触触发G₀/G₁生长停滞。后续用3-异丁基-1-甲基苍耳烷、地塞米松和高剂量的胰岛素刺激两天促使细胞进行后-融合有丝分裂无性扩增，离开细胞周期，并开始表达脂肪细胞-特异性基因。在分化的诱导后约5天，细胞表现出特征性脂质-填充的脂肪细胞表型。

将细胞以约1.5X 10⁶个细胞的初始密度接种在24-孔板中并培养 2天至融合。在第0天将细胞用(+)-KDT501(25、12.5、6.25和3.25μM)、罗格列酮(10μM，阳性对照；CaymanChemicals，Ann Harbor，MI)或DMSO (阴性对照)处理。在此初步处理之后，通过添加由10％FBS/DMEM(高葡萄糖)、0.5mM甲基异丁基黄嘌呤(Sigma，St.Louis，MO)、0.5μM 地塞米松(Sigma)和10μg/mL胰岛素(Sigma)组成的分化培养基使细胞分化成脂肪细胞。在2天后，将该培养基更换为由10μg/mL胰岛素/10％ FBS/DMEM组成的进程培养基(progressionmedium)。在另外两天后，将培养基更换为由10％ FBS/DMEM组成的维持培养基。在整个成熟期(第6 天/第7天)中每两天用(+)-KDT501或罗格列酮/DMSO再处理细胞。每当加入新培养基时，也加入新的测试材料。

在整个测试中在第0天和每两天进行显微镜评价以评估前脂肪细胞分化成脂肪细胞形态学。用Oil Red O染色量化细胞内脂质。在第8天/ 第9天后在不扰动细胞层的情况下小心地弃去培养基。将10％福尔马林加入并孵育15分钟，用60％异丙醇清洗板，并在室温下干燥10分钟。将300 μL的Oil红色O溶液(0.36％/60％乙醇；Millipore，Billerica，MA)加入并在室温下孵育10分钟。用70％乙醇清洗板，然后用水清洗2次。通过加入 200μL的100％异丙醇萃取染料20分钟。将150μL样品转移至96孔板并用板读数器(Thermo Electron Corp.)在530nm下测定吸光度。用100％异丙醇作为空白。

结果总结于图5中。(+)-KDT501在6.25、12.5和25μM下以统计学显著的方式增加3T3-L1脂肪细胞中的脂质形成。观察到的增长可与用罗格列酮观察到的增长相比。

实施例3：(+)-KDT501对THP-1细胞中TNF-α-和LPS-介导的炎症因子的影响：

在人单核细胞THP-1细胞中评价(+)-KDT501的抗炎效果。

按照生产商的说明书将THP-1细胞(ATCC，Manassas，VA)在 RPMI1640中在10％血清的存在下培养。将细胞用(+)-KDT501在不同的浓度(50、25、12.5和3.125μM)下预孵育1小时，然后用TNF-α(10ng/ml； Sigma，St.Louis，MO)或大肠杆菌LPS(1μg/ml；Sigma，St.Louis， MO)过夜(16-20小时)刺激。用ELISA试剂盒(GE Healthcare，Piscataway， NJ)测定培养基中的MMP-9水平，并使用Milliplex MAP人细胞因子/趋化因子试剂盒(Millipore，Billerica，MA)测定细胞因子。使用Luminex 100^TM IS定量分析物。用5-参数对数方法分析数据。

结果示于图6-10中。(+)-KDT501以剂量-依赖性方式抑制 MMP-9(图6)、IL-1β(图7)、MCP-1(图8)、RANTES(图9)和MlP-1α(图 10)的由TNF-α和LPS-引发的表达。

实施例4：(+)-KDT501对RASF中IL-1β-介导的炎症因子的影响：

在类风湿性关节炎滑液成纤维细胞(RASF)中评价(+)- KDT501的抗炎效果。

将人RASF细胞(Asterand，Detroit，MI)在DMEM/F12(1∶1) 培养基中在10％胎牛血清存在下培养并维持。将细胞在24-孔板中以1x10⁴个细胞/孔的密度次代培养并使其在2天中达到70-80％融合。将在无血清的培养基中在0.1％DMSO的最终浓度下融合的细胞用(+)-KDT501在不同的浓度(50、25、12.5和6.25μM)下孵育1小时，然后用IL-1β(10ng/ml) 刺激20-24小时。使用ELISA试剂盒(GE Healthcare，Piscataway，NJ)测定培养基中的MMP-13水平，并用免疫检测试剂盒(Assay Designs，Ann Arbor，MI)测定PGE₂水平。

结果示于图11和12中。(+)-KDT501抑制IL-1β-诱导的PGE₂ (图11)和MMP-13(图12)的表达。

实施例5：KDT501对PPARγ、SCN2A和AGTR2的竞争性结合：

(+)-KDT501对过氧化物酶体增殖体-激活的受体γ(PPARγ)、电压门控的钠通道II型(SCN2A)和血管紧张素II受体II型(AGTR2)的竞争性结合分别在激动剂罗格列酮、藜芦定和血管紧张素-II的存在下进行评价。

对于PPARγ，将细胞膜匀浆(8μg蛋白质)在4℃下与5nM [³H]罗格列酮在有或无(+)-KDT501的包含10mM Tris-HCl(pH8.2)、50mM KCl和1mM DTT的缓冲剂存在下孵育120分钟，并在10μM罗格列酮存在下测定非特异性结合。

对于SCN2A，将大脑皮质的细胞膜匀浆(200μg蛋白质)在 22℃下与10nM[³H]箭毒蛙毒素在有或无(+)-KDT501下在包含50mM Hepes/Tris(pH 7.4)、130mM氯化胆碱、5.4mMKCl、0.8mM MgSO₄、 1g/l葡萄糖、0.075g/l蝎毒和0.1％ BSA的缓冲剂中孵育60分钟，并在300μM藜芦定的存在下测定非特异性结合。

对于AGTR2，将细胞膜匀浆(5μg蛋白质)在37℃下与0.01 nM[¹²⁵I]CGP 42112A(血管紧张素-II受体II型激动剂)在有或无(+)-KDT501 下在包含50mM Tris-HCl(pH 7.4)、5mM MgCl₂、1mM EDTA和0.1％ BSA的缓冲剂中孵育240min，并在1μM血管紧张素II的存在下测定非特异性结合。

在孵育后，将样品通过用0.3％ PEI预浸渍的玻璃纤维过滤器 (GF/B，Packard)在真空下快速过滤并使用96-样品细胞收集器(Unifilter， Packard)用冰冷的50mM Tris-HCI冲洗数次。将过滤器干燥，然后使用闪烁混合剂(Microscint 0，Packard)在闪烁计数器(Topcount，Packard)中对放射性计数。

结果总结于表5中。(+)-KDT501表现出在靶激动剂配体存在下结合所有三种靶的能力，其中与PPARγ的结合亲和力最高。

表5：

使用(-)-KDT501替代(+)-KDT501如上所述重复结合试验。这些结果总结于表6中。类似于(+)-KDT501，(-)-KDT501表现出在靶激动剂配体存在下结合所有三种靶的能力。然而，(-)-KDT501对所有三种靶的IC₅₀和K_i高于(+)-KDT501所显示出的。

表6：

实施例6：KDT501对PPAR活性的影响：

利用PPAR报告基因试验(INDlGO Biosciences，PA)评价(+)- KDT501对PPARα、PPARδ和PPARγ活性的功能性影响。此测定利用非人哺乳动物细胞，该细胞被基因工程化以提供PPARα、PPARδ或PPARγ的组成性高水平表达并且包含对适当的PPAR特异性的萤光素酶报告基因。在通过激动剂结合激活后，PPAR诱导萤光素酶报告基因的表达。因此萤光素酶活性提供测定激动剂-处理的细胞中PPAR活性的替代品。

将报告细胞以100μL/孔接种在96-孔板上，并将100μL的 (+)-KDT501以不同的最终浓度(25、12.5、6.25、3.125、1.56和0.78μM) 加入各孔中。对于PPARγ试验，罗格列酮(1、0.5、0.25、0.125、0.063和 0.031μM)和替米沙坦(10、5、2.5、1.25和0.625μM)用作阳性对照。对于 PPARα试验，GW590735(10、5、1、0.5、0.25、0.125、0.063和0.031 μM)用作阳性对照，罗格列酮(1、0.5、0.25、0.125、0.063和0.031μM)用作阴性对照。对于PPARδ试验，GW0742(1、0.5、0.25、0.125、0.0625、 0.031、0.016和0.008μM)用作阳性对照，罗格列酮(1、0.5、0.25、0.125、0.063和0.031μM)用作阴性对照。对于每种试验，0.1％ DMSO也用作阴性对照。将板在湿润的培养器中在37℃和5％ CO₂下温育20小时。在温育后，弃去细胞培养基，并用100μL的萤光素酶检测剂处理细胞15分钟。使用照度计(Victor2，Perkin Elmer)分析板。利用GraphPad Prism分析平均相对光单位(RLU)和标准偏差。

在PPARγ试验中，阳性激动剂对照(罗格列酮)如预期增大 PPARγ活性。替米沙坦，是PPARγ的一种已知部分激动剂，也增大PPARγ活性。(+)-KDT501以统计学上显著的方式增大PPARγ活性，与作为部分 PPARγ激动剂活性一致(图13)。(+)-KDT501对PPARα和PPARδ活性具有小或无影响(图14和15)。

使用(+)-KDT501(12.5、6.25、3.125、1.56和0.78μM)和(-)- KDT501(25、12.5、6.25、3.125、1.56和0.78μM)，如上所述重复PPAR 活性试验。(-)-KDT501增大PPARγ活性，但是以比(+)-KDT501显著较小的程度(图16)。对二种化合物的结果总结于表7中。

表7：

实施例7：(+)-KDT501对GPR120报告基因活性的影响：

(+)-KDT501对GPR120活性的影响是利用稳定表达 GPR120的CHO-K1/GPR120/G_α15细胞进行评价。GPR120活性是通过细胞内钙反应进行测定。

将CHO-K1/GPR120/G_α15细胞有规律地传代以维持最佳的细胞健康，并在补充有10％胎牛血清、200μg/mL博莱霉素(zeocin)和100 μg/mL潮霉素的Ham’s F12中培养。在试验开始18小时之前，在384-孔黑壁透明底的板上将细胞以20,000个细胞/孔的密度接种在20μL的生长培养基中，并维持在37℃/5％ CO₂下。细胞被负载钙-4，并使用荧光显像平板读数器(FLIPR)从1秒至20秒获得基线荧光读数。在第20秒，(+)- KDT501(5x最终浓度)被加入至在读数的平板，并监测荧光信号100秒(第 21秒至第120秒)。α-亚麻酸(LA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸 (DHA)用作对照。

使用ScreenWorks(3.1版)进行数据采集和分析并输出至 Excel。对于第一个20秒，平均荧光值计算作为基线读数。相对荧光单位 (ΔRFU)强度值用最大荧光单位(21s至120s)减去基线读数进行计算。由 GenScript编写的数据分析向导用来分析EC₅₀。使用GraphPad Prism4四参数对数方程Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10∧((LoglC₅₀-X)＊HillSlope))拟合拮抗剂的剂量反应曲线，其中X是浓度的对数，Y是反应。

(+)-KDT501表现出GPR120激动剂活性并具有30.3μM的 EC₅₀值(图17)。α-LA、DHA和EPA的EC₅₀值分别是36.1μM、35.3μM 和116.9μM。

实施例8：KDT501对DAPK1活性的影响：

评价了(+)-KDT501和(-)-KDT501对死亡相关蛋白激酶1 (DAPK1)活性的影响。

将人DAPK1与8mM MOPS，pH 7.0、0.2mM EDTA、250 μM ZlP肽底物(KKLNRTLSFAEPG)、10mM MgOAc和[γ-³³P-ATP](特异性活性约500cpm/pmol，所需的浓度)一起温育。将(+)-KDT501或(-)- KDT501以不同的浓度(100、30、10、1、0.3、0.1、0.03、0.01μM)加入反应混合物中。通过添加MgATP混合物引发反应。在室温下温育40分钟后，通过添加3％磷酸溶液终止反应。将10μL反应混合物点在P30过滤垫上，在75mM磷酸中清洗3次5分钟并先在甲醇洗涤一次，然后干燥，并进行闪烁计数。

结果示于图18中。(+)-KDT501和(-)-KDT501以剂量-依赖性的方式抑制DAPK1活性。对(+)-KDT501和(-)-KDT501计算的IC₅₀值分别是2.65μM和40.9μM，表明此二化合物之间相差约15倍。此数据表明 (+)-KDT501在抑制DAPK1活性方面比(-)-KDT501更有效。

实施例9：(+)-KDT501在大鼠糖尿病模型中对葡萄糖和甘油三酸酯水平的影响：

将64只具有175-300mg/dL的葡萄糖水平的六周龄雄性Zucker糖尿病性肥胖(ZDF)大鼠随机化并分成8个给药组：1)仅载体(0.5％甲基纤维素(w/v)、0.2％Tween 80(w/v)；阴性对照)，2)(+)-KDT501 25 mg/kg，3)(+)-KDT501 50mg/kg，4)(+)-KDT501 100mg/kg，5)(+)-KDT501 200mg/kg，6)二甲双胍200mg/kg(阳性对照)，7)二甲双胍200mg/kg 和(+)-KDT501 100mg/kg，以及8)吡格列酮30mg/kg(阳性对照)。将药物每天两次口服给药33天。

在随机化时对动物进行称重，其后每周一次称重，并基于最近的体重测量值计算给药剂量。在随机化之前3天，在随机化时，以及在开始治疗后的第15天和第29天，通过尾部取血采集血液样品。这些血液样品用来利用血糖仪进行全血葡萄糖评价，以及用来测量血甘油三酸酯水平。在开始治疗后第2天和第29天通过qNMR测试身体组成。在开始治疗后第31天和第32天进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。大鼠在OGTT之前进行过夜禁食，并在葡萄糖药丸之前以及在葡萄糖药丸之后第15、30、60、 90和120分钟为了葡萄糖和胰岛素进行尾部取血。葡萄糖药丸是2g葡萄糖/kg体重。在第33天，为了PK分析进行心脏穿刺。

全血葡萄糖结果示于图19中。正如所料，阴性对照大鼠在研究过程中表现出全血葡萄糖糖水平的显著且稳定的增长。接受吡格列酮的阳性对照大鼠表现出葡萄糖水平显著下降，而接受二甲双胍的阳性对照大鼠表现出葡萄糖水平稍微下降。以25、50或100mg/kg的剂量接受(+)- KDT501的大鼠表现出与阴性对照大鼠中观察到的那些几乎相同的葡萄糖水平。然而，以200mg/kg的剂量接受(+)-KDT501的大鼠表现出的葡萄糖水平的显著降低远比二甲双胍对照大鼠中观察到的更大，并且几乎与吡格列酮对照大鼠中观察到的相同。

甘油三酸酯水平结果示于图20中。接受二甲双胍的大鼠与阴性对照大鼠相比在第15天和第29天表现出甘油三酸酯水平的增长，而接受吡格列酮的大鼠表现出显著的降低。以25、50或100mg/kg的剂量接受 (+)-KDT501的大鼠表现出与阴性对照大鼠中观察到的那些相似的甘油三酸酯水平。然而，以200mg/kg的剂量接受(+)-KDT501的大鼠表现出甘油三酸酯水平的显著降低，几乎与吡格列酮对照大鼠中观察到的一样大。

实施例10：(+)-KDT501在高脂肪饮食诱导的肥胖症(DIO)小鼠模型中对葡萄糖、胰岛素、血红蛋白A1C(HbA1C)和脂肪量的影响：

将14周龄的雄性小鼠随机化并分成7个给药组，每组具有 16只动物：1)仅载体(0.5％甲基纤维素(w/v)，0.2％ Tween 80(w/v)；阴性对照)，2)(+)-KDT501 25mg/kg，3)(+)-KDT501 50mg/kg，4)(+)-KDT501 100mg/kg，5)(+)-KDT501 200mg/kg，6)二甲双胍200mg/kg(阳性对照)，以及7)吡格列酮30mg/kg(阳性对照)。将药物每天两次口服给药30天。

在随机化时对动物进行称重，其后每周一次称重，并基于最近的体重测量值计算给药剂量。以高脂肪饮食(40％ Kcal)(TD95217；由 Covance Laboratories，Greenfield，IN制备)饲养小鼠。在开始治疗后的第 -5天和第28天通过qNMR测试身体组成。在开始治疗后第29天采集血液，并测量血红蛋白A1C(HbA1C)水平。在开始治疗后第30天进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。在OGTT前小鼠进行过夜禁食，并在葡萄糖药丸之前以及在葡萄糖药丸之后第15、30、60、90和120分钟为了葡萄糖和胰岛素进行尾部取血。葡萄糖药丸是2g葡萄糖/kg体重。OGTT结果通过曲线(AUC)测量值下的面积和Dunnett检验进行评价。

来自OGTT的血液葡萄糖结果示于图21中。接受吡格列酮或二甲双胍的阳性对照小鼠表现出葡萄糖水平的显著降低。相似地，以100 或200mg/kg的剂量接受(+)-KDT501的小鼠表现出葡萄糖水平的显著降低。

来自OGTT的胰岛素结果示于图22中。接受吡格列酮或二甲双胍的阳性对照小鼠表现出胰岛素水平的显著降低。相似地，以200 mg/kg的剂量接受(+)-KDT501的小鼠表现出胰岛素水平的显著降低。

HbA1C结果示于图23中。在仅载体的阴性对照和阳性对照二甲双胍给药组之间观察到HbA1C的显著差异。(+)-KDT501的给药产生趋向HbA1C抑制的趋势。

脂肪量结果示于图24中。接受二甲双胍的阳性对照小鼠表现出脂肪量的减少，而接受吡格列酮的阳性对照小鼠未表现出差异。以100或 200mg/kg给药(+)-KDT501与阴性对照小鼠相比产生脂肪量的显著差异。

实施例11：由蛇麻酮不对称合成(+)-KDT500或(-)-KDT500：

步骤1：由蛇麻酮(II)合成四氢脱氧葎草酮(VI)。

配制蛇麻酮在甲醇中的10％溶液(w/v)。加入催化量的浓HCl (aq)和10％ Pd/C。在氢气(1.1atm)下搅拌所得的混合物3小时，并通过 HPLC监测反应。在反应完成后，通过过滤除去催化剂，并在真空中浓缩滤液得到四氢脱氧葎草酮(VI)，其可未经进一步纯化用于下一反应。

步骤2A：由四氢脱氧葎草酮(VI)不对称合成(-)-四氢葎草酮 ((-)-XI)。

可选方案2A(i)：由四氢脱氧葎草酮(VI)不对称合成(-)-四氢葎草酮((-)-XI)。

配制四氢脱氧葎草酮(VI)在无水THF中的14％(w/v)溶液并用丙酮/干冰浴冷却至-78℃。将二异丙基乙胺(DIEA)(1.2eq)冷却并滴加至 (VI)的溶液。将此溶液通过套管转移入由2.2eq Cu(CH₃CN)₄PF₆和2.3eq 的二胺配体在氩气下在-78℃下得到的[(-)-金雀花碱]₂-Cu₂-O₂络合物)/THF中。将所得的混合物在-78℃或期望的温度下搅拌16小时。用4 体积的5％(以重量计)含水的硫酸终止反应。用乙酸乙酯(×3)萃取混合物，并用5％硫酸、水和盐水洗涤合并的萃取液，用硫酸钠干燥，而后在真空中浓缩(Dong 2008)。

可选方案2A(ii)：由四氢脱氧葎草酮(VI)不对称合成(-)-四氢葎草酮((-)-XI)。

按照美国专利7,704,715及其中所含的文献中所述，构建并纯化能够将四氢脱氧葎草酮(VI)转化成(-)-四氢葎草酮((-)-XI)的适合的P450 突变酶。典型的反应包含1-4μM纯化的P450血红素域酶(heme domain enzyme)和1-2mM四氢脱氧葎草酮(VI)/500μL 100mMtris-HCl，pH 8.2。将以下合并：713μL纯水、200μL 0.100M tris-HCl pH 8.2，100mM最终浓度、2μL四氢脱氧葎草酮(VI)/DMSO(1mM最终浓度)。

该反应通过加入1-10mM H₂O₂引发，并通过HPLC监测最大转化率。该反应通过加入7.5μL 6M HCl终止。(-)-四氢葎草酮((-)-XI)通过萃取后处理获得，并如前所述进行纯化。

可选2A(iii)：从四氢脱氧葎草酮(VI)不对称合成(-)-四氢葎草酮 ((-)-XI)。

按照美国专利公布2010/0144547及其中所含的文献产生能够将四氢脱氧葎草酮(VI)转化成(-)-四氢葎草酮((-)-XI)的微生物。按照以下发酵条件在四氢脱氧葎草酮(VI)的存在下培养此微生物：具有含30mg/L卡那霉素的LB培养基的500mL培养物。在1.0的OD₆₀₀下，将细胞浓缩至5.0 的最终OD₆₀₀并用1mM IPTG诱导。加入四氢脱氧葎草酮(VI)至1mM和4mM的最终浓度。在不同的时间点，采集培养物样品，离心，过滤，并注射在HPLC(5μL)上，而后测定最大转化率。在最大转化后，将液体培养基酸化至pH 2.0，用乙酸乙酯萃取，干燥，并再溶解于己烷中。通过萃取后处理获得(-)-四氢葎草酮((-)-XI)，并如前所述进行纯化。

各种发酵培养基例如本领域公知的LB、F1或TB发酵培养基可用于或经适应用于本文中公开的本发明的实施方式，包括LB、TB和F1 培养基。经适应用于培养生物体例如土曲霉(A.terreus)和丛毛红曲菌(M. pilosus)的其他培养基也是本领域公知的(参见，例如Miyake 2006；Hajjaj 2001)。

步骤2B：从四氢脱氧葎草酮(VI)不对称合成(+)-四氢葎草酮 ((+)-XI)。

可选2B(i)：从四氢脱氧葎草酮(VI)不对称合成(+)-四氢葎草酮 ((+)-XI)。

配制四氢脱氧葎草酮(VI)在无水THF中的14％(w/v)溶液，并用丙酮/干冰浴冷却至-78℃。将二异丙基乙胺(DIEA)(1.2eq)冷却并滴加至 (VI)的溶液中。将此溶液通过套管转移入由2.2eq Cu(CH₃CN)₄PF₆和2.3 eq二胺配体在氩气下在-78℃得到的[(+)-金雀花碱]₂-Cu₂-O₂络合物)/THF 中。将所得的混合物在-78℃或期望的温度下搅拌16小时。用4体积的5％(以重量计)含水的硫酸终止反应。用乙酸乙酯萃取该混合物(×3)，并用5％硫酸、水和盐水洗涤合并的萃取液，用硫酸钠干燥，然后在真空中浓缩(Dong 2008)。

可选2B(ii)：从四氢脱氧葎草酮(VI)不对称合成(+)-四氢葎草酮 ((+)-XI)。

按照美国专利7,704,715及其中所含文献中所述构建和纯化能够将四氢脱氧葎草酮(VI)转化成(+)-四氢葎草酮((+)-XI)的P450突变酶。典型的反应包含在500μL 100mMTris-HCl，pH8.2中1-4μM纯化的 P450血红素域酶和1-2mM四氢脱氧葎草酮(VI)。将以下合并：713μL纯化水、200μL 0.100M tris-HCI pH8.2，100mM最终浓度、2μL四氢脱氧葎草酮(VI)/DMSO(1mM最终浓度)。

通过添加1-10mM H₂O₂引发反应，并通过HPLC监测最大转化率。通过添加7.5μL 6MHCI终止反应。通过萃取后处理获得(+)-四氢葎草酮((+)-XI)，并如前所述进行纯化。

可选2B(iii)：从四氢脱氧葎草酮(VI)不对称合成(+)-四氢葎草酮((+)-XI)。

按照美国专利公布2010/0144547及其中所含的文献产生能够将四氢脱氧葎草酮(VI)转化成(+)-四氢葎草酮((+)-XI)的微生物。按照以下发酵条件在四氢脱氧葎草酮(VI)的存在下培养微生物：具有含30mg/L卡那霉素的LB培养基的500mL培养物。在1.0的OD₆₀₀下，将细胞浓缩至5.0 的最终OD₆₀₀并用1mM IPTG诱导。加入四氢脱氧葎草酮(VI)至1mM和 4mM的最终浓度。在不同的时间点，采集培养物样品，离心，过滤，并注射在HPLC上(5μL)，而后测定最大转化率。在最大转化后，将液体培养基酸化至pH 2.0，用乙酸乙酯萃取，干燥，并再溶解于己烷中。通过萃取后处理获得(-)-四氢葎草酮，并如前所述进行纯化。

各种发酵培养基例如本领域公知的LB、F1或TB发酵培养基可用于或经适应用于本文中公开的本发明的实施方式，包括LB、TB和F1 培养基。经适应用于培养生物体例如土曲霉和丛毛红曲菌的其他培养基也是本领域公知的(参见，例如Miyake 2006；Hajjaj 2001)。

步骤3A：从(-)-四氢葎草酮((-)-XI)不对称合成(+)-KDT500。

配制(-)-四氢葎草酮((-)-XI)在水中的50％(w/v)溶液，并在密封的容器中升温至85℃并搅拌。将MgSO₄(0.6eq)在5分钟中加入至该溶液并连续搅拌。向该密封的容器中，在搅拌下滴加KOH溶液(38.25％ (w/v)，1.0eq)。使反应温度在接着3小时中或者直至通过HPLC判断异构化完成时保持在85℃。通过将2体积的异丙醇、2体积的水和1当量的 H₂SO₄加入至反应混合物而形成(+)-KDT-500的游离酸。将此混合物混合直至完全均一，此时用2体积的二氯甲烷来萃取反应混合物(3x)。将有机萃取液在真空中浓缩，再溶解于己烷中，用Na₂SO₄干燥，过滤，在真空中浓缩，并在0.070mbar下过夜干燥。终产物是(+)KDT-500的游离酸形式。进一步纯化可通过差向异构化、色谱法、络合和/或结晶进行。

步骤3B：由(+)-四氢葎草酮((+)-XI)不对称合成(-)-KDT500。

配制(+)-四氢葎草酮((+)-XI)在水中的50％(w/v)溶液，并在密封的容器中在搅拌下升温至85℃。将MgSO₄(0.6eq)在连续搅拌下在5分钟中加入至溶液中。向密封的容器中，在搅拌下滴加KOH溶液(38.25％ (w/v)，1.0eq)。使反应温度在接着3小时中或者直至经HPLC判断异构化完成时保持在85℃。通过将2体积的异丙醇、2体积的水和1当量的H₂SO₄加入至反应混合物而形成(-)-KDT-500的游离酸。将此混合物混合直至完全均一，此时用2体积的二氯甲烷来萃取反应混合物(3x)。将有机萃取液在真空中浓缩，再溶解于己烷中，用Na₂SO₄干燥，过滤，在真空中浓缩，并在 0.070mbar下过夜干燥。终产物是(-)KDT-500的游离酸形式。进一步纯化可通过差向异构化、色谱法、络合和/或结晶进行。

实施例12：由脱氧葎草酮不对称合成(+)-KDT500或(-)-KDT500：

步骤1A：由脱氧葎草酮(I)不对称合成(-)-葎草酮((-)-IV)。

可选方案1A(i)：由脱氧葎草酮(I)不对称合成(-)-葎草酮((-)-IV)。

配制脱氧葎草酮(I)在无水THF中的14％(w/v)溶液并用丙酮/ 干冰浴冷却至-78℃。将二异丙基乙胺(DIEA)(1.2eq)冷却并滴加至(VI)的溶液中。将此溶液通过套管转移入由2.2eq Cu(CH₃CN)₄PF₆和2.3eq的二胺配体在氩气下在-78℃下得到的[(-)-金雀花碱]₂-Cu₂-O₂络合物)/THF 中。将所得的混合物在-78℃或期望的温度下搅拌16小时。用4体积的5％ (以重量计)含水的硫酸终止反应。用乙酸乙酯(×3)萃取该混合物，并用5％硫酸、水和盐水洗涤合并的萃取液，用硫酸钠干燥，而后在真空中浓缩(Dong 2008)。

可选方案1A(ii)：由脱氧葎草酮(I)不对称合成(-)-葎草酮((-)-IV)。

按照美国专利7,704,715及其中所含的文献中所述，构建并纯化能够将脱氧葎草酮(I)转化成(-)-葎草酮((-)-IV)的P450突变酶。典型的反应包含1-4μM纯化的P450血红素域酶和1-2mM葎草酮(I)/500μL 100mM tris-HCl，pH8.2。将以下合并：713μL纯化水、200μL0.100M tris-HCl pH8.2，100mM最终浓度、2μL脱氧葎草酮(I)/DMSO(1mM最终浓度)。

通过添加1-10mM H₂O₂引发反应并通过HPLC监测最大转化率。通过添加7.5μL 6MHCl终止反应。通过萃取后处理获得(-)-葎草酮 ((-)-IV)，并如前所述进行纯化。

可选方案1A(iii)：由脱氧葎草酮(I)不对称合成(-)-葎草酮((-)- IV)。

按照美国专利公布2010/0144547及其中所含的文献产生能够将葎草酮(I)转化成(-)-葎草酮((-)-IV)的微生物。然后按照以下发酵条件在脱氧葎草酮(I)存在下培养此微生物：具有含30mg/L卡那霉素的LB培养基的500mL培养物。在1.0的OD₆₀₀下，将细胞浓缩至5.0的最终OD₆₀₀并用1mM IPTG诱导。加入脱氧葎草酮(I)至1mM和4mM的最终浓度。在不同的时间点，采集培养物样品，离心，过滤，并注射在HPLC(5μL)上，而后测定最大转化率。在最大转化后，将液体培养基酸化至pH 2.0，用乙酸乙酯萃取，干燥，并再溶解于己烷中。通过萃取后处理获得(-)-葎草酮((-)- IV)，并如前所述进行纯化。

各种发酵培养基例如本领域公知的LB、F1或TB发酵培养基可用于或经适应用于本文中公开的本发明的实施方式，包括LB、TB和F1 培养基。经适应用于培养生物体例如土曲霉和丛毛红曲菌的其他培养基也是本领域公知的(参见，例如Miyake2006；Hajjaj 2001)。

步骤1B：由脱氧葎草酮(I)不对称合成(+)-葎草酮((+)-IV)。

可选方案1B(i)：由脱氧葎草酮(I)不对称合成(+)-葎草酮((+)- IV)。

配制脱氧葎草酮(I)在无水THF中的14％(w/v)溶液并用丙酮/ 干冰浴冷却至-78℃。将二异丙基乙胺(DIEA)(1.2eq)冷却并滴加至(VI)的溶液中。将此溶液通过套管转移入由2.2eq Cu(CH₃CN)₄PF₆和2.3eq的二胺配体在氩气下在-78℃下得到的[(+)-金雀花碱]2-Cu₂-O₂络合物)/THF 中。将所得的混合物在-78℃或期望的温度下搅拌16小时。用4体积的5％ (以重量计)含水的硫酸终止反应。用乙酸乙酯(×3)萃取该混合物，并用5％硫酸、水和盐水洗涤合并的萃取液，用硫酸钠干燥，而后在真空中浓缩(Dong 2008)。

可选1B(ii)：从脱氧葎草酮(I)不对称合成(+)-葎草酮((+)-IV)。

按照美国专利7,704,715及其中所含的文献中所述构建和纯化能够将脱氧葎草酮(I)转化成(+)-葎草酮((+)-IV)的P450突变酶。典型的反应包含在500μL 100mM tris-HCl，pH 8.2中1-4μM纯化的P450血红素域酶和1-2mM葎草酮(I)。将以下合并：713μL纯化水、200μL 0.100M tris-HCl pH8.2，100mM最终浓度、2μL脱氧葎草酮(I)/DMSO(1mM最终浓度)。

通过添加1-10mM H₂O₂引发反应，并通过HPLC监测最大转化率。通过添加7.5μL 6MHCI终止反应。通过萃取后处理获得(+)-葎草酮((+)-IV)，并如前所述进行纯化。

可选1B(iii)：从脱氧葎草酮(I)不对称合成(+)-葎草酮((+)-IV)。

按照美国专利公布2010/0144547及其中所含的文献产生能够将脱氧葎草酮(I)转化成(+)-葎草酮((+)-IV)的微生物。然后按照以下发酵条件在(+)-葎草酮((+)-IV)的存在下培养微生物：具有含30mg/L卡那霉素的 LB培养基的500mL培养物。在1.0的OD₆₀₀下，将细胞浓缩至5.0的最终OD₆₀₀并用1mM IPTG诱导。加入脱氧葎草酮(I)至1mM和4mM的最终浓度。在不同的时间点，采集培养物样品，离心，过滤，并注射在HPLC 上(5μL)，而后测定最大转化率。在最大转化后，将液体培养基酸化至pH 2.0，用乙酸乙酯萃取，干燥，并再溶解于己烷中。通过萃取后处理获得(+)- 葎草酮((+)-IV)，并如前所述进行纯化。

步骤2A：从(-)-葎草酮((-)-IV)不对称合成(+)-顺式异葎草酮((+)-VIII)(RTP：K008-49)

将98.9mg(-)-葎草酮((-)-IV)用170μL水稀释并在加盖的4 mL小瓶中在搅拌下升温至85℃。加入19.8mg(0.6eq)的MgSO₄，并继续搅拌5分钟。将31μL(1.03eq)的38.25％(w/v)KOH溶液加入至该溶液中，并使反应在85℃下继续进行3小时，此时经HPLC判断反应完成。所得的产物用来产生(+)-顺式异葎草酮((+)-VIII)的游离酸或Mg盐。

通过将0.5mL异丙醇、0.5mL水和1当量H₂SO₄加入至反应混合物而形成(+)-顺式异葎草酮((+)-VIII)的游离酸。将此混合物混合直至完全均一，此时用0.5mL二氯甲烷来萃取反应混合物3次。将有机萃取液在真空中浓缩，再溶解于己烷中，用Na₂SO₄干燥，过滤，并在真空中浓缩和在0.070mbar下过夜干燥，得到(+)-顺式异葎草酮((+)-VIII)的游离酸形式。

通过将反应混合物从热移开并在搅拌下加入0.5mL乙酸乙酯直至完全溶解而形成(+)-顺式异葎草酮((+)-VIII)的Mg盐。加入0.5mL水来分离水层和有机层并萃取乙酸乙酯。将乙酸乙酯萃取再重复2次，并将萃取液在真空中浓缩并在0.070mbar下过夜干燥。终产物是(+)-顺式异葎草酮((+)-VIII)的Mg盐和少量的盐杂质。进一步纯化可通过差向异构化、结晶和/或络合以除去所有的(-)-反式异葎草酮来进行。

步骤2B：从(+)-葎草酮((+)-IV)不对称合成(-)-顺式异葎草酮 ((-)-VIII)。

将1431mg的(+)-葎草酮((+)-IV)用1mL水稀释并在搅拌下在加盖的4mL小瓶中升温至80℃。加入273mg(0.6eq)的MgSO₄，并继续搅拌5分钟。将430μL(1.0eq)的38.25％(w/v)KOH溶液加入至该溶液，并使反应在80℃下继续进行6小时，此时经HPLC判断反应完成。所得的产物可用来产生(-)-顺式异葎草酮((-)-VIII)的游离酸或Mg盐。在此情况中，使反应混合物保持在溶液中并通过以下步骤3B直接用于(-)KDT 500。

通过将2体积的异丙醇、2体积的水和1当量的H₂SO₄加入至反应混合物中来形成(-)-顺式异葎草酮((-)-VIII)的游离酸。将此混合物混合直至完全均一，此时用2体积的二氯甲烷来萃取反应混合物(3x)。将有机萃取液在真空中浓缩，再溶解于己烷中，用Na₂SO₄干燥，过滤，并在真空中浓缩和在0.070mbar下过夜干燥，得到(-)-顺式异葎草酮((-)-VIII)的游离酸。

通过将反应混合物从热移开并在搅拌下加入2体积的乙酸乙酯直至完全溶解而形成(-)-顺式异葎草酮((-)-VIII)的Mg盐。加入2体积的水来分离水层和有机层并萃取乙酸乙酯。将此乙酸乙酯萃取再重复2次，并将萃取液在真空中浓缩并在0.070mbar下过夜干燥，得到(-)-顺式异葎草酮((-)-VIII)的Mg盐和少量的盐杂质。进一步纯化可通过差向异构化、结晶、色谱，和/或络合以除去所有的(+)-反式异葎草酮来进行。

步骤3A：由(+)-顺式异葎草酮((+)-VIII)合成(+)-KDT500(RTP： K008-50)

将96.3mg的(+)-顺式异葎草酮((+)-VIII)的干燥Mg盐溶于1 mL甲醇中。加入3.1mg(0.3eq)的MgO，并搅拌反应混合物5分钟。将 30mg的10％ Pd/C加入至溶液中，并再继续搅拌。通过将氢气鼓吹入溶液中导入氢气氛。在45分钟后，经HPLC判断反应完成，停止搅拌，并通过打开小瓶除去氢气氛。将1当量的硫酸加入至反应混合物(pH～1)，并通过0.2mm注射器过滤器过滤反应。将反应容器和过滤器相继地用乙酸乙酯洗涤2次。将滤液在真空中浓缩，再溶解于己烷中，用Na₂SO₄干燥，通过棉花吸管过滤，并在真空中浓缩和在0.070mbar下过夜干燥。产生58.1 mg的(+)-KDT-500。通过色谱和结晶进行进一步纯化。

步骤3B：由(-)-顺式异葎草酮((-)-VIII)合成(-)-KDT500。

将步骤2B的反应混合物(～1.4g的(-)-顺式异葎草酮)溶于10 mL甲醇中，加入256mg的MgO并搅拌反应混合物5分钟。将该溶液过滤并分成2份等体积的储备液。将34mg的MgO加入至″反应1″，而后加入200mg的10％ Pd/C，再继续搅拌。通过将氢气鼓入溶液中导入氢气氛。在1小时后，通过HPLC判断反应完成，停止搅拌，通过打开小瓶排出氢气。将1当量的硫酸加入至反应混合物(pH～1)，并将反应通过0.2mm 注射器式过滤器过滤。连续地用乙酸乙酯洗涤反应容器和过滤器2次。将滤液在真空中浓缩，再溶解于己烷中，用Na₂SO₄干燥，通过棉花吸管过滤，在真空中浓缩，并在0.070mbar下过夜干燥。在合并二反应后产生933.5mg的(-)-KDT-500。通过色谱和结晶进行进一步纯化。

实施例13：从(-)-葎草酮和脱氧葎草酮分别制备(+)-葎草酮和(-)-葎草酮：

步骤1：外消旋(±)-葎草酮(III)的合成。

可选1A：从(-)-葎草酮((-)-IV)合成外消旋(±)-葎草酮(III)。

将纯(-)-葎草酮溶于松油萜或其他适合溶剂(惰性高沸点烷烃，例如，柠檬烯、三甲基己烷)而形成3-10％溶液。将此溶液置于压力管中，用氩气或氮气吹扫以除去所有的氧气，密封，并在125至145℃加热1-20 小时。然后使反应冷却至室温，在真空中除去溶剂，若需要，按照在其他部分处所述，纯化外消旋(±)-葎草酮(III)。

可选1B：从脱氧葎草酮(I)合成外消旋(±)-葎草酮(III)。

将脱氧葎草酮(I)完全溶于甲醇中，并将1eq的醋酸铅加入此溶液，而后加入催化量的(0.1eq)10％Pd/C。将溶液搅拌并用空气鼓泡。在约4小时后，通过过滤分离铅盐，并将额外的醋酸铅加入至滤液中以确保以铅盐的形式完全回收外消旋(±)-葎草酮(III)。将所有的铅盐(鲜黄色)收集并悬浮于甲醇中而后将硫酸加入至溶液中。硫酸铅形成不可溶的沉淀，通过离心将其除去。将均一的甲醇溶液在己烷和水(粗略地各2体积)之间萃取。将外消旋(±)-葎草酮(III)萃取入己烷中并在真空中浓缩得到外消旋(±)-葎草酮(III)的游离酸形式。

步骤2A：从外消旋(±)-葎草酮(III)纯化(-)-葎草酮((-)-IV)。

分别配制外消旋(±)-葎草酮(III)在甲醇中的溶液(10％，w/v)和 1R，2R-4-环己烯-1，2-二胺在甲醇中的溶液(10％，w/v)。将这两种溶液以等摩尔量(按体积计约3∶1)混合，蒸发甲醇，并将残余物再溶解于最低量的2- 丙醇(可使用其他溶剂，例如叔丁基甲醚、乙腈、乙酸乙酯或苯)中。形成结晶，由(-)-葎草酮(IV)的胺盐组成，而(+)-葎草酮((+)-IV)盐保留在溶液中。将结晶过滤，干燥，然后与己烷和aq.硫酸混合以释放(-)-葎草酮((-)-IV)的游离酸。将己烷层分离，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，并蒸发得到如手性 HPLC所示的(-)-葎草酮((-)-IV)。

步骤2B：从外消旋(±)-葎草酮(III)纯化(+)-葎草酮((+)-IV)

分别配制外消旋(±)-葎草酮(III)在甲醇中的溶液(10％，w/v)和 1S，2S-4-环己烯-1，2-二胺在甲醇中的溶液(10％，w/v)。将这两种溶液以等摩尔量(按体积计约3∶1)混合，蒸发甲醇，并将残余物再溶解于最低量的2- 丙醇(可使用其他溶剂，例如叔丁基甲醚、乙腈、乙酸乙酯或苯)中。会形成结晶，由(+)-葎草酮((+)-IV)的胺盐组成，而(-)-葎草酮((-)-IV)盐保留在溶液中。将结晶过滤，干燥，然后与己烷和aq.硫酸混合以释放(+)-葎草酮((+)-IV)的游离酸。将己烷层分离，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，并蒸发得到如手性 HPLC所示的(+)-葎草酮((+)-IV)。

实施例14：从四氢脱氧葎草酮制备(+)-四氢葎草酮和(-)-四氢葎草酮：

步骤1：从四氢脱氧葎草酮(VI)合成外消旋(±)-四氢葎草酮(IX)。

配制四氢脱氧葎草酮(VI)在乙酸中的10％(w/v)溶液，并将催化量的浓硫酸加入至溶液中。搅拌溶液，并滴加1eq的30％(w/w)过氧化氢溶液。在2小时后，用HPLC判断反应完成，然后加入水和二氯甲烷。将外消旋(±)-四氢葎草酮(IX)萃取入二氯甲烷中并在真空中浓缩得到外消旋 (±)-四氢葎草酮(IX)的游离酸形式。

步骤2A：从外消旋(±)-四氢葎草酮(IX)纯化(-)-四氢葎草酮((-)- XI)。

分别配制外消旋(±)-四氢葎草酮(IX)在甲醇中的溶液(10％， w/v)和1R，2R-4-环己烯-1，2-二胺在甲醇中的溶液(10％，w/v)。将这两种溶液以等摩尔量(按体积计约3∶1)混合，蒸发甲醇，并将残余物再溶解于最低量的2-丙醇(可使用其他溶剂，例如叔丁基甲醚、乙腈、乙酸乙酯或苯)中。会形成结晶，由(-)-四氢葎草酮((-)-XI)的胺盐组成，而(+)-四氢葎草酮((+)-XI) 盐保留在溶液中。将结晶过滤，干燥，然后与己烷和aq.硫酸混合以释放(-)-四氢葎草酮((-)-XI)的游离酸。将己烷层分离，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，并蒸发至如手性HPLC所示的(-)-四氢葎草酮((-)-XI)。

步骤2B：从外消旋(±)-四氢葎草酮纯化(+)-四氢葎草酮((+)-XI)

分别配制外消旋(±)-四氢葎草酮(IX)在甲醇中的溶液(10％， w/v)和1S，2S-4-环己烯-1，2-二胺在甲醇中的溶液(10％，w/v)。将这两种溶液以等摩尔量(按体积计约3∶1)混合，蒸发甲醇，将残余物再溶于最低量的 2-丙醇(可使用其他溶剂，例如甲基叔丁基醚、乙腈、乙酸乙酯或苯)。会形成结晶，由(+)-四氢葎草酮((+)-XI)的胺盐组成，而(-)-四氢葎草酮((-)-XI)盐可保留在溶液中。将结晶过滤，干燥，然后与己烷和aq.硫酸混合以释放(+)- 四氢葎草酮((+)-XI)的游离酸。将己烷层分离，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，并蒸发至如HPLC所示的(+)-四氢葎草酮((+)-XI)。

实施例15：制备其他KDT500盐：

制备钙(II)盐(″KDT505″)：

将水(1000μL)和KDT500的钾盐(88.2mg)加入至4mL小瓶中，而后加入26.6mg氯化钙(1.10eq)和120μL水。将混合物搅拌1小时并将沉淀过滤，用1mL水洗涤4x，然后在高真空下干燥获得6.9mg产物。该产物具有125.1℃的熔点和1.28KF的水含量。

制备镁(II)盐(″KDT506″)：

将水(1200μL)和KDT500的钾盐(50.1mg)加入至4mL小瓶，而后7.8mg硫酸镁(0.53eq)和200μL水。将该混合物搅拌1小时并将沉淀过滤，用1mL水洗涤2x，并在高真空下干燥获得47mg产物。该产物具有130.0℃的熔点和1.27KF的水含量。

制备锌(II)盐(″KDT507″)：

将水(1300μL)和KDT500的钾盐(84.7mg)加入至4mL小瓶中，而后加入31.6mg七水合硫酸锌(0.53eq)和300μL水。将此混合物搅拌1小时并将沉淀过滤，用1mL水洗涤2x，并在高真空下干燥获得71.6 mg产物。该产物具有134.7℃的熔点和2.42KF的水含量。

制备铁(III)盐(″KDT508″)：

将水(1000μL)和KDT500的钾盐(61.9mg)加入至4mL小瓶中，而后加入43.4mg六水合氯化铁(III)(0.53eq)和300μL水。将混合物搅拌1小时并将沉淀过滤，用1mL水洗涤2x，并在高真空下干燥获得71.6 mg产物。该产物具有72.9℃的熔点和1.07KF的水含量。

制备钠(I)盐(″KDT509″)：

将水(1000μL)和KDT500游离盐(109.5mg)加入至4mL小瓶中，而后加入1M ag.NaOH溶液(300μL，1.00eq)。将此混合物蒸发并在高真空下干燥。该产物具有113.9℃的熔点和1.15KF的水含量。

制备铜(II)盐(″KDT510″)：

将水(1000μL)和KDT500游离盐(109.5mg)加入至4mL小瓶中，而后加入1M ag.NaOH溶液(300μL，1.00eq)。将此混合物蒸发并在高真空下干燥。该产物具有104.9℃的熔点和1.18KF的水含量。

制备胍盐(″KDT511″)：

将水(1000μL)和KDT500游离盐(109.5mg)加入至4mL小瓶中，而后加入1M ag.NaOH溶液(300μL，1.00eq)。将此混合物蒸发并在高真空下干燥。该产物具有140.8℃的熔点和0.94KF的水含量。

如上所述，上文仅仅旨在说明本发明的各种实施方式。以上所述的具体改变不应解释为对本发明范围的限制。对本领域技术人员而言，显然可在不脱离本发明范围的情况下进行各种等效方案、变化和修改，并应理解这样的等效实施方式应涵盖在本文中。本文中引用的所有文献通过援引如同在本文中完全详述一般并入。

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表1：所提供的结构的晶体学数据

表2：结晶(+)-KDT501的原子坐标(x 10⁴)和等效各向同性位移参数 (U(eq)定义为正交化的U^ij张量的轨迹的1/3)

表3：结晶(+)-KDT501的键长和角[](用来产生等效原子的对称变换：#1-x+3/2,y+1/2,-z+2 #2-x+3/2,y-1/2,-z+2)

表4：结晶(+)-KDT501的各向异性位移参数

Claims

1.一种治疗有此需要的对象中的对PPARγ调制有反应的病症的方法，其特征在于，该方法包括向所述对象给药治疗有效量的具有以下结构的(+)-(4S，5R)-3，4-二羟基-2-(3-甲基丁酰基)-5-(3-甲基丁基)-4-(4-甲基戊酰基)环戊-2-烯-1-酮或者其盐或结晶和药学可接受的载体的基本上对映体纯的药学组合物，

2.一种治疗有此需要的对象中的对GPR120调制有反应的病症的方法，其特征在于，该方法包括向所述对象给药治疗有效量的具有以下结构的(+)-(4S，5R)-3，4-二羟基-2-(3-甲基丁酰基)-5-(3-甲基丁基)-4-(4-甲基戊酰基)环戊-2-烯-1-酮或者其盐或结晶和药学可接受的载体的基本上对映体纯的药学组合物，

3.一种治疗有此需要的对象中的代谢障碍的方法，其特征在于，该方法包括向所述对象给药治疗有效量的具有以下结构的(+)-(4S，5R)-3，4-二羟基-2-(3-甲基丁酰基)-5-(3-甲基丁基)-4-(4-甲基戊酰基)环戊-2-烯-1-酮或者其盐或结晶和药学可接受的载体的基本上对映体纯的药学组合物，

4.一种抑制有此需要的对象中的炎症的方法，其特征在于，该方法包括向所述对象给药治疗有效量的具有以下结构的(+)-(4S，5R)-3，4-二羟基-2-(3-甲基丁酰基)-5-(3-甲基丁基)-4-(4-甲基戊酰基)环戊-2-烯-1-酮或者其盐或结晶和药学可接受的载体的基本上对映体纯的药学组合物，

5.一种治疗有此需要的对象中的与炎症相关的病症的方法，其特征在于，该方法包括向所述对象给药治疗有效量的具有以下结构的(+)-(4S，5R)-3，4-二羟基-2-(3-甲基丁酰基)-5-(3-甲基丁基)-4-(4-甲基戊酰基)环戊-2-烯-1-酮或者其盐或结晶和药学可接受的载体的基本上对映体纯的药学组合物，