CN110184202A

CN110184202A - 一种啤酒酵母菌富集钨的方法

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Publication number: CN110184202A
Application number: CN201910480404.8A
Authority: CN
Inventors: 江澜; 张桂芝; 刘燕
Original assignee: Chongqing Technology and Business University
Current assignee: Chongqing Technology and Business University
Priority date: 2019-06-04
Filing date: 2019-06-04
Publication date: 2019-08-30

Abstract

本发明属于酵母菌技术领域，公开了一种啤酒酵母菌富集钨的方法。所述的啤酒酵母菌富集钨的方法；对啤酒酵母进行活化处理获得活化啤酒酵母和种子液；将种子液按10％接种量接种到10％豆芽汁葡萄糖培养基中；加入1.2％钨酸钠溶液，加棉塞半通气，摇床110次/min、28℃培养啤酒酵母52h即可。本发明在10％豆芽汁葡萄糖培养基中啤酒酵母生长最好，酵母菌干重为0.6154g/100ml。培养温度为30℃时酵母菌生长最好，酵母菌干重为0.6851g/100ml。发酵48h为最佳培养时间，酵母菌干重为0.6510g/100ml。钨酸钠浓度为1.5％时酵母菌生长最好，酵母菌干重可达0.6412g/100ml。

Description

一种啤酒酵母菌富集钨的方法

技术领域

本发明属于酵母菌技术领域，尤其涉及一种啤酒酵母菌富集钨的方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

1、钨酸钠，钨作为一种微量元素，其储量在我国重金属产业中占51％，资源十分丰富，多以钨酸钠的形式广泛存在。还有许多其他化合物和合金，如钨酸钠、磷钨酸、三氧化钨和九钨三钛硅酸盐等。

(1)钨酸钠的物理性质

钨酸钠是无色结晶或白色结晶性粉末。钨酸钠可溶于水，水溶液呈微碱性，不溶于乙醇，微溶于氨。在干燥空气中风化。加热到100℃失去结晶水而成无水物。相对密度3.23～3.25。熔点698℃(无水品)。钨酸钠(Na₂WO₄·2H2O)是钨以2％的Na₂WO₄水溶液，应该储存在阴凉，干燥，通风良好的地方，远离不相容的物质。钨酸钠可利用盐析结晶法和饱和结晶法的生产工艺。

(2)钨酸钠的用途

钨酸钠的用途广泛，除了工业制造行业外，钨酸钠使用在人体可治疗一些常见疾病，如糖尿病，高血压，肥胖症，偏头痛，烧伤，气喘和风湿等。治疗时将钨酸钠制成不同形式的产品包括了漱剂，涂抹在皮肤上的药物，眼药水，喷雾，当然还有最常见的口服药物和皮下、肌肉注射。钨酸盐近年来在糖尿病治疗中作用显著，非常具有潜力，不仅降低血脂，延缓其他糖尿病产生的并发症，还促进胰岛细胞的再生、修复。有研究表明：钨酸钠可能通过上调GLUT-4mRNA的表达而促进脂肪细胞糖代谢。无论是长期还是短期服用，无论是单体还是化合物形式的钨在对血糖水平的生物学行为中发挥着重要的作用。然而，在使用钨酸钠治疗糖尿病人时，长期使用是不可行的。对于任何一种金属，潜在的毒性都来自于长期的使用，钨也不能被忽略。

(3)钨酸钠毒性研究

钨化合物有毒，尤其是钨酸钠的毒性更大。兔肌内注射，大鼠皮下注射，人接触钨化合物后，上呼吸道和深呼吸道受到刺激，受粉尘作用患支气管哮喘和矽肺，胃肠功能紊乱。接触皮肤后，使皮肤上出现鳞屑。然而，目前国内外使用钨酸钠作为降糖作用的药物治疗糖尿病研究中，有关其毒性的资料非常缺乏，主要集中在单一钨酸盐中。但是考虑到钨是近年来一种具有潜力的新口服降糖药，钨是否会产生毒性，是否造成对人体的影响也是必须评估的。

2、微生物转化

1)微生物转化概述

微生物转化是通过微生物细胞将复杂的底物进行结构的修饰，以改变其原本会在机体或环境中的作用。这便达到了研究的目的，使有些无机元素造成的有害影响，通过微生物体内转化转变为有机物质，最后发挥其有益的作用。为消除或降低钨酸钠作为药物使用时具有的毒性，也就是将无机化合物转化为有机化合物到人体内，利用这种转化的思路能够研究钨酸钠治疗疾病时所产生的毒性。

2)微生物转化方法

微生物作为一个生命体，虽然体积小，但是在微生物体内具有一套自身特异性的酶体系。在微生物生长过程中有无数的酶参与生化反应，合成酶、异构酶、氧化酶、还原酶都可以与加入其中的底物发生作用，使微生物结构发生改变。由这一独特的优点，微生物转化具备了生物量积累快、转化酶表达效率高、转化时间短、便于工业化生产等特点。因此，微生物转化的关键步骤就是菌种的筛选，细菌繁殖能力最快，分解转化能力也受到了广泛的关注。真菌种类繁多，并且体内具有分解淀粉、纤维素和脂类等强大的酶系，最终产生次生代谢产物。

微生物转化的反应主要有：(1)羟基化：应用于羟基化反应主要是放线菌。(2)脱氢反应：应用于脱氢反应主要是细菌。(3)酰基化：应用于酰基化反应主要是细菌。(4)水解反应：应用于水解反应主要是细菌、酵母菌和霉菌。(5)环氧化：在萜类中常见，常发生在双键部位。

微生物转化的方法主要有：(1)分批培养转化(2)利用酶进行生物转化(3)应用渗透细胞进行生物转化(4)应用孢子进行生物转化(5)应用固定化细胞进行生物转化(6)应用干燥细胞进行生物转化(7)静息细胞转化法。

3)微生物转化的应用

微生物转化方法在医药、环境、工业等各方面受到了广泛的重视。在医药学中，微生物转化有三个主要的工业应用：第一，微生物转化对手性药物结构重组、拆分，转化后药物具有抗肿瘤等作用。第二，对天然中药材料的结构进行修饰，使药物更温和，效用更好。第三，运用转化技术时天然药物的含量提高，在临床中普遍得到应用。通过生物转化方法制成低毒性，高效应的药物，也可以帮助解决复杂的医药合成工业过程中遇到的问题，如利用微生物各种机制降解吡啶从而研究含有吡啶物质的结构。环境中可利用微生物转化将对土壤产生污染的重金属(Cd²⁺和Cu²⁺)进行吸附转化以及利用生物修复法处理环境中铬的污染，因为微生物能够与重金属发生螯合作用，通过对抗性菌种的筛选和分离，菌种的细胞壁结构吸附重金属离子，如利用微生物转化地下深层沉积物中的杂环化合物分子。

微生物转化已经得到了广泛的应用。虽然生物转化通常被认为是重要的方法，其中利用转化除去药物毒性，或是在污水处理厂和在水生环境中有害物质的处理，但是对具体化合物的定量信息是匮乏，这方面还需要更多的探索。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)钨酸钠在近年来成为治疗糖尿病的潜力药物，同时钨具有像胰岛素一样的抗糖尿病的作用。这种方法以2％钨酸钠水溶液施于人体可以对人体一些常见疾病，如糖尿病，高血压，肥胖症，偏头痛等进行治疗。但是钨对人体的健康产生了巨大的影响，会积累细胞毒素于体内。

(2)目前还没有采用微生物转化法将钨酸钠无机元素转化为有机元素这种方法，以降低钨化合物对人体的有害影响，正如研究硒元素无机到有机的转化。

(3)以及对微生物富集钨的相关研究也很少，如它的结合形式、价态、稳定性等等，由于这方面的研究欠缺，所以本文初步探究啤酒酵母对钨酸钠的转化作用，以确立最优生长条件。

解决上述技术问题的难度：

主要围绕以下几个方面探究：

(1)活化啤酒酵母。

(2)最适合啤酒酵母生长的培养基的选择。

(3)不同培养条件(通气条件，培养时间，培养温度，钨酸钠的浓度)对液体培养含钨酵母菌的影响。

(4)测定不同培养条件下酵母菌的干重。

(5)在以上条件确立后选择进行L9(3⁴)正交试验，以确定最终最优的培养条件。

解决上述技术问题的意义：

钨酸钠作为近年来治疗糖尿病和减肥的潜力药物，因其较高的毒性阻碍了其应用，如果能通过啤酒酵母富集钨既降低了毒性又能用于对糖尿病的改善、减肥，无疑会对糖尿病的防治、以及减肥又着十分重大的意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种啤酒酵母菌富集钨的方法。

本发明是这样实现的，一种啤酒酵母菌富集钨的方法，具体包括以下步骤：

步骤一：对啤酒酵母进行活化处理获得活化啤酒酵母和种子液；

步骤二：将啤酒酵母种子液接种到10％豆芽汁葡萄糖培养基中；

步骤三：加入1.2％钨酸钠溶液，加棉塞半通气，摇床：28℃、110次/min培养啤酒酵母52h即可。

进一步，步骤一中，活化啤酒酵母具体为：

无菌条件下，将啤酒酵母按无菌操作接种于试管斜面豆芽汁固体培养基中，放置28℃恒温培养箱培养48h，生长后的菌种用于种子液的制备。

进一步，豆芽汁葡萄糖固体斜面培养基具体配制为：

(1)配制10％豆芽汁：称取已购新鲜黄豆芽100g，用刀切成三段放入搪瓷杯中，加入蒸馏水1000ml，水煮沸后，小火煮沸30min，用纱布过滤，倒出豆芽汁；

(2)加葡萄糖，按每100ml10％豆芽汁加入5g葡萄糖，1000ml即加入50g葡萄糖，加入后使用玻璃棒搅拌溶解；补足失水至所需体积，即制成10％豆芽汁；

(3)固体培养基需加入1.5％至2％的琼脂，加热融化；

(4)使用培养基分装器进行分装，加棉塞，旧报纸包扎；

(5)高压蒸汽灭菌121℃，20min；

(6)灭菌后放置斜面凝固。

在步骤二中，将活化的啤酒酵母试管种整支接种于100ml、10％豆芽汁葡萄糖培养基中；加棉塞半通气，摇床：28℃、110次/min培养啤酒酵母24h得到种子液。

进一步，豆芽汁葡萄糖液体培养基具体配制为：

(3)使用培养基分装器进行分装，加棉塞，旧报纸包扎；

(4)高压蒸汽灭菌121℃，20min。

在步骤三中，采用步骤二的豆芽汁葡萄糖液体培养基100ml，按接种量10％接入种子液，再加入1.2％钨酸钠溶液(6ml的20％钨酸钠溶液)，加棉塞半通气，摇床：28℃、110次/min培养啤酒酵母52h，离心(4000r/min,10min)、水洗、离心、烘干得到0.7011g/100ml的富钨啤酒酵母。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

(1)通过单因素实验发现，不同培养基、培养时间、培养温度、是否通气以及加入钨酸钠溶液的浓度都影响了酵母的生长，获得的结论是：富钨啤酒酵母在10％豆芽汁培养基中培养，干重最大可达0.6154g/100ml；培养温度30℃时干重最大可达0.6851g/100ml；培养时间48h后干重最大可达0.6210g/100ml；加棉塞半通气时干重最大可达0.6519g/100ml；加入1.5％钨酸钠溶液，干重可达到最大值0.6412g/100ml。

(2)为了确立更优化的适合富钨酵母生长的条件，通过正交试验得出最优水平组合是：在10％豆芽汁培养基中，以10％的接种量，加入1.2％钨酸钠溶液，加棉塞半通气，在28℃、110次/min摇床上培养啤酒酵母52h，即可得到富钨酵母菌，其干重达0.7011g/100ml。

根据数据评估了影响啤酒酵母生长的因素先后顺序，最终根据R值得到影响酵母生长因素的不同，影响程度大小也不同，本实验表明温度影响大于培养时间，加入钨酸钠浓度影响最小。

附图说明

图1是本发明实施例提供的啤酒酵母菌富集钨的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的不同培养基的选择结果示意图。

图3是本发明实施例提供的不同温度的选择结果示意图。

图4是本发明实施例提供的不同培养时间的选择结果示意图。

图5是本发明实施例提供的不同通气情况的选择结果示意图。

图6是本发明实施例提供的不同钨酸钠浓度对酵母菌生长的影响示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细说明；

如图1所示，本发明实施例提供的啤酒酵母菌富集钨的方法，具体包括以下步骤：

S101：对啤酒酵母进行活化处理获得活化啤酒酵母和种子液；

S102：将啤酒酵母种子液按10％接种量接种到10％豆芽汁葡萄糖培养基中；

S103：加入1.2％钨酸钠溶液，加棉塞半通气，摇床110次/min、28℃培养啤酒酵母52h即可。

步骤S101中，本发明实施例提供的活化啤酒酵母具体为：

无菌条件下，将啤酒酵母接种于试管斜面豆芽汁固体培养基中，放置28℃恒温培养箱培养48h，生长后的菌种用于种子液的制备。

下面结合具体实验对本发明的应用原理进行进一步说明；

本发明利用啤酒酵母菌对钨酸钠的转化作用筛选富钨酵母菌最优的培养条件，其具体方法为：

首先对培养基种类、培养温度、培养时间、钨酸钠的浓度以及通气条件进行单因素实验，通过测定酵母菌干重来优化不同的培养条件；

在单因素试验的基础上，再进行培养温度、培养时间以及钨酸钠浓度的L9(3⁴)试验，通过测定酵母菌干重选取富钨酵母菌最优的生长条件。

一、实验材料

1、菌种来源

重庆工商大学实验室提供的啤酒酵母(Saccharomyces.cerevisiae)。

2、药品与材料

本实验所涉及的实验药品见表1：

3、实验仪器

本实验所涉及的实验仪器见表2：

表2实验所用仪器

4、实验器具

本实验所涉及的实验器具如下：

250ml锥形瓶，500ml锥形瓶，试剂瓶，铁架台，100ml分液漏斗，300ml离心管，培养皿，1000ml搪瓷杯，50ml烧杯，250ml烧杯，500ml烧杯，100ml量筒，10ml移液管，酒精灯，玻璃棒，pH试纸，100ml容量瓶，试管架，铁架台，接种环，玻璃珠，纱布，试管，洗瓶，洗耳球，药匙，棉塞，报纸，橡皮筋，塑料绳，塑料膜，剪刀，小刀，打火机，标签纸，透明胶带。

二、实验方法

1、试剂配制

20％钨酸钠水溶液的配制：称取20g钨酸钠溶于少量无菌水中，再于100ml的容量瓶中定容至100ml，最终倒入棕色试剂瓶中储存。

2、培养基的制备

(1)马铃薯葡萄糖培养基

1)配制20％马铃薯浸汁：取去皮马铃薯200g，用小刀切成小块放入搪瓷杯中，加入蒸馏水1000ml，水煮沸后，小火煮沸1h。用纱布过滤，倒出马铃薯浸汁。

2)加葡萄糖，按每100ml20％马铃薯汁加入2g葡萄糖，1000ml即加入20g葡萄糖，加入后使用玻璃棒搅拌溶解。补足失水至所需体积，即制成20％马铃薯汁。

3)使用培养基分装器分装，加棉塞，旧报纸包扎。

4)高压蒸汽灭菌(121℃，20min)。

(2)豆芽汁葡萄糖液体培养基

1)配制10％豆芽汁：称取已购新鲜黄豆芽100g，用刀切成三段放入搪瓷杯中，加入蒸馏水1000ml，水煮沸后，小火煮沸30min，用纱布过滤，倒出豆芽汁。

2)加葡萄糖，按每100ml10％豆芽汁加入5g葡萄糖，1000ml即加入50g葡萄糖，加入后使用玻璃棒搅拌溶解。补足失水至所需体积，即制成10％豆芽汁。

3)使用培养基分装器分装，加棉塞，旧报纸包扎。

4)高压蒸汽灭菌(121℃，20min)。

(3)豆芽汁葡萄糖固体斜面培养基

1)配制10％豆芽汁：称取已购新鲜黄豆芽100g，用刀切成三段放入搪瓷杯中，加入蒸馏水1000ml，水煮沸后，小火煮沸30min，用纱布过滤，倒出豆芽汁；

2)加葡萄糖，按每100ml10％豆芽汁加入5g葡萄糖，1000ml即加入50g葡萄糖，加入后使用玻璃棒搅拌溶解。补足失水至所需体积，即制成10％豆芽汁；

3)固体培养基需加入1.5％至2％的琼脂，加热融化；

4)使用培养基分装器分装，加棉塞，旧报纸包扎；

5)高压蒸汽灭菌(121℃，20min)。

6)灭菌后放置斜面凝固，冰箱储藏备用。

(4)YPD酵母浸出粉胨葡萄糖培养基

1)称取1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖制备液体培养基。

2)按照比例加入到所需体积的蒸馏水中。加热溶解。

3)液体培养基使用培养基分装器分装，加棉塞，旧报纸包扎。

4)高压蒸汽灭菌(121℃，20min)。

5)灭菌后加入2％葡萄糖溶液(为防止葡萄糖与培养基中的成分发生反应，导致培养基发生变化)。

(4)LB培养基

1)称取胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g制备液体培养基。

2)将此配方依次准确加入500ml烧杯中，所有药品混合均匀，用玻璃棒搅拌溶解。

3)调pH至7.0。

4)液体培养基使用培养基分装器分装，加棉塞，旧报纸包扎。

5)高压蒸汽灭菌(121℃，20min)。

(5)麦氏培养基

1)称取葡萄糖1g，酵母膏2.5g，氯化钾1.8g，醋酸钠8.2g制备液体培养基。

2)将此配方依次准确加入500ml烧杯中，酵母膏用玻璃棒挑取溶解后倒入锥形瓶中。所有药品混合均匀，用玻璃棒搅拌溶解。

3)调pH至7.0。

5)高压蒸汽灭菌(121℃，20min)。

3、对酵母菌生长最好的培养条件的选择

(1)菌种活化

(2)种子液的制备

无菌条件下，在已活化菌种的试管中加入少量豆芽汁液体培养基，使用接种环轻轻刮下(不要刮破培养基)啤酒酵母菌，再将含有菌种的培养基倒入取出少量培养基剩余的液体培养基的锥形瓶中，放置110次/min，温度28℃摇床上振荡培养24h。

(3)培养基的选择

准备20％马铃薯葡萄糖、10％豆芽汁葡萄糖、YPD、LB和麦氏培养基，使用无菌移液管加入10％已摇床发酵24h的种子培养液至每种培养基中。再分别加入等量的1.5％钨酸钠溶液(7.5ml的20％钨酸钠溶液)于110次/min摇床上28℃振荡培养48h。培养后取出100ml培养液4000r/min、离心10min，取底部沉淀置于培养皿中65℃烘干，称量酵母的干重。

(4)培养温度的选择

准备6个(每组两个培养基平行试验)10％豆芽汁葡萄糖培养基，使用无菌移液管加入10％已摇床发酵24h的种子培养液至每个培养基内。再分别加入等量的1.5％钨酸钠溶液(7.5ml的20％钨酸钠溶液)于110次/min摇床上振荡培养48h，温度分别选取25℃、28℃和30℃。培养后取出100ml培养液4000r/min、离心10min，取底部沉淀置于培养皿中65℃烘干，称量酵母的干重。

(5)培养时间的选择

准备12个(每组两个培养基平行试验)10％豆芽汁葡萄糖培养基，使用无菌移液管加入10％已摇床发酵24h的种子培养液至每个培养基内。再分别加入等量的1.5％钨酸钠溶液(7.5ml的20％钨酸钠溶液)于110次/min摇床上28℃振荡培养不同时间，分别为39h、44h、48h、52h、63h和72h。培养后取出100ml培养液离心、烘干、称量同前。

(6)通气方式的选择

准备三种通气情况的10％豆芽汁葡萄糖培养基(每组两个培养基平行试验)，分别是棉塞(半通气)、纱布(通气)、纱布加塑料膜(不通气)。使用无菌移液管加入10％已摇床发酵24h的种子培养液至每个培养基内。再分别加入等量的1.5％钨酸钠溶液(7.5ml的20％钨酸钠溶液)于110r/min摇床上28℃振荡培养48h。培养后取出100ml培养液离心、烘干、称量同前。

4、最适钨酸钠浓度的选择

准备多个(每组两个培养基平行试验)10％豆芽汁葡萄糖培养基，使用无菌移液管加入10％已摇床发酵24h的种子培养液至每个培养基内。再分别加入不同浓度(1％、1.2％、1.5％、1.8％、2％、2.2％、2.5％)的钨酸钠溶液于110次/min摇床上28℃振荡培养48h，并准备一组空白对照试验(不加钨酸钠溶液)。培养后取出100ml培养液离心，取底部沉淀置于培养皿中65℃烘干，称量酵母的干重。利用以上方法可以通过测定不同钨酸钠浓度的液体培养基中酵母菌的干重，可以得出最适合酵母菌生长的钨酸钠浓度。

5、测定菌体干重

振荡培养完成后将菌悬液取出进行离心。取菌悬液100ml于离心管中，使用多管架自动平衡离心机。以4000r/min离心10min，离心结束后，倾去上清液，使用适量蒸馏水，洗涤沉淀，少量水多洗涤几次，洗涤后的倒入事先称好其质量m1(g)的培养皿中，放入烘箱中烘干(65℃)，待水分充分蒸干后，称取总质量m2(g)，m2-m1即为菌体的干重。

6、L₉(3⁴)试验

设计一种可以研究多因素多水平的正交试验，也就是从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验。经过单因素实验可以确立培养基、温度、时间、通气情况以及最适钨酸钠浓度。为确立最优条件，利用培养温度(A)、钨酸钠的浓度(B)和培养时间(C)设计L₉(3⁴)试验，如表3。最终通过菌体的干重来评估影响试验的因素及影响程度大小。

表3因素水平表

7、正交试验的验证实验

将正交试验得到的最佳条件下即A1B1C3，也就是28℃、加入1.2％的钨酸钠、培养52h条件下，制备一批富钨啤酒酵母。即按10％接种量接入啤酒酵母种子液于10％的豆芽汁葡萄糖培养基中，加入1.2％的钨酸钠，于棉塞通气，摇床110次/min、28℃振摇培养52h，离心、水洗、烘干，得到富钨啤酒酵母。

三、结果与分析

1、对富钨酵母菌生长最好培养条件的选择

(1)培养基的选择

接种量为10％啤酒酵母分别于20％马铃薯葡萄糖培养基、10％豆芽汁葡萄糖培养基、YPD液体培养基、LB培养基和麦氏培养基中，在每种培养基均加入1.5％钨酸钠溶液。摇床110次/min、振荡温度28℃培养48h后，使用低速离心机测定菌体的干重，称量的干重结果见下表4和图2。可由此选择最适宜富钨啤酒酵母生长的培养基。

表4不同培养基的选择

如图2所示，本发明实施例提供的不同培养基的选择结果示意图。

如图2所示，在28℃摇床培养48h(纱布通气)的条件下，每种培养基都加入1.5％钨酸钠溶液。可以发现使用豆芽汁葡萄糖培养基时，最终测得酵母的干重最大0.6154g/100ml，其次是LB培养基，YPD培养基，20％马铃薯葡萄糖培养基,最后是麦氏培养基。豆芽汁葡萄糖培养基是一种半合成培养基，其中的天然有机物作为碳源、氮源和生长因子，葡萄糖也是培养基制备中最佳的碳源物质，并且豆芽汁培养基配制方便且营养成分丰富。而麦氏培养基中营养成分单一，相比较豆芽汁培养基缺乏一些天然的营养物质。

由以上分析可知，最适合富钨啤酒酵母生长的培养基应选择10％豆芽汁葡萄糖培养基。

(2)温度的影响

啤酒酵母分别在25℃、28℃和30℃三种温度下摇床培养48h后，使用低速离心机测定菌体的干重，称量的干重结果见下表5和图3。可由此选择最适宜啤酒酵母生长的温度。

表5不同温度的选择

如图3所示，本发明实施例提供的不同温度的选择结果示意图。

如图3所示，在10％豆芽汁葡萄糖培养中摇床培养48h(纱布通气)的条件下，每种培养基都加入1.5％钨酸钠溶液，培养温度为30℃时菌体干重最大0.6851g/100ml，其次是28℃和25℃。温度能够在微生物生长过程中起到重要的影响作用：(1)影响微生物生长代谢机制以及发酵调控。(2)影响体内对生长有作用的酶，如氧化酶和乳糖酶等。(3)改变生长代谢的方向。(4)影响液体培养基的理化性质。，因此表明富钨啤酒酵母在30℃下发酵情况最好，代谢最旺盛。

由以上分析可知，最适合富钨啤酒酵母生长的温度应选择30℃。

(3)培养时间的选择

啤酒酵母分别培养39h、44h、48h、52h、63h和72h后，使用低速离心机测定菌体的干重，称量的干重结果见下表6和图4。可由此选择啤酒酵母最佳培养时间。

表6不同培养时间的选择

如图4所示，本发明实施例提供的不同培养时间的选择结果示意图。

如图4所示，在10％豆芽汁葡萄糖培养中摇床培养不同的时间(纱布通气)，每种培养基都加入1.5％钨酸钠溶液，培养时间为48h时菌体干重最大0.62095g/100ml。随着培养时间的增加，啤酒酵母的干重也逐渐增加，但在达到48h发酵后,酵母菌增加下降较快，这可能由于酵母细胞生长过程中对养分的消耗，菌体死亡数量逐渐增加。这也与微生物的生长规律息息相关，微生物生长期表现为四个时期：延滞期、对数期、稳定期和死亡期。在对数期，菌体生长速率最快，体内代谢旺盛、酶系活跃、活菌数占大多，几乎与总菌数相同。

本实验根据文献资料确立由对数中期开始观察酵母菌生长情况，因为在延滞期菌体刚进入培养基内，正在利用营养合成酶和辅酶，所以此时菌体的细胞数目没有增加。等达到48h时也就是酵母菌最大生长量时期。

由以上分析可知，最适合富钨啤酒酵母生长的培养时间应选择48h。

(4)不同通气情况的选择

啤酒酵母分别以棉塞(半通气)、纱布(通气)、纱布加塑料膜(不通气)三种方式进行培养，再使用低速离心机测定菌体的干重，称量的干重结果见下表7和图5。可由此选择啤酒酵母最佳通气条件。

表7不同通气情况的选择

如图5所示，本发明实施例提供的不同通气情况的选择结果示意图。

如图5所示，在啤酒酵母发酵过程中，使用不同的封口方式控制不同的通气条件，使发酵过程不同，最终得到的菌体干重也不同，加棉塞作为通气方式的发酵菌体干重最大0.6519g/100ml，其次是纱布和包有塑料膜的封口。加棉塞和纱布都是使酵母菌进行有氧呼吸，有氧呼吸能够为生物体提供生命所必需的能量，具备这些能量才能够进行有机物的代谢和合成，以及影响的吸收和运输。另外，棉塞比纱布效果好可能因为棉塞与瓶口接触面积大，阻挡不利的杂菌较多。而纱布效果会差一点，除了有杂菌污染外，无菌操作是否规范也起到至关重要的影响。

由以上分析可知，最适合富钨啤酒酵母生长的通气方式是加棉塞。

2、钨酸钠最适浓度的选择

选取豆芽汁葡萄糖培养基，在28℃培养48h条件下，确立最佳钨酸钠浓度。通过选取不同浓度的钨酸钠溶液绘制曲线，确定钨酸钠对酵母生长的影响。2％钨酸钠溶液对人体是无害的，也是我们研究的一个标准，选取1％～2.5％浓度范围内的钨酸钠溶液进一步测菌体干重。称量的干重结果见下表8和图6。可由此选择对啤酒酵母生长最适宜的钨酸钠溶液浓度。

表8不同钨酸钠浓度对酵母菌生长的影响

如图6所示，本发明实施例提供的不同钨酸钠浓度对酵母菌生长的影响示意图。

如图6所示，第4组钨酸钠浓度为1.5％时菌体干重达到最大0.6412g/100ml，如图6所示，菌体生长随着浓度的变化实现增长后下降的趋势。钨酸钠的浓度在1.5％～2.0％之间最适宜啤酒酵母生长，尤其浓度为1.5％时菌体生长最旺盛，菌体干重较大，也满足作为药物使用时浓度在2％以内不会对人体造成的影响。随着浓度的改变，说明钨酸钠浓度越大会抑制酵母菌的生长。在2％浓度之后菌体数量下降，生长几乎停止，此时在酵母菌体内的钨酸钠以无机状态存在。

由以上分析可知，钨酸钠浓度为1.5％时啤酒酵母生长最好。

3、L₉(3⁴)正交试验

在单因素实验结果的基础上进行L₉(3⁴)正交试验。啤酒酵母在10％豆芽汁葡萄糖培养基以棉塞作为通气条件，接种量按10％计，控制培养温度(选取28℃、30℃和32℃)，培养时间(选取44h、48h和52h)和钨酸钠溶液的浓度(选取1.2％、1.5％和1.8％)设置正交试验。设计正交试验和结果见表9。

表9 L₉₍3⁴)正交试验

综合正交试验数据：

(1)计算各因素每个水平酵母菌干重之和以及平均值：

K1＝∑×1,k1＝∑×1/3；

同理,K2＝∑×2,k2＝∑×2/3；K3＝∑×3,k3＝∑×3/3

(2)分析各因素对酵母菌生长影响大小：表3-3-1中k1，k2，k3是同一因素的平均值，用k中最大值减去最小值为极差R。极差的大小与因素对实验影响程度大小有关，极差越大，影响也就越显著。由计算结果得出影响程度为R_A>R_C>R_B，即A>C>B(培养温度>培养时间>钨酸钠浓度)。因此最影响实验结果的是温度，酵母菌在28℃具有最佳生长能力，酶的活力最大。其次是培养时间，最后是钨酸钠溶液的浓度。

(3)筛选最优水平组合：利用表9中同一因素的K1，K2，K3可以获得平均值。由平均值中最大者确立最优的水平组合，即A1B1C3，也就是加入1.2％的钨酸钠在28℃培养52h为最佳条件。

由以上结果分析得，温度影响程度最大，这是因为在发酵过程中温度影响菌体体内的酶，温度对蛋白质的肽键和分子间作用力还有氨基酸自身的结构会有影响从而影响蛋白质即酶的结构，其结构的改变就会使得功能改变。因此选择合适的温度是首位的。其次是培养的时间，选择微生物生长最旺盛的时期也就是生长曲线中稳定期，使得菌体生长情况最好。最后，钨酸钠的浓度影响菌体生长，浓度过大会抑制，所以选择菌体生长量较平稳的浓度区间最合适。

4、正交试验的验证实验

将正交试验得到的最佳条件下即A1B1C3，也就是加入1.2％的钨酸钠、28℃培养52h条件下，制备一批富钨啤酒酵母。即按10％接种量接入啤酒酵母种子液于10％的豆芽汁葡萄糖培养基中，并加入1.2％的钨酸钠，摇床110次/min、28℃振摇培养52h，离心水洗烘干，得到干重0.7011g/100ml的富钨啤酒酵母。

四、结果

(1)通过单因素实验发现，不同培养基、培养时间、培养温度、是否通气以及加入钨酸钠溶液的浓度都影响了酵母的生长，获得的结论是：富钨啤酒酵母在10％豆芽汁培养基中培养，干重最大可达0.6154g/100ml；培养温度30℃时干重最大可达0.6851g/100ml；培养时间48h后干重最大可达0.6210g/100ml；加棉塞半通气时干重最大可达0.6519g/100ml；加入1.5％钨酸钠溶液，干重可达到最大0.6412g/100ml。

(2)为了确立更优化的适合酵母生长的条件，通过正交试验得出最优水平组合是加入1.2％钨酸钠溶液，在28℃培养啤酒酵母52h。根据数据评估了影响啤酒酵母生长的因素先后顺序，最终根据R值得到影响酵母生长因素的不同，影响程度大小也不同，本实验表明温度影响大于培养时间，加入钨酸钠浓度影响最小。

(3)通过正交试验的验证实验，在最佳条件下即加入1.2％钨酸钠溶液，在28℃培养啤酒酵母52h，可得到干重0.7011g/100ml的富钨啤酒酵母。

单因素实验确定的富钨啤酒酵母菌最适宜生长条件为：在10％豆芽汁葡萄糖培养基中啤酒酵母生长最好，酵母菌干重为0.6154g/100ml。培养温度为30℃时酵母菌生长最好，酵母菌干重为0.6851g/100ml。发酵48h为最佳培养时间，酵母菌干重为0.6510g/100ml。钨酸钠浓度为1.5％时酵母菌生长最好，酵母菌干重可达0.6412g/100ml。通气情况选择棉塞达到效果最好，酵母菌干重为0.6519g/100ml。L₉(3⁴)正交实验确立最优条件得到钨酸钠以1.2％浓度，酵母菌在28℃下发酵52h为最优生长条件。根据极差结果得到不同因素影响程度大小是：培养温度>培养时间>钨酸钠浓度。

因此，综合选择啤酒酵母菌在10％豆芽汁葡萄糖培养基中，加入10％接种量的种子液，钨酸钠以1.2％的浓度，加棉塞通气，摇床110次/min、28℃发酵52h的最优生长条件下，啤酒酵母菌能更有效的利用钨酸钠，可得到干重0.7011g/100ml的富钨啤酒酵母。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种啤酒酵母菌富集钨的方法，其特征在于，所述的啤酒酵母菌富集钨的方法，具体包括以下步骤：

步骤一：对啤酒酵母进行活化处理获得活化啤酒酵母；

步骤二：种子液的培养；

步骤三：将啤酒酵母种子液按10％接种量接种到10％豆芽汁葡萄糖培养基中；

步骤四：加入1.2％钨酸钠溶液，加棉塞半通气，摇床110次/min、28℃培养啤酒酵母52h即可。

2.如权利要求1所述的啤酒酵母菌富集钨的方法，其特征在于，所述步骤一中，活化啤酒酵母具体为：

无菌条件下，将啤酒酵母接种于试管斜面豆芽汁葡萄糖固体培养基中，放置28℃恒温培养箱培养48h，生长后的菌种用于种子液的制备。

3.如权利要求1所述的啤酒酵母菌富集钨的方法，其特征在于，所述步骤二中，啤酒酵母种子液的培养具体为：

无菌条件下，将活化的啤酒酵母接种于三角瓶豆芽汁葡萄糖液体培养基中，摇床110次/min、28℃培养24h，生长后种子液用于啤酒酵母富集钨的制备。

4.如权利要求1所述的啤酒酵母菌富集钨的方法，其特征在于，所述豆芽汁葡萄糖液体培养基具体配制为：

(3)使用培养基分装器分装，加棉塞，旧报纸包扎；

(4)高压蒸汽灭菌121℃，20min。

5.如权利要求1所述的啤酒酵母菌富集钨的方法，其特征在于，所述豆芽汁葡萄糖固体斜面培养基具体配制为：

(3)固体培养基需加入1.5％至2％的琼脂，加热融化；

(4)使用培养基分装器分装，加棉塞，旧报纸包扎；

(5)高压蒸汽灭菌121℃，20min；

(6)灭菌后放置斜面凝固。

6.如权利要求1所述的啤酒酵母菌富集钨的方法，其特征在于，所述在10％豆芽汁葡萄糖液体培养基中加入10％接种量的种子液，并加入1.2％钨酸钠溶液，以棉塞半通气，于摇床110次/min、28℃振摇培养52h，经洗涤、离心、烘干，可得到干重0.7011g/100ml的富钨啤酒酵母。