CN110172032B - 益母草碱晶体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本申请为申请号201710995455.5，申请日2017年10月23日，名称“益母草碱晶体及其在制备胰岛素增敏剂、降糖和降脂药物中的用途”的分案申请，属中药现代化制药领域，涉及一种中草药益母草提取物及其在制药中的应用，具体涉及一种中草药益母草提取物益母草碱的晶型结构及其在制备药物中的应用。本发明通过特定的方法，将益母草碱制备成6种不同晶型的晶体，具体为益母草碱硫酸盐的6种不同结构的晶体，其中2种为水合物，2种为无水晶型，一种为甲醇合物，一种为乙醇合物。所制得益母草碱的晶型可用于制备胰岛素增敏剂、降糖药物和脂代谢调节药物，此胰岛素增敏剂尤其适用治疗胰岛素抵抗综合征，此脂代谢调节药物尤其适用治疗脂代谢紊乱、高脂血症及其并发症。
Description
本申请为申请号201710995455.5，申请日2017年10月23日，发明名称为“益母草碱晶体及其在制备胰岛素增敏剂、降糖和降脂药物中的用途”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明属中药现代化制药领域，涉及一种中草药益母草提取物及其在制药中的应用，具体涉及一种中草药益母草提取物益母草碱的晶型结构及其在制备药物中的应用，尤其是在制备胰岛素增敏剂、降糖药物和脂代谢调节药物中的用途，所述的胰岛素增敏剂尤其适用治疗胰岛素抵抗综合征，所述的脂代谢调节药物尤其适用治疗脂代谢紊乱、高脂血症及其并发症。
背景技术
现有技术公开了组成物质的原子、分子或离子呈规律性、周期性排列的物质称为晶体；所述晶体除液晶以外，绝大部分为固体。目前鉴定晶体的主要技术手段为X射线衍射法。有关研究利用电子对X射线的散射作用，可以获得晶体中电子密度的分布情况，再从中通过晶体学分析获得原子的位置信息，即晶体结构。通常，晶体内部结构中的质点(原子、离子、分子、原子团)有规则地在三维空间呈周期性重复排列，形成特定形态的晶格；鉴于晶体中原子排列的规律性和重复性，可以从晶格中拿出一个完全能够表达晶格结构的最小单元，该最小单元就称为晶胞；如某物质的质点(原子、离子、分子、原子团)不具有上述规律性的排列形式，而是以杂乱无章的形式排列，则称为非晶体。
研究证实，一种物质的晶体可以赋予其独特的物理、化学特征，例如石墨和金刚石是单质碳的不同晶体，由于晶型的不同导致两者物理、化学特征的巨大差异。若干单体化学药物也可以形成一种或以上的晶体结构，药物晶体的形成对于其物理、化学特性，以及生物学特性具有重大的影响；有研究报道了药物晶型对于该药物的化学稳定性、药代动力学，乃至药理、毒理效应具有显著的影响，业内认为同样一种化合物，其不同的晶型可以具有不同的物理、化学特征，更可产生不同的药理学效应，因此，制备药物晶型对于创制质量可控的新药具有重要价值。
研究显示，胰岛素抵抗综合征是由于机体对胰岛素生理作用的反应性降低或敏感性降低，并由此引发机体一系列的功能、结构紊乱和病变的基础性疾病。研究还显示，胰岛素抵抗综合征是由于机体对胰岛素生理作用的反应性降低或敏感性降低，并由此引发机体一系列的功能、结构紊乱和病变的基础性疾病。业内认为，该疾患其本质上是胰岛素受体及其下游信号通路的信号转导功能的降低，导致胰岛素不能充分有效地激活其靶器官如，肝、骨骼肌、脂肪中的胰岛素受体，因而使胰岛素失去其生理效应或效应降低，由此造成机体代谢功能紊乱，而且还会同时造成体内胰岛素水平过高；因此，形成了一个特殊的现象，即体内胰岛素水平高于正常值，而胰岛素应有的生理效应却反而降低；临床实践显示，该疾患如未得到及时治疗，机体会由于胰岛素受体功能障碍而产生糖代谢紊乱，继而发生脂代谢紊乱、高血压、高粘血症、肥胖等继发病，这些继发病变进一步造成血管内皮功能障碍、血管损伤、动脉粥样硬化，以及心、脑、肾等重要脏器的损害；另一方面，由于机体对胰岛素的敏感性降低，体内胰岛素的合成和分泌代偿性增加，导致高胰岛素血症，而高胰岛素长期作用于机体，又会造成重要脏器和血管的重构和损伤，因此，胰岛素抵抗综合征是一种严重的基础性、根本性疾病，是相当一部分糖尿病、高脂血症、高粘血症、肥胖、高血压(包括继发的血管及重要脏器损伤)发病的基础和原因。换言之，若干病人的高血糖、高脂血症、肥胖、高血压等临床表现是表象，真正的病因是胰岛素抵抗。如临床干预中仅对症治疗高血糖、高脂血症、肥胖、高粘血症、高血压表征等而未从根本上解决胰岛素抵抗的问题，未能实现有效的对因治疗，则尽管某些临床指标如血糖、血脂、血液粘度、血压等可能得到改善，作为基础性原发疾病的胰岛素抵抗未能得到缓解的话，则上述的对症治疗的长期效果不佳，尤其是难以改善最重要的脏器损害。业内认为，只有从根本上解决胰岛素抵抗的问题，才是治愈该类常见且多发的重大疾病的对因治疗方案。事实上，近年来提出的精准医学观点，即针对不同个体发病机制的不同，个体化地针对病因加以对因治疗，而不再局限于以往的对症治疗，这实际上与祖国医学的理论不谋而合，这种概念的提出可以追溯到1000多年以前传统中医的“辨证施治”、“同症异治”、“异症同治”理论，例如，胰岛素抵抗可以导致糖尿病，还可导致高脂血症、肥胖、高血压等其他疾病，通过“异症同治”，针对所述的表面上不同病症的共同原发疾病(胰岛素抵抗综合征)，应用胰岛素增敏疗法解除胰岛素抵抗该共同的原发基础疾病，则高血糖、高脂血症、肥胖、高粘血症、高血压等继发病症即可迎刃而解；另一方面，临床研究表明，糖尿病患者并非均由胰岛素抵抗所引起，通过一系列检测，区分出有无胰岛素抵抗的不同亚群加以不同的治疗(“辨证施治”)，由胰岛素抵抗造成的亚群则适合施以胰岛素增敏疗法，此谓“同症异治”。从现代精准医学的角度看，本发明所关注的高血糖、高脂血症、肥胖、高血压等疾病，首先需作各项相关检验，其中由胰岛素抵抗而导致上述疾病的，应采取改善胰岛素抵抗的对因治疗方法。
临床实践表明，上述问题确已得到前人的关注，并提出了胰岛素增敏剂，专门用于治疗胰岛素抵抗综合征，为开展精准医学对因治疗提供了有力的技术手段，所述的药物即噻唑烷二酮类衍生物，其第一药物是曲格列酮(Troglitagone的商品名Rezulin)，该药物明一度被医学界寄予厚望，认为对于胰岛素抵抗综合征终于有了有效的对因治疗药物，然而，噻唑烷二酮类衍生物在临床应用中发生了严重的肝脏毒性和心血管事件，包括心衰和严重水肿等，只得自2000年起，撤出全球市场，至今尚无高效低毒的替代产品问世。
中草药益母草(唇形科植物，Herba Leonuri，Chinese Motherwort)最早收载于《神农本草经》、《本草纲目》等古籍中，有活血调经、利尿消肿的功效；中华人民共和国药典(2000年版)中用于月经不调、痛经、经闭、恶露不尽、水肿尿少、急性肾炎水肿等治疗，尚未见有关益母草碱晶体作为胰岛素增敏剂应用的报道。本申请的前期研究发现益母草具有除上述已知功能以外的一系列新用途，包括心血管保护作用等，并进一步分离、合成了其单体有效成分益母草碱，确定了益母草碱作为候选药物的若干新用途；但是，益母草碱的晶体结构至今未被解析，基于此，本申请的发明人拟提供益母草碱晶型的结构，并提供其优势药用晶型在制备药物中的新用途；所涉及的益母草碱晶体的用途具体为胰岛素增敏剂和脂代谢紊乱调节剂。所述的胰岛素增敏剂尤其适用治疗机体对胰岛素敏感性降低所导致的各种疾病，包括糖尿病和胰岛素抵抗综合症。
另一方面，动脉粥样硬化是导致心肌缺血、心肌梗死的重要基础性疾病，如能对其进行有效防止，可大幅降低心血管疾病的发病率和死亡率。
目前临床上主要通过降脂药物的应用来防治动脉粥样硬化。现有的临床降脂药物主要是他汀类药物，包括辛伐他汀、阿托伐他汀等。这类药物的缺陷在于长期用药导致的毒副作用十分严重。因此，寻找安全、有效、低毒的抗动脉粥样硬化药物具有重要的临床应用价值。
本发明所述的益母草单体成分益母草碱具有毒性低、安全性高的特点。本发明所描述的益母草碱晶体为此前未经报道的新型益母草碱晶型结构，尤其是其中的优势晶型不但结构稳定，具有优势药用晶型的特征，而且具有良好的降脂和抗动脉粥样硬化作用。本发明拟进一步提供上述益母草碱晶体在制备降脂和抗动脉粥样硬化作用的药物。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术的现状，提供一种中草药益母草提取物益母草碱的晶型结构及其在制备药物中的应用，尤其是在制备胰岛素增敏剂、降糖药物和脂代谢调节药物中的用途，所述的胰岛素增敏剂尤其适用治疗胰岛素抵抗综合征，所述的脂代谢调节药物尤其适用治疗脂代谢紊乱、高脂血症及其并发症。
具体的，本发明提供了中药益母草的活性成分益母草碱晶体及其在制备胰岛素受体增敏剂、降糖药物、治疗胰岛素抵抗综合症药物、降脂药物和抗动脉粥样硬化中的新的药用用途。
本发明的另一目的是将上述活性成分作为药物制剂的原料。
本发明的进一步目的是提供益母草碱晶体在制备治疗胰岛素敏感性降低所导致的各种疾病，包括糖尿病、胰岛素抵抗综合征和高脂血症药物组合物中的应用。
本发明所述的益母草碱是从益母草中分离得到的有效成分，并经过人工合成加以大量制备，其化学结构式为：
所述益母草碱英文名称为：Leonurine；化学名称：3，5-二甲氧基-4-羟基-苯甲酸(4-胍基)-1-丁酯。
本发明通过特定的方法，将益母草碱制备成6种不同晶型的晶体，具体为益母草碱硫酸盐的6种不同结构的晶体，其中2种为水合物，2种为无水晶型，一种为甲醇合物，一种为乙醇合物。
为便于描述和理解，本发明上述的6种益母草碱晶体分别命名为晶型A、晶型B、晶型C、晶型D、晶型E和晶型F。
上述益母草碱晶体分别具有如下特征：
(1)晶型A：
一水晶型(单晶结构证实)，方形块状晶体；熔融前无转晶行为，该晶型在120-150℃脱水转为无水晶型B，在约250℃开始分解。在0～95％相对湿度范围内，晶型未发生转变，吸湿性发生微小变化，表现为无或几乎无引湿性。在25℃混悬实验中，甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃、硝基甲烷、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、异戊醇、甲基叔丁基醚、甲苯、甲基异丁基酮、正己烷、正庚烷、乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、水等溶剂中；在50℃混悬实验中，在甲醇、乙醇、丙酮、甲基乙基酮、乙酸异丙酯、甲基叔丁基醚、甲苯、正己烷、正庚烷、乙醚、三氯甲烷、石油醚、水等溶剂中；25℃及50℃混合溶剂混悬和挥发中大部分溶剂条件下均可以得到晶型A；
(2)晶型B：
无水晶型，该晶型的熔点Tonset＝190.8℃，熔融前无转晶行为，在约230℃开始分解。在0～95％相对湿度范围内，晶型发生转变，转变为晶型A，吸湿性发生变化，表现为略有引湿性。在50℃混悬实验中，异丙醇、乙腈、四氢呋喃、硝基甲烷、乙酸乙酯、异戊醇、甲基异丁基酮、二氯甲烷等溶剂中；晶型A在120-150℃加热脱水条件下均可以得到晶型B；
(3)晶型C：
甲醇合物，熔融前有转晶行为，该晶型在120-160℃以上转为无水晶型B，在235℃开始分解；在0～95％相对湿度范围内，晶型发生转变，转变为晶型A。在25℃混合溶剂混悬实验中，甲醇和正己烷(V/V＝1/1)、甲醇和正庚烷(V/V＝1/1)、甲醇和甲基叔丁基醚(V/V＝1/1)、甲醇和甲苯(V/V＝1/1)、甲醇和甲基异丁基酮(V/V＝1/1)、甲醇和甲基叔丁基醚(V/V＝1/2)、甲醇和甲苯(V/V＝1/2)等；50℃混合溶剂混悬实验中，甲醇和甲基叔丁基醚(V/V＝1/2)、甲醇和甲苯(V/V＝1/2)、甲醇和甲基异丁基酮(V/V＝1/1)等条件下均可以得到晶型C；
(4)晶型D：
乙醇合物，该晶型在120-150℃脱水转为无水晶型B，在250℃开始分解；在0～95％相对湿度范围内，晶型发生转变，转变为晶型A。在50℃混合溶剂混悬实验中，乙醇和甲苯(V/V＝1/1)、乙醇和甲苯(V/V＝1/2)等条件下均可以得到晶型D；
(5)晶型E
一水晶型，熔融前有转晶行为，该晶型在120-150℃脱水转为无水晶型B，在250℃开始分解；在0～95％相对湿度范围内，晶型未发生转变，吸湿性发生变化，表现为略有引湿性。在25℃混合溶剂混悬实验中，异丙醇和水(V/V＝2/1)、异丙醇和水(V/V＝1/1)、异戊醇和水(V/V＝1/1)、四氢呋喃和水(V/V＝2/1)；在50℃混合溶剂混悬实验中，乙醇和水(V/V＝2/1)、异丙醇和水(V/V＝2/1)、异戊醇和水(V/V＝2/1)、硝基甲烷和水(V/V＝2/1)、甲苯和水和甲醇(V/V/V＝2/1/1)、甲醇和水(V/V＝1/1)、异丙醇和水(V/V＝1/1)、异丙醇和水(V/V＝1/1)等条件下均可以得到晶型E；
(6)晶型F：
无水晶型，该晶型的熔点Tonset＝192.2℃，熔融前有转晶行为，该晶型在120-150℃脱水转为无水晶型B，在250℃开始分解；在0～95％相对湿度范围内，晶型发生转变，转变为晶型A，吸湿性发生变化，表现为略有引湿性。将其在60℃时甲醇饱和溶液在4℃冷却结晶得到晶型F。
本发明中，根据上述的性能与成药性的关系，优选推荐加速实验(40℃/75％RH)最稳定的晶型A为益母草碱硫酸盐的药用晶型。
为了进一步鉴定上述6种益母草碱晶型的特征，本发明进行了X-射线粉末衍射(XRPD)分析，获得如下表1所述的XRPD数据：
表1、六种益母草碱晶体的XRPD数据：
本发明中，所述的6种益母草碱晶型特指具有上述XRPD特征的晶体。
本发明提供了上述益母草碱晶体用于制备治疗胰岛素抵抗综合征的药物的用途。
更具体的，本发明提供了一种新的胰岛素增敏剂，其中含从益母草中分离纯化得到的单体有效成分益母草碱晶体。该胰岛素增敏剂适用于治疗胰岛素敏感性降低所导致的各种疾病，尤其是作为降糖药物用于糖尿病的治疗糖尿病，也可用于治疗胰岛素抵抗综合征。
本发明的益母草碱晶体还适用于精准医学实践中应用于对因治疗由胰岛素抵抗所继发的疾病，包括但不限于高血糖、高脂血症、肥胖、高血压等疾病，本发明的实施方式中个体化地，对因治疗用于上述疾病中胰岛素敏感性降低所导致的病例的个体化治疗。
本发明的益母草碱晶体可作为药物原料，直接或与药学上通常用于制剂的固体或液体辅料混合制成适宜制剂，包括胶囊、片剂、散剂、混悬剂以及复方制剂。
本发明进行了药理学研究，结果显示，所述的益母草碱晶体具有提高机体胰岛素敏感性的作用，能增强机体对胰岛素的反应，增强胰岛素的生理效应，增加胰岛素受体的敏感性；可作为胰岛素增敏剂用于治疗胰岛素抵抗综合征，以及由胰岛素抵抗所造成的继发病症，包括但不限于高血糖、高脂血症、肥胖、高粘血症、高血压等。本发明所述的益母草碱晶体具有降低血糖和血脂的作用，还可用于治疗糖尿病和高脂血症，以及继发的动脉粥样硬化。本发明所述的益母草碱晶体还具有降低体重的作用，可用于治疗单纯性肥胖；益母草碱晶体具有增加胰岛素受体敏感性的作用，可作为胰岛素增敏剂用于治疗胰岛素抵抗综合征。
本发明中，进行了制备益母草碱晶体并对此加以鉴定的实验；
晶型筛选方法：
通过混悬结晶、挥发结晶、冷却结晶、反溶剂结晶、加热和冷却时的相转变、水吸附与解吸附实验等实验步骤/方法筛选、制备益母草碱能形成的晶型。
本发明中，对获得的益母草碱晶体研究、鉴定的方法包括：
热失重分析(TGA)方法，仪器型号：Netzsch TG 209F3，温度范围：30-400℃，扫描速率：10℃/min，吹扫气：25mL/min，保护气：15mL/min；
差示扫描量热分析(DSC)方法，仪器号：Perkin Elmer DSC 8500，温度范围：50-230℃，扫描速率：10℃/min，氮气流速：50mL/min；
X-射线粉末衍射(XRPD)方法，仪器型号：Bruker D8advance，靶：Cu Kα(40kV，40mA)，样品到检测器距离：30cm，扫描范围：3°-40°(2 theta值)，扫描步径：0.05s；
吸湿性分析(DVS)方法，仪器型号：SMS DVS Intrinsic，0～95％RH，温度：25℃FTIR方法仪器型号：Nicolet 6700，光谱范围：4000～400cm-1，分辨率：4cm-1，扫描次数：32，采用KBr压片法测定样品红外光谱，温度：25℃；
热失重分析(TGA)、拉曼光谱(Raman)、红外光谱(IR)等；
本发明中还通过加速稳定性实验方法筛选优势药用晶型并观察各晶型之间的转化。
通过上述方法，筛选、鉴定出所述的晶型A、晶型B、晶型C、晶型D、晶型E、晶型F六种益母草碱晶型，其中晶型A为优势药用晶型。
本发明进行了益母草碱A型晶体的胰岛素增敏作用实验：
给予实验大鼠不同剂量的所述的益母草碱A型晶体后，测定大鼠的胰岛素敏感性，制作胰岛素敏感性曲线，观察益母草碱A型晶体对胰岛素敏感性曲线的影响，并与对照组相比较，结果表明，所述的益母草碱A型晶体能使胰岛素敏感性曲线下移和左移，与对照组相比，益母草碱A型晶体增加大鼠对于胰岛素的敏感性，差别具有统计学显著性；
本发明的实验结果还表明，由于胰岛素通过胰岛素受体产生生理效应，使益母草碱A型晶体增加了机体对胰岛素的敏感性，进一步表明了益母草碱A型晶体的作用靶点在于胰岛素受体或其偶联的信号通路。
本发明提供了中草药益母草提取物益母草碱A型晶体在制备胰岛素增敏剂中的用途，所述的胰岛素增敏剂尤其适用对因治疗胰岛素抵抗综合征以及由胰岛素抵抗胰或胰岛素敏感性下降所引起的的继发病症，包括但不限于高血糖、高脂血症、肥胖、高粘血症、高血压等。
本发明还进行了益母草碱A型晶体降脂及防治动脉粥样硬化的实验：
通过给予ApoE基因敲除小鼠给予高脂饮食，造成高脂血症动物模型。在此模型中给予益母草碱A型晶体，观察其对脂代谢各指标的影响，并与阳性药Atorvastatin的效果作对照。实验结果表明，益母草碱A型晶体可显著降低上述动物血清中总胆固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白的水平；
本发明还在高胆固醇喂养新西兰大白兔动脉粥样硬化模型中研究了益母草碱A型晶体降脂作用，实验结果表明灌胃给予高脂兔子益母草碱A型晶体不同剂量可降低血清中总胆固醇以及甘油三酯水平；
在高血脂症肥胖恒河猴模型中，益母草碱A型晶体长期喂服后表现出降低血清总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL-C)的作用。
本发明提供新的益母草碱晶型的结构，并提供了其优势药用晶型在制备药物中的新用途；所涉及的益母草碱晶体可用于制备胰岛素增敏剂和脂代谢紊乱调节剂。
附图说明
图1是晶型B的差示扫描量热分析(DSC)图。
图2是晶型B的热失重分析(TGA)图。
图3是晶型B的拉曼光谱(Raman)图。
图4是益母草碱晶型E的XRPD图。
图5是晶型C的XRPD谱图。
图6是晶型D的XRPD谱图。
图7是晶型B的XRPD图。
图8是晶型F的XRPD图。
图9是晶型F的DSC图。
图10是晶型F的TGA图。
图11是晶型F的Raman光谱图。
图12是晶型A的DVS图，实验显示，晶型A无或几乎无引湿性，在0～95％RH范围内，晶型脱水吸水行为非常微弱。
图13是晶型A的粉末偏光照片(200倍)。
图14是晶型A的单晶偏光照片(100倍)。
图15是晶型A的XRPD图。
图16是益母草碱晶型A的分子结构。
图17是益母草碱晶型A分子的二维结构。
图18是益母草碱晶型A分子的三维结构。
图19是三个剂量的益母草碱A型晶体一次急性给药对胰岛素敏感性曲线的影响，其中，益母草碱A型晶体60mg/kg剂量组的胰岛素敏感性曲线在60分钟时间点显著下移(P＝0.038)，表明益母草碱A型晶体增加了大鼠对胰岛素的敏感性。
图20是三个剂量的益母草碱A型晶体连续给药7天对胰岛素敏感性曲线的影响，其中，在30分钟时间点，益母草碱A型晶体30和60mg/kg/d剂量组的胰岛素敏感性曲线显著下移(与对照组相比，P＝0.004和P＝0.018)；在60分钟时间点，益母草碱A型晶体30、60和120mg/kg/d等三个剂量组的胰岛素的敏感性曲线显著下移(与对照组相比，P＝0.011、P＝0.018和P＝0.017)；在90分钟时间点，益母草碱A型晶体30和60mg/kg/d剂量组的胰岛素的敏感性曲线显著下移(与对照组相比，P＝0.009和P＝0.008)。
图21是慢性给予益母草碱A型晶体3周对大鼠体重的影响，其中，可在第4周(停药一周后)观察到益母草碱A型晶体在60mg/kg/d剂量时显著地降低大鼠的体重(与溶剂对照组相比P＝0.033)；而益母草碱A型晶体120mg/kg/d剂量组则有体重下降的趋势，但其差异尚未达到统计学上的显著性(与溶剂对照组相比P＝0.057)。
图22是慢性给予益母草碱A型晶体3周对大鼠空腹血糖的影响，其中，在连续给药3周后，益母草碱A型晶体在120mg/kg/d剂量时显著地降低了大鼠的空腹血糖(与溶剂对照组相比P＝0.009)；而益母草碱A型晶体60mg/kg/d剂量组则有空腹血糖下降的趋势，但其差异尚未达到统计学上的显著性(与溶剂对照组相比P＝0.083)。在第4周则可观察到，益母草碱A型晶体在60mg/kg/d和120mg/kg/d的剂量下均降低了空腹血糖(与溶剂对照组相比P分别等于0.016和0.043)。
图23是慢性给予益母草碱A型晶体3周对大鼠葡萄糖耐量试验的影响，其中，益母草碱A型晶体可使葡萄糖耐量曲线在15分钟和60分钟时间点均发生显著下移；在15分钟时间点，葡萄糖耐量曲线下移，益母草碱A型晶体在30mg/kg/d的计量下可降低血糖的升高程度，提高机体对葡萄糖的耐受性(与溶剂对照组相比P＝0.012)；在60分钟时间点，葡萄糖耐量曲线也发生下移，益母草碱A型晶体在30mg/kg/d和120mg/kg/d的计量下可降低血糖的升高程度，提高机体对葡萄糖的耐受性(与溶剂对照组相比P分别等于0.026和0.005)。
图24，慢性连续给予益母草碱A型晶体可在高脂血症小鼠中降低血清总胆固醇(TC)水平，其中：Total cholesterol，总胆固醇(TC)；Control，对照组；Model，模型组；Leonurine，益母草碱A型晶体组；***，与模型组相比，P＜0.001。
图25，益母草碱A型晶体(中剂量组)可以降低ApoE基因敲除小鼠血清中的甘油三酯水平，其中：Total triglycerides，血清甘油三酯(TG)；Control，对照组；Model，模型组；Leonurine，益母草碱A型晶体组；*，与模型组相比，P＜0.05；**，与模型组相比，P＜0.01；***，与模型组相比，P＜0.001。
图26，益母草碱A型晶体(中剂量组)可以降低ApoE基因敲除小鼠血清中的低密度脂蛋白水平，其中：LDL-cholesterol，低密度脂蛋白(LDL)；Control，对照组；Model，模型组；Leonurine，益母草碱A型晶体组；**，与模型组相比，P＜0.01；***，与模型组相比，P＜0.001。
图27，慢性连续给予益母草碱A型晶体12周可在新西兰大白兔高脂血症模型中降低血清总胆固醇(TC)水平，其中：Total cholesterol，总胆固醇(TC)；Control，对照组；Model，模型组；Leonurine，益母草碱A型晶体组；**，与模型组相比，P＜0.01；***，与模型组相比，P＜0.001。
图28，慢性连续给予益母草碱A型晶体12周可在新西兰大白兔高脂血症模型中降低总甘油三酯水平，其中：Total triglycerides，血清甘油三酯(TG)；Control，对照组；Model，模型组；Leonurine，益母草碱A型晶体组；***，与模型组相比，P＜0.001。
图29，颈动脉粥样斑块显微超声图，显示高脂饮食同时给药8周后颈动脉长轴切面观察各组颈总动脉分叉处的粥样斑块形成情况，箭头指向血管增厚处的斑块。模型组血管有明显增厚，益母草碱A型晶体给药组斑块厚度明显降低，并呈现出剂量依赖性；
其中：NC，正常饮食组；MD，动脉粥样硬化模型组；ST，Atorvastatin组；AS，阿司匹林组；SCM198-L，益母草碱A型晶体低剂量组；SCM198-M，益母草碱A型晶体中剂量组；SCM198-H，益母草碱A型晶体高剂量组；白色标尺表示1mm。
图30，颈动脉粥样斑块显微超声舒张末期最大斑块处内膜-中膜厚度(IMT)数据的统计比较图，模型组斑块厚度明显增厚，益母草碱A型晶体中、高剂量组可降低斑块厚度；
其中：NC，正常饮食组；MD，动脉粥样硬化模型组；ST，Atorvastatin组；AS，阿司匹林组；SCM198 4mg/kg/d，益母草碱A型晶体低剂量组；SCM198 8mg/kg/d，益母草碱A型晶体中剂量组；SCM198 16mg/kg/d，益母草碱A型晶体高剂量组；#P＜0.01，与正常组比较；*P＜0.05，与模型组比较。
具体实施方式
以下例举实施例更具体地说明本发明，实施例所示制备、鉴定益母草碱晶体的方法、给药方式、制剂形式、操作条件和顺序等可在不脱离本发明精神的限定内适当变更。
实施例1混悬结晶方法制备益母草碱晶体
取约20g硫酸益母草碱原料药，分别在25℃和50℃条件下与1mL溶剂搅拌平衡至少24h，随后，分别过滤溶液，固体部分在空气中干燥10min，随后做X-射线粉末衍射(XRPD)检测，如观察到测出的XRPD谱图与原料谱图不同，则继续对此固体进行其他方面的表征(如DSC、TGA、IR、DVS等)；液体部分在真空中将溶剂挥干利用重量分析法测定原料药在溶剂中的近似溶解度；溶剂挥干后析出的固体做XRPD检测，如观察到测出的XRPD谱图与原料谱图不同，则继续对此固体进行其他方面的表征(如DSC、TGA、IR、DVS等)；
重量分析法：准确取一定体积(一般为0.5mL)的滤液放入干燥且已称好重量的容器中，记为M0mg，于真空中挥干溶剂后再准确称量其总重量，记为M1mg，则析出的固体质量为M1-M0，溶剂的体积为V mL，据此原料在该溶剂中的近似溶解度为X＝(M1-M0)/V mg/mL。
表2为在50℃条件下溶剂中混悬结晶结果。
表2、在50℃条件下溶剂中混悬结晶结果：
其中：(1)用“-”表示未检测到与原料有变化；(2)若检测到与原料有变化，DSC标注Onset温度，TGA标注失重温度及其百分数，且分别标出相应谱图编号。
通过上述方法尤其是溶剂组合获得到如表1所示XRPD数据特征的益母草碱B型晶体，其DSC、TGA和Raman光谱数据特征分别如图1、图2和图3所示；上述数据提供了鉴定益母草碱B型晶体的依据。
实施例2挥发结晶方法制备益母草碱晶体
备2组硫酸益母草碱样品，每组称取96份，每份约3mg，参照表3设计加入溶剂，混匀，溶解。分别在25℃和50℃缓慢挥发至干(该过程需要24h至几天)，然后收集固体，然后作XRPD、DSC、TGA和Raman光谱等测试分析；其中不溶解的在该条件下再作前述的混悬实验。
表3缓慢挥发溶剂表(显示挥发结晶方法制备益母草碱晶体的溶剂组合方案)：
其中：MeOH＝甲醇；EtOH＝乙醇；i-PrOH＝异丙醇；IAA＝异戊醇；MEK＝甲乙酮；ACN＝乙腈；MTBE＝甲基叔丁基醚；MIBK＝甲基异丁基酮；NM＝硝基甲烷；THF＝四氢呋喃；EA＝乙酸乙酯；Hep＝正庚烷；Hex＝正己烷
实验结果：按照表3所示的溶剂组合方案，挥发溶剂可得到如下表4所示数种益母草碱晶体：
表4、根据表3所示溶剂组合方案获得的25℃缓慢溶剂挥发结晶实验结果：
其中：(1)用“-”表示未检测到与硫酸益母草碱原料相比有晶型的变化；(2)若检测到与硫酸益母草碱原料相比有晶型的有变化，括号内相应XRPD谱图编号；(3)空白表示由于样品无法溶清而做混悬结晶。
如表4所示，根据表3所列的溶剂组合方案，在25℃条件下缓慢挥发缓慢挥发溶剂，可在4种溶剂组合方案中得到益母草碱的E型晶体，此晶体具有表1和图4所示的XRPD图谱特征；
根据表3所示溶剂组合方案，其中样品无法溶请的样本作混悬结晶，其结果如表5所示，其中的混悬结晶试验可得到晶型C和晶型D等2种晶型；鉴定晶型C的XRPD数据如表1所示，其谱图如图5所示；鉴定晶型D的XRPD数据如表1所示，其谱图如图6所示。
表5、根据表3所示溶剂组合方案获得的25℃混悬实验结果
其中：(1)用“-”表示未检测到与硫酸益母草碱原料相比有变化；(2)若检测到与原料有变化，则鉴定其晶型并在括号中标出其XRPD谱图编号；(3)空白表示由于样品溶清而做溶剂挥发结晶。
在本实施例中，通过设计不同的溶剂组合方案，在排除不能产生(与所合成的硫酸益母草碱原料相比)新的晶型的溶剂组合方案后，在可溶解的溶剂组合方案中以挥发结晶方法制备益母草碱晶体，获得益母草碱晶型E；在样品无法溶清的样本中则作混悬结晶，获得益母草碱晶型C和D；本实施例中，不同益母草碱晶型的鉴定以XRPD数据及谱图为准。在50℃条件下根据表3所示溶剂组合方案重复溶剂缓慢挥发结晶实验，其中益母草碱不能溶清的样本则作混悬结晶试验。实验结果表明，按照表3所示的溶剂组合方案，挥发溶剂可得到如下表6所示数种益母草碱晶体。
表6、根据表3所示溶剂组合方案获得的50℃缓慢挥发结晶实验结果：
其中：(1)用“-”表示未检测到与原料有变化；(2)若检测到与原料有变化，标出所鉴定的晶型并在括号中标出其XRPD谱图编号；(3)空白表示由于益母草碱样品无法溶清而做混悬结晶试验。
在表6所示的实验中，益母草碱样品无法溶清的样本继续在50℃条件下作混悬结晶试验，其结果如表7所示：
表7、根据表3所示溶剂组合方案获得的50℃混悬结晶实验结果
其中：(1)用“-”表示未检测到与硫酸益母草碱原料相比有变化；(2)若检测到与硫酸益母草碱原料相比有变化，则鉴定其晶型并在括号中标出其XRPD谱图编号；(3)空白表示由于样品溶清而作溶剂挥发结晶。
上述实验结果表明，在50℃条件下，根据表3的溶剂组合方案实验，获得的了与25℃条件下明显不同的益母草碱晶型组合，具体为在挥发结晶实验中获得了益母草碱晶型B和晶型E(如表6所示)；而在混悬结晶实验中则获得4种益母草碱的晶型，具体为晶型B、C、D和E(如表7所示)；所有上述益母草碱晶型的鉴定以所示的相应XRPD数据及图谱为准。
实施例3从热的浓溶液中冷却结晶
取约6mg硫酸益母草碱原料，溶解在溶剂中，加热至60℃，直到完全溶解。然后冷至室温，过滤，测定固体，或放入4℃冰箱直待晶体析出；
表8、热的浓溶液中冷却结晶结果
其中：(1)用“-”表示未检测到与硫酸益母草碱原料相比有变化；(2)若检测到与硫酸益母草碱原料相比有变化，则用XRPD、DSC、TGA和Raman等方法鉴定并标出相应的谱图编号，其中DSC标注Tonset温度，TGA标注开始失重温度；
通过上述实验，在MeOH热溶液中，通过冷却结晶得到益母草碱的晶型F，并用XRPD、DSC、TGA和Raman等方法加以测定，确认为晶型F；晶型的鉴定以XRPD数据及谱图为准。
实施例4益母草碱晶型A的单晶解析
通过对合成的硫酸益母草碱原料药的DVS实验(如图12所示)结果显示，该原料药本身为一水晶型，相对湿度从0～95％，原料药吸湿约0.15％，有引湿性；在本发明中命名为益母草碱晶型A，其为一水晶型，方形块状晶体(如图13所示)，熔融前无转晶行为，该晶型在120～150℃脱水转为无水晶型B，在约250℃开始分解。在0～95％相对湿度范围内，晶型未发生转变，吸湿性发生微小变化，表现为无或几乎无引湿性，在25℃混悬实验中，甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃、硝基甲烷、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、异戊醇、甲基叔丁基醚、甲苯、甲基异丁基酮、正己烷、正庚烷、乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、水等溶剂中；在50℃混悬实验中，在甲醇、乙醇、丙酮、甲基乙基酮、乙酸异丙酯、甲基叔丁基醚、甲苯、正己烷、正庚烷、乙醚、三氯甲烷、石油醚、水等溶剂中；25℃及50℃混合溶剂混悬和挥发中大部分溶剂条件下均可以得到晶型A；图12显示了晶型A的DVS图，吸湿性实验结果显示，晶型A无或几乎无引湿性，在0～95％RH范围内，晶型脱水吸水行为非常微弱；图14显示晶型A的单晶偏光照片，晶型A的单晶可在乙腈/水或甲乙酮/水或丙酮/水＝2/1(V/V)溶液中，或乙醇/水或丙酮/水或甲乙酮/水或乙腈/水或四氢呋喃/水＝1/1(V/V)，或甲基叔丁基醚/水/甲醇＝2/2/1(V/V/V)中溶解，放于室温中缓慢挥发得到；将分离得到的益母草碱A型单晶作X-射线衍射分析，其数据如表1所示，其XRPD图如图15所示；
用Bruker Smart Apex II型单晶X射线衍射仪对益母草碱A型单晶作结构测定，仪器参数：光源：Mo靶；X射线：Mo-K
探测器：CCD面探测器；分辨率：
电流电压：50kV，30mA；曝光时间：10s；面探测器至样品距离：50mm；测试温度：296(2)K，通过分析益母草碱A型单晶的X-射线衍射数据解析其结构；
结构解析与精修过程：采用SAINT程序对衍射数据进行积分还原后，采用SADABS程序对数据进行经验吸收校正；采用SHELXT2014通过直接法解析单晶结构，并采用最小二乘法对结构进行精修，氢原子精修过程采取各向同性计算处理获得，O、N上氢原子通过残余电子密度获得，C-H上氢原子通过计算加氢获得，并采取骑式模型对其作精修处理；
上述测定及数据分析，得如表9所示的益母草碱A型晶体单晶数据；分子中所有原子的空间位置参数如表10所示，根据上述数据，描绘出益母草碱A型晶体的分子结构(如图16所示)，益母草碱A型晶体为半硫酸盐一水合物，为无色片状晶体(如图14所示)，属于单斜晶系，其空间群为P-1，不对称单元中包含2个益母草碱分子，1个硫酸根离子以及2个水分子，两个益母草碱分子的胍基与硫酸根的负离子形成离子键三聚体，此三聚体与三聚体之间通过胍基和硫酸根的氢键作用形成二维结构，形成多聚体分子平面层(如图17所示)，多层多聚体分子平面以平行的形式叠加排列，其二维结构分子平面通过水分子的氢键作用形成益母草碱A型晶体的三维层叠网状结构(如图18所示)，三维结构显示，胍基和硫酸根形成的亲水层与益母草碱疏水基团交替排列。
表9、益母草碱晶型A单晶数据
表10、益母草碱晶型A单晶分子中所有原子的空间位置参数(功能原子坐标和等方性或相当等方性位移参数)
实施例5益母草碱各种晶型的加速稳定性实验和优势晶型的选择
在40℃，相对湿度为70％的稳定性箱中放置10天，晶型A、E保持不变，晶型B、晶型C、晶型D、晶型F均转化为晶型A；
在40℃，相对湿度为60％-80％条件下，为期10天的稳定性试验(如表11所示)结果表明，益母草碱A型晶体最稳定，无转晶行为，引湿性不明显；而晶型B、晶型C、晶型D、晶型F均发生转晶；晶型E尽管未发生转晶，但引湿性较强，其引湿性约为晶型A的10倍，因此，益母草碱晶型A为优选药用晶型，其为一水合物，性能稳定，可以通过多种条件重复获得。
表11、益母草碱各种新晶型稳定比较表
其中：RH，相对湿度
实施例6一次急性给予益母草碱A型晶体提高大鼠胰岛素敏感性实验
采用32只SD雄性大鼠(体重为180～220g)，随机分为4组，分别给予对照溶剂和三个不同剂量的益母草碱A型晶体，对照溶剂组给予等体积的二甲亚砜(DMSO)，用药组分别按30mg/kg、60mg/kg和120mg/kg等三个剂量给药，每组8只大鼠，益母草碱A型晶体分别以30mg/ml、60mg/ml和120mg/ml的浓度溶解于DMSO中，每个大鼠在给药时得到的溶剂体积均为每公斤体重1毫升，给药途径为灌胃，灌胃前称重，取尾静脉血测定血糖；每只大鼠在给药或对照溶剂后1小时作胰岛素敏感性试验，试验选取的胰岛素剂量为每公斤体重0.5单位，胰岛素经腹腔注射，在注射胰岛素之前以及注射后15、30、60、90、120分钟分别测定血糖，采用SPSS11.5统计软件分析数据，实验结果均以平均数±标准误差(mean±SEM)表示，多组间两两比较采用单因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)法检验，P＜0.05则认为组间有显著性差异；实验结果显示(如图19所示)，在给予60mg/kg剂量益母草碱A型晶体时可见大鼠胰岛素敏感性曲线的下移，在曲线的60分钟时间点，该下移达到统计学的显著性(P＝0.038)，表明益母草碱A型晶体能增加大鼠对胰岛素的敏感性；与DMSO对照组相比，在120mg/kg剂量时，在60分钟时间点益母草碱A型晶体有一个下移胰岛素敏感性曲线的趋势，但未见统计学的显著性差别(P＝0.079)；在益母草碱A型晶体30mg/kg剂量组，其胰岛素敏感性曲线与对照组基本重合，无显著性差别。
实施例7慢性连续给予益母草碱A型晶体提高大鼠的胰岛素敏感性实验
采用20只SD雄性大鼠(体重为180～220g)，随机分为4组，分别给予对照溶剂和三个不同剂量的益母草碱A型晶体；对照溶剂组给予等体积的DMSO，用药组分别按30mg/kg、60mg/kg和120mg/kg等三个剂量给药，每组5只大鼠，益母草碱A型晶体分别以30mg/ml、60mg/ml和120mg/ml的浓度溶解于DMSO中，使每个大鼠在给药时得到的溶剂体积均为每公斤体重1毫升，给药途径为灌胃，每天给药或对照溶剂1次，连续给药7天，在第7天作胰岛素敏感性试验，试验当天仍给药或对照溶剂，灌胃前称重，取尾静脉血测定血糖；每只大鼠在给药或对照溶剂后的1小时作胰岛素敏感性试验，在作此胰岛素敏感性试验前4小时不喂大鼠食物，使其空腹，但仍给予饮水；胰岛素敏试验选取的胰岛素剂量为每公斤体重0.75单位，胰岛素经腹腔注射，在注射胰岛素之前以及注射后15、30、60、90、120分钟分别测定血糖，采用SPSS11.5统计软件分析数据，实验结果均以平均数±标准误(mean±SEM)表示，多组间两两比较用单因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)法检验，P＜0.05则认为组间有显著性差异；实验结果显示(如图20所示)，在给予30、60和120mg/kg/d三个剂量的益母草碱A型晶体时均可见大鼠胰岛素敏感性曲线的下移，在曲线的30分钟、60分钟和90分钟三个时间点，均显示不同剂量的益母草碱A型晶体显著性下移胰岛素敏感性曲线的效应，在30分钟时间点，与对照组相比，益母草碱A型晶体在30和60mg/kg/d剂量组均提高胰岛素的敏感性(P＝0.004和P＝0.018)；在60分钟时间点，与对照组相比，益母草碱A型晶体在30、60和120mg/kg/d三个剂量组均提高胰岛素的敏感性(P＝0.011、P＝0.018和P＝0.017)；在90分钟时间点，与对照组相比，益母草碱A型晶体在30和60mg/kg/d剂量组均提高胰岛素的敏感性(P＝0.009和P＝0.008)，上述实验结果表明，慢性连续给予益母草碱A型晶体可提高胰岛素敏感性。
实施例8慢性连续给予益母草碱A型晶体降低大鼠体重、空腹血糖并增加糖耐量实验
选用40只SD雄性大鼠(体重为180～220g)，随机分为4组，分别给予对照溶剂和三个不同剂量的益母草碱A型晶体；对照溶剂组给予等体积的DMSO，用药组分别按30mg/kg、60mg/kg和120mg/kg等三个剂量给药，每组10只大鼠，益母草碱A型晶体分别以30mg/ml、60mg/ml和120mg/ml的浓度溶解于DMSO中，使每个大鼠在给药时得到的溶剂体积均为每公斤体重1毫升，给药途径为灌胃，每天给药或对照溶剂1次，连续给药3周，在第3周测体重及空腹血糖，试验前空腹约12小时(断食不断水)，试验当天仍按原方案给药一次，给药一小时后测血糖，称体重。停药一周后，在第4周再测一次空腹血糖和体重。采用SPSS11.5统计软件分析数据，实验结果均以平均数±标准误(mean±SEM)表示，多组间两两比较用单因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)法检验，P＜0.05则认为组间有显著性差异；
实验结果表明，慢性给予益母草碱A型晶体3周后，可在第4周(停药一周后)观察到益母草碱A型晶体在60mg/kg/d剂量时显著地降低大鼠的体重(与溶剂对照组相比P＝0.033)；而益母草碱A型晶体120mg/kg/d剂量组则有体重下降的趋势，但其差异尚未达到统计学上的显著性(与溶剂对照组相比P＝0.057)(如图21所示)；
空腹血糖测定结果显示，在连续给药3周后，益母草碱A型晶体在120mg/kg/d剂量时显著地降低了大鼠的空腹血糖(与溶剂对照组相比P＝0.009)；而益母草碱A型晶体60mg/kg/d剂量组则有空腹血糖下降的趋势，但其差异尚未达到统计学上的显著性(与溶剂对照组相比P＝0.083)(图22)。在第4周则可观察到，益母草碱A型晶体在60mg/kg/d和120mg/kg/d的剂量下均降低了空腹血糖(与溶剂对照组相比P分别等于0.016和0.043)(如图22所示)；
选用18只SD雄性大鼠(体重为180～220g)，随机分为4组，分别给予对照溶剂和三个不同剂量的益母草碱A型晶体；对照溶剂组给予等体积的DMSO，用药组分别按30mg/kg、60mg/kg和120mg/kg等三个剂量给药，益母草碱A型晶体分别以30mg/ml、60mg/ml和120mg/ml的浓度溶解于DMSO中，使每个大鼠在给药时得到的溶剂体积均为每公斤体重1毫升，给药途径为灌胃，每天给药或对照溶剂1次，连续给药3周，在第3周作葡萄糖耐量试验，葡萄糖耐量试验前空腹约12小时(断食不断水)，试验当天仍按原方案给药一次，给药一小时后开始试验。试验前测血糖，称体重。葡萄糖耐量试验方法：每个大鼠按2g/kg体重腹腔注射葡萄糖(25％葡萄糖，8ml/kg)，注射后15、30、60、90、120分钟测葡萄糖负荷后血糖。葡萄糖耐量试验后停药一周后，在第4周再测一次空腹血糖和体重。采用SPSS11.5统计软件分析数据，实验结果均以平均数±标准误(mean±SEM)表示，多组间两两比较用单因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)法检验，P＜0.05则认为组间有显著性差异。葡萄糖耐量试验显示，葡萄糖耐量曲线在15分钟和60分钟时间点均发生显著下移；在15分钟时间点，葡萄糖耐量曲线下移，益母草碱A型晶体在30mg/kg/d的计量下可降低血糖的升高程度，提高机体对葡萄糖的耐受性(与溶剂对照组相比P＝0.012)(图23)；在60分钟时间点，葡萄糖耐量曲线也发生下移，益母草碱A型晶体在30mg/kg/d和120mg/kg/d的计量下可降低血糖的升高程度，提高机体对葡萄糖的耐受性(与溶剂对照组相比P分别等于0.026和0.005)(如图23所示)；
上述实验结果表明，益母草碱A型晶体可降低体重、降低空腹血糖，并且提高葡萄糖耐量。基于前期的毒理学研究表明，益母草碱A型晶体的毒性非常低，上述给药剂量均远低于其中毒剂量，因此所述益母草碱A型晶体作用均可认为是具有疾病防治用途的治疗作用而非毒性作用。
实施例9慢性连续给予益母草碱A型晶体可在高脂血症小鼠中产生降脂效应
取雄性C57BL/6J小鼠15只(6-8周)、雄性APOE敲除小鼠75只(8-10周)。C57BL/6J小鼠以正常饲料喂养；ApoE敲除小鼠以正常饲料/高脂饲料1/1的比例适应性喂养一周，按随机数表分为以下6组：
1)对照组(C57BL/6J，普通饲料，n＝15)：三蒸水，灌胃；
2)模型组(溶剂对照，ApoE，高脂饲料，n＝15)：三蒸水，灌胃；
3)益母草碱A型晶体低剂量组(ApoE，高脂饲料，n＝15)：10mg/kg/day，灌胃；
4)益母草碱A型晶体中剂量组(ApoE，高脂饲料，n＝15)：20mg/kg/day，灌胃；
5)益母草碱A型晶体高剂量组(ApoE，高脂饲料，n＝15)：40mg/kg/day，灌胃；
6)Atorvastatin组(阳性药对照组，ApoE，高脂饲料，n＝15)：3mg/kg/day，灌胃；
每组每周给药前称体重，并根据该体重计算该周给药量，室温24±1℃空气湿度55±5％，给予充足的水和饲料，连续给药4周后，小鼠按体重用戊巴比妥钠麻醉，眼球取血，每只取约0.5毫升用于血液学检测，血液学检测：将各组小鼠血液静置2小时后，每分钟3000转离心10分钟，取上清，血清样本采用全自动生化分析仪测定血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)的含量；统计学分析：用GraphPad Prism 5软件进行数据分析及作图，实验结果均以平均数±标准差(mean±SD)表示，多组间两两比较使用单因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)或者Student’s t检验。如果P＜0.05表示组间具有显著性的差异，数据差异性表示方法如下：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，实验结果表明，ApoE基因敲除小鼠给予高脂饲料后，其血清总胆固醇水平显著高于正常饮食C57BL/小鼠，与高脂饮食的(溶剂对照)模型组相比，阳性药Atorvastatin组和益母草碱A型晶体(中剂量)均可以降低动物血清中的总胆固醇水平；
实验结果还表明，ApoE基因敲除小鼠给予高脂饮食后，其血清甘油三酯水平显著高于正常饮食C57BL/小鼠，当与单给高脂饮食的(溶剂治疗)模型组相比，阳性药Atorvastatin组和益母草碱A型晶体(中剂量组)均可以显著降低ApoE基因敲除小鼠血清中的甘油三酯水平(如图25所示)；
实验结果还表明，ApoE基因敲除小鼠给予高脂饮食后，其血清低密度脂蛋白水平显著高于正常饮食C57BL/小鼠，当与单给高脂饮食的(溶剂治疗)模型组相比，阳性药Atorvastatin组和益母草碱A型晶体(中剂量组)均可以显著降低ApoE基因敲除小鼠血清中的低密度脂蛋白水平(如图26所示)；
上述实验结果表明，慢性连续给予益母草碱A型晶体4周可在ApoE基因敲除高脂血症小鼠中降低血清总胆固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白的水平，鉴于胆固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白均为导致动脉粥样硬化等心血管疾病的独立危险因子，益母草碱A型晶体的上述作用可用于制备防治以高胆固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白为特征的脂代谢紊乱疾病，进而降低继发的动脉粥样硬化等心血管疾病的危险性。
实施例10慢性连续给予益母草碱A型晶体可在兔高脂血症模型中降低总胆固醇和甘油三脂水平
雄性新西兰大白兔48只(1.8-2.2kg)，动物房适应一周。期间，动物自由饮食，灯光12小时交替照明，按随机数表分为6组：
1)对照组(普通饲料，n＝8)：三蒸水，灌胃；
2)模型组(高脂饲料，n＝8)：三蒸水，灌胃；
3)益母草碱A型晶体低剂量组(高脂饲料，n＝8)：4mg/kg/day，灌胃；
4)益母草碱A型晶体中剂量组(高脂饲料，n＝8)：8mg/kg/day，灌胃；
5)益母草碱A型晶体高剂量组(高脂饲料，n＝8)：16mg/kg/day，灌胃；
6)Atorvastatin组(阳性药组，高脂饲料，n＝8)：2.5mg/kg/day，灌胃；
每组每周给药前称体重，并根据该体重计算该周给药量。室温24±1℃，空气湿度55±5％，给予充足的水和饲料。动物给药第12周后，禁食12小时，耳缘静脉取血，采血量2ml用于血液学检测。血液学检测：将各组动物血液静置2小时后，3000转/分钟离心10分钟，取血清。血清样本严格按照南京建成生物工程研究所推荐的测试步骤进行检测，分别采用酶标仪以及全自动生化分析仪测定血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)以及高密度脂蛋白胆固醇(HDL)的含量。统计学分析：用GraphPad Prism 5软件进行数据分析及作图，实验结果均以平均数±标准差(mean±SD)表示。多组间两两比较使用单因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)或者Student’s t检验。如果P＜0.05表示组间具有显著性的差异，数据差异性表示方法如下：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；
实验结果表明，新西兰大白兔给予高脂饮食后，其血清总胆固醇水平显著高于正常饮食对照组；同时，与单给高脂饮食的模型组相比，益母草碱A型晶体高剂量组可降低动物血清中的总胆固醇水平(如图27所示)，而阳性药尚未对血清的总胆固醇水平产生具有统计学意义的差异，表明益母草碱A型晶体在高剂量情况下可产生优于已知药物Atorvastatin的降低总胆固醇水平的作用(如图27所示)；
此外，新西兰大白兔给予高脂饮食后，其血清总甘油三酯水平显著高于正常饮食对照组，同时，与单给高脂饮食的模型组相比，益母草碱A型晶体中剂量和高剂量组均可降低动物血清中的总甘油三酯水平(如图28所示)，阳性药Atorvastatin也可产生总甘油三酯水平的作用；
上述实验结果表明，新西兰大白兔在给予高脂饮食后，极易造成高脂血症，而长期慢性给予益母草碱A型晶体可明显地改善其高脂血症状态，包括降低动物血清中的总胆固醇水平和总甘油三酯水平，并显示出优于已知药物Atorvastatin的作用。
实施例11慢性连续给予益母草碱A型晶体可在兔高脂血症模型中抑制动脉粥样硬化斑块的形成实验
取雄性新西兰兔42只，体重2.0～2.5kg，先以普通饲料喂养1周，以适应环境，一周后开始正式试验；以高脂饲料(含1％胆固醇；SF00-221，SpecialtyFeed，Australia)喂饲家兔8周，建立动脉粥样硬化家兔模型；动物随机分为七组，每组6只，分别为正常饮食组(NC组)、动脉粥样硬化模型组(MD组)、降脂阳性药阿托伐他汀(Atorvastatin，ST)组，2.5mg/kg/day)、抗炎阳性药阿司匹林组(ASP组，25mg/kg/day)、益母草碱A型晶体低剂量组(SCM198-L组，4mg/kg/day)、益母草碱A型晶体中剂量组(SCM198-M组，8mg/kg/day)、益母草碱A型晶体高剂量组(SCM198-H组，16mg/kg/day)；上述各组动物在开始给予高脂饲料时，同步开始按上述方案给予各种药物或对照溶剂(NC和MD组)。每天给药一次，连续8周，期间每周称重一次，以调整给药剂量。每日光照12小时，室温24±1℃，空气湿度55±5％，给予充足的水和饲料；颈动脉斑块的高频超声检测：于第8周实验末期，使用高频显微超声影像系统Vevo770探测颈动脉粥样硬化斑块；3％戊巴比妥钠30mg/kg剂量麻醉实验兔，以二维超声于颈动脉长轴切面观察颈总动脉分叉处斑块并测量其血流速度，选用探头为RMV707B(分辨率30MHz)，调整探头方向，使之与颈动脉的夹角小于60°，以获得长轴切面，于舒张末期最大斑块处测量内膜-中层厚度(intima-media thickness，IMT)，IMT的测量方法是取管腔-内膜回声至中膜-外膜回声之间的垂直距离，探测右颈总动脉分叉近端动脉粥样斑块：对比分析颈动脉超声影像图及斑块处最大IMT，评价分析动脉粥样斑块的形态，应用Vevo770显微超声仪分析测量软件分析数据，所有测量均在同一部位重复两遍，取平均值，实验结果显示MD组平均IMT明显高于正常组，益母草碱A型晶体能显著的抑制高脂所致的IMT增长并呈现出一定的剂量依赖性(如图29、图30所示)，表明益母草碱A型晶体对动脉粥样斑块的形成有抑制作用，并呈现出剂量依赖性。
实施例12
取药物有效量的所述的益母草碱A型晶体，添加适量微晶纤维素、淀粉或其他赋形剂或助溶剂，按常规方法分别制成胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、丸剂等内服药物剂型。
Claims (23)
1.一种益母草碱半硫酸盐一水合物晶体，其X-射线粉末衍射图谱与图15实质相同。
2.根据权利要求1所述的晶体，其特征在于，所述的益母草碱半硫酸盐一水合物晶体，为无色片状晶体，属三斜晶系，其空间群为P-1，晶胞参数为a=7.857(5) Å、b=13.913(8) Å、c=17.314(10) Å、α=103.993(12)°、β=99.612(12)°、γ=100.482(15)，晶胞体积为1761.2(18) ų。
3.根据权利要求1所述的晶体，其特征在于，两个益母草碱分子的胍基与硫酸根的负离子形成离子键三聚体，该三聚体与三聚体之间通过胍基和硫酸根的氢键作用形成二维结构，形成多聚体分子平面层。
4.根据权利要求3所述的晶体，其特征在于，所述多聚体分子平面层为如下的多聚体分子平面层：
5.根据权利要求1所述的晶体，其特征在于，所述的益母草碱半硫酸盐一水合物晶体的多层多聚体分子平面以平行的方式叠加排列，其二维结构分子平面通过水分子的氢键作用形成益母草碱半硫酸盐一水合物晶体三维层叠网状结构，其胍基和硫酸根形成的亲水层与益母草碱疏水基团交替排列。
6.根据权利要求5所述的晶体，其特征在于，所述三维层叠网状结构为如下的三维层叠网状结构：
7.根据权利要求1所述的晶体，其特征在于，所述的益母草碱半硫酸盐一水合物晶体为在 25 °C 混悬实验中，甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃、硝基甲烷、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、异戊醇、甲基叔丁基醚、甲苯、甲基异丁基酮、正己烷、 正庚烷、乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚或水溶剂中；或在 50 °C 混悬实验中，在甲醇、乙醇、丙酮、甲基乙基酮、乙酸异丙酯、甲基叔丁基醚、甲苯、正己烷、正庚烷、乙醚、三氯甲烷、石油醚或水溶剂中；或25 °C 及 50 °C 混合溶剂混悬和挥发部分溶剂条件下制得。
8.根据权利要求1所述的晶体，其特征在于，所述益母草碱半硫酸盐一水合物晶体理化性质稳定，无转晶行为，引湿性不明显。
9.根据权利要求1所述的晶体，其特征在于，所述晶体具有如下X-射线粉末衍射数据特征 ：
。
10.权利要求1 – 9任一项所述的晶体在制备药物中的用途。
11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的药物为增加胰岛素敏感性药物，或治疗糖尿病药物，或治疗单纯性肥胖药物，或治疗高脂血症药物，或防治动脉粥样硬化药物。
12.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的药物为胰岛素增敏剂，用于制备治疗胰岛素敏感性下降引起的继发性疾病的药物，所述的继发性疾病是胰岛素抵抗综合征。
13.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的药物为降糖药物，用于治疗糖尿病，所述糖尿病为血糖增高的疾病状态，或糖耐量降低的疾病状态，或伴有胰岛素敏感性降低的2型糖尿病。
14.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的药物为降低体重药物或治疗肥胖症的药物，所述的肥胖症为中心性肥胖、单纯性肥胖和伴随其他疾病状态的肥胖症。
15.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的药物为降低血脂药物，用于纠正脂代谢紊乱、防治高脂血症，或用于降低总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇。
16.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的药物为防治动脉粥样硬化斑块的药物，用于抑制动脉粥样硬化斑块的形成，防治动脉粥样硬化斑块所导致的疾病。
17.一种药物，其制备方法包括使用如权利要求1 – 9任一项所述的晶体。
18.如权利要求17所述的药物，其特征在于，所述的药物为增加胰岛素敏感性药物，或治疗糖尿病药物，或治疗单纯性肥胖药物，或治疗高脂血症药物，或防治动脉粥样硬化药物。
19.如权利要求17所述的药物，其特征在于，所述的药物为胰岛素增敏剂，用于制备治疗胰岛素敏感性下降引起的继发性疾病的药物，所述的继发性疾病是胰岛素抵抗综合征。
20.如权利要求17所述的药物，其特征在于，所述的药物为降糖药物，用于治疗糖尿病，所述糖尿病为血糖增高的疾病状态，或糖耐量降低的疾病状态，或伴有胰岛素敏感性降低的2型糖尿病。
21.如权利要求17所述的药物，其特征在于，所述的药物为降低体重药物或治疗肥胖症的药物，所述的肥胖症为中心性肥胖、单纯性肥胖和伴随其他疾病状态的肥胖症。
22.如权利要求17所述的药物，其特征在于，所述的药物为降低血脂药物，用于纠正脂代谢紊乱、防治高脂血症，或用于降低总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇。
23.如权利要求17所述的药物，其特征在于，所述的药物为防治动脉粥样硬化斑块的药物，用于抑制动脉粥样硬化斑块的形成，防治动脉粥样硬化斑块所导致的疾病。
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