CN113967206B - 益母草碱在治疗多囊卵巢综合征的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及益母草碱在制备治疗多囊卵巢综合征的药物中的应用，所述益母草碱使用剂量为100‑300mg/kg体重·天，优选200mg/kg体重·天。本发明提出使用益母草碱治疗PCOS，并探究其治病机制，证明持续口服至少21天益母草碱，服用剂量为200mg/kg体重·天可以有效缓解PCOS的相关症状，例如胰岛素抵抗消失、发情周期趋于正常，排卵数增加，雄性激素恢复正常等。
Description
技术领域
本发明涉及药品技术领域，具体涉及益母草碱在治疗多囊卵巢综合征的药物中的应用。
技术背景
多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)是一种常见的内分泌疾病，影响6％-10％的育龄妇女。PCOS的主要特征是雄激素过多、排卵功能障碍和卵巢呈现多囊样。此外，PCOS常伴有代谢紊乱，如胰岛素抵抗(IR)、葡萄糖耐受和肥胖。多囊卵巢综合征的研究虽然已经进行了很长时间，但因其病因和病理生理机制尚不清楚，如今国内外均没有一项专为PCOS的治疗药物。目前存在的几种治疗手段也有一定的副作用。①针对青春期、育龄期无生育要求、因排卵障碍引起月经紊乱的患者周期性的使用孕激素，可能会造成内分泌失调，引起患者肥胖或者出现骨质脱钙的情况；口服避孕药(OCP)对于PCOS患者，只能是造成人工周期的“月经”，保护因长期不排卵而单一雌激素刺激的子宫内膜，降低PCOS因高雄造成的痤疮和多毛，本身并不能“治疗”PCOS，停药后月经不调和闭经仍然会发生的，而且短效复方口服避孕药会导致胃黏膜受到刺激，引起食欲不振，恶心呕吐的症状。②抗高雄激素的治疗时，对于OCP治疗效果不佳时使用螺内酯，至少6个月见效。治疗周期较长，而且在大剂量使用时，会发生乳房胀痛、月经紊乱、头痛或者多尿，也可能会引起低血压及高血钾。；③重度肥胖、糖脂代谢紊乱的患者，诊疗指南建议使用二甲双胍或胰岛素增敏剂治疗，长期使用二甲双胍最常见的副作用是胃肠道反应，可以出现腹胀，恶心，呕吐，食欲减退，腹痛腹泻及体重减轻等。少见的不良反应有皮疹、低血糖、头晕等，极少数可以出现乳酸酸中毒。胰岛素增敏剂如曲格列酮，常见副作用有胃肠道症状，如恶心、呕吐、腹胀、腹泻、上腹部疼痛等。可有浮肿、呼吸道感染、可逆性黄疸(肝活检显示为特应性的药物反应)2000年3月美国FDA通知撤销该品种。中医认为PCOS与肝、肾、脾三脏功能失调密切相关，兼杂气郁、痰湿、内热等多种病理因素，治疗上主要是调补肝脾肾的基础上根据辩证分别施以理气、化痰、利湿、化瘀、清热等多种手段，如能结合月经周期进行分期用药将更加有助于恢复PCOS患者的排卵乃至成功受孕。越来越多的人提出中药治疗PCOS的诊疗方案，效果显著，但没有证据表明中药是通过何种机制治疗PCOS，因为中药成分复杂，含有各类生化成分，难以研究。
现有技术中，用于治疗PCOS的中药里通常都含有益母草，益母草的化学成分：益母草碱、水苏碱、益母草定、益母草宁等多种生物碱、苯甲酸、多量氯化钾、月桂酸、亚麻酸、油酸、甾醇、维生素A、芸香甙等黄酮类，又含精氨酸、4-胍基-1-丁醇、4-胍基-丁酸、水苏糖等。早年即证明益母草制剂对兔、豚鼠、犬的离体子宫有直接兴奋作用，与脑垂体后叶素相似，但作用较弱。而后的药理研究证实此说。益母草的水浸膏或乙醇浸膏不但在离体子宫，而且在在位子宫(静脉注射)、子宫瘘(灌胃)的试验中，均证实有兴奋作用，子宫的振幅、收缩率、紧张度，无论已孕与未孕者均见增加，持续时间颇久，益母草酊剂效力似不及煎剂。煎煮8小时或室温保存2周，效力尚无显着减弱。其有效成分在叶部，而茎部无收缩子宫作用，根部效力亦差，采集宜在5月间叶子茂盛之时进行。益母草中也有某种成分(溶于乙醚)对子宫呈抑制作用，所提得的益母草碱能兴奋离体子宫，却不能兴奋在位子宫。也有报告粗制的益母草碱对离体子宫及子宫瘘试验中作用都不明显。用Stas-Otto法提得的益母草碱，对离体子宫有收缩作用。据报道用益母草碱2.5～5毫克/公斤予麻醉猫静脉注射，对子宫有兴奋作用，能增加子宫张力，并能降压；对猫、豚鼠离体子宫有明显的兴奋作用。从种子中提得的益母草碱则无显著作用。四川提得的益母草总碱对豚鼠离体子宫有收缩作用，其作用类型与麦角新碱相似，益母草总生物碱3毫克与马来酸麦角新碱0.04毫克的效价相当。总之，益母草水溶性成分无论对离体、在位及整体不麻醉动物的子宫皆有兴奋作用，但其真正有效生物碱尚待确定。
发明内容
为了解决以上问题，本发明提出的技术方案为益母草碱在制备治疗多囊卵巢综合征的药物中的应用。
进一步，所述益母草碱在所述药物中的有效剂量为100-300mg/kg体重·天。
进一步，所述益母草碱在所述药物中的有效剂量为200mg/kg体重·天。
进一步，所述药物的使用方法为连续口服不少于21天。
本发明所述药物的应用动物为雌性哺乳动物。
本发明的有益效果如下：
1、提出使用益母草碱治疗PCOS，并探究其治病机制。
2、证明持续口服至少21天益母草碱，服用剂量为200mg/kg体重·天可以有效缓解PCOS的相关症状，例如胰岛素抵抗消失、发情周期趋于正常，排卵数增加，雄性激素恢复正常等。
3、同时验证口服益母草颗粒是否可以改善PCOS，答案是否定的，证明益母草中的益母草碱是改善PCOS的有效成分，且每日摄入量要达到100mg/kg体重以上才可以起效果，如果单纯服用益母草水煎剂或者益母草颗粒，则需要服用非常大量的益母草水煎剂或者益母草颗粒才能达到100mg/kg体重·天以上益母草碱的量，并没有实用性。
4、证明益母草碱的最佳作用剂量为200mg/kg体重·天，低于100或者高于300都起不到效果。
5、有研究表明肠道微生物的组成与性激素有关，肠道菌群可能与多囊卵巢综合征有双向相互作用。本发明发现每天摄入200mg/kg体重益母草碱通过调节肠道微生物的组成，改善肠道微生物紊乱的情况，降低了炎症和氧化应激反应进而达到治疗PCOS的目的。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
实验声明
1、实验动物：所有实验均严格遵守中国实验动物福利法并经中国农业大学生物学院实验动物伦理委员会批准同意。实验中所用到的C57小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于中国农业大学清洁级实验动物房。实验所设置每个分组的小鼠不少于25只。动物房保持环境温度在22-24℃，光照环境为12h光照和12h黑暗交替，小鼠可自由采食和饮水。
2、造模药物：脱氢表雄酮的配制：从西格玛里奥公司购得DHEA(规格：10g/瓶,CAS；53-43-0)和芝麻油(规格：1000ml/瓶,CAS:8008-74-0)，按照45mg DHEA，10ml芝麻油的比例进行配制。最后待药物完全溶解后使用。
益母草碱的配制：从成都瑞芬思生物科技有限公司购得益母草碱(规格；800mg/瓶，CAS:24697-74-3)，800mg益母草碱溶于30ml 1％羧甲基纤维素钠中备用。
3、模型构建：为诱导多囊卵巢综合征，3周龄雌性青春期前C57小鼠每天皮下注射6mg/100g DHEA。Control组小鼠每日注射0.2ml的芝麻油，处理21天建模成功。PCOS小鼠建模成功的标志是发情周期紊乱、高雄激素、卵巢呈多囊、无排卵且伴随着葡萄糖耐受和胰岛素抵抗的症状。
4、以下实验中益母草碱组或益母草组的剂量单位都为mg/kg体重·天。
5、以下所有表格中的值为平均值+标准误，*为与对照组相比有统计学意义；**与对照组相比有显著统计学意义；***表示与对照组相比有极显著统计学意义；#为与安慰剂组相比有统计学意义，##表示与安慰剂组相比有显著统计学意义，###为与安慰剂组相比有极显著的统计学意义。
实施例1、益母草碱的最佳使用浓度探究
1.实验分组：
建模成功的PCOS小鼠，随机分为5组，分别为安慰剂组、50mg/kg益母草碱组、100mg/kg益母草碱组、200mg/kg益母草碱组、300mg/kg益母草碱组各7只。
2.给药方法：
对照组：对正常小鼠灌胃1％的羧甲基纤维素钠；
安慰剂组:对PCOS小鼠灌胃1％的羧甲基纤维素钠；
益母草碱组：灌胃不同剂量的益母草碱，分别是50mg/kg体重·天、100mg/kg体重·天、200mg/kg体重·天、300mg/kg体重·天。
3.观察内容和方法
灌胃21天，给每一只小鼠做空腹血糖值检测，通过阴道涂片实验测定发情周期；每组取3只小鼠腹腔注射PMSG、HCG后断颈处死，取壶腹部统计MⅡ期卵母细胞的数目；取血清检测炎症反应因子IL-22和氧化应激标志物SOD。
4.结果：
(1)一般情况：
对照组、安慰剂组、不同浓度的益母草碱组小鼠均发育良好，体毛润泽，行为征无明显差异，反应灵敏。
(2)发情周期测试：
灌胃不同浓度益母草碱以后，PCOS造成的发情周期紊乱的现象均有所改善，根据不同发情周期所处时间进行差异显著性比较，四个灌药组与安慰剂组均出现显著性差异。实验数据如表1显示。
表1不同剂量的益母草碱对PCOS小鼠发情周期作用的效果测试
(3)排卵情况统计
如表2显示，PCOS引起的小鼠排卵数显著下降的情况通过200mg/kg剂量的益母草碱灌胃后，MⅡ卵母细胞数显著升高，但50mg/kg、100mg/kg、300mg/kg益母草碱的灌胃剂量均没有改善PCOS小鼠的排卵情况。
表2不同剂量的益母草碱对PCOS小鼠排卵数的效果测试
| 组别 | n | 排卵数 |
| 对照组 | 3 | 21±8 |
| 安慰剂组 | 3 | 6±3<sup>***</sup> |
| 50mg/kg益母草碱组 | 3 | 4±3<sup>***</sup> |
| 100mg/kg益母草碱组 | 3 | 7±4<sup>***</sup> |
| 200mg/kg益母草碱组 | 3 | 14±2<sup>##</sup> |
| 300mg/kg益母草碱组 | 3 | 5±2<sup>***</sup> |
(4)空腹血糖值测定
给小鼠禁断食12h后，注射2g/kg的葡萄糖，分别在0min，15min，30min，60mn，90min分别测定血糖值，发现PCOS小鼠的葡萄糖耐受现象只有200mg/kg益母草碱灌胃组恢复到与对照组没有显著差异；3天后，小鼠禁断食12h后，注射1IU/kg的胰岛素，分别在0min，15min，30min，60mn，90min，120min分别测定血糖值，结果如表3、4所示，发现100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg的益母草碱灌胃PCOS小鼠均可以改善其胰岛素抵抗的症状。
表3不同剂量的益母草碱对PCOS小鼠葡萄糖耐量的效果测试
表4不同剂量的益母草碱对PCOS小鼠胰岛素耐量的效果测试
(5)炎症因子和氧化应激标志物的检测
小鼠摘眼球取血，室温下，3000rpm离心，取血清。ELISA试剂盒检测血清中炎症因子IL-22和氧化应激标志物SOD的含量，发现200mg/kg益母草碱组缓解炎症和氧化应激反应的效果是最好的(见表5)。
表5不同剂量的益母草碱对PCOS小鼠炎症因子白介素-22含量检测
| 组别 | n | IL-22(pg/ml) |
| 对照组 | 4 | 79.03±6.53 |
| 安慰剂组 | 4 | 53.08±3.10<sup>***</sup> |
| 50mg/kg益母草碱组 | 3 | 59.59±5.32<sup>**</sup> |
| 100mg/kg益母草碱组 | 4 | 68.21±8.24<sup>*,##</sup> |
| 200mg/kg益母草碱组 | 4 | 74.11±9.40<sup>###</sup> |
| 300mg/kg益母草碱组 | 4 | 69.35±6.32<sup>##</sup> |
表6不同剂量的益母草碱对PCOS小鼠超氧化物歧化酶含量检测
| 组别 | n | SOD(ng/ml) |
| 对照组 | 4 | 4.60±0.42 |
| 安慰剂组 | 4 | 3.23±0.51<sup>***</sup> |
| 50mg/kg益母草碱组 | 3 | 3.91±0.61<sup>*，#</sup> |
| 100mg/kg益母草碱组 | 4 | 4.04±0.41<sup>#</sup> |
| 200mg/kg益母草碱组 | 4 | 4.27±0.28<sup>##</sup> |
| 300mg/kg益母草碱组 | 4 | 3.91±0.22<sup>*，#</sup> |
结论:与安慰剂组相比，100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg的益母草碱组的灌胃均可以改善PCOS小鼠发情周期紊乱和胰岛素抵抗的症状，但是在恢复排卵和改善葡萄糖耐受方面，200mg/kg益母草碱组显著优于其他几组；而且通过检测炎症因子白介素IL-22和氧化应激标志物SOD发现200mg/kg益母草碱组缓解炎症和氧化应激反应的效果是最好的。因此我们决定采用200mg/kg的灌胃剂量进行后续实验。
实施例2：探究益母草颗粒和益母草碱治疗PCOS的效果
1.实验分组：
建模成功的PCOS小鼠，随机分为4组，对照组、安慰剂组、益母草碱组、益母草组各8只。
2.给药方法：
对照组：对正常小鼠灌胃1％的羧甲基纤维素钠；
安慰剂组:对PCOS小鼠灌胃1％的羧甲基纤维素钠；
益母草碱组：对PCOS小鼠灌胃200mg/kg体重·天的益母草碱；
益母草组：对PCOS小鼠灌胃510mg/kg体重·天的益母草颗粒(山东凤凰制药股份有限公司，国药准字Z37020360)。
注：已经有文献证明，该公司的益母草颗粒中益母草碱的含量为2.4％，中国成年女性的平均体重是59kg，每天口服益母草颗粒的量是30g，按照这个剂量给小鼠灌胃，每天灌胃益母草颗粒510mg/kg体重，换算为益母草碱的摄入量是12.24mg/kg体重。
3.观察内容和方法
灌胃21天，给每一只小鼠做空腹血糖值检测，通过阴道涂片实验测定发情周期；每组取3只小鼠腹腔注射PMSG、HCG后断颈处死，取壶腹部统计MⅡ期卵母细胞的数目；其余小鼠处死后取卵巢组织，用于观察卵巢形态学变化。
结果
(1)一般情况：对照组、安慰剂组、益母草碱组和益母草组小鼠均发育良好，体毛润泽，行为征无明显差异，反应灵敏。
(2)发情周期测试：灌胃益母草碱和益母草颗粒以后，PCOS造成的发情周期紊乱的现象均有所改善，根据不同发情周期所处时间进行差异显著性比较，益母草碱组、益母草组与安慰剂组均出现显著性差异。实验数据如表7所示。
表7益母草碱及益母草颗粒对PCOS小鼠发情周期作用的效果测试
(3)排卵情况统计：如表8显示，PCOS引起的小鼠排卵数显著下降的情况通过益母草碱灌胃后，MⅡ卵母细胞数显著升高，但灌胃益母草并没有改善PCOS小鼠的排卵情况.
表8益母草碱及益母草颗粒对PCOS小鼠排卵数的效果测试
| 组别 | n | 排卵数 |
| 对照组 | 3 | 28±7 |
| 安慰剂组 | 3 | 15±6<sup>*</sup> |
| 益母草碱组 | 3 | 25±3<sup>#</sup> |
| 益母草组 | 3 | 16±2<sup>*</sup> |
(4)卵巢卵泡计数
如表9显示，安慰剂组、益母草组与对照组相比有多个闭锁卵泡，次级卵泡、有腔卵泡数量较多；而益母草碱组闭锁卵泡、次级卵泡、有腔卵泡的数量均下降，与安慰剂组存在显著的差异，说明灌胃益母草碱可以有效改善PCOS小鼠的多囊样卵巢，但是益母草颗粒不能。
表9益母草碱及益母草颗粒对PCOS小鼠各级卵泡数目的影响
| 组别 | n | 初级卵泡 | 次级卵泡 | 有腔卵泡 | 闭锁卵泡 |
| 对照组 | 4 | 17.75±12.79 | 29.00±8.76 | 13.25±8.62 | 0.00 |
| 安慰剂组 | 4 | 17.00±7.75 | 61.75±10.69<sup>***</sup> | 30.75±6.80<sup>**</sup> | 2.75±0.96<sup>**</sup> |
| 益母草碱组 | 4 | 15.50±3.51 | 34.75±2.22<sup>###</sup> | 12.25±4.35<sup>##</sup> | 0.00<sup>##</sup> |
| 益母草组 | 4 | 14.25±4.86 | 63.00±7.07<sup>***</sup> | 39.75±1.70<sup>***</sup> | 4.25±1.71<sup>***</sup> |
(5)空腹血糖值测定
给小鼠禁断食12h后，注射2g/kg的葡萄糖，分别在0min，15min，30min，60mn，90min分别测定血糖值，如表10显示，发现PCOS小鼠的葡萄糖耐受现象只有益母草碱灌胃组恢复到与对照组没有显著差异；3天后，小鼠禁断食12h后，注射1IU/kg的胰岛素，分别在0min，15min，30min，60mn，90min，120min分别测定血糖值，如表11显示，结果发现只有益母草碱灌胃组恢复到与对照组没有显著差异。益母草颗粒对于PCOS小鼠的葡萄糖耐受和胰岛素抵抗症状并没有治疗效果。
表10益母草碱及益母草颗粒对PCOS小鼠葡萄糖耐量的效果测试
表11益母草碱及益母草颗粒对PCOS小鼠胰岛素耐量的效果测试
(6)炎症因子和氧化应激标志物的检测
小鼠摘眼球取血，室温下，3000rpm离心，取血清。ELISA试剂盒检测血清中炎症因子IL-22和氧化应激标志物SOD的含量，发现益母草碱组具有缓解炎症和氧化应激反应的效果，而益母草效果不显著(见表12、13)。
表12益母草碱及益母草颗粒对PCOS小鼠白介素-22含量检测
| 组别 | n | IL-22(pg/ml) |
| 对照组 | 4 | 78.26±9.67 |
| 安慰剂组 | 4 | 51.98±4.29<sup>***</sup> |
| 益母草碱组 | 4 | 68.86±6.48<sup>##</sup> |
| 益母草 | 4 | 62.21±7.28<sup>**</sup> |
表13益母草碱及益母草颗粒对PCOS小鼠超氧化物歧化酶含量检测
| 组别 | n | SOD(ng/ml) |
| 对照组 | 4 | 4.35±0.38 |
| 安慰剂组 | 4 | 3.26±0.31<sup>**</sup> |
| 益母草碱组 | 4 | 4.13±0.20<sup>##</sup> |
| 益母草组 | 4 | 3.63±0.50<sup>*</sup> |
实施例3：探究益母草碱通过什么机制改善PCOS.
1.实验分组
建模成功的PCOS小鼠，随机分组，对照组、益母草碱组、安慰剂组各20只。
2.给药方法：
对照组：对正常小鼠灌胃1％的羧甲基纤维素钠；
安慰剂组:对PCOS小鼠灌胃1％的羧甲基纤维素钠；
益母草碱组：对PCOS小鼠灌胃200mg/kg体重·天的益母草碱。
3.观察内容和方法
灌胃21天，处死部分小鼠，采集血清、卵巢组织。此时所有小鼠大肠和小肠内的新鲜粪样，移入1.5ml无菌EP管中。这些试管在液氮中迅速冷冻，并在-80℃下储存。其余小鼠在7-10d内进行测定发情周期、空腹血糖并且合笼后统计第一窝幼崽的数目。
酶联免疫吸附测定法法检测小鼠血清睾酮(T)、促黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)、抗穆勒氏激素(AMH)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、白介素-22(IL-22)、丙二醛(MDA)、晚期糖基化终末产物(AGEs)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)水平以及小鼠卵巢组织上清液中超敏C反应蛋白(hs-CRP)、丙二醛(MDA)、晚期糖基化终末产物(AGEs)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)水平；HE染色观察小鼠卵巢形态学变化：取小鼠卵巢组织，体积分数4％多聚甲醛溶液固定，酒精逐级脱水，浸蜡包埋，5μm切片，HE染色，光镜观察卵巢组织形态学变化。流式细胞仪检测小鼠外周血中CD4、NK细胞的所占比例。
4.结果：
(1)一般情况：对照组、安慰剂组和益母草碱组大鼠均发育良好，体毛润泽，行为、体征无明显差异，反应灵敏。
(2)发情周期情况：如表14所示，与发情周期正常的对照组相比，建模成功后的安慰剂组发情周期紊乱，持续处于发情期，而益母草碱灌胃后发情周期恢复正常。
表14对照组、安慰剂组、益母草碱组的发情周期测定
(3)排卵和产崽情况统计
如表15、16显示，PCOS引起的小鼠排卵数显著下降的情况通过益母草碱灌胃后，MⅡ卵母细胞数显著升高；合笼后产崽的数目也有显著性增加。
表15对照组、安慰剂组、益母草碱组的排卵数目统计
| 组别 | n | 排卵数 |
| 对照组 | 7 | 28±8 |
| 安慰剂组 | 7 | 13±5<sup>***</sup> |
| 益母草碱组 | 7 | 23±7<sup>#</sup> |
表16对照组、安慰剂组、益母草碱组的产崽数目统计
| 组别 | n | 产崽数 |
| 对照组 | 6 | 8±2 |
| 安慰剂组 | 6 | 2±3<sup>***</sup> |
| 益母草碱组 | 6 | 7±1<sup>##</sup> |
(4)卵巢卵泡计数
如表17显示，安慰剂组与对照组相比，闭锁卵泡，次级卵泡、、有腔卵泡数量显著增多且黄体数显著减少；而益母草碱组闭锁卵泡、次级卵泡、有腔卵泡的数量均下降，黄体数增加，与安慰剂组存在显著的差异，说明灌胃益母草碱可以有效改善PCOS小鼠的多囊样卵巢。
表17对照组、安慰剂组、益母草碱组的各级卵泡、黄体数目统计
| 组别 | n | 初级卵泡 | 次级卵泡 | 有腔卵泡 | 闭锁卵泡 | 黄体数目 |
| 对照组 | 4 | 12.25±5.85 | 42.50±8.85 | 21.25±4.57 | 0.00 | 7.75±1.50 |
| 安慰剂组 | 4 | 8.50±1.73 | 76.25±14.13<sup>**</sup> | 29.50±3.11<sup>**</sup> | 5.00±1.41<sup>***</sup> | 2.50±0.58<sup>**</sup> |
| 益母草碱组 | 4 | 10.50±4.20 | 35.00±10.10<sup>##</sup> | 18.50±1.91<sup>##</sup> | 0.75±0.96<sup>###</sup> | 5.75±0.96<sup>##</sup> |
(5)空腹血糖值测定
给小鼠禁断食12h后，注射2g/kg的葡萄糖，分别在0min，15min，30min，60mn，90min分别测定血糖值，如表18显示，发现PCOS小鼠的葡萄糖耐受现象在益母草碱灌胃后消失；3天后，小鼠禁断食12h后，注射1IU/kg的胰岛素，分别在0min，15min，30min，60mn，90min，120min分别测定血糖值，如表19显示，结果发现益母草碱改善了PCOS小鼠的胰岛素抵抗的症状，血糖值恢复到与对照组无异。
表18对照组、安慰剂组、益母草碱组的葡萄糖耐量测试
表19对照组、安慰剂组、益母草碱组的胰岛素耐量测试
(6)血清性激素含量测定
做发情周期测定，当小鼠处于发情周期时，摘眼球取血，室温下，3000rpm离心，取血清。ELISA试剂盒检测血清中T、LH、FSH、E2、P、AMH的含量。结果如表20所示，灌胃益母草碱之后，与安慰剂组相比，益母草碱组T、AMH、E2、LH显著降低，FSH显著性增加，但是P的含量并没有被改善。总之，益母草碱组除了T、P与对照组存在差异外，其他几种性激素水平恢复到与正常小鼠一致。
表20对照组、安慰剂组、益母草碱组的血清性激素含量测定
(7)炎症因子和炎症细胞的检测
小鼠取血清，应用ELISA试剂盒检测炎症因子hs-CRP、IL-22的含量，如表21所示，灌胃益母草碱以后，血清的hs-CRP含量有降低的趋势，但是与对照组还是存在显著差异，但是血清中IL-22的含量与安慰剂组相比显著性增高，且与对照组无差异。接下来，取外周血过流式细胞仪检测免疫细胞CD4、NK细胞的比例，如表22所示，与安慰剂组相比，益母草碱组的CD4单阳细胞显著增加，NK细胞显著减少。以上结果说明益母草碱缓解了PCOS带来的全身性炎症反应。
表21对照组、安慰剂组、益母草碱组的血清炎症反应因子含量测定
| 组别 | hs-CRP(mg/l)n＝7/组 | IL-22(pg/ml)n＝15/组 |
| 对照组 | 2.29±0.18 | 97.05±3.15 |
| 安慰剂组 | 2.94±0.23<sup>***</sup> | 80.66±5.80<sup>***</sup> |
| 益母草碱组 | 2.72±0.17<sup>**</sup> | 90.27±6.20<sup>###</sup> |
表22对照组、安慰剂组、益母草碱组的外周血中免疫细胞所占比例测定
| 组别 | n | CD4<sup>+</sup>细胞(％) | NK细胞(％) |
| 对照组 | 3 | 9.9±0.36 | 1.06±0.22 |
| 安慰剂组 | 3 | 8.32±0.42<sup>*</sup> | 2.35±0.27<sup>***</sup> |
| 益母草碱组 | 3 | 9.54±0.64<sup>#</sup> | 1.18±0.25<sup>###</sup> |
(8)氧化应激相关基因与标志物检测
小鼠取血清、卵巢组织上清，应用ELISA试剂盒检测氧化应激标志物GSH、SOD、AGEs、MDA的含量；提取卵巢RNA，通过Q-PCR实验检测氧化应激相关基因的表达情况。在PCOS小鼠卵巢中，NOXO1基因表达增多，SOD、GPX1基因表达量减少，但是灌胃益母草碱以后，NOXO1显著减少，SOD、GPX1显著增多，结果如表23所示。检测卵巢、和血清中氧化应激标志物发现，与安慰剂组相比，GSH、SOD显著性增加，AGEs、MDA显著减少，结果如表24、25所示。表明益母草碱缓解了PCOS造成的小鼠局部和全身的氧化应激反应。
表23对照组、安慰剂组、益母草碱组的氧化应激相关基因表达量测试
| 组别 | n | NOXO1 | SOD | GPX-1 |
| 对照组 | 3 | 1.14±0.06 | 0.99±0.02 | 0.97±0.04 |
| 安慰剂组 | 3 | 1.56±0.19<sup>*</sup> | 0.79±0.07<sup>**</sup> | 0.66±0.13<sup>**</sup> |
| 益母草碱组 | 3 | 0.95±0.13<sup>##</sup> | 1.03±0.08<sup>##</sup> | 1.13±0.04<sup>###</sup> |
表24对照组、安慰剂组、益母草碱组血清中的氧化应激标志物含量测试
| 组别 | n | GSH(ng/ml) | MDA(nmol/ml) | AGEs(pg/ml) | SOD(ng/ml) |
| 对照组 | 7 | 3.01±0.28 | 6.17±0.80 | 169.5±18.99 | 4.33±0.51 |
| 安慰剂组 | 7 | 2.12±0.24<sup>***</sup> | 8.41±0.56<sup>***</sup> | 245.30±21.16<sup>***</sup> | 3.21±0.33<sup>**</sup> |
| 益母草碱组 | 7 | 2.79±0.25<sup>###</sup> | 7.43±0.29<sup>##</sup> | 211.03±12.50<sup>***,##</sup> | 4.19±0.18<sup>###</sup> |
表25对照组、安慰剂组、益母草碱组卵巢组织中的氧化应激标志物含量测试
(9)大肠和小肠的内容物16s测序
取小鼠大肠和小肠内容物做16s测序实验，分析在肠道微生物属水平上益母草碱对PCOS小鼠造成的影响，对照组为正常小鼠，安慰剂组为PCOS小鼠。如表26所示，在PCOS小鼠大肠菌群属水平上，益母草碱增加了Christensenellaceae_R-7_group、Eubacterium_siraeum_group、Marvinbryantia菌群的丰富度，而降低了葡萄球菌、棒状杆菌、费克蓝姆氏菌群的丰富度。在PCOS小鼠小肠菌群属水平上，益母草碱增加了Reyranella菌群的丰富度，但是降低了Stenotrophomonas、Mycobacterium、Sulfuritalea、KCM-B-112、Undibacterium菌群的丰富度，结果如表27所示。表明益母草碱有效改善了PCOS小鼠的肠道菌群紊乱的现象。
有文献证明，葡萄球菌属与性激素的水平相关；
Christensenellaceae与BMI和炎症等代谢疾病显著负相关，如脂肪沉积、IBD和代谢综合征等，这种细菌对人体健康有益，在身材较瘦的人体内丰度更高。研究人员用这种细菌处理小鼠，抑制了这些小鼠的体重增加(与对照组相比)；Eubacterium siraeum介导的BCAA摄取和分解代谢能力降低。BCAA分解代谢受到损害，累积的BCAA会诱导氧化应激并破坏线粒体功能。
表26对照组、安慰剂组、益母草碱组的大肠菌群属水平上的差异
表27对照组、安慰剂组、益母草碱组的小肠菌群属水平上的差异
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (2)
1.益母草碱在制备治疗多囊卵巢综合征的药物中的应用，其特征在于，所述益母草碱在所述药物中的有效剂量为100-300mg/kg体重·天，所述药物的使用方法为连续口服不少于21天。
2.根据权利要求1所述益母草碱在制备治疗多囊卵巢综合征的药物中的应用，其特征在于，所述益母草碱在所述药物中的有效剂量为200mg/ kg体重·天。
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