CN110187047B - 一种用于肺肾阴虚证中药组合物的检测方法 - Google Patents
一种用于肺肾阴虚证中药组合物的检测方法 Download PDFInfo
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/90—Plate chromatography, e.g. thin layer or paper chromatography
Abstract
本发明公开了一种用于肺肾阴虚证的中药组合物的检测方法，包括对冬虫夏草和甘草的定性鉴别、中药组合物中总生物碱含量的测定、中药组合物中腺苷含量的测定。本发明中甘草的定性鉴别方法简便、快速、易操作、重复性好，荧光斑点显色后非常清晰，阴性无干扰；建立了以总生物碱为中药组合物的定量评价指标，能够对制剂中间品和成品进行有效的质量控制；本发明中腺苷的含量测定对色谱条件及供试品的制备方法方面都进行创新和优化，尤其是色谱条件中的流动相，将常用的乙腈‑缓冲盐溶液改为本发明的是乙腈‑水进行等度洗脱，并减少了有机溶剂使用量，提高了检测的灵敏度，该方法简便、快速、易操作、重复性好。
Description
技术领域
本发明属于中药制剂质量检测技术领域，具体涉及一种用于肺肾阴虚证的中药组合物的检测方法。
背景技术
肺肾阴虚证主要是由于慢性呼吸系统疾病久病不愈或体弱病人中居多，主症为咳嗽痰少、口燥咽干、盗汗、痰中带血、形体消瘦。该证型多见于慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病、肺结核等疾病。中医治则以养阴润肺、止咳化痰为主，发挥复方中药在慢性病治疗中多靶点、多途径的整体优势，达到治疗疾病的目的。市售此类中药治疗药物有百合固金口服液、虫草清肺胶囊、养阴清肺丸等制剂。本发明的中药组合物有百部、白及、冬虫夏草、甘草、菠菜子五味药材组成，方中君药百部润肺下气止咳，杀虫灭虱，百部温而不热，润而不寒，用于新久咳嗽，肺痨咳嗽，顿咳。白及可收敛止血，消肿生肌，用于咯血，吐血，外伤出血；冬虫夏草能补肾益肺，止血化痰，用于肾虚精亏，阳痿遗精，腰膝酸痛，久咳虚喘，劳嗽咯血；二者共为臣药。菠菜籽用于咳喘祛风，开通关窍，利肠胃，为佐药。甘草补脾益气，祛痰止咳，缓急止痛、调和诸药为使药。诸药合用，共奏滋肺益肾，止咳化痰，止血消炎，消肿生肌之功效，对久治不愈的内伤咳嗽或外感咳嗽、咳痰、咯血、乏力等症多具有很好的临床疗效。
在多年的临床使用中，证明本发明的中药组合物对久治不愈的内伤咳嗽、外感咳嗽和肺结核病的咳嗽、咳痰、咯血、乏力等症具有很好的疗效。因此，该制剂在慢性呼吸系统疾病，尤其是在肺肾阴虚证的治疗中有着独特的优势。但该制剂的质量控制方法与当前中药产品质量控制的要求有较大的差距，不能有效控制治疗制剂质量的稳定性，从而影响产品的生产和保证质量。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于肺肾阴虚证的中药组合物的检测方法，以解决上述问题。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种用于肺肾阴虚证的中药组合物的检测方法，中药组合物包括百部、白及、冬虫夏草、甘草和菠菜子，包括对冬虫夏草和甘草的定性鉴别：
所述冬虫夏草的定性鉴别采用显微鉴别，包括如下步骤：
（1）取用于肺肾阴虚证的中药组合物制备成供试品溶液，同时制备不含冬虫夏草的阴性对照品溶液；
（2）分别取供试品溶液和阴性对照品溶液进行涂片；
（3）显微镜检供试品溶液涂片和阴性样品溶液涂片，供试品溶液涂片上可见带有小刺毛的黄棕色体壁碎片、团状虫草菌丝或灰棕色子座细胞，阴性对照品溶液涂片上未见上述显微结构；
所述甘草的定性鉴别采用薄层色谱法鉴别，包括如下步骤：
（1）取用于肺肾阴虚证的中药组合物制备供试品溶液，同时制备甘草对照品溶液和不含甘草的阴性对照品溶液；
（2）分别取步骤（1）得到的三种溶液点于同一硅胶G薄层板上；
（3）以正丁醇-乙酸乙酯-水的上层溶液为展开剂，将薄层板放置在展开缸中展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置日光下和/或紫外灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上显相同颜色斑点，阴性无干扰。
所述冬虫夏草的定性鉴别采用显微鉴别，包括如下步骤：
（1）取用于肺肾阴虚证的中药组合物0.05-2.0重量份，置于试管中，加蒸馏水0.5-10体积份，超声处理1-5 min，制备成供试品溶液；
另取不含冬虫夏草的阴性样品0.05-2.0重量份，同法制备对照品溶液；
（2）分别取供试品溶液和阴性对照品溶液0.1-0.8体积份进行涂片；
（3）显微镜检供试品溶液涂片和阴性样品溶液涂片，供试品溶液涂片上可见带有小刺毛的黄棕色体壁碎片、团状虫草菌丝或灰棕色子座细胞，阴性对照品溶液涂片上未见上述显微结构；
所述甘草的定性鉴别采用薄层色谱法鉴别，包括如下步骤：
（1）取用于肺肾阴虚证的中药组合物0.05-0.4重量份，置于具塞三角瓶中，加50-90%的甲醇5-30体积份，超声处理5-30min，滤过，水浴蒸干，用0.2-2.0体积份的甲醇溶解，制备成供试品溶液；
另取甘草对照药材0.01-2.0重量份，同法制备成甘草对照品溶液；
按用于肺肾阴虚证的中药组合物中各药材比例及制备工艺配制不含甘草的阴性样品，取0.05-2.0重量份不含甘草的阴性样品，同法制成不含甘草的阴性对照品溶液；
（2）取步骤（1）得到的三种溶液各0.001-0.02体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上；
（3）以正丁醇-乙酸乙酯-水的体积比为(1-10:0.1-4:1-10)的上层溶液为展开剂，将薄层板放置在展开缸中展开，取出晾干，喷以5-20%的硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置日光下和紫外灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上显相同颜色斑点，阴性无干扰。
所述检测方法还包括测定中药组合物中总生物碱的含量，包括如下步骤：
（1）取用于肺肾阴虚证的中药组合物制备供试品溶液，同时制备对叶百部碱对照品溶液；
（2）采用紫外分光光度法，磷酸盐缓冲液和溴百里香酚蓝试液为显色剂，检测波长为412nm，进行测定，即得。
所述检测方法还包括测定中药组合物中总生物碱的含量，包括如下步骤：
（1）精密称取用于肺肾阴虚证的中药组合物0.5-5.0重量份于具塞三角瓶中，加甲醇10-50体积份，超声处理15-60min，滤过，滤液定容至10-50体积份，制备成供试品溶液；
精密称取对叶百部碱对照品0.002-0.08重量份于10-50体积份的容量瓶中，加甲醇定容至刻线，摇匀，制备成对叶百部碱对照品溶液；
（2）精密吸取供试品溶液0.2-3.0体积份于分液漏斗中，加入pH3.6-8.5的磷酸盐缓冲液1-10体积份和溴百里香酚蓝试液1-8体积份，摇匀，用氯仿萃取1-5次，每次1-20体积份，取下层液置于10-50体积份的容量瓶中，用氯仿定容至刻线，摇匀，以甲醇为空白，于412nm处测定，即得。
所述检测方法还包括测定中药组合物中腺苷的含量，包括如下步骤：
（1）采用高效液相色谱法检测腺苷含量，色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（5-30:95-70）为流动相进行等度洗脱；流速为0.5-2.0mL/min；柱温为15-40℃；检测波长为210-400nm；理论塔板数按腺苷峰计算应不低于4000；
（2）取用于肺肾阴虚证的中药组合物用甲醇提取，制备成供试品溶液，同时制备腺苷对照品溶液和不含冬虫夏草的阴性对照品溶液；
（3）分别精密吸取供试品溶液、腺苷对照品溶液和不含冬虫夏草的阴性对照品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得；
每1g用于肺肾阴虚证的中药组合物含冬虫夏草以腺苷计，不得少于0.03mg。
所述检测方法还包括测定中药组合物中腺苷的含量，包括如下步骤：
（1）采用高效液相色谱法检测腺苷含量，色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水为流动相进行等度洗脱；流速为1.0mL/min；柱温为25℃；检测波长为260nm；理论塔板数按腺苷峰计算应不低于4000；
（2）取用于肺肾阴虚证的中药组合物0.5-4.0重量份，精密称定，置50-250体积份的三角瓶中，加50-100%甲醇20-200体积份，称定重量，加热回流10-40min，放冷，用50-100%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，蒸干，再用50-100%甲醇定容至5-20体积份，制备成供试品溶液；
取腺苷对照品0.00002-0.0001重量份，精密称定，加50-100%甲醇1-5体积份，制备成腺苷对照品溶液；
按照用于肺肾阴虚证的中药组合物中各药材比例及制备工艺配制不含冬虫夏草的阴性样品，取0.5-4.0重量份阴性样品，同法制备成不含冬虫夏草的阴性对照品溶液；
（3）分别精密吸取供试品溶液、腺苷对照品溶液和不含冬虫夏草的阴性对照品溶液各0.001-0.05体积份，注入液相色谱仪，测定，即得；
每1g用于肺肾阴虚证的中药组合物含冬虫夏草以腺苷计，不得少于0.03mg。
步骤（1）中所述超声的条件为50-300W、30-120HZ。
步骤（3）中所述加热的温度为80-120℃。
步骤（1）中所述超声的条件为50-300W、30-120HZ。
本发明相较于现有技术的有益效果为：
1、本发明中甘草的定性鉴别采用新设计的提取方法和薄层色谱条件，该方法较《中国药典》及有关文献方法中甘草鉴别方法简便、快速、易操作、重复性好，且荧光斑点显色后非常清晰，阴性无干扰；
2、本发明中总生物碱的含量测定，根据中药药效学物质基础研究和复方制剂药效的整体性及多靶点、多途径的作用特点，建立了以总生物碱为中药组合物的定量评价指标，能够对制剂中间品和成品进行有效的质量控制；
3、本发明中腺苷的含量测定，对色谱条件及供试品的制备方法方面都进行创新和优化，尤其是色谱条件中的流动相，将常用的乙腈-缓冲盐溶液改为本发明的是乙腈-水进行等度洗脱，并减少了有机溶剂使用量，提高了检测的灵敏度，该方法简便、快速、易操作、重复性好。
附图说明
图1为本发明胶囊剂中甘草薄层色谱图（日光下观察），图中A为甘草阴性、BCD为制剂药品、E为甘草药材对照品；
图2为本发明胶囊剂中甘草薄层色谱图（365nm下观察）图中A为甘草阴性、BCD为制剂药品、E为甘草药材对照品；
图3为腺苷对照品的高效液相色谱图；
图4为本发明中药组合物高效液相色谱图；
图5为本发明中药组合物缺冬虫夏草阴性样品高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。
实验例1：冬虫夏草的显微鉴别
（1）仪器：显微镜、照相机、酒精灯、载玻片、盖玻片、电子天平、广口瓶、胶头滴管、擦镜纸；
（2）试剂：水合氯醛、稀甘油、中药组合物、冬虫夏草阴性样品；
（3）鉴别方法：取中药组合物测试样品0.1g，进行水合氯醛涂片、透化后滴加稀甘油溶液，置显微镜下观察，可见带有小刺毛的黄棕色体壁碎片、团状虫草菌丝或灰棕色子座细胞。
实验例2：甘草的薄层鉴别
（1）仪器：超声仪、电子恒温水浴锅、硅胶G薄层板、点样毛细管、电子天平、锥形瓶、容量瓶、擦镜纸；
（2）试剂：正丁醇、乙酸乙酯、水、甲醇、乙醇、硫酸、中药组合物、甘草对照药材、缺甘草阴性样品；
（3）检测方法：
提取溶剂的选择：分别采用甲醇、1%（V/V）醋酸甲醇溶液、乙醇等溶液为提取溶剂；
提取方法的选择：分别采用超声和加热回流法用上述溶剂提取苍柏袪痛制剂；
展开剂的选择：分别采用正丁醇-乙酸乙酯-水( 4:1:5，V/V，I )、正丁醇-乙酸乙酯-水( 4:1:5，V/V， II )的上层液为展开剂展开；
分别选择以上提取溶剂、提取方法和展开剂进行试验，结果如下表1所示：
表1甘草的薄层鉴别方法试验
阴性样品除不含甘草外，其余均与甘草供试品溶液相同。薄层色谱法依《中国药典》2015年版一部附录0502试验：吸取供试品溶液、对照药材溶液和阴性对照溶液各取5μL，分别点于同一硅胶G 薄层板，以正丁醇-乙酸乙酯-水(4:1:5)的上层液为展开剂展开、取出晾干、喷以10%的硫酸乙醇，105℃加热至班点清晰，在日光下和紫外灯365 nm下观察。在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，呈现出相同颜色的斑点，阴性制剂无干扰，见附图1-2。
由表1可以看出，定性检测中药组合物中甘草的最优条件是：采用甲醇提取中药组合物，所得供试样品在薄层板上用正丁醇-乙酸乙酯-水(4:1:5)的上层液为展开剂展开。
对表1中各符号的说明：“×”表示“严重拖尾”，“○”表示“斑点拖尾”，“△”表示“斑点不清晰，阴性有干扰”，“□”表示“分离不好，有拖尾，斑点模糊”，“√”表示“Rf值适中，斑点清晰，分离度好，无拖尾”。
实验例3：总生物碱的含量测定
（1）仪器：紫外分光光度计、超声仪、电子恒温水浴锅、锥形瓶、容量瓶、烧杯、具塞三角瓶、移液管；
（2）试剂：中药组合物，缺百部阴性样品、对叶百部碱（购自上海源叶生物科技有限公司，批号：CAS#6879-01-2）、蒸馏水、硫酸、溴百里香酚蓝、氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、甲醇、氯仿；
（3）检验方法：
中药组合物，缺百部阴性样品、对叶百部碱超声提取得到供试样品。
提取溶剂的选择：采用甲醇溶液为提取溶剂；
提取时间的选择：超声处理30 min（220W，60HZ）；
缓冲溶液和酸性染料的选择：pH 6.6磷酸盐缓冲液5 mL和溴百里香酚蓝试液3mL，氯仿萃取2次。
检测条件：以甲醇为空白，于412 nm处测定并计算总生物碱含量。
实验例4：腺苷的含量测定
（1）仪器：HPLC、超声仪、电子恒温水浴锅、锥形瓶、容量瓶、烧杯、移液管、三角瓶；
（2）试剂：中药组合物、缺冬虫夏草阴性样品、腺苷对照品(批号：110879-201703,购自中国食品药品鉴定研究院)、甲醇、氯仿、蒸馏水。
（2）检验方法：
中药组合物、缺冬虫夏草阴性样品、腺苷对照品加热回流提取得到供试样品。
提取溶剂的选择：分别采用甲醇、90%甲醇、水为提取溶剂；
流动相的选择：分别采用流动相①乙腈-水（体积比为30：70）、②乙腈-水（体积比为20：80）、③乙腈-水（体积比为12：88）。
提取时间的选择：分别进行加热回流10min和20min。
色谱条件 色谱柱：高效液相色谱仪(Waters公司)：PDA检测器，四元泵，Waters2695色谱工作站；以十八烷基键合硅胶为填充剂（4.6×250mm，5μm）；流速：1.0mL/min；柱温25 ℃；检测波长260nm；进样量10μL；流动相：乙腈-水（12:88）；理论板数按腺苷峰计算应不低于4000。
上述“乙腈-水（体积比为30：70）、乙腈-水（体积比为20：80）、（体积比为12:88）”是指乙腈与水溶液的混合。
分别选择以上提取溶剂、提取时间和流动相进行试验，结果如下表2所示：
表2腺苷含量测定方法试验
由表2可以看出，高效液相色谱法检测中药组合物中腺苷的最优条件是：采用90%甲醇（体积比）提取中药组合物得到供试样品，色谱条件为：以乙腈-水（体积比12：88）为流动相进行洗脱，检测波长为260nm，所得色谱见附图3-5。
实施例1：胶囊剂的检测
百部24g、白及24g、冬虫夏草10g、甘草10g、菠菜子5g
取百部、白及、甘草、菠菜子四味药材提取、浓缩，加入冬虫夏草粗粉进行低温干燥、粉碎，加入常规辅料混匀，按照制剂工艺制备胶囊。
A. 冬虫夏草的显微鉴别
取胶囊剂内粉末0.05g，置于试管中，加蒸馏水0.5ml，超声处理1min，制备成供试品溶液；另取不含冬虫夏草的阴性样品0.05g，同法制备对照品溶液。
分别取供试品溶液和阴性对照品溶液0.1ml进行涂片，显微镜检供试品溶液涂片和阴性样品溶液涂片，供试品溶液涂片上可见带有小刺毛的黄棕色体壁碎片、团状虫草菌丝或灰棕色子座细胞，阴性对照品溶液涂片上未见上述显微结构。
B. 甘草的薄层鉴别
取胶囊剂内粉末0.05g，置于具塞三角瓶中，加50%的甲醇5ml，50W、30HZ下超声处理5min，滤过，水浴蒸干，用0.2ml的甲醇溶解，制备成供试品溶液；另取甘草对照药材0.01g，同法制备成甘草对照品溶液；按用于肺肾阴虚证的中药组合物中各药材比例及制备工艺配制不含甘草的阴性样品，取0.05g不含甘草的阴性样品，同法制成不含甘草的阴性对照品溶液。
取上述三种溶液各0.001ml，分别点于同一硅胶G薄层板上；以正丁醇-乙酸乙酯-水的体积比为(1:0.1:1)的上层溶液为展开剂，将薄层板放置在展开缸中展开，取出晾干，喷以5%的硫酸乙醇溶液，80℃加热至斑点显色清晰，置日光下和紫外灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上显相同颜色斑点，阴性无干扰。
C. 总生物碱含量的测定
精密称取胶囊剂内粉末0.5g于具塞三角瓶中，加甲醇10ml，50W、30HZ下超声处理15min，滤过，滤液定容至10ml，制备成供试品溶液；精密称取对叶百部碱对照品0.002g于10ml的容量瓶中，加甲醇定容至刻线，摇匀，制备成对叶百部碱对照品溶液。
精密吸取供试品溶液0.2ml于分液漏斗中，加入pH3.6的磷酸盐缓冲液1ml和溴百里香酚蓝试液1ml，摇匀，用氯仿萃取1次，每次1ml，取下层液置于10ml的容量瓶中，用氯仿定容至刻线，摇匀，以甲醇为空白，于412nm处测定，即得。
结果：每1g胶囊中含总生物碱不少于1.08mg。
D. 腺苷的含量测定
采用高效液相色谱法检测腺苷含量，色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（5:95）为流动相进行等度洗脱；流速为0.5 mL/min；柱温为15℃；检测波长为210nm；理论塔板数按腺苷峰计算应不低于4000；
取胶囊剂内粉末0.5g，精密称定，置50ml的三角瓶中，加50%甲醇20ml，称定重量，加热回流10min，放冷，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，蒸干，再用50%甲醇定容至5ml，制备成供试品溶液；取腺苷对照品0.00002g，精密称定，加50%甲醇1ml，制备成腺苷对照品溶液；按照用于肺肾阴虚证的中药组合物中各药材比例及制备工艺配制不含冬虫夏草的阴性样品，取0.5g阴性样品，同法制备成不含冬虫夏草的阴性对照品溶液；
分别精密吸取供试品溶液、腺苷对照品溶液和不含冬虫夏草的阴性对照品溶液各0.001ml，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果：每1g胶囊中含腺苷(C10H13N5O4)不少于0.052mg。
实施例2：片剂的检测
百部24g、白及24g、冬虫夏草10g、甘草10g、菠菜子5g
取百部、白及、甘草、菠菜子四味药材提取、浓缩，加入冬虫夏草粗粉进行低温干燥、粉碎，加入常规辅料混匀，按照制剂工艺制备片剂。
A. 冬虫夏草的显微鉴别
取片剂0.1g，置于试管中，加蒸馏水1.0ml，超声处理2min，制备成供试品溶液；另取不含冬虫夏草的阴性样品0.1g，同法制备对照品溶液。
分别取供试品溶液和阴性对照品溶液0.2ml进行涂片；显微镜检供试品溶液涂片和阴性样品溶液涂片，供试品溶液涂片上可见带有小刺毛的黄棕色体壁碎片、团状虫草菌丝或灰棕色子座细胞，阴性对照品溶液涂片上未见上述显微结构。
B. 甘草的薄层鉴别
取片剂0.1g，置于具塞三角瓶中，加60%的甲醇10ml，80W、60HZ下超声处理10min，滤过，水浴蒸干，用0.4ml的甲醇溶解，制备成供试品溶液；另取甘草对照药材0.02g，同法制备成甘草对照品溶液；按用于肺肾阴虚证的中药组合物中各药材比例及制备工艺配制不含甘草的阴性样品，取0.1g不含甘草的阴性样品，同法制成不含甘草的阴性对照品溶液。
取上述三种溶液各0.002ml，分别点于同一硅胶G薄层板上；以正丁醇-乙酸乙酯-水的体积比为(2:0.5:2)的上层溶液为展开剂，将薄层板放置在展开缸中展开，取出晾干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，90℃加热至斑点显色清晰，置日光下和紫外灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上显相同颜色斑点，阴性无干扰。
C. 总生物碱含量的测定
精密称取片剂1.0g于具塞三角瓶中，加甲醇15ml，80W、60HZ下超声处理20min，滤过，滤液定容至25ml，制备成供试品溶液；精密称取对叶百部碱对照品0.004g于25ml的容量瓶中，加甲醇定容至刻线，摇匀，制备成对叶百部碱对照品溶液。
精密吸取供试品溶液0.5ml于分液漏斗中，加入pH4.5的磷酸盐缓冲液2ml和溴百里香酚蓝试液2ml，摇匀，用氯仿萃取2次，每次2ml，取下层液置于25ml的容量瓶中，用氯仿定容至刻线，摇匀，以甲醇为空白，于412nm处测定，即得。
结果：每1g片剂含总生物碱不少于1.08mg。
D. 腺苷的含量测定
采用高效液相色谱法检测腺苷含量，色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（10:90）为流动相进行等度洗脱；流速为1.0mL/min；柱温为25℃；检测波长为260nm；理论塔板数按腺苷峰计算应不低于4000。
取片剂1.0g，精密称定，置50ml的三角瓶中，加60%甲醇30ml，称定重量，加热回流15min，放冷，用60%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，蒸干，再用60%甲醇定容至10ml，制备成供试品溶液；取腺苷对照品0.00004g，精密称定，加60%甲醇2ml，制备成腺苷对照品溶液；按照用于肺肾阴虚证的中药组合物中各药材比例及制备工艺配制不含冬虫夏草的阴性样品，取1.0g阴性样品，同法制备成不含冬虫夏草的阴性对照品溶液。
分别精密吸取供试品溶液、腺苷对照品溶液和不含冬虫夏草的阴性对照品溶液各0.002ml，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果：每1g片剂含腺苷(C10H13N5O4) 不少于0.052mg。
实施例3：颗粒剂的检测
百部24g、白及24g、冬虫夏草10g、甘草10g、菠菜子5g
取百部、白及、甘草、菠菜子四味药材提取、浓缩，加入冬虫夏草粗粉进行低温干燥、粉碎，加入常规辅料混匀，按照制剂工艺制备颗粒剂。
A. 冬虫夏草的显微鉴别
取颗粒剂0.2g，置于试管中，加蒸馏水2.0ml，超声处理3min，制备成供试品溶液；另取不含冬虫夏草的阴性样品0.2g，同法制备对照品溶液。
分别取供试品溶液和阴性对照品溶液0.3ml进行涂片；显微镜检供试品溶液涂片和阴性样品溶液涂片，供试品溶液涂片上可见带有小刺毛的黄棕色体壁碎片、团状虫草菌丝或灰棕色子座细胞，阴性对照品溶液涂片上未见上述显微结构。
B. 甘草的薄层鉴别
取颗粒剂0.2g，置于具塞三角瓶中，加70%的甲醇15ml，150W、80HZ下超声处理15min，滤过，水浴蒸干，用0.5ml的甲醇溶解，制备成供试品溶液；另取甘草对照药材0.05g，同法制备成甘草对照品溶液；按用于肺肾阴虚证的中药组合物中各药材比例及制备工艺配制不含甘草的阴性样品，取0.2g不含甘草的阴性样品，同法制成不含甘草的阴性对照品溶液。
取上述三种溶液各0.005ml，分别点于同一硅胶G薄层板上；以正丁醇-乙酸乙酯-水的体积比为(5:2:5)的上层溶液为展开剂，将薄层板放置在展开缸中展开，取出晾干，喷以12%的硫酸乙醇溶液，100℃加热至斑点显色清晰，置日光下和紫外灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上显相同颜色斑点，阴性无干扰。
C. 总生物碱含量的测定
精密称取颗粒剂2.0g于具塞三角瓶中，加甲醇25ml，150W、80HZ下超声处理25min，滤过，滤液定容至25ml，制备成供试品溶液；精密称取对叶百部碱对照品0.01g于25ml的容量瓶中，加甲醇定容至刻线，摇匀，制备成对叶百部碱对照品溶液。
精密吸取供试品溶液1.0ml于分液漏斗中，加入pH5.5的磷酸盐缓冲液4ml和溴百里香酚蓝试液4ml，摇匀，用氯仿萃取3次，每次4ml，取下层液置于25ml的容量瓶中，用氯仿定容至刻线，摇匀，以甲醇为空白，于412nm处测定，即得。
结果：每1g颗粒剂含总生物碱不少于1.08mg。
D. 腺苷的含量测定
采用高效液相色谱法检测腺苷含量，色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（12:88）为流动相进行等度洗脱；流速为1.2mL/min；柱温为30℃；检测波长为280nm；理论塔板数按腺苷峰计算应不低于4000；
取颗粒剂2.0g，精密称定，置100ml的三角瓶中，加70%甲醇50ml，称定重量，加热回流20min，放冷，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，蒸干，再用70%甲醇定容至25ml，制备成供试品溶液；取腺苷对照品0.00005g，精密称定，加70%甲醇3ml，制备成腺苷对照品溶液；按照用于肺肾阴虚证的中药组合物中各药材比例及制备工艺配制不含冬虫夏草的阴性样品，取2.0g阴性样品，同法制备成不含冬虫夏草的阴性对照品溶液。
分别精密吸取供试品溶液、腺苷对照品溶液和不含冬虫夏草的阴性对照品溶液各0.005ml，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果：每1g颗粒剂含腺苷(C10H13N5O4) 不少于0.052mg。
实施例4：丸剂的检测
百部24g、白及24g、冬虫夏草10g、甘草10g、菠菜子5g
取百部、白及、甘草、菠菜子四味药材提取、浓缩，加入冬虫夏草粗粉进行低温干燥、粉碎，加入常规辅料混匀，按照制剂工艺制备丸。
A. 冬虫夏草的显微鉴别
取丸剂0.8g，置于试管中，加蒸馏水4.0ml，超声处理4min，制备成供试品溶液；另取不含冬虫夏草的阴性样品0.8g，同法制备对照品溶液。
分别取供试品溶液和阴性对照品溶液0.4ml进行涂片；显微镜检供试品溶液涂片和阴性样品溶液涂片，供试品溶液涂片上可见带有小刺毛的黄棕色体壁碎片、团状虫草菌丝或灰棕色子座细胞，阴性对照品溶液涂片上未见上述显微结构。
B. 甘草的薄层鉴别
取丸剂0.3g，置于具塞三角瓶中，加80%的甲醇20ml，200W、100HZ下超声处理20min，滤过，水浴蒸干，用1.0ml的甲醇溶解，制备成供试品溶液；另取甘草对照药材1.0g，同法制备成甘草对照品溶液；按用于肺肾阴虚证的中药组合物中各药材比例及制备工艺配制不含甘草的阴性样品，取0.3g不含甘草的阴性样品，同法制成不含甘草的阴性对照品溶液。
取上述三种溶液各0.01ml，分别点于同一硅胶G薄层板上；以正丁醇-乙酸乙酯-水的体积比为(8:3:8)的上层溶液为展开剂，将薄层板放置在展开缸中展开，取出晾干，喷以15%的硫酸乙醇溶液，110℃加热至斑点显色清晰，置日光下和紫外灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上显相同颜色斑点，阴性无干扰。
C. 总生物碱含量的测定
精密称取丸剂3.0g于具塞三角瓶中，加甲醇30ml，200W、100HZ下超声处理30min，滤过，滤液定容至25ml，制备成供试品溶液；精密称取对叶百部碱对照品0.01g于25ml的容量瓶中，加甲醇定容至刻线，摇匀，制备成对叶百部碱对照品溶液。
精密吸取供试品溶液2.0ml于分液漏斗中，加入pH6.5的磷酸盐缓冲液8ml和溴百里香酚蓝试液8ml，摇匀，用氯仿萃取4次，每次8ml，取下层液置于50ml的容量瓶中，用氯仿定容至刻线，摇匀，以甲醇为空白，于412nm处测定，即得。
结果：每1g丸剂含总生物碱不少于1.08mg。
D. 腺苷的含量测定
采用高效液相色谱法检测腺苷含量，色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（20:80）为流动相进行等度洗脱；流速为1.5mL/min；柱温为35℃；检测波长为320nm；理论塔板数按腺苷峰计算应不低于4000；
取丸剂3.0g，精密称定，置100ml的三角瓶中，加80%甲醇80ml，称定重量，加热回流30min，放冷，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，蒸干，再用80%甲醇定容至25ml，制备成供试品溶液；取腺苷对照品0.00008g，精密称定，加80%甲醇4ml，制备成腺苷对照品溶液；按照用于肺肾阴虚证的中药组合物中各药材比例及制备工艺配制不含冬虫夏草的阴性样品，取3.0g阴性样品，同法制备成不含冬虫夏草的阴性对照品溶液。
分别精密吸取供试品溶液、腺苷对照品溶液和不含冬虫夏草的阴性对照品溶液各0.01ml，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果：每1g丸剂含腺苷(C10H13N5O4) 不少于0.052mg。
实施例5：口服液的检测
百部24g、白及24g、冬虫夏草10g、甘草10g、菠菜子5g
取百部、白及、甘草、菠菜子四味药材提取、浓缩，加入冬虫夏草粗粉进行低温干燥、粉碎，加入常规辅料混匀，按照制剂工艺制备口服液。
A. 冬虫夏草的显微鉴别
取口服液2.0g，置于试管中，加蒸馏水10ml，300W、120HZ下超声处理5min，制备成供试品溶液；另取不含冬虫夏草的阴性样品2.0g，同法制备对照品溶液；
分别取供试品溶液和阴性对照品溶液0.8ml进行涂片；显微镜检供试品溶液涂片和阴性样品溶液涂片，供试品溶液涂片上可见带有小刺毛的黄棕色体壁碎片、团状虫草菌丝或灰棕色子座细胞，阴性对照品溶液涂片上未见上述显微结构。
B. 甘草的薄层鉴别
取口服液0.4g，置于具塞三角瓶中，加90%的甲醇30ml，超声处理30min，滤过，水浴蒸干，用2.0ml的甲醇溶解，制备成供试品溶液；另取甘草对照药材2.0g，同法制备成甘草对照品溶液；按用于肺肾阴虚证的中药组合物中各药材比例及制备工艺配制不含甘草的阴性样品，取2.0g不含甘草的阴性样品，同法制成不含甘草的阴性对照品溶液；取上述三种溶液各0.02ml，分别点于同一硅胶G薄层板上；以正丁醇-乙酸乙酯-水的体积比为(10:4:10)的上层溶液为展开剂，将薄层板放置在展开缸中展开，取出晾干，喷以20%的硫酸乙醇溶液，120℃加热至斑点显色清晰，置日光下和紫外灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上显相同颜色斑点，阴性无干扰。
C. 总生物碱含量的测定
精密称取口服液5.0g于具塞三角瓶中，加甲醇40ml，300W、120HZ下超声处理60min，滤过，滤液定容至50ml，制备成供试品溶液；精密称取对叶百部碱对照品0.08g于50ml的容量瓶中，加甲醇定容至刻线，摇匀，制备成对叶百部碱对照品溶液；精密吸取供试品溶液3.0ml于分液漏斗中，加入pH8.5的磷酸盐缓冲液10ml和溴百里香酚蓝试液8ml，摇匀，用氯仿萃取5次，每次20ml，取下层液置于100ml的容量瓶中，用氯仿定容至刻线，摇匀，以甲醇为空白，于412nm处测定，即得。
结果：每1g口服液含总生物碱1.08mg。
D. 腺苷的含量测定
采用高效液相色谱法检测腺苷含量，色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（30:70）为流动相进行等度洗脱；流速为2.0mL/min；柱温为40℃；检测波长为400nm；理论塔板数按腺苷峰计算应不低于4000；
取口服液4.0g，精密称定，置250ml的三角瓶中，加甲醇200ml，称定重量，加热回流40min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，蒸干，再用甲醇定容至25ml，制备成供试品溶液；取腺苷对照品0.0001g，精密称定，加甲醇5ml，制备成腺苷对照品溶液；按照用于肺肾阴虚证的中药组合物中各药材比例及制备工艺配制不含冬虫夏草的阴性样品，取4.0g阴性样品，同法制备成不含冬虫夏草的阴性对照品溶液。
分别精密吸取供试品溶液、腺苷对照品溶液和不含冬虫夏草的阴性对照品溶液各0.05ml，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果：每1ml口服液含腺苷(C10H13N5O4)0.058mg。
Claims (6)
1.一种用于肺肾阴虚证的中药组合物的检测方法，中药组合物包括百部、白及、冬虫夏草、甘草和菠菜子，其特征在于包括对冬虫夏草和甘草的定性鉴别：
所述冬虫夏草的定性鉴别采用显微鉴别，包括如下步骤：
（1）取用于肺肾阴虚证的中药组合物0.05-2.0重量份，置于试管中，加蒸馏水0.5-10体积份，超声处理1-5 min，制备成供试品溶液；
另取不含冬虫夏草的阴性样品0.05-2.0重量份，同法制备对照品溶液；
（2）分别取供试品溶液和阴性对照品溶液0.1-0.8体积份进行涂片；
（3）显微镜检供试品溶液涂片和阴性样品溶液涂片，供试品溶液涂片上可见带有小刺毛的黄棕色体壁碎片、团状虫草菌丝或灰棕色子座细胞，阴性对照品溶液涂片上未见上述显微结构；
所述甘草的定性鉴别采用薄层色谱法鉴别，包括如下步骤：
（1）取用于肺肾阴虚证的中药组合物0.05-0.4重量份，置于具塞三角瓶中，加50-90%的甲醇5-30体积份，超声处理5-30min，滤过，水浴蒸干，用0.2-2.0体积份的甲醇溶解，制备成供试品溶液；
另取甘草对照药材0.01-2.0重量份，同法制备成甘草对照品溶液；
按用于肺肾阴虚证的中药组合物中各药材比例及制备工艺配制不含甘草的阴性样品，取0.05-2.0重量份不含甘草的阴性样品，同法制成不含甘草的阴性对照品溶液；
（2）取步骤（1）得到的三种溶液各0.001-0.02体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上；
（3）以正丁醇-乙酸乙酯-水的体积比为4:1:5的上层溶液为展开剂，将薄层板放置在展开缸中展开，取出晾干，喷以5-20%的硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置日光下和紫外灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上显相同颜色斑点，阴性无干扰。
2.如权利要求1所述的用于肺肾阴虚证的中药组合物的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括测定中药组合物中总生物碱的含量，包括如下步骤：
（1）取用于肺肾阴虚证的中药组合物制备供试品溶液，同时制备对叶百部碱对照品溶液；
（2）采用紫外分光光度法，磷酸盐缓冲液和溴百里香酚蓝试液为显色剂，检测波长为412nm，进行测定，即得。
3.如权利要求2所述的用于肺肾阴虚证的中药组合物的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括测定中药组合物中总生物碱的含量，包括如下步骤：
（1）精密称取用于肺肾阴虚证的中药组合物0.5-5.0重量份于具塞三角瓶中，加甲醇10-50体积份，超声处理15-60min，滤过，滤液定容至10-50体积份，制备成供试品溶液；
精密称取对叶百部碱对照品0.002-0.08重量份于10-50体积份的容量瓶中，加甲醇定容至刻线，摇匀，制备成对叶百部碱对照品溶液；
（2）精密吸取供试品溶液0.2-3.0体积份于分液漏斗中，加入pH3.6-8.5的磷酸盐缓冲液1-10体积份和溴百里香酚蓝试液1-8体积份，摇匀，用氯仿萃取1-5次，每次1-20体积份，取下层液置于10-50体积份的容量瓶中，用氯仿定容至刻线，摇匀，以甲醇为空白，于412nm处测定，即得。
4.如权利要求3所述的用于肺肾阴虚证的中药组合物的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括测定中药组合物中腺苷的含量，包括如下步骤：
（1）采用高效液相色谱法检测腺苷含量，色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为5-30:95-70的乙腈-水为流动相进行等度洗脱；流速为0.5-2.0mL/min；柱温为15-40℃；检测波长为210-400nm；理论塔板数按腺苷峰计算应不低于4000；
（2）取用于肺肾阴虚证的中药组合物用甲醇提取，制备成供试品溶液，同时制备腺苷对照品溶液和不含冬虫夏草的阴性对照品溶液；
（3）分别精密吸取供试品溶液、腺苷对照品溶液和不含冬虫夏草的阴性对照品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得；
每1g用于肺肾阴虚证的中药组合物含冬虫夏草以腺苷计，不得少于0.03mg。
5.如权利要求4所述的用于肺肾阴虚证的中药组合物的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括测定中药组合物中腺苷的含量，包括如下步骤：
（1）采用高效液相色谱法检测腺苷含量，色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比12:88的乙腈-水为流动相进行等度洗脱；流速为1.0mL/min；柱温为25℃；检测波长为260nm；理论塔板数按腺苷峰计算应不低于4000；
（2）取用于肺肾阴虚证的中药组合物0.5-4.0重量份，精密称定，置50-250体积份的三角瓶中，加50-100%甲醇20-200体积份，称定重量，加热回流10-40min，放冷，用50-100%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，蒸干，再用50-100%甲醇定容至5-20体积份，制备成供试品溶液；
取腺苷对照品0.00002-0.0001重量份，精密称定，加50-100%甲醇1-5体积份，制备成腺苷对照品溶液；
按照用于肺肾阴虚证的中药组合物中各药材比例及制备工艺配制不含冬虫夏草的阴性样品，取0.5-4.0重量份阴性样品，同法制备成不含冬虫夏草的阴性对照品溶液；
（3）分别精密吸取供试品溶液、腺苷对照品溶液和不含冬虫夏草的阴性对照品溶液各0.001-0.05体积份，注入液相色谱仪，测定，即得；
每1g用于肺肾阴虚证的中药组合物含冬虫夏草以腺苷计，不得少于0.03mg。
6.如权利要求5所述的用于肺肾阴虚证的中药组合物的检测方法，其特征在于：所述甘草的定性鉴别采用薄层色谱法鉴别的步骤（3）中加热至斑点显色清晰的加热温度为80-120℃。
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| GR01 | Patent grant | ||
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