CN110168372A

CN110168372A - 用于确定dpp3的方法和治疗方法

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Publication number: CN110168372A
Application number: CN201780039077.1A
Authority: CN
Inventors: 安德烈亚斯·伯格曼
Original assignee: Si Fuyingao Tektronix Ltd
Current assignee: Si Fuyingao Tektronix Ltd
Priority date: 2016-04-21
Filing date: 2017-04-20
Publication date: 2019-08-23
Also published as: CA3021252A1; MX2018012856A; EP3446125A1; WO2017182561A1; JP2019520550A; JP2022163014A; AU2023258417A1; US20200378977A1; JP7219737B2; SG11201809252YA; AU2017252212A1; MX2020001193A; US20190145981A1; DE112017002105T5; KR20230123520A; RU2018140832A; JP2020127409A; BR112018071583A2; KR102565453B1; KR20190003959A

Abstract

本发明涉及用于确定体液样品中的活性DPP3的方法、用于确定体液样品中的活性DPP3的测定或试剂盒、用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法以及治疗或预防所述疾病的方法。

Description

用于确定DPP3的方法和治疗方法

技术领域

本发明涉及用于确定体液样品中的活性DPP3的方法、用于测定体液样品中的活性DPP3的测定或试剂盒、用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法以及治疗所述疾病的方法。

背景技术

二肽基肽酶3—也称为二肽基氨肽酶III、二肽基芳基酰胺酶III、二肽基肽酶III、脑啡肽酶B或红细胞血管紧张素酶；简称：DPP3，DPPIII—是金属肽酶，其可以从生理活性肽中移除二肽，如脑啡肽和血管紧张素。

由Ellis&Nuenke在1967年首次鉴定了DPP3，并在在纯化的牛垂体前叶提取物中测量了其活性。将所述酶列为EC 3.4.14.4，其分子量为约83kDa，在原核生物和真核生物中高度保守(Prajapati&Chauhan，2011年)。人变体的氨基酸序列描述于SEQ ID NO 1中。二肽基肽酶III是广泛表达的主要胞质肽酶。尽管缺乏信号序列，但一些研究报道了膜活性(Lee&Snyder，1982年)。

DPP3是属于肽酶家族M49的锌依赖性外肽酶。其对多种组合物的三/四个至十个氨基酸的寡肽具有广泛的底物特异性，并且还能够在脯氨酸后裂解。已知DPP3从其底物的N-末端水解肽，包括血管紧张素II、血管紧张素III和血管紧张素IV；亮氨酸脑啡肽和甲硫氨酸脑啡肽；内吗啡肽1和内吗啡肽2。金属肽酶DPP3在pH 8.0至9.0时具有其最佳活性，并且可以通过添加二价金属离子如CO²⁺和Mg²⁺来进行活化。DPP3的结构分析揭示了催化基序HELLGH(hDPP3450-455)和EECRAE(hDPP3 507-512)以及对底物结合和水解很重要的以下氨基酸:Glu316、Tyr318、Asp366、Asn391、Asn394、His568、Arg572、Arg577、Lys666和Arg669(Prajapati&Chauhan，2011年；Kumar等人，2016年；编号是指人DPP3的序列，参见SEQ IDNo.1)。考虑到参与底物结合和水解的所有已知氨基酸或序列区，可将人DPP3的活性位点定义为氨基酸316至氨基酸669的区域。

DPP3的活性可以通过不同的通用蛋白酶抑制剂(例如PMSF、TPCK)、巯基试剂(例如pHMB、DTNB)和金属螯合剂(EDTA、邻苯二酚；等人，2000年)非特异性地进行抑制。

DPP3活性可以通过不同种类的化合物特异性地进行抑制：内源性DPP3抑制剂是肽spinorphin。已经生产了几种合成的spinorphin衍生物，例如，tynorphin，并且其显示出不同程度地抑制DPP3活性(Yamamoto等人，2000年)。其它公开的DPP3肽抑制剂是propioxatinA和propioxatin B(US4804676)和propioxatin A类似物(Inaoka等人，1988年)。

DPP3还可以被小分子如fluostatins和苯并咪唑衍生物抑制。Fluostatins A和Fluostatins B是在链霉菌属(Streptomyces sp.)TA-3391中产生的抗生素，其是无毒性的并强烈地抑制DPP3活性。迄今为止，已合成并公开了20种不同的苯并咪唑衍生物(等人，2007年；Rastija等人，2015年)，其中两种化合物1'和4'显示出最强的抑制作用(等人，2007年)。关于DPP3抑制剂的完整列表，参见表2。

DPP3在细胞生理学中的确切生物学功能尚不清楚，但最近的研究结果表明其不仅在蛋白质代谢中起作用，而且在血压调节、疼痛调节和炎症过程中也起作用(Prajapati&Chauhan，2011年)。

在几种出版物中已经示出DPP3是有前景的生物标志物，其均涉及细胞内DPP3。已经示出DPP3活性在卵巢和子宫内膜肿瘤的匀浆中升高。DPP3活性甚至随着所述肿瘤的严重性/恶性而增加(等人，1998年和2003年)。胶质母细胞瘤细胞系的免疫组织学和蛋白质印迹分析也显示DPP3水平升高(Singh等人，2014年)。

还提出了细胞内或膜质DPP3是潜在的动脉风险(arteriorisk)标志物(US2011008805)和类风湿性关节炎的标志物(US2006177886)。专利申请WO2005106486要求保护：在所有种类的疾病中，DPP3表达和活性作为诊断标志物并且DPP3作为治疗靶标，这是由于DPP3在细胞内或细胞表面的广泛表达。EP1498480提到了水解酶(包括DPP3)的潜在诊断和治疗用途。

DPP3不仅被提议作为潜在的生物标志物，而且由于其能够切割几种生物活性肽而作为潜在的治疗靶标。DPP3的过表达保护神经母细胞瘤细胞免受氧化应激(Liu等人，2007年)。Influenca A病毒改变宿主DPP3水平以进行自身复制(cell culture studies(细胞培养研究)，Meliopoulos等人，2012年)。一般的脑啡肽和/或血管紧张素降解酶，包括DPP3，具有作为治疗疼痛、心血管疾病(CVD)和癌症的靶标的治疗潜力，以及相应的抑制剂作为疼痛、精神疾病和心血管疾病的潜在治疗(Khaket等人，2012年；Patel等人，1993年；Igic等人，2007年)。

尽管将DPP3称为细胞内蛋白质，但在一些体液中检测到DPP3活性：胎盘后血清(Shimamori等人，1986年)、精浆(Vanha-Perttula等人，1988年)和CSF(Aoyagi等人，1993年)。在CSF中，在患有阿尔茨海默病(AD，Aoyagi等人，1993年)的患者中测量的DPP3活性水平升高。Wattiaux等人(2007年)提出细胞内DPP3的释放作为细胞培养系统中死亡和/或垂死细胞的标志物。还提出从坏死细胞中释放DPP3会影响小鼠模型中的免疫应答(Gamrekelashvili等人，2013年)。

发明内容

本发明的目的是提供用于特异性地确定体液样品中的活性DPP3的方法，即，确定活性DPP3但不确定DPP3以外的任何其它氨肽酶。

本发明的一个目的是提供相应的测定和试剂盒。

本发明的另一个目的是提供用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法以及治疗所述疾病的方法。

本发明的主题是用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法，其包括以下步骤：

·使所述样品与特异性结合全长DPP3的捕获结合剂接触，

·分离与所述捕获结合剂结合的DPP3，

·向所述分离的DPP3中添加DPP3的底物，

·通过测量DPP3底物的转化率来量化DPP3活性。

在本发明的一个具体实施方案中，所述方法是酶捕获测定(ECA，参见例如US5612186A、US5601986A)。

说明书中指定的所有定义和具体实施方案均应适用于本发明的所有方面和目的。应当理解，对于本发明的一个方面或目的，详细概括的定义和具体实施方案也应当是本发明的其它方面和目的的定义和具体实施方案，例如，捕获结合剂或特异性捕获的定义可适用于本发明的所有实施方案：例如，确定DPP3的方法、测定和试剂盒、诊断方法、治疗方法。在整个说明书中可以不重复这样的定义。

与全长DPP3特异性结合意指所述捕获结合剂不与DPP3之外的任何其它蛋白质结合。与全长DPP3特异性结合意指所述捕获结合剂不与DPP之外的任何其它氨肽酶结合。

与全长DPP3结合的结合剂是与SEQ ID No.1的蛋白质结合的结合剂。与全长DPP3结合的结合剂是与SEQ ID No.1结合的结合剂。

在一个具体实施方案中，所述捕获结合剂在液相测定中对DPP3活性的抑制小于50％，优选小于40％，优选小于30％。液相测定是其中DPP3对底物的裂解在液相中发生的测定。

根据本发明，可以如下地确定通过结合剂在液相测定中对DPP3活性的抑制：在液相测定中，将可能的DPP3捕获结合剂与重组或纯化的天然DPP3和特异性DPP3底物一起孵育。优选地，作为ECA的捕获结合剂，选择具有最小抑制能力的捕获剂。捕获结合剂对DPP3活性的抑制应小于50％，优选小于40％，优选小于30％。用于确定可能的捕获结合剂的抑制能力的特异性液相DPP3活性测定在实施例1中进行详细描述，并包括以下步骤：

·将25ng/ml重组GST-hDPP3与5μg/ml各自的捕获结合剂和缓冲液对照在50mM Tris-HCl，pH 7.5和100μM ZnCl₂中在室温下孵育1小时。

·添加荧光底物Arg-Arg-βNA(20μl，2mM)。

·在37℃下孵育并在1小时内监测Twinkle LB 970微孔板荧光计(BertholdTechnologies GmbH)中游离βNA的产生。通过在340nm处激发并测量在410nm处的发射来检测βNA的荧光。

·计算不同样品的荧光增加的斜率(以RFU/分钟为单位)。将缓冲液对照的GST-hDPP3的斜率指定为100％活性。将可能的捕获结合剂的抑制能力定义为通过与所述捕获结合剂一起孵育导致的GST-hDPP3活性的降低，以百分比计。

与此相反，固相测定是其中相应的结合事件发生在固相的测定(参见实施例4和5)。

为了清楚起见，用于确定活性DPP3的方法可以作为液相测定和固相测定进行。然而，根据上述过程，可以在液体测定中确定DPP3活性的抑制。

因此，固相测定是本发明的实施方案。使所述样品与特异性地结合全长DPP3的捕获结合剂接触可以在液相中发生(液相捕获测定)，然后分离步骤可以包括固定所述捕获结合剂-DPP3-复合物。或者，可以将捕获结合剂固定在表面上，并且结合事件-捕获结合剂与DPP3-在固相上进行(固相捕获测定)。

在一个具体实施方案中，为了防止DPP3的完全抑制和在前述液相测定中对DPP3活性的抑制小于50％，优选小于40％，优选小于30％，捕获结合剂应优选地不在SEQ ID No.1的316位至669位氨基酸的区处或通向所述区的区中与DPP3结合。SEQ ID No.1的316位至669位氨基酸区包括DPP3的活性中心和底物结合区域(Prajapati&Chauhan，2011年；Kumar等人，2016年)。

DPP3活性可以通过检测DPP3特异性底物的切割产物来测量。

已知的肽激素底物包括血管紧张素II、III和IV、亮氨酸脑啡肽、甲硫氨酸脑啡肽、内吗啡肽1和2、英洛芬(valorphin)、β-酪啡肽、强啡肽、原肠肽、ACTH(促肾上腺皮质激素)和MSH(黑素细胞刺激激素；等人，2000年；等人，2007年；Dhanda等人，2008年)。可以通过检测相应的切割产物来监测所提及的肽激素以及其它未加标签的寡肽(例如Ala-Ala-Ala-Ala，Dhanda等人，2008年)的切割。检测方法包括但不限于HPLC分析(例如，Lee&Snyder，1982年)、质谱法(例如，等人，2000年)、H1-NMR分析(例如，Vandenberg等人，1985年)、毛细管区带电泳(CE；例如，等人，2007年)、薄层色谱法(例如，Dhanda等人，2008年)或反相色谱法(例如，Mazocco等人，2006年)。

检测由DPP3对荧光底物的水解所引起的荧光是监测DPP3活性的标准程序。那些底物是与荧光团偶联的特异性二肽或三肽(Arg-Arg、Ala-Ala、Ala-Arg、Ala-Phe、Asp-Arg、Gly-Ala、Gly-Arg、Gly-Phe、Leu-Ala、Leu-Gly、Lys-Ala、Phe-Arg、Suc-Ala-Ala-Phe)。荧光团包括但不限于β-萘基酰胺(2-萘基酰胺、βNA、2NA)、4-甲氧基-β-萘基酰胺(4-甲氧基-2-萘基酰胺)和7-氨基-4-甲基香豆素(AMC、MCA；等人，2000年；Ohkubo等人，1999年)。这些荧光底物的切割分别导致荧光β-萘胺或7-氨基-4-甲基香豆素的释放。在液相测定，或者，ECA底物和DPP3以例如96孔板形式进行孵育，并使用荧光检测器(Ellis&Nuenke，1967年)来测量荧光。此外，可以将携带样品的DPP3固定并通过电泳在凝胶上分开，用荧光底物(例如Arg-Arg-βNA)和固深红GBC(Fast Garnet GBC)来染色凝胶，并通过荧光读取器检测荧光蛋白质条带(Ohkubo等人，1999年)。

相同的肽(Arg-Arg、Ala-Ala、Ala-Arg、Ala-Phe、Asp-Arg、Gly-Ala、Gly-Arg、Gly-Phe、Leu-Ala、Leu-Gly、Lys-Ala、Phe-Arg、Suc-Ala-Ala-Phe)可以与发色团如对硝基苯胺二乙酸酯偶联。由于显色底物水解引起的颜色变化的检测可用于监测DPP3活性。

检测DPP3活性的另一种选择是蛋白酶-Glo^TM测定(可在Promega商购获得)。在所述方法的该实施方案中，将DPP3特异性二肽或三肽(Arg-Arg、Ala-Ala、Ala-Arg、Ala-Phe、Asp-Arg、Gly-Ala、Gly-Arg、Gly-Phe、Leu-Ala、Leu-Gly、Lys-Ala、Phe-Arg、Suc-Ala-Ala-Phe)与氨基荧光素偶联。在通过DPP3切割后，释放氨基荧光素并且将其用作偶联荧光素酶反应的底物，该底物发出可检测的发光。

在优选的实施方案中，通过添加荧光底物Arg-Arg-βNA并实时监测荧光来测量DPP3活性。

在用于确定对象的体液样品中DPP3结合剂的抑制作用和/或DPP3活性的方法的一个具体实施方案中，所述结合剂可选自抗体、抗体片段或非IgG支架的组。

根据本发明的抗体是包括基本上由与抗原特异性结合的免疫球蛋白基因编码的一种或多种多肽的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA)、γ(IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄)、δ(IgD)、ε(IgE)和μ(IgM)恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白轻链的长度通常为约25kD或214个氨基酸。全长免疫球蛋白重链的长度通常为约50kD或446个氨基酸。轻链由在NH₂-端的可变区基因(长度约110个氨基酸)和在COOH-端的κ或λ恒定区基因编码。重链类似地由可变区基因(长度约116个氨基酸)和其它恒定区基因中的一个编码。

抗体的基本结构单元通常是四聚体，其由两对相同的免疫球蛋白链组成，每对具有一条轻链和一条重链。在每对中，轻链和重链可变区与抗原结合，并且恒定区介导效应子功能。免疫球蛋白还以多种其它形式存在，包括例如Fv、Fab和(Fab')₂，以及双功能杂交抗体和单链(例如，Lanzavecchia等人，1987年；Huston等人，1988年；Bird等人，1988年；Hood等人，1984年；Hunkapiller&Hood，1986年)。免疫球蛋白轻链或重链可变区包括被三个高变区(也称为互补决定区(CDR))中断的框架区(参见，Kabat等人，1983年)。如上所述，CDR主要负责与抗原的表位结合。免疫复合物是与抗原特异性结合的抗体，如单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，或功能性抗体片段。

嵌合抗体是通常通过基因工程从属于不同物种的免疫球蛋白可变区和恒定区基因构建轻链和重链基因的抗体。例如，来自小鼠单克隆抗体的基因的可变区段可以与人恒定区段如κ和γ1或γ3连接。在一个实例中，因此，治疗性嵌合抗体是由来自小鼠抗体的可变或抗原结合结构域和来自人抗体的恒定或效应子结构域构成的杂合蛋白质，但也可以使用其它哺乳动物物种，或者可变区可通过分子技术生产。制备嵌合抗体的方法是本领域公知的，例如，参见美国专利第5,807,715号。“人源化”免疫球蛋白是包括人框架区和来自非人(如小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。将提供CDR的非人免疫球蛋白称为“供体”，将提供框架的人免疫球蛋白称为“受体”。在一个实施方案中，所有CDR均来自人源化免疫球蛋白中的供体免疫球蛋白。不需要存在恒定区，但如果其存在，则其必须与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即，至少约85％至90％，如约95％或更多相同。因此，除了可能的CDR之外，人源化免疫球蛋白的所有部分基本上与天然人免疫球蛋白序列的相应部分相同。“人源化抗体”是包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。人源化抗体与提供CDR的供体抗体结合相同的抗原。人源化免疫球蛋白或抗体的受体框架可以具有通过取自供体框架的氨基酸进行的有限数量的替换。人源化或其它单克隆抗体可具有另外的保守氨基酸替换，这些替换对抗原结合或其它免疫球蛋白功能基本上没有影响。示例性的保守替换是诸如gly、ala；val、ile、leu；asp、glu；asn、gln；ser、thr；lys、arg以及phe、tyr的那些替换。人源化免疫球蛋白可以通过基因工程进行构建(例如，参见美国专利第5,585,089号)。人抗体是其中轻链和重链基因是人来源的抗体。可以使用本领域已知的方法产生人抗体。可以通过使分泌目的抗体的人B细胞永生化来生产人抗体。永生化可以，例如，通过EBV感染或通过将人B细胞与骨髓瘤或杂交瘤细胞融合以产生三源杂交瘤细胞来实现。人抗体也可以通过噬菌体展示方法产生(参见例如PCT公开No.WO91/17271；PCT公开No.WO92/001047；PCT公开No.WO92/20791，其通过引用并入本文)，或选自人组合单克隆抗体文库(参见Morphosys网站)。还可以通过使用携带人免疫球蛋白基因的转基因动物来制备人抗体(例如，参见PCT公开No.WO93/12227；PCT公开No.WO91/10741，其通过引用并入本文)。

因此，DPP3抗体可具有本领域已知的形式。实例是人抗体、单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、CDR接枝抗体。在一个优选的实施方案中，根据本发明的抗体是重组产生的抗体，例如IgG，典型的全长免疫球蛋白，或至少含有重链和/或轻链的F-可变结构域的抗体片段，例如化学偶联抗体(片段抗原结合)，包括但不限于Fab片段，包括Fab微型抗体、单链Fab抗体、带有表位标签的单价Fab抗体，例如，Fab-V5SX2；与CH3结构域二聚的二价Fab(微抗体)；二价Fab或多价Fab，例如借助异源结构域通过多聚化形成的，例如通过dHLX结构域的二聚形成的，例如Fab-DHLx-FSX2；F(ab‘)2-片段、scFv-片段、多聚化多价或/和多特异性scFv-片段、二价和/或双特异性双抗体、(双特异性T-细胞接合子)、三功能性抗体、多价抗体，例如来自不同于G的类别；单结构域抗体，例如来源于骆驼或鱼免疫球蛋白以及许多其它免疫球蛋白的纳米抗体。

除了抗DPP3抗体之外，其它生物聚合物支架用来复合靶分子在本领域是众所周知的，并且已经用于产生高度靶特异性的生物聚合物。实例是适体、镜像异构适体(spiegelmers)、anticalins和芋螺毒素(conotoxins)。

非Ig支架可以是蛋白质支架，并且可以用作抗体模拟物，因为其能够与配体或抗原结合。非Ig支架可以选自包括以下的组：基于四连接素的非Ig支架(例如，描述于US2010/0028995中)、纤连蛋白支架(例如，描述于EP1266025中)；基于脂质运载蛋白的支架((例如，描述于WO2011/154420中)；泛素支架(例如，描述于WO2011/073214中)、转移支架(例如，描述于US2004/0023334中)、蛋白A支架(例如，描述于EP2231860中)、基于锚蛋白重复的支架(例如，描述于WO2010/060748中)、微生物蛋白(microprotein)(优选地，微生物蛋白形成胱氨酸结)支架(例如，描述于EP2314308中)、基于Fyn SH3结构域的支架(例如，描述于WO2011/023685中)、基于EGFR-A结构域的支架(例如，描述于WO2005/040229中)和基于Kunitz结构域的支架(例如，描述于EP1941867中)。非Ig支架可以是肽或寡核苷酸适体。适体通常通过从大的随机序列库中选择其来产生，并且是寡核苷酸的短链(DNA、RNA或XNA；Xu等人，2010年，Deng等人，2014年)或附着于蛋白质支架的短的可变肽结构域(Li等人，2011年)。

在本发明的一个实施方案中，根据本发明的抗DPP3抗体可以如下来生产：

用重组DPP3(例如，来自USBio，Salem，USA的GST-hDPP3)、包含部分DPP3氨基酸序列的肽(例如，与BSA缀合的)或天然纯化的DPP3(例如，来自人红细胞，等人，1988年)来免疫小鼠。

在第0天，用100μg重组GST-hDPP3、天然纯化的hDPP3或DPP3-肽-BSA-缀合物在腹膜内(i.p.)注射Balb/c小鼠(在TiterMax Gold佐剂中乳化)，在第14天注射100μg(在完全弗氏佐剂中乳化)并且在第21天和第28天注射50μg(在不完全弗氏佐剂中)。在第49天，动物接受静脉内(i.v.)注射50μg溶解于盐水中的GST-hDPP3、天然纯化的hDPP3或DPP3-肽-BSA-缀合物。三天后处死小鼠并进行免疫细胞融合。

将来自免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系SP2/0的细胞与1ml50％聚乙二醇在37℃下融合30秒。在洗涤之后，将细胞接种在96孔细胞培养板中。通过在HAT培养基[补充有20％胎牛血清和HAT补充物的RPMI 1640培养基]中生长来选择杂交克隆。一周后，用HT培养基替换HAT培养基进行三代，然后返回正常细胞培养基。

融合后两周，对细胞培养上清液进行重组DPP3结合IgG抗体的初步筛选。因此，将带有GST标签的重组DPP3(USBiologicals，Salem，USA)固定在96孔板(100ng/孔)中，并在室温下与50μl细胞培养上清液/孔(即，每个孔)一起孵育2小时。在洗涤了板之后，添加50μl/孔的POD-兔抗小鼠IgG，并在室温下孵育1小时。在下一个洗涤步骤之后，向每个孔中添加50μl色原溶液(在柠檬酸盐/磷酸氢盐缓冲液中的3,7mM邻苯二胺，0.012％H₂O₂)，在室温下孵育15分钟并且通过添加50μl 4N硫酸终止显色反应。在490mm处检测吸收。

将测试阳性的微量培养物转移到24孔板中进行繁殖。在重新测试之后，使用限制性稀释技术克隆和再克隆所选择的培养物，并确定同种型。

针对带有GST标签的人DPP3或DPP3-肽产生的抗体通过标准抗体生产方法(Marx等人，1997年)来生产并通过蛋白A进行纯化。基于SDS凝胶电泳分析，抗体纯度≥90％。

可以借助于噬菌体展示根据以下程序生产抗体：

将人天然抗体基因文库HAL7/8用于针对DPP3肽分离重组单链F-可变结构域(scFv)。用淘选策略筛选抗体基因文库，所述淘选策略包括使用含有通过两个不同间隔区与DPP3肽序列连接的生物素标签的肽。将使用非特异性结合的抗原和抗生蛋白链菌素结合的抗原的混合淘选轮用于使非特异性结合剂的背景最小化。已经将来自第三轮淘选的洗脱的噬菌体用于产生表达单克隆scFv的大肠杆菌(E.coli)菌株。已经将来自这些克隆菌株培养的上清液直接用于抗原ELISA测试(还参见Hust等人，2011年；Schütte等人，2009年)。

可以根据以下程序进行鼠抗体的人源化：

对于鼠源抗体的人源化，针对框架区(FR)与互补决定区(CDR)和抗原的结构相互作用分析抗体序列。基于结构建模，选择适当的人源FR，并将鼠CDR序列移植到人FR中。可以引入CDR或FR的氨基酸序列的变化以重新获得结构相互作用，所述结构相互作用被FR序列的物种开关消除。这种结构相互作用的恢复可以通过使用噬菌体展示文库的随机方法或通过分子建模引导的定向方法来实现。(Almagro&Fransson，2008年)。

在替换的实施方案中，DPP3抗体形式选自包括Fv片段、scFv片段、Fab片段、scFab片段、F(ab)₂片段和scFv-Fc融合蛋白的组。在另一个优选的实施方案中，抗体形式选自包括scFab片段、Fab片段、scFv片段和其生物利用度优化的缀合物的组，如PEG化片段。

在所述用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法的一个具体实施方案中，所述结合剂是抗体。

在一个实施方案中，可以进行捕获测定或结合测定以检测和/或定量DPP3。可将与DPP3蛋白反应、但在液相测定中对肽酶活性的干扰不大于50％，优选小于40％，优选小于30％的结合剂固定在固相上。在一个实施方案中，为了防止DPP3的抑制，捕获结合剂应该优选地不与SEQ ID No.1的316位至669位氨基酸区中的DPP3结合。SEQ ID No.1的316位至669位氨基酸区包括DPP3的活性中心和底物结合区域(Prajapati&Chauhan，2011年；Kumar等人，2016年)。

在所述用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法的一个具体实施方案中，所述结合剂可以选自抗体、抗体片段、非Ig支架或适体的组。

在所述用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法的一个具体实施方案中，将与DPP3反应的所述捕获结合剂固定在固相上。

使测试样品经过固定的结合剂，并且DPP3(如果存在的话)与结合剂结合并且其本身被固定以用于检测。然后可以添加底物，并且可以检测反应产物以指示测试样品中DPP3的存在或量。出于本说明书的目的，术语“固相”可用于包括可在其中或在其上进行测定的任何材料或器皿，包括但不限于：多孔材料、无孔材料、试管、孔、载玻片、琼脂糖树脂(例如，来自GE Healthcare Life Sciences的Sepharose)、磁性颗粒(例如来自Thermo FisherScientific的Dynabeads^TM或Pierce^TM磁珠)等。

通过以下方法将蛋白质或肽来源的结合剂(例如，抗体、抗体片段、非Ig支架)固定在固相上，所述方法包括：物理吸附(例如，通过静电相互作用或疏水相互作用)、生物亲和固定化(例如，抗生物素蛋白-生物素、蛋白A/G/L、His-标签和Ni²⁺-NTA、GST-标签和谷胱甘肽、DNA杂交、适体)、共价键(例如，胺和N-羟基琥珀酰亚胺)或所述固定方法的组合(Kim&Herr，2013年)。寡核苷酸来源的结合剂(例如，适体)可以通过利用(链霉)抗生物素蛋白-生物素系统固定在固相上(Müller等人，2012年；Deng等人，2014年)。

在用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的所述方法的一个具体实施方案中，所述分离步骤是洗涤步骤，其从捕获的DPP3中移除未与所述捕获结合剂结合的样品成分。该分离步骤可以是将与所述捕获结合剂结合的DPP3与所述体液样品的成分分离的任何其它步骤。

在所述用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法的一个具体实施方案中，所述固定化DPP3的DPP3底物转化率通过选自以下的方法来测量(检测)：荧光底物(例如Arg-Arg-βNA、Arg-Arg-AMC)的荧光、显色底物的颜色变化、与氨基荧光素偶联的底物(Promega蛋白酶-Glo^TM测定)的发光、质谱、HPLC/FPLC(反相色谱、尺寸排阻色谱)、薄层色谱、毛细管区带电泳、凝胶电泳后进行活性染色(固定化、活性DPP3)或蛋白质印迹(切割产物)。

在所述用于确定对象体液样品中的活性DPP3的方法的一个具体实施方案中，所述底物可选自：血管紧张素II、血管紧张素III和血管紧张素IV、亮氨酸脑啡肽、甲硫氨酸脑啡肽、内吗啡肽1和内吗啡肽2、英洛芬、β-酪啡肽、强啡肽、原肠肽、ACTH和MSH或者与荧光团、发色团或氨基荧光素偶联的二肽和三肽(Promega Protease-Glo^TM测定)。由DPP3切割的二肽或三肽包括但不限于Arg-Arg、Ala-Ala、Ala-Arg、Ala-Phe、Asp-Arg、Gly-Ala、Gly-Arg、Gly-Phe、Leu-Ala、Leu-Gly、Lys-Ala、Phe-Arg、Suc-Ala-Ala-Phe。荧光团包括但不限于β-萘基酰胺(2-萘基酰胺、βNA、2NA)、4-甲氧基-β-萘基酰胺(4-甲氧基-2-萘基酰胺)和7-氨基-4-甲基香豆素(AMC、MCA；等人，2000；Ohkubo等人，1999年)。这些荧光底物的切割分别导致荧光β-萘胺或7-氨基-4-甲基香豆素的释放。发色团包括但不限于对硝基苯胺二乙酸酯(pNA)。显色底物中肽-pNA键的水解导致pNA的释放，pNA则又改变颜色。因此，吸光度的变化(DA/分钟)与酶活性成正比。使用来自Promega的Protease-Glo^TM测定，在由DPP3切割后，氨基荧光素被释放并用作发射可检测发光的偶联荧光素酶反应的底物。

在优选的实施方案中，通过添加荧光底物Arg-Arg-βNA并实时监测荧光来测量DPP3活性。在所述用于确定对象体液样品中的活性DPP3的方法的一个具体实施方案中，所述样品选自全血、血清、血浆、脑脊髓液、尿液、唾液、痰液和胸腔积液。

在所述用于确定对象体液样品中的活性DPP3的方法的一个具体实施方案中，所述样品是选自全血、血清和血浆的血液样品。

本发明的另一个实施方案是用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的测定或试剂盒，其包含：

·与全长DPP3特异性结合的捕获结合剂，

·DPP3的底物。

所述试剂盒可以另外包含校准物：

·校准物可以是具有已知DPP3浓度的样品(天然的、纯化的或重组的)；

·校准物可以是裂解产物本身，如游离荧光团(例如，2-萘胺)、游离发色团(例如，对硝基苯胺)或游离荧光素。

所述试剂盒可以另外包含洗涤试剂：

·洗涤剂(可以是含洗涤剂或不含洗涤剂的任何含水缓冲溶液。这里我们使用8mMTris-HCl，pH7,5、60mM NaCl、0.02％吐温20)。

在一个具体实施方案中，所述测定是酶捕获测定(ECA，例如US5612186A，US5601986A)。

在一个具体实施方案中，所述与全长DPP3结合的捕获结合剂在液相测定中特异性地抑制小于50％的DPP3活性，优选小于40％，更优选小于30％。关于液相测定的定义，参见上文。在防止DPP3抑制的一个具体实施方案中，所述捕获结合剂不应在活性中心和底物结合区(SEQ ID No.1的316位至669位氨基酸)周围区域与DPP3结合。

在所述用于确定对象体液样品中的活性DPP3的测定或试剂盒的一个具体实施方案中，所述结合剂可选自抗体、抗体片段或非Ig支架。

在所述用于确定对象体液样品中的活性DPP3的测定和试剂盒的一个具体实施方案中，所述结合剂是抗体。

术语“抗体”通常包含单克隆和多克隆抗体及其结合片段，特别是Fc片段以及所谓的“单链抗体”(Bird等人，1988年)、嵌合抗体、人源化抗体，特别是CDR-接枝抗体以及三抗体或四抗体(Holliger等人，1993年)。还包括通过包括例如噬菌体展示的技术所选择的免疫球蛋白样蛋白质，以与样品中包含的目的分子特异性结合。在本文中，术语“特异性结合”是指针对目的分子或其片段产生的抗体。如果抗体对目的分子或其前述片段的亲和力是对在含有目标分子的样品中包含的其它分子的亲和力的优选至少50倍，更优选100倍，最优选至少1000倍，则认为抗体是特异性的。本领域公知的是，如何制备抗体并选择具有给定特异性的抗体。

在所述用于确定对象体液样品中的活性DPP3的测定和试剂盒的一个具体实施方案中，将所述捕获结合剂固定在表面上。

在所述用于确定对象体液样品中的活性DPP3的测定和试剂盒的一个具体实施方案中，所述底物可选自：血管紧张素II、血管紧张素III和血管紧张素IV、亮氨酸脑啡肽、甲硫氨酸脑啡肽、内吗啡肽1和内吗啡肽2、英洛芬、β-酪啡肽、强啡肽、原肠肽、ACTH和MSH或者与荧光团、发色团或氨基荧光素偶联的二肽和三肽(Promega Protease-Glo^TM测定)。由DPP3切割的二肽或三肽包括但不限于Arg-Arg、Ala-Ala、Ala-Arg、Ala-Phe、Asp-Arg、Gly-Ala、Gly-Arg、Gly-Phe、Leu-Ala、Leu-Gly、Lys-Ala、Phe-Arg、Suc-Ala-Ala-Phe。荧光团包括但不限于β-萘基酰胺(2-萘基酰胺、βNA、2NA)、4-甲氧基-β-萘基酰胺(4-甲氧基-2-萘基酰胺)和7-氨基-4-甲基香豆素(AMC、MCA；等人，2000年；Ohkubo等人，1999年)。这些荧光底物的切割分别导致荧光β-萘胺或7-氨基-4-甲基香豆素的释放。发色团包括但不限于对硝基苯胺二乙酸酯(pNA)。显色底物中肽-pNA键的水解导致pNA的释放，pNA则又改变颜色。因此，吸光度的变化(DA/分钟)与酶活性成正比。使用来自Promega的Protease-Glo^TM测定，在由DPP3切割后，氨基荧光素被释放并用作发射可检测发光的偶联荧光素酶反应的底物。

在所述用于确定对象体液样品中的活性DPP3的测定和试剂盒的一个具体实施方案中，所述校准物选自：A)重组DPP3(例如，来自USBio的GST-hDPP3)、纯化的天然DPP3(例如，来自人红细胞，等人，1988年)或DPP3片段(天然的、合成的或重组的)；B)切割产物本身：游离荧光团(例如，2-萘胺)、游离发色团(例如，对硝基苯胺)或游离荧光素，用于荧光、颜色变化和生物发光信号的定量。

使用DPP3作为诊断生物标志物的本发明的一个实施方案包括多种形式的免疫测定，例如放射免疫测定(RIA)、化学发光和荧光免疫测定、酶联免疫测定(ELISA)、基于Luminex的珠阵列、蛋白质微阵列测定和快速测试形式，例如免疫色谱条带测试。

测定可以是均相或非均相测定，竞争性和非竞争性夹心测定。在使用根据本发明的两种抗体的特别优选的实施方案中，所述测定是夹心测定的形式，其是非竞争性免疫测定，其中待检测和/或待定量的DPP3或其片段与第一抗体和第二抗体结合。第一抗体可以与固相结合，例如，珠子、孔或其它容器的表面、小片或条带，第二抗体是被标记的抗体，例如，用染料、放射性同位素或反应性或催化活性部分标记的抗体。然后通过适当的方法测量与分析物结合的标记抗体的量。涉及“夹心测定”的一般组合物和程序是公认的并且是技术人员已知的。(The Immunoassay Handbook(《免疫分析手册》)，Ed.David Wild，2005年；Hultschig等人，2006年)。

在特别优选的实施方案中，所述测定包含液体反应混合物，其中第一标记组分与第一抗体连接，其中所述第一标记组分是基于荧光-或化学发光-猝灭或扩增的标记系统的一部分，并且所述标志系统的第二标记组分与第二抗体连接，以使得在两种抗体与分析物结合后，产生可测量的信号，该信号允许在包含样品的溶液中检测形成的夹心复合物。

在本发明的上下文中，基于荧光的测定包括使用染料，染料可以例如选自包括以下的组：FAM(5-羧基荧光素或6-羧基荧光素)、VIC、NED、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、IRD-700/800、花青染料，如CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7、氧杂蒽(Xanthen)、6-羧基-2',4',7',4,7-六氯荧光素(HEX)、TET、6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲酰荧光素(JOE)、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹明、罗丹明绿、罗丹明红、罗丹明110、BODIPY染料，如BODIPY TMR、俄勒冈绿、香豆素如伞形酮、苯酰亚胺如Hoechst33258；菲啶类，如得克萨斯红、亚基马黄、Alexa Fluor、PET、菲啶溴红、吖啶鎓染料、咔唑染料、吩恶嗪染料、紫菜碱染料、聚甲基碘染料等。

在本发明的上下文中，基于化学发光的测定包括使用染料，基于Kirk-Othmer中的化学发光材料所述的物理原理，Encyclopedia of chemical technology(《化学技术百科全书》)，第四版，执行编辑，J.I.Kroschwitz；编辑，M.Howe-Grant，John Wiley&Sons，1993年,第15卷，第518至562页，其通过引用并入本文，包括第551至562页的引文。优选的化学发光染料是吖啶酯。

本发明的一个实施方案涉及DPP3的化学测定。所述测定使用酶底物，其与DPP3反应以形成可检测的反应产物。或者，可以监测底物的反应速率以确定测试样品中DPP3的存在或量。合适的酶底物包括但不限于二肽底物如Arg-Arg-β-NA或Arg-Arg-AMC。

体现这样的试剂和反应的测定可以在任何合适的反应器皿中进行，例如，微量滴定板的试管或孔。或者，可以开发一次性形式的测定装置，如测验片(dipstick)或测试条装置形式，其为本领域技术人员所公知，并且易于制造和使用。这种一次性测定装置可以以包含所有必需材料、试剂和使用说明的试剂盒的形式包装。

可以将本发明的测定装置有利地设计为测验片或测试条装置的形式。例如，测验片可以由包含用于DPP3的显色底物的一块吸水材料制成。或者，测验片可以由其上涂覆有底物的无孔材料制成。在使装置与期望的测试样品接触后，底物与样品中存在的任何DPP3将相互作用以在装置上形成可检测的反应。

在一个替代实施方案中，所述装置可以是测试条，其中底物沿着吸水材料条的长度包含在一个或多个区带(zone)中。在吸水材料条的一端与期望的测试样品接触时，液体样品沿着吸水材料迁移。底物的反应和可检测信号的产生表明测试样品中存在DPP3。在多区带装置中，产生可检测信号的沿着条带长度的离散或隔离区带的数量也可以指示测试样品中存在的DPP3的量。或者，测试条的大部分可包含底物。在具有这样的单个、细长底物区带的测试条中形成的着色反应的长度可用于指示测试样品中DPP3的存在或量。

在替换的测定实施方案中，可以检测反应发生的速率，作为测试样品中存在的DPP3的量的指示。例如，底物反应的速率可用于指示测试样品中存在的DPP3的量。或者，形成反应产物的速率可用于指示测试样品中存在的DPP3的量。

在又一个实施方案中，可以进行捕获测定或结合测定以检测和/或定量蛋白酶。例如，可以将与DPP3蛋白反应但不干扰肽酶活性的抗体固定在固相上。使测试样品经过固定的抗体，并且DPP3(如果存在的话)与抗体结合并且其本身被固定以用于检测。然后可以添加底物，并且可以检测反应产物以指示测试样品中DPP3的存在或量。对于本说明书，术语“固相”可用于包括可以在其中或在其上进行测定的任何材料或器皿，并且包括但不限于多孔材料、无孔材料、试管、孔、载玻片等。

在另一个具体的实施方案中，DPP3ECA可以执行为测试条测定。在示例性测试条装置中，将测试样品施加垫可选地附接到多孔条带的一端。条带含有固定的抗体，抗体将与DPP3结合并因此将DPP3固定在预定位点以用于随后的检测。可选地，所述装置可包括测定结束指示剂，该测定结束指示剂位于测试条的远端，远离测试样品接触位点。测定结束指示剂在与测试样品或测定试剂接触时产生可检测的信号，从而指示测定完成。

测试样品施加垫可以是多孔条带本身的一部分或者是与多孔条带的端部(称为近端)进行流体流动接触的材料，以使得测试样品可以从施加垫通过或迁移到多孔条带。流体流动接触可以包括施加垫与多孔条带的物理接触以及通过介入空间或另外的材料将施加垫与多孔条带分离，其仍然允许流体在施加垫与多孔条带之间流动。基本上所有的施加垫都可以与多孔条带重叠，以使测试样品能够基本上通过施加垫的任何部分到达多孔条带的近端。或者，仅一部分施加垫可与多孔条带流体流动接触。施加垫可以是能够将测试样品转移到多孔条带的任何材料。

测定装置的多孔条带可以是任何合适的吸收性、多孔的、吸水的、色谱的处理材料或毛细管处理材料，含有分析物的测试样品可以通过毛细管或芯吸作用运输通过所述材料。可将合成改性的天然、合成或天然存在的材料用作多孔条带，这些材料包括但不限于：纤维素材料如纸、纤维素和纤维素衍生物如醋酸纤维素和硝酸纤维素；玻璃纤维；布，天然存在的(例如，棉)和合成的(例如，尼龙)两者；多孔凝胶，如硅胶、琼脂糖、葡聚糖和明胶；多孔纤维基质；淀粉基材料，如交联葡聚糖链；陶瓷材料；聚氯乙烯膜；以及聚氯乙烯-二氧化硅的组合，等等。多孔条带不应干扰可检测信号的产生。多孔条带应具有合理的固有强度，或者可通过补充支撑提供强度。

多孔条带的特定尺寸将是方便的，取决于所涉及的测试样品的尺寸、测定方案、用于检测和测量信号的工具等。例如，可以选择尺寸以调节流体迁移的速率以及由多孔条带吸收的测试样品的量。

在本发明的一种可能的测试条装置中，可以将DPP3底物和/或DPP3捕获抗体固定在多孔条带上以形成至少一个分析物检测位点，即，具有非扩散性附着于其上的一种或多种分析试剂的多孔条带区。在另一个装置实施方案中，测试条的测量或检测区可包括含有DPP3底物和/或固定的抗DPP3抗体的多个位点。可选地，不同的检测位点可含有不同量的底物和/或固定的抗DPP3抗体，即，第一检测位点中的量较高，后续位点中的量较少。例如，如果20纳克抗体捕获1nmol/分钟/ml的DPP3当量，那么测定装置的第一个检测位点可包含50纳克抗DPP3抗体，而后续位点包含10纳克、20纳克、30纳克等纳克抗体。在添加测试样品后，显示可检测信号的位点数量提供样品中存在的DPP3量的定量指示。可以将检测位点构造成任何合适的可检测的形状，并且通常为跨测试条宽度的条形。

可选地，可以制备多捕获位点装置，以使得如果测试样品中不存在阈值量的DPP3，则基本上所有DPP3都将与第一捕获位点中的抗体结合并因此固定在该位点处。如果测试样品中存在大于阈值量的DPP3，则剩余的DPP3将沿着测试条的长度与固定化抗体的后续检测区结合。测试样品中DPP3的量越大，由于DPP3的存在将显示可检测信号的捕获位点的数量就越大。如本领域技术人员将理解的，还可以生产包含多个DPP3底物位点的装置，其中设计单个位点中的底物量以产生定量的或半定量的测定结果。

本发明的另一个重要实施方案是用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其包括：

·确定所述对象的体液样品中的总DPP3量或确定所述对象的体液样品中的活性DPP3的量，

·将所述确定的量与预定阈值进行比较，

·其中如果所述确定的量高于所述预定阈值，则将所述对象诊断为患有伴有坏死过程或与坏死过程相关的疾病或病症。

在所述用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法的一个具体实施方案中，所述总DPP3的量或活性DPP3的量以浓度单位进行确定。

确定总DPP3的量或活性DPP3的量的方法是本领域已知的。在根据本发明的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法的上下文中，可以使用现有技术的方法和测定，或者可以使用上述用于确定DPP3的方法和测定。

通过测量健康对照中的DPP3浓度和或DPP3活性并计算例如相应的75-百分位数、更优选90-百分位数、甚至更优选95-百分位数来预先确定阈值。75-百分位数、更优选90-百分位数、甚至更优选95-百分位数的上边界限定了健康患者相对于患病患者的阈值。关于所述百分位数，在血浆中使用夹心型抗DPP3免疫测定在健康患者和患病患者之间划分的阈值可以为5ng/ml至25ng/ml、更优选7ng/ml至20ng/ml、更优选8ng/ml至18ng/ml、最优选10ng/ml至15ng/ml之间(参见实施例3)。在血浆中的DPP3特异性酶捕获活性测定中，在健康患者和患病患者之间划分的阈值可以为0.5至2nmolβNA min^-1ml^-1、更优选0.7至1.8nmolβNAmin^-1ml^-1、更优选0.8至1.5nmolβNA min^-1ml^-1、最优选1.0至1.3nmolβNA min^-1ml^-1之间(参见

实施例5)。

本领域技术人员知道如何从先前进行的研究中确定阈值。本领域技术人员知道特定阈值可以取决于用于计算预定阈值的群组，该预定阈值可以后续用于例行程序中。本领域技术人员知道特定阈值可取决于测定中使用的校准。本领域技术人员知道特定阈值可取决于似乎从业者可接受的敏感性和/或特异性。

诊断测试的敏感性和特异性不仅只取决于测试的分析“质量”，它们也取决于关于什么组成了返常结果的定义。在实践中，接收者操作特征曲线(ROC曲线)通常通过将“正常”群体(即表观健康)和“患病”群体(即经受感染的患者)中的变量值对其相关频率作图来计算。根据要解决的特定诊断问题，参考组不一定必须是“正常”，而是可能是经受另一种疾病或病症的一组患者，从中区分目的患病组。对于任何特定标记物，有或没有疾病的对象的标记物水平分布可能会重叠。在这种情况下，测试并不能以100％精确度绝对区分正常和患病，且重叠的区域表明测试不能区分正常和患病的部分。选择阈值，在阈值之上(或在阈值之下，取决于标记物如何随疾病变化)则认为测试是反常的，而在阈值之下则认为测试是正常的。位于ROC曲线以下的面积是所认知的测量能够正确识别病症的概率的度量。即使当测试结果不一定给出一个精确的数字时，也可以使用ROC曲线。只要能够对结果排序，就可以创建ROC曲线。例如，关于“患病”样品的测试结果可以根据程度排序(例如，1＝低，2＝正常，以及3＝高)。该排序可以与“正常”群体中的结果相关联，并创建出ROC曲线。这些方法在本领域是公知的(参见，例如Hanley等人，1982年)。优选地，选择阈值来提供大于约0.5，更优选大于约0.7的ROC曲线面积。本上下文中的术语“约”是指给定测量的+/-5％。

一旦通过使用先前的研究群组并考虑所有上述点来确定阈值，则医师将使用根据本发明的用于诊断疾病的方法的预定阈值并且将确定是否对象具有高于或低于所述预定阈值的值，以便进行适当的诊断。

可以使用多种市售DPP3ELISA试剂盒(例如，来自LifeSpan BioSciences)测量组织匀浆和体液中的DPP3浓度。这些测定均基于夹心测定原理并仅用于研究用途。

测量DPP3水平的标准程序是在液相测定中使用荧光底物(例如，Arg-Arg-β-萘酰胺)确定DPP3活性(Ellis&Nuenke，1967年)。市售试剂盒(例如，来自BPS Bioscience)通常含有低结合黑色微量滴定板、重组DPP3、荧光底物和相应的缓冲液。这些试剂盒经常用作DPP3底物和抑制剂的筛选测定。

在所述用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法的一个具体实施方案中，所述样品选自全血、血清和血浆。在本发明的方法的上下文中的体液还可选自血液、血清、血浆、脑脊髓液、尿液、唾液、痰液和胸腔积液。

本文中的坏死过程由体内所有导致细胞死亡和DPP3从细胞质释放到细胞外空间和/或体液中的过程来定义。这些过程包括但不限于坏死、细胞凋亡、坏死性凋亡、红细胞衰亡。

在所述用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法的一个具体实施方案中，所述疾病选自：心力衰竭、慢性心力衰竭、急性心力衰竭(AHF)、心肌梗塞(MI)、中风、肝衰竭、烧伤、外伤、严重感染(微生物、病毒(例如，AIDS)、寄生虫(例如，疟疾))或SIRS或败血症、癌症、急性肾损伤(AKI)、中枢神经系统(CNS)障碍(例如，癫痫、神经退行性疾病)、自身免疫疾病、血管疾病(例如，川崎综合症)和低血压。表1列出了伴有坏死过程或与坏死过程相关的临床症状/疾病和相应的坏死事件。

在另一个实施方案中，所述疾病选自：急性心力衰竭(AHF)、心肌梗塞(MI)、肝衰竭、烧伤、严重感染(微生物、病毒(例如，AIDS)、寄生虫(例如，疟疾))或SIRS或败血症、癌症和急性肾损伤(AKI)。

在一个实施方案中，所述疾病是低血压。

表1：伴有坏死过程或与坏死过程有关的疾病。

细胞凋亡是可能发生在多细胞生物体中的程序性细胞死亡(PCD)的过程。生化事件导致特征性细胞变化(形态学)和死亡。这些变化包括起泡、细胞皱缩、核碎裂、染色质凝聚和染色体DNA片段化。有关评论参见Elmore，2007年。

坏死是一种细胞损伤的形式，其通过自溶导致活组织中细胞的过早死亡(Vanlangenakker等人，2008年)。坏死是由细胞或组织外部的因素(例如，感染、毒素或创伤)引起的，其导致细胞组分的不受调节的消化。

虽然细胞凋亡通常对机体产生有益作用，但是坏死几乎总是有害的并且可能是致命的。

由坏死导致的细胞死亡不遵循凋亡信号转导途径，而是各种受体被激活，并导致细胞膜完整性丧失和细胞死亡产物不受控制地释放到细胞外空间。这会在周围组织中引发炎症反应，防止附近的吞噬细胞通过吞噬作用定位和消除死亡细胞。由于这个原因，通常需要手术除去坏死组织，即，已知为清创术过程。未治疗的坏死导致在细胞死亡部位处或附近分解死亡组织和细胞碎片的累积。

称为坏死性凋亡的程序性坏死形式已被认为是程序性细胞死亡的另一种形式。当凋亡信号被内源性因子或外源性因素如病毒或突变阻断时，坏死性凋亡可作为细胞凋亡的细胞死亡后备(Linkermann等人，2014年)。最近，还发现了其他类型的调节性坏死，其与坏死性凋亡和细胞凋亡共享多种信号传导事件(Vanden Berghe等人，2014年)。

心力衰竭(HF)是当心脏的结构或功能问题损害其提供充足血流以满足身体需求的能力时发生的心脏病症。它可引起多种症状，特别是在休息或运动期间的呼吸短促(SOB)、体液潴留的迹象(例如，肺充血或踝关节肿胀)、以及静息时心脏结构或功能异常的客观证据。

心力衰竭是一种临床综合征，其特征是由心脏功能障碍引起的症状和体征的荟萃。它是发达国家发病率和死亡率的主要原因之一，患病率为1％至2％。心力衰竭可分为慢性HF和急性HF。患有慢性HF的患者可分为稳定的慢性HF、慢性HF的恶化体征和症状以及慢性HF的急性失代偿。急性心力衰竭(AHF)被定义为导致需要紧急治疗或住院治疗的心力衰竭的体征和症状的快速发作。AHF可呈现为急性新创HF(无先前已知的心功能不全的患者中AHF的新发病)或慢性AHF的急性代偿失调。AHF是超过65岁的成人住院的主要原因。尽管在过去数十年中主要与治疗进展相关的慢性心力衰竭患者的预后显著改善，但是一旦患者因失代偿性心力衰竭住院，短期和长期结果仍然非常差。住院治疗后30天内接受AHF住院的患者中有近25％需要再入院，而住院后超过5年的患者存活率<50％。除了显著降低受影响患者的生存和生活质量外，AHF对医疗保健系统的经济负担也是巨大的。仅在美国，在2012年心力衰竭护理的总费用估计为$310亿，其大部分费用与住院治疗相关。由于人口老龄化，预计2030年这笔费用将增加到前所未有的$700亿。

心力衰竭包括广泛的患者，从通常被认为≥50％的正常左心室射血分数(LVEF)的患者(也称为具有保留的EF的HF(HFpEF))到通常被认为是<40％的LVEF降低的患者(也称为具有降低的EF的HF(HFrEF))。LVEF范围为40％至49％的患者代表“灰色区域”，其定义为具有中等EF的HF(HFmrEF)(Ponikowski等人，2016年)。

心力衰竭可能发生在急性心力衰竭或慢性心力衰竭中。

术语“急性”用于意指快速发作并描述恶化或失代偿性心力衰竭，指的是患者可被表征为心力衰竭体征和症状改变导致需要紧急治疗或住院治疗的事件。

术语“慢性”是指持续时间长。慢性心力衰竭是一种长期病症，通常通过治疗症状保持稳定(稳定的慢性HF)。

稳定的慢性HF的特征是：

(i)存在心脏的损害其提供充足血流以满足身体需求的能力的结构或功能衰竭，

(ii)没有体积超负荷(表现为肺和/或全身性充血)和/或心输出量严重下降(表现为低血压、肾功能不全和/或休克综合征)，而患者不需要紧急治疗或治疗调整并且不需要住院治疗。

具有恶化体征和症状的慢性HF的特征是：

(ii)存在体积超负荷(表现为肺和/或全身性充血)和/或心输出量严重下降(表现为低血压、肾功能不全和/或休克综合征)，而患者不需要紧急治疗并且不需要住院治疗，但是需要治疗调整。

慢性心力衰竭也可能失代偿(称为急性失代偿性心力衰竭或急性失代偿性慢性心力衰竭)，最常见的原因是并发疾病(例如，肺炎)、心肌梗塞、心律失常、未控制的高血压或患者未能保持流体限制、饮食或药物治疗。治疗之后，急性失代偿性慢性HF患者可恢复到稳定的慢性代偿状态(稳定的慢性HF)。

新发急性HF和急性失代偿性慢性HF的特征是：

(ii)存在体积超负荷(表现为肺和/或全身性充血)和/或心输出量严重下降(表现为低血压、肾功能不全和/或休克综合征)，而患者需要紧急治疗或治疗调整，并且需要住院治疗。

急性心力衰竭的上述定义，即新发AHF或急性失代偿性HF或急性失代偿性慢性HF或慢性心力衰竭的恶化症状/体征符合Voors等人在2016年所阐述的。

在所述用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法的一个具体实施方案中，可以使用液相活性测定或使用酶捕获活性测定来确定DPP3活性。

在液相测定中，体液的测定样品直接经受荧光底物(例如，Arg-Arg-β-NA)。由于血浆中存在许多不同的氨基肽酶(Sanderink等人，1988年)，所以所用的底物可能被DPP3以外的肽酶切割。为了避免这个问题，检测特异性DPP3活性的一种优选方法是使用酶捕获活性测定。

在一个具体实施方案中，酶捕获测定中活性DPP3的确定包括以下步骤：

·使所述样品与结合至全长DPP3但是优选在液相测定中抑制小于50％、优选小于40％、更优选小于30％的DPP3活性的捕获结合剂接触。为了防止DPP3的抑制，捕获结合剂不应在活性中心和底物结合区(SEQ ID No.1的316位至669位氨基酸)周围区域与DPP3结合。

·将与所述捕获结合剂结合的DPP3和体液样品分离，

·将DPP3的底物添加到所述分离的DPP3中，

·通过测量DPP3的底物的转化率来量化DPP3活性，

·与非患病对照相比，测量信号的评估。阈值可以是预先确定的，例如，通过测量健康对照中的DPP3浓度和或DPP3活性并计算相应75百分位数。75百分位数的上边界限定健康患者相对于患病患者的阈值。

在一个具体实施方案中，根据本发明的上述方法进行活性DPP3的确定。

在所述用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法的一个具体实施方案中，所述结合剂可选自抗体、抗体片段或非IgG支架。

在所述用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法的一个具体实施方案中，是酶捕获测定(ECA，US5612186A，US5601986A)。该测定中的DPP3的结合剂是抗体。

在所述用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法的一个具体实施方案中，将所述捕获结合剂固定在表面上。可以将与DPP3蛋白反应但不干扰肽酶活性超过50％、优选低于40％、优选低于30％的结合剂固定在固相上。为了防止DPP3的抑制，捕获结合剂不应在活性中心和底物结合区(SEQ ID No.1的316位至669位氨基酸)周围区域与DPP3结合。

在所述用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法的一个具体实施方案中，所述结合剂可选自抗体、抗体片段、非Ig支架或适体。

使测试样品经过固定的结合剂，并且DPP3(如果存在的话)与结合剂结合并且其本身被固定以用于检测。然后可以添加底物，并且可以检测反应产物以指示测试样品中DPP3的存在或量。对于本说明书，术语“固相”可用于包括可在其中或在其上进行测定的任何材料或器皿，包括但不限于：多孔材料、无孔材料、试管、孔、载玻片、琼脂糖树脂(例如，来自GEHealthcare Life Sciences的Sepharose)、磁性颗粒(例如来自Thermo FisherScientific的Dynabeads^TM或Pierce^TM磁珠)等。

在所述用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法的一个具体实施方案中，其中所述分离步骤是洗涤步骤，其从所述捕获的DPP3中移除未与所述捕获结合剂结合的样品成分。

在所述用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法的一个具体实施方案中，所述DPP3底物转化率通过选自以下的方法来测量：荧光底物的荧光(例如，Arg-Arg-2NA、Arg-Arg-AMC)、显色底物的颜色变化、与氨基荧光素偶联的底物的发光(Promega蛋白酶-Glo^TM测定)、质谱、HPLC/FPLC(反相色谱、尺寸排阻色谱)、薄层色谱、毛细管区带电泳、凝胶电泳后的活性染色(固定化、活性DPP3)或蛋白质印迹(切割产物)。

在所述用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法的一个具体实施方案中，所述底物可选自：血管紧张素II和血管紧张素III、亮氨酸脑啡肽、甲硫氨酸脑啡肽、内吗啡肽1和内吗啡肽2、英洛芬、β-酪啡肽、强啡肽、原肠肽、ACTH和MSH或者与荧光团、发色团或氨基荧光素偶联的二肽和三肽(Promega Protease-GloTM测定)。由DPP3切割的二肽或三肽包括但不限于Arg-Arg、Ala-Ala、Ala-Arg、Ala-Phe、Asp-Arg、Gly-Ala、Gly-Arg、Gly-Phe、Leu-Ala、Leu-Gly、Lys-Ala、Phe-Arg、Suc-Ala-Ala-Phe。荧光团包括但不限于β-萘基酰胺(2-萘基酰胺、βNA、2NA)、4-甲氧基-β-萘基酰胺(4-甲氧基-2-萘基酰胺)和7-氨基-4-甲基香豆素(AMC、MCA；Abramic等人，2000年；Ohkubo等人，1999年)。这些荧光底物的切割分别导致荧光β-萘胺或7-氨基-4-甲基香豆素的释放。发色团包括但不限于对硝基苯胺二乙酸酯(pNA)。显色底物中肽-pNA键的水解导致pNA的释放，pNA则又改变颜色。因此，吸光度的变化(DA/分钟)与酶活性成正比。使用来自Promega的Protease-GloTM测定，在由DPP3切割后，氨基荧光素被释放并用作发射可检测发光的偶联荧光素酶反应的底物。

在一个优选的实施方案中，通过添加荧光底物Arg-Arg-βNA并实时监测荧光来测量DPP3活性。

本发明的另一个重要的实施方案是用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性的抑制剂。

抑制剂是优选显著地抑制DPP3活性的分子。这些分子可以是肽和小分子(参见表2)或抗体(参见表3)。显著地抑制意味着在如上所述的液相测定中抑制大于80％、优选大于90％、更优选几乎或实际上100％抑制。

DPP3的肽抑制剂包括但不限于：自旋蛋白，自旋蛋白的合成衍生物(tynorphin和其他肽，参见表2；Yamamoto等人，2000年)，propioxatin A和propioxatin B(US4804676)和合成propioxatin A类似物(Inaoka等人，1988年)。

DPP3的小分子抑制剂包括但不限于fluostatin和苯并咪唑衍生物。FluostatinsA和Fluostatins B是在链霉菌属(Streptomyces sp.)TA-3391中产生的抗生素，其是无毒性的并强烈地抑制DPP3活性。迄今为止，已合成并公开了20种不同的苯并咪唑衍生物(Agic等人，2007年；Rastija等人，2015年)，其中两种化合物1'和4'显示出最强的抑制作用(Agic等人，2007年)。

表2：DPP3的肽和小分子抑制剂

在本发明的一个优选实施方案中，所选择的抑制剂对DPP3是药学上可接受的、选择性的和/或特异性的，并且不穿过细胞膜和/或血脑屏障。DPP3的选择性和特异性抑制剂不与其他蛋白质/酶结合或与其他蛋白质/酶结合，并且不抑制除DPP3之外的任何其他酶/蛋白酶/肽酶。小肽可以被非特异性氨肽酶结合和切割，小分子抑制剂容易穿过细胞膜和血脑屏障。抗DPP3抗体、抗DPP3抗体片段或抗DPP3非Ig支架特异性地和选择性地结合DPP3，并且不穿过细胞膜或血脑屏障。因此，优选的DPP3活性抑制剂是特异性抗DPP3抗体、抗体片段或非Ig支架。

在本发明的一个具体实施方案中，DPP3活性抑制剂用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症，其中所述抑制剂选自抗DPP3抗体或抗DPP3抗体片段或抗DPP3非Ig支架。

在本发明的一个具体实施方案中，DPP3活性抑制剂或效应子用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症，其中所述疾病选自心力衰竭、慢性心力衰竭、急性心力衰竭(AHF)、心肌梗塞(MI)、中风、肝衰竭、烧伤、外伤、严重感染(微生物、病毒(例如，AIDS)、寄生虫(例如，疟疾))或SIRS或败血症、癌症、急性肾损伤(AKI)、中枢神经系统(CNS)障碍(例如，癫痫、神经退行性疾病)、自身免疫疾病、血管疾病(例如，川崎综合症)和低血压。

在另一个实施方案中，所述疾病选自急性心力衰竭(AHF)、心肌梗塞(MI)、肝衰竭、烧伤、严重感染(微生物、病毒(例如，AIDS)、寄生虫(例如，疟疾))或SIRS或败血症、癌症和急性肾损伤(AKI)。

在本发明的一个具体实施方案中，DPP3活性抑制剂用于预防对象的疾病或病症，其中疾病或病症是急性心力衰竭(AHF)、心肌梗塞(MI)、肝衰竭、癌症、急性肾损伤(AKI)和低血压。

在本发明的一个具体实施方案中，DPP3活性抑制剂用于治疗对象的疾病或病症，其中疾病或病症是急性心力衰竭(AHF)、心肌梗塞(MI)、肝衰竭、癌症、急性肾损伤(AKI)和低血压。

在本发明的所有实施方案的一个具体实施方案中，所述疾病不是阿尔茨海默病。在本发明的所有实施方案的一个具体实施方案中，所述疾病不是癌症。在本发明的所有实施方案的一个具体实施方案中，所述疾病不是类风湿性关节炎。

在一个具体的实施方案中，所述疾病或病症是低血压。

在本发明的一个具体实施方案中，DPP3活性抑制剂用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症，其中所述抑制剂是单结合或至少两结合的抗体。

在本发明的一个具体实施方案中，DPP3活性的抑制剂或效应子用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症，其中所述抑制剂或效应子是与SEQ IDNo.1结合的抗DPP3抗体或抗DPP3抗体片段或抗DPP3非Ig支架，并且在一个具体实施方案中，是与SEQ ID No.2结合的抗DPP3抗体或抗DPP3抗体片段或抗DPP3非Ig支架。

在本发明的一个具体实施方案中，DPP3活性的抑制剂或效应子用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症，其中所述抑制剂或效应子是对DPP3的最小结合亲和力小于10^-7M的抗体或片段或支架。

在用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法的一个具体实施方案中，其中所述抑制剂或效应子为与全长DPP3结合并且抑制至少10％、或至少50％、更优选至少60％、甚至更优选大于70％、甚至更优选大于80％、甚至更优选大于90％、甚至更优选大于95％的DPP3活性的抗体或片段或支架。可以如上所述在液相测定中确定活性。

在本发明的一个具体实施方案中，DPP3活性抑制剂或效应子用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症，其中所述抑制剂或效应子是单特异性的抗体或片段或支架。

单特异性抗DPP3抗体或单特异性抗DPP3抗体片段或单特异性抗DPP3非Ig支架意指所述抗体或抗体片段或非Ig支架结合靶标DPP3内包含至少5个氨基酸的一个特定区域。单特异性抗DPP3抗体或单特异性抗DPP3抗体片段或单特异性抗DPP3非Ig支架是对同一抗原均具有亲和力的抗DPP3抗体或抗DPP3抗体片段或抗DPP3非Ig支架。

在另一个具体和优选的实施方案中，结合至DPP3的抗DPP3抗体或抗DPP3抗体片段或抗DPP3非Ig支架分别是单特异性抗体、抗体片段或非Ig支架，由此单特异性意指所述抗体或抗体片段或非Ig支架结合靶标DPP3内包含至少4个氨基酸的一个特定区域。根据本发明的单特异性抗体或片段或非Ig支架是对同一抗原均具有亲和力的抗体或片段或非Ig支架。单克隆抗体是单特异性的，但单特异性抗体也可以通过除了从普通生殖细胞产生它们之外的其他方式产生。

在本发明的一个具体实施方案中，DPP3活性的抑制剂或效应子用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症，其中所述对象具有升高水平的DPP3。升高水平是高于预定阈值的水平。

本发明的另一个实施方案是药物组合物，其包含上述用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程有关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂。

本发明的另一个实施方案是用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中施用DPP3活性抑制剂。

在用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法的一个具体实施方案中，所述抑制剂选自包括抗DPP3抗体或抗DPP3抗体片段或抗DPP3非Ig支架的组。

在用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法的一个具体实施方案中，其中所述疾病选自心力衰竭、慢性心力衰竭、急性心力衰竭(AHF)、心肌梗塞(MI)、中风、肝衰竭、烧伤、外伤、严重感染(微生物、病毒(例如，AIDS)、寄生虫(例如，疟疾))或SIRS或败血症、癌症、急性肾损伤(AKI)、CNS障碍(例如，癫痫、神经退行性疾病)、自身免疫疾病、血管疾病(例如，川崎综合症)和低血压。

在用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法的一个具体实施方案中，其中所述抑制剂是单结合或至少两结合的抗体。

在用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法的一个具体实施方案中，所述抑制剂是与SEQ ID No.1结合的抗DPP3抗体或抗DPP3抗体片段或抗DPP3非Ig支架，并且在一个具体实施方案中，是与SEQ ID No.2结合的抗DPP3抗体或抗DPP3抗体片段或抗DPP3非Ig支架。

在用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法的一个具体实施方案中，其中所述抑制剂是对DPP3的最小结合亲和力小于10^-7M的抗体或片段或支架。

在用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法的一个具体实施方案中，所述抑制剂或效应子是单特异性的抗体或片段或支架。

在用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法的一个具体实施方案中，所述抑制剂或效应子为与全长DPP3结合并且抑制至少10％、或至少50％、更优选至少60％、甚至更优选大于70％、甚至更优选大于80％、甚至更优选大于90％、甚至更优选大于95％的DPP3活性的抗体或片段或支架。

在用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法的一个具体实施方案中，所述对象具有升高水平的DPP3。升高水平是高于预定阈值的水平。阈值如上所限定。

本发明的另一个实施方案是从患者血液中清除DPP3。可以通过多种血液成分单采术和/或亲和层析步骤实现清除(Balogun等人，2010年)。这些方法包括但不限于通过含有与琼脂糖树脂偶联的特异性的和高亲和力的DPP3抗体的吸附剂过滤患者血浆，参见实施例12，用于分析DPP3与可能的吸附剂材料的结合。

配制本发明的药物组合物以与其预期的给药途径相容。给药途径通常按物质的施用位置分类。常见的实例包括口服、表皮、皮下、皮内、舌下、肌肉内、动脉内、静脉内和腹膜内给药。

药物组合物也可以通过中枢神经系统(CNS)施用，例如硬膜外(epidural)(同义词：peridural)注射或输注进入硬膜外腔，脑内(进入大脑)直接注射到脑内，脑室内(给药进入大脑的脑室系统)或鞘内(进入脊髓管)。

在下面概述了本发明的具体实施方案：

1.用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其包括：

·确定所述对象的体液样品中的总DPP3的量和/或活性DPP3的量，

·将所述确定的总DPP3的量或活性DPP3的量与预定阈值进行比较，

2.根据权利要求1的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中总DPP3的量或活性DPP3的量以浓度单位进行确定。

3.根据权利要求1或2的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中所述样品选自全血、血清和血浆。

4.根据权利要求1至3中任一项的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中所述疾病选自心力衰竭、慢性心力衰竭、急性心力衰竭(AHF)、心肌梗塞(MI)、中风、肝衰竭、烧伤、外伤、严重感染(微生物、病毒(例如，AIDS)、寄生虫(例如，疟疾))、SIRS或败血症、癌症、急性肾损伤(AKI)、CNS障碍(例如，癫痫、神经退行性疾病)、自身免疫疾病、血管疾病(例如，川崎综合症)和低血压。

5.根据权利要求1至4中任一项的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中总DPP3的量和/或活性DPP3的量在所述对象的体液样品中进行确定，并包括以下步骤：

·使所述样品与特异性结合全长DPP3的捕获结合剂接触，

·分离与所述捕获结合剂结合的DPP3，

·将DPP3的底物添加到所述分离的DPP3中，

·通过测量和量化DPP3的底物的转化率来量化所述活性DPP3。

6.根据权利要求5的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中所述捕获结合剂可选自抗体、抗体片段或非IgG支架。

7.根据权利要求5或6的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中所述捕获结合剂是抗体。

8.根据权利要求5至7中任一项的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中将所述捕获结合剂固定在表面上。

9.根据权利要求5至8中任一项的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中所述分离步骤是洗涤步骤，其从所述捕获的DPP3中移除未与所述捕获结合剂结合的样品成分。

10.根据权利要求5至9中任一项的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中DPP3底物转化率通过选自以下的方法来检测：荧光底物的荧光(例如，Arg-Arg-βNA、Arg-Arg-AMC)、显色底物的颜色变化、与氨基荧光素偶联的底物的发光(Promega蛋白酶-Glo^TM测定)、质谱、HPLC/FPLC(反相色谱、尺寸排阻色谱)、薄层色谱、毛细管区带电泳、凝胶电泳后的活性染色(固定化、活性DPP3)或蛋白质印迹(切割产物)。

11.根据权利要求5至10中任一项的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中所述底物可选自：血管紧张素II、血管紧张素III和血管紧张素IV、亮氨酸脑啡肽、甲硫氨酸脑啡肽、内吗啡肽1和内吗啡肽2、英洛芬、β-酪啡肽、强啡肽、原肠肽、ACTH和MSH、或者与荧光团、发色团或氨基荧光素偶联的二肽，其中所述二肽是Arg-Arg。

12.根据权利要求5至11中任一项的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中所述底物可选自：与荧光团、发色团或氨基荧光素偶联的二肽，其中所述二肽是Arg-Arg。

13.用于监测伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中将根据权利要求1至12中任一项的诊断方法进行至少两次。

14.用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂。

15.根据权利要求14的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂选自抗DPP3抗体或抗DPP3抗体片段或抗DPP3非Ig支架。

16.根据权利要求14或15的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂，其中所述疾病选自心力衰竭、慢性心力衰竭、急性心力衰竭(AHF)、心肌梗塞(MI)、中风、肝衰竭、烧伤、外伤、严重感染(微生物、病毒(例如，AIDS)、寄生虫(例如，疟疾))、或SIRS或败血症、癌症、急性肾损伤(AKI)、CNS障碍(例如，癫痫、神经退行性疾病)、自身免疫疾病、血管疾病(例如，川崎综合症)和低血压。

17.根据权利要求14至16中任一项的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂是单结合或至少两结合的抗体。

18.根据权利要求14至17中任一项的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂是与SEQ ID No.1结合、特别是与SEQ ID No.2结合的抗DPP3抗体或抗DPP3抗体片段或抗DPP3非Ig支架。

19.根据权利要求14至18中任一项的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂是对DPP3的最小结合亲和力等于或小于10^-7M的抗体或片段或支架。

20.根据权利要求14至19中任一项的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂是单特异性的抗体或片段或支架。

21.根据权利要求14至20中任一项的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂为与全长DPP3结合并且抑制至少10％、或至少50％、更优选至少60％、甚至更优选大于70％、甚至更优选大于80％、甚至更优选大于90％、甚至更优选大于95％的DPP3活性的抗体或片段或支架。

22.根据权利要求14至21中任一项的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂对DPP3是选择性的和/或特异性的，并且不跨越细胞膜和/或血脑屏障。

23.根据权利要求14至22中任一项的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂，其中所述对象在所述对象的体液样品中的总DPP3的量和/或活性DPP3的量高于预定阈值。

24.药物组合物，其包含根据权利要求14至23中任一项的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂。

25.根据权利要求14至23中任一项的DPP3活性抑制剂在从血浆中体外移除DPP3的方法中的用途，所述方法包括血液成分单采术和亲和色谱。

26.用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法，其包括以下步骤：

·使所述样品与特异性结合全长DPP3的捕获结合剂接触，

·分离与所述捕获结合剂结合的DPP3，

·将DPP3的底物添加到所述分离的DPP3中，

·通过测量和量化DPP3的底物的转化率来量化所述活性DPP3。

27.根据权利要求26的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法，其中所述捕获结合剂可以选自抗体、抗体片段或非IgG支架。

28.根据权利要求26或27的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法，其中所述捕获结合剂是抗体。

29.根据权利要求26至28中任一项的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法，其中将所述捕获结合剂固定在表面上。

30.根据权利要求26至29中任一项的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法，其中所述分离步骤是洗涤步骤，其从所述捕获的DPP3中移除未与所述捕获结合剂结合的样品成分。

31.根据权利要求26至30中任一项的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法，其中DPP3底物转化率通过选自以下的方法来检测：荧光底物的荧光(例如，Arg-Arg-βNA、Arg-Arg-AMC)、显色底物的颜色变化、与氨基荧光素偶联的底物的发光(Promega蛋白酶-Glo^TM测定)、质谱、HPLC/FPLC(反相色谱、尺寸排阻色谱)、薄层色谱、毛细管区带电泳、凝胶电泳后的活性染色(固定化、活性DPP3)或蛋白质印迹(切割产物)。

32.根据权利要求26至31中任一项的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法，其中所述底物可选自：与荧光团、发色团或氨基荧光素偶联的二肽，其中所述二肽是Arg-Arg。

33.根据权利要求26至32中任一项的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法，其中所述样品是选自全血、血清和血浆的血液样品。

34.用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的测定或试剂盒，其包含：

·与全长DPP3特异性结合的捕获结合剂，

·DPP3的底物。

35.根据权利要求34所述的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的测定或试剂盒，其中所述捕获结合剂可选自抗体、抗体片段或非IgG支架。

36.根据权利要求34或35的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的测定或试剂盒，其中所述捕获结合剂在液相测定中抑制小于50％、优选小于40％、更优选小于30％的DPP3活性。

37.根据权利要求34至36中任一项的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的测定或试剂盒，其中所述捕获结合剂的DPP3的结合区域不在SEQ Id No.1的316位至669位氨基酸的区域内。

38.根据权利要求34至37中任一项的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的测定或试剂盒，其中所述结合剂是抗体。

39.根据权利要求34至38中任一项的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的测定或试剂盒，其中将所述捕获结合剂固定在表面上。

40.根据权利要求34至39中任一项的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的测定或试剂盒，其中所述底物可选自：血管紧张素II、血管紧张素III和血管紧张素IV、亮氨酸脑啡肽、甲硫氨酸脑啡肽、内吗啡肽1和内吗啡肽2、英洛芬、β-酪啡肽、强啡肽、原肠肽、ACTH和MSH、或者与荧光团、发色团或氨基荧光素偶联的二肽，其中优选的二肽是Arg-Arg。

41.根据权利要求26至33中任一项的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法在根据权利要求1至13中任一项的用于诊断或监测伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法中的用途，或者根据权利要求34至40中任一项的测定或试剂盒在根据权利要求1至13中任一项的用于诊断或监测伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法中的用途。

具体实施方式

1.实施例1

使用特异性DPP3捕获活性测定来确定各种患病患者(患有急性心肌梗塞(AMI)、心源性休克、败血性休克和肝衰竭的患者)的血浆中的DPP3活性，并与健康对照的DPP3血浆活性进行比较。

1.1.研究人群：

血浆样品从388名直接进入急诊室的患者在他们第一次出现时获得。根据他们的最终诊断，这些患者可分为4个亚组：经受急性心肌梗塞(AMI)的患者、经受心源性休克的患者、经受败血性休克的患者和肝衰竭的患者。对照组是来自93名健康对照的血浆样品的集合。

1.2.hDPP3捕获活性测定：

首先通过亲和纯化步骤富集血浆样品(10μl)的DPP3，其次通过添加荧光底物Arg-Arg-βNA测量其活性(详细描述参见实施例4)。计算出的增加不同样品的荧光的斜率(以nmolβNA/min/ml样品[nmolβNA min^-1ml^-1]计)是指10μl样品大小。

1.3结果：

对于所有患有严重疾病或器官衰竭的患者，患者样品与健康对照比较显示出显著更高的DPP3活性值(图10)。

2.实施例2

在该实验中，通过监测血压来研究重组hDPP3注射在健康大鼠中的作用。

2.1方法：

将2至3个月大的雄性Wistar大鼠(Charles River Laboratories，德国)用于该研究。为了测量和记录血压(BP)，将导管(Introcan-W；22G/1'；B.Braun)插入动脉颈动脉(右颈总动脉)中。通过尾静脉注射具有N-末端GST-标签的人重组二肽基肽酶3(recGST-hDPP3)。

首先用异氟醚麻醉动物以用于称重(全g)并腹膜内(i.p.)注射1.2g/kg BW氨基甲酸乙酯(c＝0.4g/mL)以用于长期麻醉。然后将颈部的腹部区域剪掉并用乙醇擦去。准备容器并插入导管。最后，用肝素化等渗氯化钠溶液冲洗两个导管。然后将压力传感器(medexlogical，Medex Medical Ltd.)与患者监测系统(Datex-Ohmeda，GE)连接。连接到BP监视器的的便携式计算机通过S/5收集软件分别记录BP数据。

通过注射到尾静脉来用PBS中的recGST-hDPP3 0.2mg/kg处理大鼠。在注射DPP3之前和之后不断监测血压。

2.2结果：

在健康大鼠中注射重组GST-hDPP3导致血压立即降低(图11)。

3.实施例3

抗体的产生和DPP3结合能力的确定：产生几种鼠抗体，并通过它们在夹心测定或活性测定中结合人DPP3的能力进行筛选(参见表3)。

3.1.方法：

-用于免疫的肽/缀合物：

合成用于免疫的DPP3肽，参见表3(JPT Technologies，Berlin，德国)，其具有将肽缀合至牛血清白蛋白(BSA)的额外N-末端半胱氨酸(如果在所选DPP3-序列中不存在半胱氨酸)残基。通过使用Sulfolink偶联凝胶(Perbio-science，Bonn，德国)将肽与BSA共价连接。偶联过程根据Perbio的手册进行。通过USBio生产重组GST-hDPP3。

-小鼠免疫、免疫细胞融合和筛选：

在第0天，Balb/c小鼠腹膜内(i.p.)注射84μg GST-hDPP3或100μg DPP3-肽-BSA-缀合物(在TiterMax Gold佐剂中乳化)，在第14天注射84μg或100μg(在完全弗氏佐剂中乳化)以及在第21天和第28天注射42μg或50μg(在不完全弗氏佐剂中乳化)。在第49天，动物接受静脉内(i.v.)注射溶解在盐水中的42μg GST-hDPP3或50μg DPP3-肽-BSA-缀合物。三天之后，处死小鼠并进行免疫细胞融合。

在37℃下将来自免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系SP2/0的细胞与1ml 50％聚乙二醇融合30秒。洗涤之后，将细胞接种在96-孔细胞培养板中。通过在HAT培养基[补充有20％胎牛血清和HAT补充物的RPMI 1640培养基]中生长来选择杂交克隆。一周之后，用HT培养基替换HAT培养基三代，然后返回至正常细胞培养基。

在融合之后两周，主要针对重组DPP3结合IgG抗体筛选细胞培养物上清液。因此，将重组GST标记的DPP3(USBiologicals，Salem，USA)固定在96-孔板(100ng/孔)中，并与每孔50μl细胞培养上清液在室温下孵育2小时。在洗涤了板之后，添加50μl/孔POD-兔抗小鼠IgG并在室温下孵育1小时。在下一个洗涤步骤之后，向每个孔中添加50μl的色原溶液(在柠檬酸盐/磷酸氢盐缓冲液中的3.7mM邻苯二胺，0.012％的H₂O₂)，在室温下孵育15分钟并且通过添加50μl 4N硫酸终止显色反应。在490mm处检测吸收。

将阳性测试的微量培养物转移到24-孔板中用于繁殖。重新测试之后，使用限制性稀释技术克隆并重新克隆选择的培养物，并确定同种型。

-小鼠单克隆抗体生产

通过标准抗体生产方法(Marx等人，1997年)生产针对GST标记的人DPP3或DPP3-肽产生的抗体，并通过蛋白A纯化。基于SDS凝胶电泳分析，抗体纯度为≥90％。

-抗体的表征-hDPP3-抑制分析

为了分析不同抗体和抗体克隆的DPP3抑制能力，用已知过程进行DPP3活性测定(Jones等人，1982年)。将重组GST标记的hDPP3稀释于测定缓冲液(在50mM Tris-HCl，pH7.5和100μM ZnCl₂中的25ng/ml GST-DPP3)中，并将200μl的该溶液在室温下与10μg各自抗体一起孵育。在预孵育1小时之后，向溶液中添加荧光底物Arg-Arg-βNA(20μl，2mM)，并在37℃下使用Twinkle LB 970微孔板荧光计(Berthold Technologies GmbH&Co.KG)监测随时间的游离βNA的产生。通过在340nm处激发并测量410nm处的发射来检测βNA的荧光。计算不同样品的荧光增加的斜率(以RFU/分钟计)。具有缓冲液对照的GST-hDPP3的斜率被指定为100％活性。可能的捕获-结合剂的抑制能力被定义为通过与所述捕获-结合剂一起以百分比孵育来降低GST-hDPP3活性。所得的DPP3活性降低如图1a和表3所示。

3.2.结果：

下表表示所获得的抗体的选择及其最大抑制率(表3)。针对下文描述的DPP3区产生的单克隆抗体通过它们结合天然DPP3的能力来选择(mAb-FL-DPP3_2555作为固相，而_2553作为免疫测定的示踪剂，详情参见实施例4)。

对于固定的DPP3活性测定(参见实施例6和实施例7)，必须选择不太强烈地抑制DPP3活性的固相抗体。作为抗体筛选的截止，固相抗体不应当抑制DPP3活性超过50％，因为mAbDPP3_2555显示出最低的抑制率(表3，图1A)。

为了产生可以治疗使用的强DPP3抑制剂(参见实施例8至实施例13)，必须选择显示最高抑制率的DPP3结合剂。选择具有抑制DPP3活性70％的能力的单克隆抗体mAbDPP3_1967作为可能的治疗性抗体(参见图1A和表3)，并且使用该抗体进行所有进一步分析。图1B显示mAbDPP3_1967的抑制曲线，其IC₅₀为0.2041μg/ml。

表3：产生的抗DPP3抗体的免疫原序列、名称和特征

4.实施例4

确定在hDPP3免疫测定中产生高信噪比的抗体组合。

4.1.方法：

-单克隆抗体生产

通过标准抗体生产方法(Marx等人，1997年)生产针对GST标记的人DPP3产生的抗体，并通过蛋白A纯化。基于SDS凝胶电泳分析，抗体纯度为≥90％。分析了不同的克隆他们结合DPP3的能力。使用得到的阳性克隆作为固相或示踪剂抗体。

-固相

用一种抗DPP3抗体克隆(捕获抗体；1.5μg抗体/0.25mL100mmol/L NaCl，50mmol/LTris/HCl，pH 7.8)涂覆96-孔聚苯乙烯微孔板(Greiner Bio-One International AG，奥地利)(在室温下1小时)。在用5％牛血清白蛋白封闭之后，对微孔板进行真空干燥。-标记过程(示踪剂)

将100μg(100μl)的不同抗DPP3抗体(检测抗体，PBS中1mg/ml，pH 7.4)与10μl吖啶NHS-酯(乙腈中1mg/ml，InVent GmbH，德国；EP 0 353 971)一起混合并在室温下孵育30分钟。在Shodex Protein 5μm KW-803(Showa Denko，日本)上通过凝胶过滤HPLC纯化标记的抗DPP3抗体。纯化的标记抗体在测定缓冲液(50mmol/l磷酸钾，100mmol/l NaCl，10mmol/lNa₂-EDTA，5g/l牛血清白蛋白，1g/l鼠IgG，1g/l牛IgG，50μmol/l抑氨肽酶肽，100μmol/l亮抑酶肽，pH 7.4)中稀释。最终浓度为标记化合物的约7*10⁶相对光单位(RLU)(约20ng标记抗体)/200μl。通过使用Centro LB 960发光计(Berthold Technologies GmbH&Co.KG)测量吖啶酯化学发光。

-校准物

使用(50mmol/L磷酸钾，100mmol/L NaCl，10mmol/L Na-EDTA，5g/L牛血清白蛋白，1g/L鼠IgG，1g/L牛IgG，50μmol/L抑氨肽酶肽，100μmol/L亮抑酶肽，pH 7.4)线性稀释重组人GST-DPP3(USBiological，USA)的储备溶液(在PBS中，pH 7.4)。将储备溶液在-80℃下储存。校准物在使用之前准备好。

-hDPP3免疫测定

在添加标记和稀释的检测抗体(200μl)之后，将10μl的样品(或校准物)移液到经涂覆的96-孔微孔板中，将板在2℃至8℃下孵育18小时至24小时。通过用350μl洗涤溶液(20mM PBS，pH7.4，0.1％Triton X-100)洗涤4次除去未结合的示踪剂。通过使用Centro LB960发光计(Berthold Technologies GmbH&Co.KG)测量良好结合的化学发光。

4.2结果：

将所有抗体用于夹心免疫测定，作为经涂覆的微孔板和标记的抗体，组合在以下变化中(表4和表5)。如hDPP3-免疫测定所述进行孵育。结果以重组人GST-DPP3(100ng/ml、10ng/ml和1ng/ml)和血浆样品中的天然hDPP3的特异性信号/背景信号的比例给出。

表4：抗DPP3抗体对中的信噪比-重组GST-hDPP3的测量(SP-固相)。

表5：抗DPP3抗体对中的信噪比-人血浆样品的测量(SP-固相)。

所有组合显示重组GST-hDPP3的良好信噪比。此外，除了2552和2554之外的所有组合产生相对于天然样品的良好信噪比。因此，所有剩余的组合可用于进一步研究。关于最高绝对RLU信号，我们使用2555作为固相抗体，并且2553作为标记的抗体。

5.实施例5

使用hDPP3免疫测定确定各种患病患者(具有急性心力衰竭(AHF)、心肌梗死(MI)、败血症、癌症、急性肾损伤(AKI)和下呼吸道感染(LRTI)的患者)血浆中的DPP3浓度并与健康对照的DPP3血浆浓度进行比较。

5.1研究人群:

血浆样品从214名直接进入急诊科或肿瘤科的患者在他们第一次出现时获得。根据他们的最终诊断，这些患者可分为6个亚组：患有急性心力衰竭(AHF)的患者、患有心肌梗塞(MI)的患者、患有败血症的患者、患有癌症的患者、患有急性肾损伤(AKI)的患者和患有下呼吸道感染(LRTI)的患者。对照组是来自93名健康对照的血浆样品的集合。

5.2hDPP3免疫测定:

使用mAbDPP3_2555作为固相抗体，并且使用mAbDPP3_2553作为标记的示踪抗体。如实施例2中所述进行抗体固定、标记和孵育。5.3.结果：

与相应的诊断细节一起，对生成的数据进行统计分析(图2A)。与健康对照(标准)相比，所有患者显示出显著升高的DPP3血浆浓度。表6显示了DPP3值高于对照组的75百分位数的患者百分比及其各自的诊断。血浆DPP3水平的分析表明患者的疾病状态。该启示可用于诊断领域，并且还用于构建治疗性治疗的基础，例如，通过DPP3的抑制。

表6：夹心型免疫测定中患病患者和健康对照的DPP3值的比较。

通过他们的死亡率来分析相同研究人群。入院到急诊室后死亡的患者血浆DPP3水平显著高于在医院存活的急诊患者。因此，升高的DPP3浓度表明死亡率方面的预后不良(图2B)。

6.实施例6

人血浆中的DPP3的量不仅可以通过DPP3浓度来确定，还可以通过活性测定来确定。一种标准过程是使用Arg-Arg-βNA作为荧光底物的可溶性活性测定：

通过Arg-Arg-β-萘酰胺(Bachem Holdig AG，瑞士)的水解确定天然人DPP III的活性以形成荧光β-萘胺。将200μl缓冲液(50mM TRIS/HCl，pH 8.8，0.04％NaN₃，50μM抑氨肽酶肽，100μM亮抑酶肽)和10μl的样品(人血浆)移液到黑色96-孔微孔板(Greiner Bio-OneInternational GmbH，奥地利)中并在37℃下预热10分钟。在添加底物(20μl，2mM)之后，在Twinkle LB 970微孔板荧光计(Berthold Technologies GmbH&Co.KG)中使用340nm的激发波长、410nm的发射波长在37℃下监测荧光增加1小时。参考校准物游离βNA以nmolβNA/min/ml样品[nmolβNA min^-1ml^-1]计算不同样品的荧光增加的斜率。

利用所述标准的可溶性DPP3活性测定，不能确定是否测量到血浆中的DPP3活性或其他氨基肽酶的活性。为了产生对DPP3特异的信号，进行酶捕获测定，其中在第一步中通过与单克隆抗体结合将DPP3固定在表面上，并且在洗涤步骤之后，仅可测量特异性DPP3活性：

如实施例5中所述使用黑色96-孔微孔板(Greiner Bio-One InternationalGmbH，奥地利)制备固相。将10μl样品(血浆或标准物)和200μl缓冲液(50mmol/l磷酸钾，100mmol/l NaCl，5g/l牛血清白蛋白，1g/l鼠IgG，1g/l牛IgG，50μmol/l抑氨肽酶肽，100μmol/l亮抑酶肽，pH 7.4)移液到所述经涂覆的微孔板中并孵育(18小时至24小时，2℃至8℃，600rpm)。通过用洗涤溶液洗涤(3×350μl)除去未结合的分析物。在添加底物(200μl，100μM，在50mM Tris/HCl中，pH(25℃)8.8，0.04％，NaN₃)之后，在Twinkle LB 970微孔板荧光计(Berthold Technologies GmbH&Co.KG)中使用340nm的激发波长、410nm的发射波长在37℃下监测荧光增加1小时。参考校准物游离βNA以nmolβNA/min/ml样品[nmolβNA min^-1ml^-1计]计算不同样品的荧光增加的斜率。

在每种活性测定类型中，使用游离βNA作为测定校准物。因此，在Twinkle LB 970微孔板荧光计(Berthold Technologies GmbH&Co.KG)中在37℃下使用340nm的激发波长、410nm的发射波长测量βNA的浓度增加(在200μl中，在50mM Tris/HCl中，pH(25℃)8.8，0.04％NaN₃；0、4、8、16、32、64、125、250μMβNA)。所有样品测量均在该βNA标准上校准。

7.实施例7

使用特异性DPP3捕获活性测定确定各种患病患者(患有急性心力衰竭(AHF)、败血症、急性肾损伤(AKI)和下呼吸道感染(LRTI)的患者)的血浆中的DPP3活性并与健康对照的DPP3血浆活性进行比较。

7.1方法：

对在实施例5中分析的群组的一些部分进行DPP3特异性酶捕获活性测定。在该测定中，血浆样品的DPP3(10μl)首先通过亲和纯化步骤富集，其次通过添加荧光底物Arg-Arg-βNA测量其活性(详细描述参见实施例6)。计算出的不同样品的荧光增加的斜率(以nmolβNA/min/ml样品[nmolβNA min^-1ml^-1]计)是指10μl样品大小。

7.2.结果：

患者样品和健康对照的比较显示所有患者(AHF、败血症、AKI和LTRI，图3)的DPP3活性值显著更高。

表7显示了DPP3值高于对照组的75百分位数的患者的百分比及其各自的诊断。活性显示健康对照和患病患者的更好区分。

表7：夹心型免疫测定和酶捕获活性测定中患病患者和健康对照的DPP3值的比较。

为了更好地比较DPP3活性测定与浓度测定，我们对来自AHF(图4A)或败血症患者(图4B)的健康对照的区分进行了ROC(接受者操作特征)分析。曲线下面积(AUC)和置信区间(CI)的值如表8所示。数据分析显示与夹心免疫测定相比活性测定具有更高的特异性。

表8：ROC分析的数据(AUC-曲线下面积；CI-置信区间)。

8.实施例8

在该实验中，监测健康小鼠中mAbDPP3剂量增加的一般安全性。

8.1方法：

在分娩时4-5周龄，体重约15g至18g的雌性BALB/c裸鼠(CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl)小鼠(Charles River GmbH，Sulzfeld，德国)保持在最佳卫生条件下，空气每小时换气10次至15次进行空气调节，连续监测环境，目标温度范围为22±3℃，相对湿度为30-70％，12小时人工荧光灯/12小时黑暗。每个通风笼(IVC)最多饲养4只动物，并喂食由M-Zucht(ssniff GmbH)和高压灭菌的社区标签水组成的饮食。

在4天的适应期之后，开始施用mAbDPP3：将PBS中的三种不同mAbDPP3浓度(0.65mg/kg、1.9mg/kg和5.75mg/kg)注射到每组4只小鼠中。在第1、3、5和7天腹膜内(i.p.)施用MAbDPP3，并监测小鼠14天。

8.2结果：

所有小鼠在14天治疗中存活，没有副作用，也是在最高剂量下。MAbDPP3对于在其他动物实验中使用是安全的，其总是以1.9mg/kg的浓度进行。

9.实施例9

在该实验中，通过监测平均血压来研究mAbDPP3治疗在健康大鼠中的一般安全性。

9.1方法：

2至3个月大的雄性Wistar大鼠(Charles River Laboratories，德国)用于该研究。为了测量和记录血压(BP)，将导管(Introcan-W；22G/1”；B.Braun)插入动脉颈动脉(右颈总动脉)中。将给药和取样导管插入颈静脉(左颈静脉)。

首先用异氟醚麻醉动物用于称重(全g)并腹膜内(ip)注射1.2g/kg BW氨基甲酸乙酯(c＝0.4g/mL)用于长期麻醉。然后，将颈部的腹侧区域剪掉并用乙醇擦去。准备容器并插入导管。最后，两个导管用肝素化等渗氯化钠溶液冲洗。然后将压力传感器(medexlogical，Medex Medical Ltd.)与患者监测系统(Datex-Ohmeda，GE)连接。通过连接到BP监视器的笔记本电脑通过S/5收集软件分别记录BP数据。

用PBS，PBS中的1.9mg/kg和5.75mg/kg mAbDPP3处理大鼠(每组n＝3)。通过静脉导管施用化合物。在施用化合物之前监测血压1小时并在施用化合物之后监测血压6小时以上。

9.2结果：

大鼠对mAbDPP3处理反应良好。用高剂量mAbDPP3处理的小鼠显示平均血压略微增加(图5)。通常，即使在较高剂量下，mAbDPP3也可安全地用于大鼠模型中。

10.实施例10

在该研究中，分析了mAbDPP3的治疗如何影响CLP小鼠模型中的败血症死亡率。

10.1方法：

将12至15周龄雄性C57Bl/6小鼠(Charles River Laboratories，德国)用于研究。在轻度异氟醚麻醉下手术诱导了腹膜炎。切口进入腹膜腔的左上象限(盲肠的正常位置)。将盲肠暴露并在盲肠周围放置紧密的结扎线，在小肠插入的远端缝合。用24号针头将一个穿刺伤口放入盲肠，并通过伤口表达少量盲肠内容物。将盲肠放回到腹腔中并闭合剖腹部位。最后，将动物放回它们的笼中，自由获取食物和水。皮下给予500μl生理盐水作为流体替代物。

相对于载剂(PBS)测试MAbDPP3(在PBS中1.9mg/kg)。在CLP(预防性治疗)前和败血症完全发展后静脉注射化合物和载剂5分钟，在CLP(治疗性处理)之后静脉注射化合物和载剂2小时。每组含有10只小鼠，随访7天。

10.2结果：

从图6中可以看出，与PBS施用相比，mAbDPP3抗体显著降低了死亡率。4天之后，当用mAbDPP3处理时，75％的小鼠存活。与此相反，当用载剂处理4天之后几乎所有小鼠都死亡。

11.实施例11

使用败血性休克模型诱导大鼠心力衰竭，然后表征mAbDPP3对心脏功能的影响。

11.1.方法：

-研究设计

研究流程如下图7A所示。在CLP或假手术之后，使动物静置20小时，自由饮水和食物。然后将它们麻醉，进行气管切开术并放置动脉和静脉线。在CLP手术之后24小时，施用2mg/kg的mAbDPP3或载剂(盐水)。侵入性地监测血流动力学并从t＝0小时到3小时连续监测。在手术之后立即进行心脏的超声心动图，在mAbDPP3或盐水注射之后15分钟、1小时、2小时和3小时的时候进行。

-败血症的CLP模型

将来自Centre d'élevageJanvier(法国)的雄性Wistar大鼠(2至3个月，300g至400g，组大小参见表1)随机分配至三组中的一组。使用氯胺酮盐酸盐(90mg/kg)和甲苯噻嗪(9mg/kg)腹膜内(i.p.)麻醉所有动物。为了诱导多微生物败血症，使用稍作修改的Rittirsch的方案进行盲肠结扎和穿刺(CLP)。制作腹侧中线切口(1.5cm)以使盲肠外侧化。然后将盲肠接合在回盲瓣下方并用18针刺破一次。然后将腹腔封成两层，然后进行流体复苏(皮下注射3ml/100g体重的盐水)并将动物放回其笼中。假动物接受手术，没有让他们的盲肠被刺破。

-有创血压(Invasive Blood Pressure)

使用AcqKnowledge系统(BIOPAC系统，Inc.，美国)获得血液动力学变量。它提供全自动血压分析系统。导管通过压力传感器连接到BIOPAC系统。

对于该过程，将大鼠麻醉(氯胺酮和甲苯噻嗪)。将动物移至加热垫以使所需体温达到37℃至37.5℃。将温度反馈探针插入直肠中。将大鼠置于操作台处于仰卧位。气管打开，插入导管(16G)作为外部呼吸机而不会损伤颈动脉和迷走神经。动脉导管插入右颈动脉。在结扎前将颈动脉与迷走神经分开。

通过左颈静脉插入中心静脉导管，允许给药。

手术之后，在血液动力学测量之前让动物休息以获得稳定状态。然后记录基线血压(BP)。在数据收集期间，停止通过动脉管线输注盐水。

-超声心动图

使用氯胺酮盐酸盐麻醉动物。剃削切口并将大鼠置于卧位。

对于经胸超声心动图(TTE)检查，使用配备有高频(14-MHz)线性探针和10-MHz心脏探针的商业GE Healthcare Vivid 7超声系统。所有检查以数字方式记录并存储以便随后进行离线分析。

在2cm的深度下记录灰度图像。在胸骨旁长轴视图中开始二维检查以测量主动脉环直径和肺动脉直径。我们还采用M模式测量左心室(LV)尺寸并评估缩短分数(FS％)。LVFS计算为LV舒张末期直径—LV收缩末期直径/LV舒张末期直径，并以％表示。因此，在LV的最大直径下限定舒张末期的时间。因此，收缩末期被定义为同一心脏循环中的最小直径。所有参数均手动测量。每次测量均进行三次心脏循环。

从相同的胸骨旁长轴视图中，使用脉冲波多普勒记录肺动脉血流。测量肺动脉流出的速度时间积分。

从顶端五腔室视图中，使用脉冲多普勒在二尖瓣的尖端水平记录二尖瓣血流。

-实验时间点和动物组

手术之后记录基线BP和超声心动图。然后注射mAbDPP3(2mg/kg)或载剂(盐水)(i.v.，手术后5分钟)并开始盐水输注。在mAbDPP3或载剂注射之后15分钟以及1小时、2小时和3小时的时候记录血液动力学点(BP和超声心动图)。存在1个对照组和2个CLP组，总结在下表(表9)中。在实验结束时，对动物实施安乐死，抽取血液用于EDTA-血浆生成，收获器官用于后续分析。

表1：实验组

11.2.结果：

与假动物相比，败血症大鼠具有非常低的血压和减少的心脏缩短分数。mAbDPP3的施用显著增加了缩短分数(图7B)，提高了平均血压(图7C)并极大地改善了败血症大鼠的健康状况。

12.实施例12

本文描述的研究的目的是评估mAbDPP3在使用多种癌细胞系的体外细胞培养系统中的潜在抗增殖效果。

12.1.方法：

将mAbDPP3(在PBS中1mg/ml)的储备溶液稀释至覆盖0μg/ml至100μg/ml的最终浓度范围。使用PBS作为参照化合物。源自已建立的癌细胞系(A549、HCT116、MDA-MB231)的癌细胞在含有10％FCS和青霉素/链霉素的DMEM中培养。

A549细胞是腺癌人肺泡基底上皮细胞。该细胞系首先通过在58岁男性的外植肿瘤中去除和培养癌性肺组织而建立。在自然界中，这些细胞是鳞状的，并且负责一些物质(例如，水和电解质)扩散到肺泡。如果所述A549细胞在体外培养，则它们作为单层细胞生长，粘附至培养瓶。另一个特征是这些细胞能够合成卵磷脂并含有高水平的去饱和脂肪酸。A549细胞系广泛用作用于药物代谢的II型肺上皮细胞模型的体外模型和作为转染宿主。

HCT116细胞系表示人结肠癌细胞。这些上皮细胞具有贴壁培养特性，并且源自雄性成人。该细胞系是合适的转染宿主。该系在ras原癌基因的密码子13中具有突变，并且可以用作该密码子中突变的PCR测定的阳性对照。

MDA-MB231细胞系表示具有上皮形态的人乳腺癌细胞。这些细胞是从白种人乳腺癌患者的胸腔积液中分离出来的。

对于每种细胞系，准备96孔悬浮细胞培养板。倒入100μL的软琼脂底层(在完全培养基中0.6％终浓度)并使其凝固。然后在顶部加入50μL的含有相应细胞和细胞数的软琼脂顶层(0.4％终浓度)，凝固并将这样的96孔板在37℃、10％CO₂下孵育过夜。

第二天，将化合物加入板的内孔中。随后，将测定物在细胞培养孵育箱中孵育。最后，使用Alamar Blue开发测定，并在37℃下孵育3-5小时后确定荧光强度(激发：560nm；发射：590nm)。作为低对照，用10至5M星形孢菌素处理细胞(6倍值)。作为高对照，用0.1％DMSO处理细胞(溶剂对照，6倍值)。

相对于高对照(溶剂0.1％DMSO)和低对照(10至5M星形孢菌素)，将原始数据转换成软琼脂生长百分比，其分别设定为100％和0％。IC₅₀计算利用具有可变斜率S形响应拟合模型的GraphPad Prism 5软件使用0％软琼脂生长作为底部约束、没有底部约束以及使用100％软琼脂生长作为顶部约束进行。

12.2.结果：

在细胞培养系统中，根据应用的各种剂量的mAbDPP3(图8)评估三种癌细胞系(A549，HCT116，MDA-MB231)的生长。使用标准参数基于溶剂对照的信号作为顶部约束(100％软琼脂生长)和星形孢菌素对照的信号作为底部约束(0％软琼脂生长)来确定IC₅₀值。各个IC₅₀值概括在表10中。

MAbDPP3处理对测试的三种细胞系具有抗增殖作用。

细胞系	组织源	孵育时间	IC<sub>50</sub>
				A549	肺	8天	6.3μg/ml
HCT116	结肠	8天	2.0μg/ml
				MDA-MB231	乳腺	11天	8.7μg/ml

表10：mAbDPP3处理的IC50值。

13.实施例13

本文描述的研究的目的是评估mAbDPP3在乳腺癌和结肠癌的异种移植模型中预防肿瘤形成的能力(肿瘤生长抑制研究)。

13.1.方法：

单层MDA-MB-231细胞(乳腺癌)和HCT-116细胞(结肠癌)分别在DMEM+10％FCS中生长。在37℃下将细胞在90％空气和10％二氧化碳的潮湿气氛中培养。介质每3天例行更换一次。使用胰蛋白酶/EDTA将汇合培养物每3至4天1：3至1：3分开，并以约3至4×10⁶个细胞/15cm²+25mL培养基的密度接种。

将分娩时4至5周龄，体重约15g至18g的雌性BALB/c裸鼠(CAnN.Cg-Foxn1^nu/Crl)小鼠(Charles River GmbH，Sulzfeld，德国)保持在最佳卫生条件下，每小时10至15次换气进行空气调节，连续监测环境，目标温度范围为22±3℃，相对湿度为30％至70％，12小时人工荧光灯/12小时黑暗。每个通风笼(IVC)最多饲养4只动物，并喂食由M-Zucht(ssniff GmbH)和高压灭菌的社区标签水组成的饮食。

由ATCC提供的人乳腺癌MDA-MB-231细胞和结肠癌HCT-116细胞将用于该研究。在接种到小鼠中之前，细胞继代培养5代。将3×10⁶个细胞/0.1mL皮下注入小鼠右侧。当肿瘤体积达到约100mm³至200mm³时，根据肿瘤体积和体重将具有合适大小肿瘤的20只小鼠随机分组(每组10只小鼠)。根据肿瘤体积和体重给予剂量并开始向动物给药。这些组如下表(表11)所示。

表11：治疗策略的概述。

每天观察动物行为和健康状况，并且通过卡尺测量在24天或数天内每两天记录肿瘤生长。通过卡尺(手动卡尺，OMC Fontana)测量原发肿瘤大小。根据公式V＝W²×L/2(L＝长度，W＝肿瘤的垂直宽度，L>W)计算肿瘤大小。如下计算各个相对肿瘤体积(RTV)：RTV＝V_t/V₀，其中V_t是每天的体积，V₀是治疗开始时的体积。

13.2.结果：

在异种移植癌症模型中，mAbDPP3的施用减少了所研究的所有肿瘤的形成(图9A至9D)。在mAbDPP3处理下，使乳腺细胞肿瘤多生长2天，生长至20倍大小(图9B)，结肠细胞瘤长多生长2天，生长至10倍大小(图9D)。在该模型中，由结肠癌细胞系诱导的肿瘤比由乳腺癌细胞系诱导的肿瘤生长慢得多。

14.实施例14

为了评估使用DPP3-吸附剂以从过量DPP3中清除血浆的可能性，应当分析DPP3是否与抗DPP3柱充分结合。通过将DPP3结合抗体固定在GlycoLink柱(Thermo Fisher)上来制备亲和层析柱。通过在流过这些柱之前和之后测量DPP3浓度来分析DPP3与这些柱的结合。

14.1.方法：

在第一个步骤中，每个根据指导者手册将所有DPP3结合抗体(mAbDPP3_2552、2553、2554、2555)氧化并固定在一个GlycoLink柱上。随后将重组GST-hDPP3(USBio)或患者血浆样品装载到柱上并监测DPP3的结合。

-抗体的氧化

因此，将300μl的3mg/ml的各自抗DPP3抗体溶液在700μl GlycoLink偶联缓冲液中稀释至1ml且pH<6的最终体积。为了氧化抗体的碳水化合物基团，将2.1mg的偏高碘酸钠添加到溶液中并在室温下孵育30分钟。使用脱盐柱从抗体溶液中除去氧化剂。

-GlycoLink柱的制备

为了催化偶联反应，将0.1M苯胺加入到氧化的抗体中。然后将溶液施加到平衡的GlycoLink柱上并在室温下孵育4小时。允许未结合的物质流过柱。之后对柱进行洗涤，平衡并储存直到进一步使用。

-DPP3亲和纯化

将重组GST-hDPP3或患者血浆在偶联缓冲液中稀释(重组DPP3的最终浓度＝100ng/ml，1ml；1ml血浆+1ml偶联缓冲液)，应用于平衡的mAbDPP3柱并在室温下孵育30分钟。保存整个通流以评估结合效率和容量。对柱进行洗涤，使用GlycoLink洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白质，并在储存前平衡柱。

-DPP3内容物的分析

使用夹心型发光免疫测定测量在亲和纯化和流过之前的样品和重组GST-hDPP3的DPP3浓度(详情参见实施例4)。在添加标记和稀释的检测抗体(200μl)之后，将20μl的样品(或校准物)移液到经涂覆的96-孔微孔板中，将板在2℃至8℃下孵育18小时至24小时。通过用350μl洗涤溶液(20mM PBS，pH 7.4，0.1％Triton X-100)洗涤4次除去未结合的示踪剂。通过使用Centro LB 960发光计(Berthold Technologies GmbH&Co.KG)测量良好结合的化学发光。

14.2.结果：

通过亲和层析从样品中除去血浆中和重组DPP3溶液中的几乎所有的DPP3(参见表12)。不同的mAbDPP3抗体显示出对DPP3的不同亲和力。由于mAbDPP3_2555显示出最高的recDPP3结合率，因此选择该抗体用于血浆样品的层析。表12显示通过亲和层析可以强烈降低DPP3血浆水平。这些结果表明，可以在血浆置换术中使用DPP3-吸附剂来清除患者血浆中过量的DPP3。

表12：使用所描绘的抗DPP3抗体的亲和层析之前和之后样品中的天然或重组DPP3的浓度。

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序列

SEQ ID NO：1

hDPP3 AS 1-737

SEQ ID NO：2

hDPP3 AS 474-493(N-Cys)

附图说明

图1：DPP3活性的抑制

(A)在多种不同的抗DPP3抗体的存在下测量重组GST-hDPP3的活性。针对肽和/或全长(FL)天然DPP3产生的DPP3结合抗体显示出高达70％的强抑制效果。

(B)具有抑制性mAbDPP3的重组GST-hDPP3的抑制曲线。特异性抗体对DPP3的抑制是浓度依赖性的，其中IC₅₀为～0.2μg/ml。

图2：DPP3浓度作为诊断标记物

(A)健康对照和患有各种疾病(AHF-急性心力衰竭、MI-心肌梗塞、败血症、癌症、AKI-急性肾损伤、LRTI-下呼吸道感染)的患者的EDTA血浆中的DPP3浓度。患者组的中值与健康对照显著不同(Mann-Whitney测试，p<0.005)。

(B)在急诊科入院后不久死亡的患者与存活患者的血浆DPP3浓度的比较。存活患者显示出显著较低的DPP3水平(Mann-Whitney测试，p<0.05)。

图3：DPP3活性作为诊断标记物

健康对照和患有各种疾病(AHF-急性心力衰竭、败血症、AKI-急性肾损伤、LRTI-下呼吸道感染)的患者的EDTA血浆中的DPP3活性。患者组的中值与健康对照显著不同(Mann-Whitney测试，p<0.0001)。

图4：DPP3活性和浓度测定的ROC图分析。

(A)健康对照和患有AHF的患者的ROC分析。

(B)健康对照和患有败血症的患者的ROC分析。

图5：mAbDPP3处理的安全性(血压)

用PBS或mAbDPP3(5.75mg/kg)处理健康大鼠。通过将导管插入右颈总动脉测量并记录血压(BP)。将给药和取样导管插入颈静脉。与PBS处理的大鼠相比，处理略微增加了相对血压(每组n＝3)。

图6：mAbDPP3对败血症小鼠的死亡率的影响

在CLP之前5分钟和CLP之后2小时，用PBS或mAbDPP3(1.9mg/kg)处理败血症小鼠(CLP模型)。在7天内监测死亡率。Kaplan-Meyer图显示mAbDPP3处理之后败血症小鼠的存活增加。

图7：mAbDPP3对败血症大鼠的心力衰竭的影响

(A)败血性休克中的大鼠的心力衰竭研究的实验设计。

(B)CLP诱导大鼠的心力衰竭，如与假动物相比减少的缩短分数所指示的。通过mAbDPP3处理显著增加了该缩短分数(2mg/kg；每组n≥7；Mann-Whitney测试，p<0.0001)。

(C)载剂处理的败血症大鼠的平均血压随时间降低，而mAbDPP3处理导致mBP显著增加(2mg/kg；每组n≥7；Mann-Whitney测试，p<0.005)。

图8：mAbDPP3对体外肿瘤生长的影响

肿瘤细胞系(肺癌、结肠癌和乳腺癌)的软琼脂测定。抗DPP3抗体的添加降低了肿瘤细胞生长率。

图9：mAbDPP3对体内肿瘤生长的影响

(A)用PBS或mAbDPP3处理具有异种移植的乳腺肿瘤细胞的小鼠(每组n＝10)。在24天内相对肿瘤体积的生长曲线显示mAbDPP3处理的小鼠中肿瘤生长减少。

(B)时间比较，在使用和不使用mAbDPP3处理时，乳腺细胞肿瘤需要20倍增加其体积。使用mAbDPP3处理，生长需要显著更长时间(Mann-Whitney测试，p<0.05)。

(C)用PBS或mAbDPP3处理具有异种移植结肠肿瘤细胞的小鼠(每组n＝10)。在30天内相对肿瘤体积的生长曲线显示mAbDPP3处理的小鼠中肿瘤生长减少。

(D)时间比较，在使用和不使用mAbDPP3处理时，结肠细胞肿瘤需要10倍增加其体积。使用mAbDPP3处理时，生长需要更长时间。

图10：DPP3活性作为诊断标记物(II)

健康对照和患有各种疾病(急性心肌梗死(AMI)、心源性休克、脓毒性休克和肝功能衰竭)的患者的EDTA血浆中的DPP3活性。患者组的中值与健康对照显著不同(Mann-Whitney测试，p<0.05)。

图11：DPP3对健康大鼠的血压的影响

向健康雄性Wistar大鼠注射0.2mg/kg重组GST-hDPP3。通过将导管插入右颈动脉血管中测量和记录血压(BP)。通过尾静脉静脉内注射DPP3。DPP3注射导致BP降低。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，包括：

·确定所述对象的体液样品中的总DPP3的量和/或确定所述对象的体液样品中的活性DPP3的量，

·其中，如果所述确定的量高于所述预定阈值，则将所述对象诊断为患有伴有坏死过程或与坏死过程相关的疾病或病症，

·其中所述样品选自全血、血清和血浆。

2.根据权利要求1所述的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中所述总DPP3的量或活性DPP3的量以浓度单位进行确定。

3.根据权利要求1或2所述的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中所述疾病选自心力衰竭、慢性心力衰竭、急性心力衰竭(AHF)、心肌梗塞(MI)、中风、肝衰竭、烧伤、外伤、严重感染(微生物、病毒(例如，AIDS)、寄生虫(例如，疟疾))、SIRS或败血症、癌症、急性肾损伤(AKI)、CNS障碍(例如，癫痫、神经退行性疾病)、自身免疫疾病和血管疾病(例如，川崎综合症)和低血压。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中所述总DPP3的量和/或所述活性DPP3的量在所述对象的体液样品中进行确定，并且所述方法包括以下步骤：

·使所述样品与特异性结合全长DPP3的捕获结合剂接触，

·分离与所述捕获结合剂结合的DPP3，

·将DPP3的底物添加到所述分离的DPP3中，

·通过测量和量化DPP3的底物的转化率来量化所述活性DPP3。

5.根据权利要求4所述的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中所述捕获结合剂能够选自抗体、抗体片段或非IgG支架。

6.根据权利要求4或5所述的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中所述捕获结合剂是抗体。

7.根据权利要求4至6中任一项所述的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中将所述捕获结合剂固定在表面上。

8.根据权利要求4至7中任一项所述的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中所述分离步骤是洗涤步骤，在所述洗涤步骤中从所捕获的DPP3中移除未与所述捕获结合剂结合的样品成分。

9.根据权利要求4至8中任一项所述的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中DPP3底物转化率通过选自以下的方法来检测：荧光底物的荧光(例如Arg-Arg-βNA、Arg-Arg-AMC)、显色底物的颜色变化、与氨基荧光素偶联的底物的发光(Promega蛋白酶-Glo^TM测定)、质谱、HPLC/FPLC(反相色谱、尺寸排阻色谱)、薄层色谱、毛细管区带电泳、凝胶电泳后的活性染色(固定化、活性DPP3)或蛋白质印迹(切割产物)。

10.根据权利要求4至9中任一项所述的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中所述底物能够选自：血管紧张素II、血管紧张素III和血管紧张素IV、亮氨酸脑啡肽、甲硫氨酸脑啡肽、内吗啡肽1和内吗啡肽2、英洛芬、β-酪啡肽、强啡肽、原肠肽、ACTH和MSH，或与荧光团、发色团或氨基荧光素偶联的二肽，其中所述二肽是Arg-Arg。

11.根据权利要求4至10中任一项所述的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中所述底物能够选自：与荧光团、发色团或氨基荧光素偶联的二肽，其中所述二肽是Arg-Arg。

12.用于监测伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中将根据权利要求1至11中任一项所述的诊断方法进行至少两次。

13.一种用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂，其中所述疾病选自心力衰竭、慢性心力衰竭、急性心力衰竭(AHF)、心肌梗塞(MI)、中风、肝衰竭、烧伤、外伤、严重感染(微生物、病毒(例如，AIDS)、寄生虫(例如，疟疾))、SIRS或败血症、癌症、急性肾损伤(AKI)、CNS障碍(例如，癫痫、神经退行性疾病)、自身免疫疾病和血管疾病(例如，川崎综合症)和低血压。

14.根据权利要求13所述的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂选自抗DPP3抗体或抗DPP3抗体片段或抗DPP3非Ig支架。

15.根据权利要求14所述的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂是单结合或至少两结合的抗体。

16.根据权利要求14或15所述的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂是与SEQ ID No.1结合、特别是与SEQID No.2结合的抗DPP3抗体或抗DPP3抗体片段或抗DPP3非Ig支架。

17.根据权利要求14至16中任一项所述的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂是对DPP3的最小结合亲和力等于或小于10^-7M的抗体或片段或支架。

18.根据权利要求14至17中任一项所述的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂是单特异性的抗体或片段或支架。

19.根据权利要求14至18中任一项所述的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂为与全长DPP3结合并且抑制至少10％、或至少50％、更优选至少60％、甚至更优选大于70％、甚至更优选大于80％、甚至更优选大于90％、甚至更优选大于95％的DPP3活性的抗体或片段或支架。

20.根据权利要求14至19中任一项所述的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂对DPP3是选择性的和/或特异性的，并且不跨越细胞膜和/或血脑屏障。

21.根据权利要求14至20中任一项所述的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂，其中所述对象在所述对象的体液样品中的总DPP3的量和/或活性DPP3的量高于预定阈值。

22.一种药物组合物，包含根据权利要求14至21中任一项所述的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂。

23.根据权利要求14至21中任一项所述的DPP3活性抑制剂在从血浆中体外移除DPP3的方法中的用途，包括血液成分单采术和亲和色谱。

24.一种用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法，包括以下步骤：

·使所述样品与特异性结合全长DPP3的捕获结合剂接触，

·分离与所述捕获结合剂结合的DPP3，

·将DPP3的底物添加到所述分离的DPP3中，

·通过测量和量化DPP3的底物的转化率来量化所述活性DPP3。

25.根据权利要求24所述的用于测定对象的体液样品中的活性DPP3的方法，其中所述捕获结合剂能够选自抗体、抗体片段或非IgG支架。

26.根据权利要求24或25所述的用于测定对象的体液样品中的活性DPP3的方法，其中所述捕获结合剂是抗体。

27.根据权利要求24至26中任一项所述的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法，其中将所述捕获结合剂固定在表面上。

28.根据权利要求24至27中任一项所述的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法，其中所述分离步骤是洗涤步骤，在所述洗涤步骤中从所捕获的DPP3中移除未与所述捕获结合剂结合的样品成分。

29.根据权利要求24至28中任一项所述的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法，其中DPP3底物转化率通过选自以下的方法来检测：荧光底物的荧光(例如Arg-Arg-βNA、Arg-Arg-AMC)、显色底物的颜色变化、与氨基荧光素偶联的底物的发光(Promega蛋白酶-Glo^TM测定)、质谱、HPLC/FPLC(反相色谱、尺寸排阻色谱)、薄层色谱、毛细管区带电泳、凝胶电泳后的活性染色(固定化、活性DPP3)或蛋白质印迹(切割产物)。

30.根据权利要求24至29中任一项所述的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法，其中所述底物能够选自：与荧光团、发色团或氨基荧光素偶联的二肽，其中所述二肽是Arg-Arg。

31.根据权利要求24至30中任一项所述的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法，其中所述样品是选自全血、血清和血浆的血液样品。

32.一种用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的测定或试剂盒，其包含：

·与全长DPP3特异性结合的捕获结合剂，

·DPP3的底物。

33.根据权利要求32所述的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的测定或试剂盒，其中所述捕获结合剂能够选自抗体、抗体片段或非IgG支架。

34.根据权利要求32或33所述的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的测定或试剂盒，其中所述捕获结合剂在液相测定中抑制小于50％、优选小于40％、更优选小于30％的DPP3活性。

35.根据权利要求32至34中任一项所述的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的测定或试剂盒，其中所述捕获结合剂的DPP3的结合区域不在SEQ Id No.1的316位至669位氨基酸的区域内。

36.根据权利要求32至35中任一项所述的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的测定或试剂盒，其中所述结合剂是抗体。

37.根据权利要求32至36中任一项所述的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的测定或试剂盒，其中将所述捕获结合剂固定在表面上。

38.根据权利要求32至37中任一项所述的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的测定或试剂盒，其中所述底物能够选自：血管紧张素II、血管紧张素III和血管紧张素IV、亮氨酸脑啡肽、甲硫氨酸脑啡肽、内吗啡肽1和内吗啡肽2、英洛芬、β-酪啡肽、强啡肽、原肠肽、ACTH和MSH，或与荧光团、发色团或氨基荧光素偶联的二肽，其中所述二肽是Arg-Arg。

Claims

·其中，如果所述确定的量高于所述预定阈值，则将所述对象诊断为患有伴有坏死过程或与坏死过程相关的疾病或病症。

3.根据权利要求1或2所述的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中所述样品选自全血、血清和血浆。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中所述疾病选自心力衰竭、慢性心力衰竭、急性心力衰竭(AHF)、心肌梗塞(MI)、中风、肝衰竭、烧伤、外伤、严重感染(微生物、病毒(例如，AIDS)、寄生虫(例如，疟疾))、SIRS或败血症、癌症、急性肾损伤(AKI)、CNS障碍(例如，癫痫、神经退行性疾病)、自身免疫疾病和血管疾病(例如，川崎综合症)和低血压。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中所述总DPP3的量和/或所述活性DPP3的量在所述对象的体液样品中进行确定，并且所述方法包括以下步骤：

·使所述样品与特异性结合全长DPP3的捕获结合剂接触，

·分离与所述捕获结合剂结合的DPP3，

·将DPP3的底物添加到所述分离的DPP3中，

·通过测量和量化DPP3的底物的转化率来量化所述活性DPP3。

6.根据权利要求5所述的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中所述捕获结合剂能够选自抗体、抗体片段或非IgG支架。

7.根据权利要求5或6所述的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中所述捕获结合剂是抗体。

8.根据权利要求5至7中任一项所述的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中将所述捕获结合剂固定在表面上。

9.根据权利要求5至8中任一项所述的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中所述分离步骤是洗涤步骤，在所述洗涤步骤中从所捕获的DPP3中移除未与所述捕获结合剂结合的样品成分。

10.根据权利要求5至9中任一项所述的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中DPP3底物转化率通过选自以下的方法来检测：荧光底物的荧光(例如Arg-Arg-βNA、Arg-Arg-AMC)、显色底物的颜色变化、与氨基荧光素偶联的底物的发光(Promega蛋白酶-Glo^TM测定)、质谱、HPLC/FPLC(反相色谱、尺寸排阻色谱)、薄层色谱、毛细管区带电泳、凝胶电泳后的活性染色(固定化、活性DPP3)或蛋白质印迹(切割产物)。

11.根据权利要求5至10中任一项所述的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中所述底物能够选自：血管紧张素II、血管紧张素III和血管紧张素IV、亮氨酸脑啡肽、甲硫氨酸脑啡肽、内吗啡肽1和内吗啡肽2、英洛芬、β-酪啡肽、强啡肽、原肠肽、ACTH和MSH，或与荧光团、发色团或氨基荧光素偶联的二肽，其中所述二肽是Arg-Arg。

12.根据权利要求5至11中任一项所述的用于诊断伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中所述底物能够选自：与荧光团、发色团或氨基荧光素偶联的二肽，其中所述二肽是Arg-Arg。

13.用于监测伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法，其中将根据权利要求1至12中任一项所述的诊断方法进行至少两次。

14.一种用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂。

15.根据权利要求14所述的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂选自抗DPP3抗体或抗DPP3抗体片段或抗DPP3非Ig支架。

16.根据权利要求14或15所述的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂，其中所述疾病选自心力衰竭、慢性心力衰竭、急性心力衰竭(AHF)、心肌梗塞(MI)、中风、肝衰竭、烧伤、外伤、严重感染(微生物、病毒(例如，AIDS)、寄生虫(例如，疟疾))、SIRS或败血症、癌症、急性肾损伤(AKI)、CNS障碍(例如，癫痫、神经退行性疾病)、自身免疫疾病和血管疾病(例如，川崎综合症)和低血压。

17.根据权利要求14至16中任一项所述的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂是单结合或至少两结合的抗体。

18.根据权利要求14至17中任一项所述的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂是与SEQ ID No.1结合、特别是与SEQ ID No.2结合的抗DPP3抗体或抗DPP3抗体片段或抗DPP3非Ig支架。

19.根据权利要求14至18中任一项所述的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂是对DPP3的最小结合亲和力等于或小于10^-7M的抗体或片段或支架。

20.根据权利要求14至19中任一项所述的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂是单特异性的抗体或片段或支架。

21.根据权利要求14至20中任一项所述的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂为与全长DPP3结合并且抑制至少10％、或至少50％、更优选至少60％、甚至更优选大于70％、甚至更优选大于80％、甚至更优选大于90％、甚至更优选大于95％的DPP3活性的抗体或片段或支架。

22.根据权利要求14至21中任一项所述的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂，其中所述抑制剂对DPP3是选择性的和/或特异性的，并且不跨越细胞膜和/或血脑屏障。

23.根据权利要求14至22中任一项所述的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂，其中所述对象在所述对象的体液样品中的总DPP3的量和/或活性DPP3的量高于预定阈值。

24.一种药物组合物，包含根据权利要求14至23中任一项所述的用于预防或治疗伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的DPP3活性抑制剂。

25.根据权利要求14至23中任一项所述的DPP3活性抑制剂在从血浆中体外移除DPP3的方法中的用途，包括血液成分单采术和亲和色谱。

26.一种用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法，包括以下步骤：

·使所述样品与特异性结合全长DPP3的捕获结合剂接触，

·分离与所述捕获结合剂结合的DPP3，

·将DPP3的底物添加到所述分离的DPP3中，

·通过测量和量化DPP3的底物的转化率来量化所述活性DPP3。

27.根据权利要求26所述的用于测定对象的体液样品中的活性DPP3的方法，其中所述捕获结合剂能够选自抗体、抗体片段或非IgG支架。

28.根据权利要求26或27所述的用于测定对象的体液样品中的活性DPP3的方法，其中所述捕获结合剂是抗体。

29.根据权利要求26至28中任一项所述的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法，其中将所述捕获结合剂固定在表面上。

30.根据权利要求26至29中任一项所述的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法，其中所述分离步骤是洗涤步骤，在所述洗涤步骤中从所捕获的DPP3中移除未与所述捕获结合剂结合的样品成分。

31.根据权利要求26至30中任一项所述的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法，其中DPP3底物转化率通过选自以下的方法来检测：荧光底物的荧光(例如Arg-Arg-βNA、Arg-Arg-AMC)、显色底物的颜色变化、与氨基荧光素偶联的底物的发光(Promega蛋白酶-Glo^TM测定)、质谱、HPLC/FPLC(反相色谱、尺寸排阻色谱)、薄层色谱、毛细管区带电泳、凝胶电泳后的活性染色(固定化、活性DPP3)或蛋白质印迹(切割产物)。

32.根据权利要求26至31中任一项所述的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法，其中所述底物能够选自：与荧光团、发色团或氨基荧光素偶联的二肽，其中所述二肽是Arg-Arg。

33.根据权利要求26至32中任一项所述的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法，其中所述样品是选自全血、血清和血浆的血液样品。

34.一种用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的测定或试剂盒，其包含：

·与全长DPP3特异性结合的捕获结合剂，

·DPP3的底物。

35.根据权利要求34所述的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的测定或试剂盒，其中所述捕获结合剂能够选自抗体、抗体片段或非IgG支架。

36.根据权利要求34或35所述的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的测定或试剂盒，其中所述捕获结合剂在液相测定中抑制小于50％、优选小于40％、更优选小于30％的DPP3活性。

37.根据权利要求34至36中任一项所述的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的测定或试剂盒，其中所述捕获结合剂的DPP3的结合区域不在SEQ Id No.1的316位至669位氨基酸的区域内。

38.根据权利要求34至37中任一项所述的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的测定或试剂盒，其中所述结合剂是抗体。

39.根据权利要求34至38中任一项所述的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的测定或试剂盒，其中将所述捕获结合剂固定在表面上。

40.根据权利要求34至39中任一项所述的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的测定或试剂盒，其中所述底物能够选自：血管紧张素II、血管紧张素III和血管紧张素IV、亮氨酸脑啡肽、甲硫氨酸脑啡肽、内吗啡肽1和内吗啡肽2、英洛芬、β-酪啡肽、强啡肽、原肠肽、ACTH和MSH，或与荧光团、发色团或氨基荧光素偶联的二肽，其中所述二肽是Arg-Arg。

41.根据权利要求26至33中任一项所述的用于确定对象的体液样品中的活性DPP3的方法在根据权利要求1至13中任一项所述的用于诊断或监测伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法中的用途，或者根据权利要求34至40中任一项所述的测定或试剂盒在根据权利要求1至13中任一项所述的用于诊断或监测伴有坏死过程或与坏死过程相关的对象的疾病或病症的方法中的用途。