CN110184388A - 尿液hpv快速分型检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种尿液HPV快速分型检测方法，按照先后顺序包括以下步骤：(1)将尿液离心，弃上清取沉淀细胞，沉淀细胞使用PBS清洗，加裂解液，加热，然后再次高速离心，取上清液进行后续的qPCR；(2)将缓冲液、多重DNA聚合酶、混合引物、混合探针、步骤(1)中的上清液和水组成qPCR体系进行qPCR扩增；(3)对扩增产物进行检测。本发明提供的尿液HPV快速分型检测方法采用快速qPCR检测HPV并进行分型；本法不需要DNA提取，可以节省成本和简化操作；本法进行检测时只需要采取尿样即可进行检测，尿液取样比传统的取阴道分泌物更简单容易接受。
Description
技术领域
本发明属于基因诊断技术领域，具体涉及一种尿液HPV快速分型检测方法。
背景技术
宫颈癌是常见的女性恶性肿瘤之一，其发病率仅次于乳腺癌，居妇科肿瘤第二位。科学研究已经证实高危型乳头瘤病毒(hrHPV)的持续感染是宫颈癌的主要病因，HPV阴性的妇女罹患宫颈癌的风险极低。然而，大多数HPV检测结果为阳性的妇女并不会发展成癌前病变或癌症，只有少部分HPV感染妇女有可能发展为宫颈癌前病变。
HPV检测则主要可通过染色镜检法、HPV的DNA检测法或血清学试验来检查是否感染了HPV。主流的检测还是通过宫颈细胞取样进行总DNA提取，然后是HPV的qPCR分型检测。这种方法比较直接而且简单快速，但是推广也存在一些问题：首先虽然宫颈细胞取样属于无创检测，但是对于取样要求相对较高容易造成宫颈和阴道上皮组织细微损伤，而且大部分需要在医院进行操作；此外大多数女性由于出于隐私考虑对于宫颈细胞取样还是持排斥的态度。有研究显示，尿液里面含有阴道分泌物以及阴道上皮脱落细胞，如果阴道存在HPV或者发生HPV感染在尿液是能够检测到的，这样可以以间接的方式了解宫颈的HPV感染情况。研究显示尿液的HPV检出率可能低于宫颈脱落细胞检测，但是检测几乎不受任何伦理限制对于未成年女性及未进行性生活女性，甚至男性HPV携带者都可以进行检测，是真正意义的无创检测，非常适合进行大规模人群的HPV筛查。
发明内容
为了进一步增加实验步骤的可操作性，本专利对HPV检测方法进行了改进，无需DNA提取，样本一步处理就可以进行qPCR，不仅降低了实验成本同时也减少了操作时间。为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种尿液HPV快速分型检测方法，按照先后顺序包括以下步骤：
(1)将尿液离心，弃上清取沉淀细胞，沉淀细胞使用PBS清洗，加裂解液，加热，然后再次高速离心，取上清液进行后续的qPCR；
(2)将缓冲液、多重DNA聚合酶、混合引物、混合探针、步骤(1)中的上清液和水组成qPCR体系进行qPCR扩增；
(3)对扩增产物进行检测。
优选的是，步骤(2)中，所述混合引物包括16F、16R、18F、18R，其中，各引物的序列为：
16F GGAGGAAGAGGATGAAATAGATGGT
16R AGAGTCACACTTGCAACAAAAGGT
18F CAGGCAGATTTTGTGAAAGCTAGA
18R AACCGTGGACTTAACTCTGTATCCA。
在上述任一方案中优选的是，步骤(2)中，所述混合探针包括16 Probe、18 Probe，其中，各探针的序列为：
16 Probe FAM-AACCGGACAAGCAGACAGAGCCCAT-BHQ1
18 Probe HEX-GCATTGTTACAGCACAGCCATGCG-BHQ2。
在上述任一方案中优选的是，步骤(1)的详细步骤为：尿液直接3000g离心5min，弃上清取沉淀细胞，沉淀细胞使用PBS清洗一次，加50ul裂解液，95度10min加热，然后再次高速13000g离心10min，直接取上清液进行后续的qPCR。
在上述任一方案中优选的是，步骤(2)中，qPCR体系的具体加入量为：缓冲液5ul、多重DNA聚合酶0.2ul、混合引物0.8ul、混合探针0.5ul、步骤(1)中的上清液2ul、水1.5ul。
在上述任一方案中优选的是，所述缓冲液为2×Multiplex Buffer。
在上述任一方案中优选的是，步骤(2)中，qPCR扩增的条件为：95℃5min，1个循环；95℃15s，55℃60s，45个循环；38℃5s，1个循环。
本发明与现有技术相比具有以下的有益效果：
(1)本发明提供的尿液HPV快速分型检测方法采用快速qPCR检测HPV并进行分型；
(2)本法不需要DNA提取，可以节省成本和简化操作；
(3)本法进行检测时只需要采取尿样即可进行检测，尿液取样比传统的取阴道分泌物更简单容易接受。
附图说明
图1为按照本发明的尿液HPV快速分型检测方法的检测图；
具体实施方式
为了更进一步了解本发明的发明内容，下面将结合具体实施例详细阐述本发明。
扩增前处理：50ml尿液直接3000g离心5min，弃上清取沉淀，沉淀细胞PBS清洗一次，加50ul裂解液，95度10min加热，然后再次高速13000g离心10min，直接取上清进行qPCR。
qPCR引物和探针序列见下表：
| 引物/探针 | 序列 |
| 16F | ggaggaagaggatgaaatagatggt |
| 16R | agagtcacacttgcaacaaaaggt |
| 18F | caggcagattttgtgaaagctaga |
| 18R | aaccgtggacttaactctgtatcca |
| 16 Probe | fam-aaccggacaagcagacagagcccat-bhq1 |
| 18 Probe | HEX-gcattgttacagcacagccatgcg-BHQ2 |
两种分型是在同一个扩增体系进行多重扩增(10ul)：
| 组分 | 体积 |
| 2×Multiplex Buffer | 5ul |
| Multiplex DNA Polymerase | 0.2ul |
| Primer mix | 0.8ul |
| Probe mix | 0.5ul |
| DNA | 2ul |
| H<sub>2</sub>O | 1.5ul |
扩增程序如下：
检测结果如下：
从图1上可以看出HPV16和18型的阳性样本使用不同荧光可以明显区分，说明本法具有良好的特异性；
和临床宫颈脱落细胞样本分型结果如下表：
从上表结果看出，尿液检测确实没有脱落细胞检测准确，存在一定的漏检几率，比如N1PA00002，N1PA00004，N1PA00007。如果宫颈脱落细胞是100％检出，尿液总体的检出率大概是70％左右，但是需要扩大临床样本量之后检出率数据会更准确。
本领域技术人员不难理解，本发明的尿液HPV快速分型检测方法包括上述本发明说明书的发明内容和具体实施方式部分以及附图所示出的各部分的任意组合，限于篇幅并为使说明书简明而没有将这些组合构成的各方案一一描述。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京格致医学检验有限公司
<120> 尿液HPV快速分型检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaggaagag gatgaaatag atggt 25
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtcacac ttgcaacaaa aggt 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caggcagatt ttgtgaaagc taga 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaccgtggac ttaactctgt atcca 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaccggacaa gcagacagag cccat 25
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcattgttac agcacagcca tgcg 24
Claims (7)
1.一种尿液HPV快速分型检测方法，按照先后顺序包括以下步骤：
(1)将尿液离心，弃上清取沉淀细胞，沉淀细胞使用PBS清洗，加裂解液，加热，然后再次高速离心，取上清液进行后续的qPCR；
(2)将缓冲液、多重DNA聚合酶、混合引物、混合探针、步骤(1)中的上清液和水组成qPCR体系进行qPCR扩增；
(3)对扩增产物进行检测。
2.根据权利要求1所述的尿液HPV快速分型检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述混合引物包括16F、16R、18F、18R，其中，各引物的序列为：
16F GGAGGAAGAGGATGAAATAGATGGT
16R AGAGTCACACTTGCAACAAAAGGT
18F CAGGCAGATTTTGTGAAAGCTAGA
18R AACCGTGGACTTAACTCTGTATCCA。
3.根据权利要求1所述的尿液HPV快速分型检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述混合探针包括16 Probe、18 Probe，其中，各探针的序列为：
16 Probe FAM-AACCGGACAAGCAGACAGAGCCCAT-BHQ1
18 Probe HEX-GCATTGTTACAGCACAGCCATGCG-BHQ2。
4.根据权利要求1所述的尿液HPV快速分型检测方法，其特征在于，步骤(1)的详细步骤为：尿液直接3000g离心5min，弃上清取沉淀细胞，沉淀细胞使用PBS清洗一次，加50ul裂解液，95度10min加热，然后再次高速13000g离心10min，直接取上清液进行后续的qPCR。
5.根据权利要求1所述的尿液HPV快速分型检测方法，其特征在于，步骤(2)中，qPCR体系的具体加入量为：缓冲液5ul、多重DNA聚合酶0.2ul、混合引物0.8ul、混合探针0.5ul、步骤(1)中的上清液2ul、水1.5ul。
6.根据权利要求5所述的尿液HPV快速分型检测方法，其特征在于，所述缓冲液为2×Multiplex Buffer。
7.根据权利要求1所述的尿液HPV快速分型检测方法，其特征在于，步骤(2)中，qPCR扩增的条件为：95℃5min，1个循环；95℃15s，55℃60s，45个循环；38℃5s，1个循环。
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| CN103184294A (zh) * | 2011-12-27 | 2013-07-03 | 上海复星医学科技发展有限公司 | 人乳头瘤病毒(hpv)16,18型多通道荧光pcr检测方法与试剂盒 |
| US20150376725A1 (en) * | 2013-09-04 | 2015-12-31 | Trovagene, Inc. | HPV Detection in Urine |
| CN106755583A (zh) * | 2017-01-04 | 2017-05-31 | 安徽安龙基因医学检验所有限公司 | 应用数字pcr检测尿液中人乳头瘤病毒16/18型基因的方法 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 姚庆英等: "《PCR检测宫颈病变组织和配偶精液及尿液HPV16、18型的研究》", 《首都医科大学学报》 * |
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