CN110156873A - Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明Fmoc‑D‑Pro‑D‑Pro‑OH的制备方法，属于多肽合成领域。Fmoc‑D‑Pro‑D‑Pro‑OH的制备方法，按以下步骤进行：a、将Fmoc‑D‑Pro‑OR、D‑Pro‑Na、NdSe2和溶剂混合反应，得到Fmoc‑D‑Pro‑D‑Pro‑ONa；其中，所述Fmoc‑D‑Pro‑OR为能够与氨基反应生成酰胺键的酯类；b、将Fmoc‑D‑Pro‑D‑Pro‑ONa进行酸化，得到Fmoc‑D‑Pro‑D‑Pro‑OH。本发明方法制备Fmoc‑D‑Pro‑D‑Pro‑OH，生产步骤更短，主反应更快，副产物更少，更容易纯化，提高生产效率，适应工业生产。
Description
技术领域
本发明Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH的制备方法，属于多肽合成领域。
背景技术
Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH即芴甲氧羰基-D-脯氨酰-D-脯氨酸，是一种化工中间体，常用于多肽合成或用作多肽合成原料质量控制标准品。
现有技术中，制备Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH的常用方法有两种。
一种是液相合成法：先反应生成Fmoc-D-Pro-OR活化酯后，与D-Pro-OR′反应，接肽生成Fmoc-D-Pro-D-Pro-OR′，然后皂化生成D-Pro-D-Pro，再上Fmoc保护基团生成Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH。但是该方法步骤较长，制备过程需要先脱去Fmoc基团，再上Fmoc基团，增加了Fmoc试剂的用量，增加了成本。
另外一种是采用固相法合成：先反应生成Fmoc-D-Pro-OR活化酯后，与树脂反应，脱Fmoc，再与Fmoc-D-Pro-OR活化酯接肽，然后用三氟乙醇把Fmoc-D-Pro-D-Pro从树脂上脱下，经过纯化，结晶得到Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH。但是该方法中使用了树脂，价格较高，而且Fmoc-D-Pro-OR活化酯也是百分之几百的过量，因此大大增加了成本。
已有液相法全保护合成策略通常收率不高，在50％以下，最严重的缺点是极限纯度通常在90％以下，很难达到95％以上。固相法纯度可以达到95％，但以Fmoc-D-Pro-OR活化酯计量，收率在30％以下。
现有方法存在的问题是：步骤长、产率低、生产效率低，而且产品纯度通常都不高；或者成本特别昂贵。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种合成步骤短的Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH合成方法。
Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH的制备方法，按以下步骤进行：
a、将Fmoc-D-Pro-OR、D-Pro-Na、NdSe2和溶剂混合反应，过滤，得到Fmoc-D-Pro-D-Pro-ONa；其中，所述Fmoc-D-Pro-OR为能够与氨基反应生成酰胺键的酯类；
b、将Fmoc-D-Pro-D-Pro-ONa进行酸化，得到Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH。
优选的，在Fmoc-D-Pro-OR中，所述R为-Su、-NB或-Bt；更优选的，R为-NB。
优选的，步骤a中，溶剂为醇类、醚类、酰胺类或酯类溶剂；更优选的，所述溶剂为甲醇或乙醇。
优选的，步骤a中，过滤后，得到的产品用乙酸乙酯进行淋洗。
优选的，步骤a中，Fmoc-D-Pro-OR、D-Pro-Na和NdSe2的摩尔比为100:80～300:1～300；
更优选的，Fmoc-D-Pro-OR、D-Pro-Na和NdSe2的摩尔比为100:100～300:1～10。进一步优选的，Fmoc-D-Pro-OR、D-Pro-Na和NdSe2的摩尔比为100:200～300:5～10。最优选的，Fmoc-D-Pro-OR、D-Pro-Na和NdSe2的摩尔比为100:200:5。
优选的，步骤a中，反应方法为：室温下反应8～72小时；更优选的，在室温下搅拌反应；进一步优选的，反应时间为24小时。
优选的，步骤b中，酸化的方法为：将Fmoc-D-Pro-D-Pro-ONa加入到酸性溶液中进行酸化，所述酸性溶液的pH≤2；更优选的，所述酸性溶液为盐酸溶液、硫酸溶液、硝酸溶液、磷酸溶液、磷酸二氢钠溶液、磷酸二氢钾溶液、硫酸氢钾溶液、甲酸溶液和三氟乙酸溶液中的至少一种；进一步优选的，所述酸性溶液为盐酸溶液。
优选的，步骤b中，将酸化后得到的Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH，用有机溶剂进行萃取，收集有机相，浓缩、结晶、过滤得到Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH固体；优选的，所述有机溶剂为乙酸乙酯。
优选的，步骤b中，对得到的Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH固体进行进一步纯化，纯化方法为：将Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH进行重结晶或打浆；更优选的，Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH固体先用乙醚打浆、再过滤、干燥；然后再用水打浆、再次过滤、干燥，得到纯化后的Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH。
本发明的有益效果：
1、本发明的方法制备Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH，生产步骤更短，提高生产效率，适应工业生产。
2、本发明可以避免一些副反应，减少杂质的生成，从而提高产品质量及产率，收率在69％以上，纯度在98.5％以上。
3、本发明制备成本相对较低。
4、相比较传统的合成方法，本发明不需要先脱掉Fmoc基团，再二次加上Fmoc基团，节约了Fmoc试剂，从而减少了步骤，且降低了成本。
附图说明
图1为实施例1制得产品的13C NMR图谱总图；
图2为实施例1制得产品的13C NMR图谱中，位移为115～180ppm的图谱；
图3为实施例1制得产品的13C NMR图谱中，位移为20～70ppm的图谱。
具体实施方式
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种合成步骤短的Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH合成方法。
Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH的制备方法，按以下步骤进行：
a、将Fmoc-D-Pro-OR、D-Pro-Na、NdSe2和溶剂混合反应，过滤，得到Fmoc-D-Pro-D-Pro-ONa；
b、将Fmoc-D-Pro-D-Pro-ONa进行酸化，得到Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH。
本发明具体的反应流程如下：
其中，所述Fmoc-D-Pro-OR为能够与氨基反应生成酰胺键的酯类；Fmoc-D-Pro-OR可采用常规方法制得，比如Fmoc-D-Pro-OR制备方法可以为：将Fmoc-D-Pro-OH中的羧基活化，得到活化酯Fmoc-D-Pro-OR；方法如下所述：
优选的，在Fmoc-D-Pro-OR中，所述R为-Su、-NB或-Bt；更优选的，R为-NB。
其中，Fmoc-D-Pro-OSu中文名称为：芴甲氧羰酰-D-脯氨酸-N-羟基琥珀亚胺酯；
Fmoc-D-Pro-ONB中文名称为：芴甲氧羰酰-D-脯氨酸-1-羟基苯并三唑酯；
Fmoc-D-Pro-OBt中文名称为：芴甲氧羰酰-D-脯氨酸-N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺酯；
D-Pro-Na中文名称为：D-脯氨酸钠盐；
NdSe2中文名称为：硒化钕。
本发明步骤a中，加入溶剂的目的是为了使反应物能够溶解，增大反应物的接触面积，从而加快反应速度。优选的，步骤a中，溶剂为醇类、醚类、酰胺类或酯类溶剂。溶剂的加入量没有特别的限定，使反应物能够溶解即可。其中，所述醇类溶剂包括常见的醇类溶剂，比如乙醇、甲醇、丙三醇等；所述醚类溶剂包括常见的醚类溶剂，比如乙醚、苯甲醚等；所述酰胺类溶剂包括常见的酰胺类溶剂，比如N，N－二甲基丙酰胺(DMP)、N，N－二乙基丙酰胺(DEP)和N，N－二乙基乙酰胺(DEA)等；所述酯类溶剂包括常见的酯类溶剂，比如乙酸乙酯、乙酸甲酯、肉桂酸乙酯等。
更优选的，所述溶剂为甲醇或乙醇。
本发明需要在反应的过程中加入催化剂NdSe2。如果不加NdSe2，副反应速度会超过主反应速度，产物纯度极低，无法纯化到需要的标准。
优选的，步骤a中，Fmoc-D-Pro-OR、D-Pro-Na和NdSe2的摩尔比为100:80～300:1～300；
为了提高产品的纯度和收率，更优选的，Fmoc-D-Pro-OR、D-Pro-Na和NdSe2的摩尔比为100:100～300:1～10。
进一步优选的，Fmoc-D-Pro-OR、D-Pro-Na和NdSe2的摩尔比为100:200～300:5～10；最优选的，Fmoc-D-Pro-OR、D-Pro-Na和NdSe2的摩尔比为100:200:5。
优选的，步骤a中，反应方法为：室温下反应8～72小时；更优选的，在室温下搅拌反应；进一步优选的，反应时间为24小时。
优选的，步骤b中，酸化的方法为：将Fmoc-D-Pro-D-Pro-ONa加入到酸性溶液中进行酸化，所述酸性溶液的pH≤2；更优选的，所述酸性溶液为盐酸溶液、硫酸溶液、硝酸溶液、磷酸溶液、磷酸二氢钠溶液、磷酸二氢钾溶液、硫酸氢钾溶液、甲酸溶液和三氟乙酸溶液中的至少一种；进一步优选的，所述酸性溶液为盐酸溶液。
为了提高产品的纯度，步骤a中，将得到的Fmoc-D-Pro-D-Pro-ONa用乙酸乙酯进行淋洗，其目的是为了除去杂质。
优选的，步骤b中，将酸化后得到的Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH，用有机溶剂进行萃取，再收集有机相，浓缩、结晶、过滤得到Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH固体；优选的，所述有机溶剂为乙酸乙酯。
为了降低杂质含量，收集有机相后，用盐水洗酯层至少3遍；优选的，洗涤3遍。
浓缩后，往浓缩液加入正己烷，析出晶体。过滤、烘干得到初步纯化的产品。
为了进一步提高产品的纯度，优选的，步骤b中，对得到的Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH固体进行进一步纯化，纯化方法为：将Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH进行重结晶或打浆；更优选的，Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH固体先用乙醚打浆、过滤、干燥；然后再用水打浆、过滤、干燥，得到纯化后的Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH。具体操作方式可以为：先用乙醚25～35℃打浆3～5h，过滤，40～50℃鼓风干燥3～5h；再用水打浆6～9h，过滤，40～50℃鼓风干燥。更优选的，先用乙醚30℃打浆3h，过滤，45℃鼓风干燥4h；300ml水打浆8h，过滤，45℃鼓风干燥即得。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1
在反应瓶中加入43.5g Fmoc-D-Pro-OSu、100mL乙醇、0.2mol D-Pro-Na、3g硒化钕NdSe2，室温搅拌反应24小时。过滤，乙酸乙酯淋洗，收集固体，加入200mL乙酸乙酯、50mL水，盐酸酸化到pH≤2，分液；盐水50ml洗酯层3遍。浓缩酯层至50mL，加正己烷100mL，结晶，过滤，烘干；100mL乙醚30℃打浆3h，过滤，45℃鼓风干燥4h；300mL水打浆8h，过滤，45℃鼓风干燥，得到白色固体。经MS、NMR确认结构正确，产品为Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH，其碳谱图见说明书附图图1～3，产品总量为30.5克，收率70.1％。HPLC纯度98.93％，最大单个杂质0.23％。
实施例2
在反应瓶中加入100g Fmoc-D-Pro-ONB、200mL甲醇、0.4mol D-Pro-Na、4g硒化钕，室温搅拌反应24小时。过滤，收集固体，加入400ml乙酸乙酯、100mL水，盐酸酸化到pH≤2，分液；盐水50ml洗酯层3遍。浓缩酯层至100mL，加正己烷200mL，结晶，过滤，烘干；200mL乙醚30℃打浆3h，过滤，45℃鼓风干燥4h；500mL水打浆8h，过滤，45℃鼓风干燥，得到白色固体。经与实施例1所得样品对照确认，白色固体为Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH，产品总量为63.5克，收率73.1％，产品HPLC纯度98.94％。
实施例3
在反应瓶中加入91g Fmoc-D-Pro-OBt、200mL甲醇、0.3mol D-Pro-Na、5g硒化钕，室温搅拌反应24小时。过滤，收集固体，加入400mL乙酸乙酯、100mL水，盐酸酸化到pH≤2，分液；盐水50mL洗酯层3遍。浓缩酯层至100mL，加正己烷200mL，结晶，过滤，烘干；200mL乙醚30℃打浆3h，过滤，45℃鼓风干燥4h；500mL水打浆8h，过滤，45℃鼓风干燥，得到白色固体。经与实施例1所得样品对照确认，白色固体为Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH，产品总量为60.5克，收率69.7％，HPLC纯度98.92％。
对比例
在反应瓶中加入100g Fmoc-D-Pro-ONB、200mL甲醇、0.4mol D-Pro-Na，室温搅拌反应24小时。过滤，收集固体，加入400mL乙酸乙酯、100mL水，盐酸酸化到pH≤2，分液；盐水50mL洗酯层3遍。浓缩酯层至100mL，加正己烷200mL，结晶，过滤，烘干；200mL乙醚30℃打浆3h，过滤，45℃鼓风干燥4h；500mL水打浆8h，过滤，45℃鼓风干燥，得到白色固体。经MS、NMR确认结构正确，产品为Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH，产品总量为58.3克，收率67.11％。HPLC纯度89.12％，最大单个杂质6.31％。
Claims (10)
1.Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH的制备方法,其特征在于，按以下步骤进行：
a、将Fmoc-D-Pro-OR、D-Pro-Na、NdSe2和溶剂混合反应，过滤，得到Fmoc-D-Pro-D-Pro-ONa；其中，所述Fmoc-D-Pro-OR为能够与氨基反应生成酰胺键的酯类；
b、将Fmoc-D-Pro-D-Pro-ONa进行酸化，得到Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH。
2.根据权利要求1所述的Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH的制备方法,其特征在于，在Fmoc-D-Pro-OR中，所述R为-Su、-NB或-Bt；优选的，R为-NB。
3.根据权利要求1所述的Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH的制备方法,其特征在于，步骤a中，溶剂为醇类、醚类、酰胺类或酯类溶剂；优选的，所述溶剂为甲醇或乙醇。
4.根据权利要求1～3任一项所述的Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH的制备方法,其特征在于，步骤a中，Fmoc-D-Pro-OR、D-Pro-Na和NdSe2的摩尔比为100:80～300:1～300。
5.根据权利要求4所述的Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH的制备方法,其特征在于，Fmoc-D-Pro-OR、D-Pro-Na和NdSe2的摩尔比为100:100～300:1～10；优选的，Fmoc-D-Pro-OR、D-Pro-Na和NdSe2的摩尔比为100:200～300:5～10。
6.根据权利要求5所述的Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH的制备方法,其特征在于，Fmoc-D-Pro-OR、D-Pro-Na和NdSe2的摩尔比为100:200:5。
7.根据权利要求1～6任一项所述的Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH的制备方法,其特征在于，步骤a中，反应方法为：室温下反应8～72小时；优选的，在室温下搅拌反应；更优选的，反应时间为24小时。
8.根据权利要求1～7任一项所述的Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH的制备方法,其特征在于，步骤b中，酸化的方法为：将Fmoc-D-Pro-D-Pro-ONa加入到酸性溶液中进行酸化，所述酸性溶液的pH≤2；优选的，所述酸性溶液为盐酸溶液、硫酸溶液、硝酸溶液、磷酸溶液、磷酸二氢钠溶液、磷酸二氢钾溶液、硫酸氢钾溶液、甲酸溶液和三氟乙酸溶液中的至少一种；更优选的，所述酸性溶液为盐酸溶液。
9.根据权利要求1所述的Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH的制备方法,其特征在于，步骤b中，将酸化后得到的Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH，用有机溶剂进行萃取，收集有机相，浓缩、结晶、过滤得到Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH固体；优选的，所述有机溶剂为乙酸乙酯。
10.根据权利要求1所述的Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH的制备方法,其特征在于，步骤b中，对得到的Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH固体进行进一步纯化，纯化方法为：将Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH进行重结晶或打浆；优选的，Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH固体先用乙醚打浆、再过滤、干燥；然后再用水打浆、再次过滤、干燥，得到纯化后的Fmoc-D-Pro-D-Pro-OH。
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