CN110133303A - 凝血酶原时间测定试剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及凝血酶原时间测定试剂及其应用，该凝血酶原时间测定试剂包括：凝血活酶、钙离子试剂、缓冲液和保护剂，所述凝血活酶为人组织因子脂化物。该试剂对抗凝药物足够敏感且稳定性好，可有效应用于临床上抗凝药物治疗的监测。

Description

凝血酶原时间测定试剂及其应用
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体地，本发明涉及凝血酶原时间测定试剂及其应用，更具体地，本发明涉及凝血酶原时间测定试剂以及测定凝血酶原时间的方法。
背景技术
凝血酶原时间(prothrombin time,PT)测定是检查机体外源性凝血系统功能有无障碍的过筛试验，也是临床抗凝治疗重要监测指标。由于不同品牌、不同仪器测试同一个样本得到的凝血酶原时间(PT)即样本凝固时间结果不尽相同，这直接导致临床诊断中的误判，因此寻找一个统一的标准是十分有必要的。目前，国际上推荐用国际标准化比值(international normalized ratio,INR)来监测溶栓治疗和口服抗凝药的用量，此时同一份样本在不同实验室进行测试，虽然所得PT时间有差异，但是INR测值一致。因此，INR值作为临床上抗凝疗效的判断依据被广泛应用，而INR值又与试剂本身的敏感性密不可分，INR值的计算公式如下：
INR＝PTRISI
PTR——凝血酶原时间比值。
近年来，由于心血管疾病发病率的逐年升高，PT-INR检测的临床应用日益广泛。健康成年人的INR值约为1，患有静脉血栓的病人INR一般在2.0～2.5范围内，而患有心房纤维性颤动的患者INR一般在2.0～3.0范围内，当病人INR值超过4.0时，则提示出血风险可能无法控制。然而，目前市面上的凝血酶原时间(PT)试剂基本被进口试剂垄断。
因此，结果可靠、价格低廉的凝血酶原时间(PT)试剂急需开发。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
发明人在比较市面常见的凝血酶原时间(PT)测定试剂盒后发现，目前国内多数厂家PT试剂的主要成分由兔脑组织提取组织因子和磷脂组成。然而，利用兔脑组织及不同方法提取的组织因子和磷脂来制备PT试剂时，批间差很难控制，且对抗凝药物敏感性差强人意，难以取代市面上价格高昂的进口PT试剂。基于上述问题，发明人经过大量的实验研究，开发了一种新的PT测定试剂，该试剂对抗凝药物足够敏感且稳定性好，可有效应用于临床上抗凝药物治疗的监测。
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种凝血酶原时间测定试剂。根据本发明的实施例，所述凝血酶原时间测定试剂包括：凝血活酶、钙离子试剂、缓冲液和保护剂，所述凝血活酶为人组织因子脂化物。需要说明的是，所述“人组织因子脂化物”表示人组织因子在一定条件下与磷脂相结合得到的物质，本领域技术人员可以通过公知的技术手段自行制备获得或者购买获得。例如，在一些实施例中，所述人组织因子脂化物购买自太原博奥特生物技术有限公司。所述“钙离子试剂”指的是可以提供钙离子的无机盐，如氯化钙。发明人发现，所述凝血活酶为人组织因子脂化物，同时配合试剂中的其他成分时，根据本发明实施例的凝血酶原时间测定试剂对抗凝药物的敏感性高，性能稳定，测试结果准确可靠，与市面上广受好评的西门子凝血酶原时间测定试剂水平相当，打破了进口试剂的垄断。
根据本发明的实施例，上述凝血酶原时间测定试剂还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述钙离子试剂为氯化钙。根据本发明的实施例，所述保护剂包括选自牛血清白蛋白、酪蛋白、人血清白蛋白的至少之一。
根据本发明的实施例，所述缓冲液包括选自Tris-HCl、HEPES、PIPES、PBS、甘氨酸、MOPS缓冲液的至少之一。根据本发明的实施例，所述缓冲液的pH为6.0～8.0，如为6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6或7.8。在一些实施例中，所述缓冲液的pH为6.2～7.0。在一些实施例中，所述缓冲液的浓度为0.05～0.20mol/L，如为0.05、0.07、0.09、0.1、0.13、0.15、0.17、0.19或0.20mol/L。其中，所述“缓冲液的pH”或所述“缓冲液的浓度”按照本领域通用解释进行理解即可。
根据本发明的实施例，基于所述凝血酶原时间测定试剂的总体积，所述凝血活酶的质量百分比为0.01～0.5wt％，如为0.03、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.17、0.2、0.23、0.25、0.27、0.3、0.35、0.4或0.45wt％；所述钙离子试剂的质量百分比为0.1～0.5wt％，如为0.13、0.15、0.17、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.27、0.3、0.35、0.4或0.45wt％；所述保护剂的浓度为0.1～5.0g/L，如为0.3、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.5、1.7、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0或4.5g/L。需要说明的是，本发明中的“基于所述凝血酶原时间测定试剂的总体积”指的是配置完成的终产品凝血酶原时间测定试剂的总体积，但是鉴于配置时添加的固体质量较少，对总体积的影响较小，因此，便以缓冲液的体积作为凝血酶原时间测定试剂的总体积。另外，某一组分的“质量百分比”指的是每100mL的缓冲液中添加的该组分的质量(单位为g)。例如，所述凝血活酶的质量百分比为0.01～0.5wt％，缓冲液的体积为1000mL时，添加的所述凝血活酶的质量为0.1～5g。另外，需要说明的是，在一些实施例中，所述凝血活酶为购买自太原博奥特生物技术有限公司的产品人组织因子脂化物时，所述人组织因子脂化物的外观为混悬液，添加的所述混悬液的质量即表示添加的所述凝血活酶的质量。发明人发现，若所述凝血活酶的质量过小，无法激活外源性凝血机制，若所述凝血活酶的质量过大，所述凝血酶原时间测定试剂的稳定性差且对抗凝药物的敏感性会显著降低；若所述钙离子试剂的质量过小或所述保护剂的浓度过低，无法发挥保障凝血的功能，若所述钙离子试剂的质量过大或所述保护剂的浓度过高，所述凝血酶原时间测定试剂对抗凝药物的敏感性会显著降低。由此，所述凝血活酶的质量百分比、所述钙离子试剂的质量百分比、所述保护剂的浓度在上述范围时，根据本发明实施例的凝血酶原时间测定试剂对抗凝药物的敏感性更好，且更加均一、稳定，检测结果更加准确可靠。
根据本发明的实施例，基于所述凝血酶原时间测定试剂的总体积，所述凝血活酶的质量百分比为0.06～0.14wt％，所述钙离子试剂的质量百分比为0.15～0.3wt％，所述保护剂的浓度为0.1～2.0g/L。发明人发现，所述凝血活酶的质量百分比、所述钙离子试剂的质量百分比、所述保护剂的浓度在上述范围时，根据本发明实施例的凝血酶原时间测定试剂对抗凝药物的敏感性更好，且更加均一、稳定，检测结果更加准确可靠。
根据本发明的实施例，基于所述凝血酶原时间测定试剂的总体积，所述凝血活酶的质量百分比为0.08～0.12wt％，所述钙离子试剂的质量百分比为0.2～0.25wt％，所述保护剂的浓度为0.5～1.5g/L。发明人发现，所述凝血活酶的质量百分比、所述钙离子试剂的质量百分比、所述保护剂的浓度在上述范围时，根据本发明实施例的凝血酶原时间测定试剂对抗凝药物的敏感性更好，且更加均一、稳定，检测结果更加准确可靠。
根据本发明的实施例，所述凝血酶原时间测定试剂进一步包括：防腐剂。根据本发明的实施例，所述防腐剂包括选自Proclin300、山梨酸钾和对羟基苯甲酸甲酯的至少之一。根据本发明的实施例，基于所述凝血酶原时间测定试剂的总体积，所述防腐剂的质量百分比为0.01～1wt％，如为0.03、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.17、0.19、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4或0.45wt％。发明人发现，若所述防腐剂的质量过大，所述凝血酶原时间测定试剂的稳定性、均一性会较差；若所述防腐剂的质量过小，所述凝血酶原时间测定试剂的防腐效果较差，影响检测结果的准确性。由此，所述防腐剂的质量百分比在上述范围时，根据本发明实施例的凝血酶原时间测定试剂更加均一、稳定，检测结果更加准确可靠。
根据本发明的实施例，基于所述凝血酶原时间测定试剂的总体积，所述防腐剂的质量百分比为0.01～0.5wt％。在一些实施例中，基于所述凝血酶原时间测定试剂的总体积，所述防腐剂的质量百分比为0.01～0.2wt％。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种凝血酶原时间测定试剂。根据本发明的实施例，所述凝血酶原时间测定试剂包括：缓冲液、氯化钙、牛血清白蛋白、Proclin300和人组织因子脂化物，所述缓冲液为Tris-HCl、HEPES、PIPES、PBS或MOPS缓冲液，所述缓冲液的pH为6.2～7.0，其中：基于所述凝血酶原时间测定试剂的总体积，所述氯化钙的质量百分比为0.22wt％，所述牛血清白蛋白的浓度为1.0g/L，所述Proclin300的质量百分比为0.1wt％，所述人组织因子脂化物的质量百分比为0.1wt％。根据本发明实施例的凝血酶原时间测定试剂对抗凝药物的敏感性更高，性能更稳定，测试结果更加准确可靠，可以替代市面上广受好评的西门子凝血酶原时间测定试剂。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种测定凝血酶原时间的方法，所述方法用于非诊断目的，如用于科学研究，通过测定凝血酶原时间，研究PT测定试剂对抗凝药物敏感性的变化规律等。根据本发明的实施例，所述方法包括：将枸橼酸抗凝血浆与前面所描述的凝血酶原时间测定试剂进行混合，以便形成血浆凝块；基于所述血浆凝块的形成时间，确定所述凝血酶原时间。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种稳定且对抗凝药物敏感的即用液体凝血酶原时间(PT)测定试剂。为此，该发明还将提供该试剂的制备方法及检测方法。
基于上述目的，本发明提供了凝血酶原时间(PT)试剂，用来作为凝血酶原时间(PT)检测试剂，所述凝血酶原时间(PT)试剂中含有凝血活酶，能够激活外源性凝血机制，同时在PT试剂中加入缓冲液、钙离子、保护剂等成分，能够起到保障凝血的功能。采用本发明的凝血酶原时间(PT)试剂进行凝血检测，开瓶即用不需要进行其他特殊处理，例如冻干粉末需提前半小时进行复溶。
另外，本发明提供了凝血酶原时间测定试剂的制备方法，包括如下步骤：
1)配制缓冲液，调节pH至6.0～8.0；
2)将氯化钙、保护剂及防腐剂加入到缓冲液中，搅拌均匀；
3)将人组织因子脂化物加入到步骤2)所得试剂中，搅拌均匀，得到凝血酶原时间(PT)的初步试剂；
4)将上述初步试剂放置在相应的凝血分析仪上测定质控品，将测试质控品的结果调整至质控品靶值范围内即为凝血酶原时间(PT)测定试剂的最终配比。
在本发明的一种具体实施方式中，本发明提供了一种凝血酶原时间(PT)测定试剂的制备方法，包括如下步骤：
S1，配制缓冲液，调节pH值至6.0～8.0；
S2，向上述S1中依次加入0.1～0.5wt％氯化钙，0.1～5.0g/L保护剂，0.01～1wt％防腐剂，搅拌均匀；
S3，在上述S2中加入0.01～0.5wt％人组织因子脂化物，搅拌均匀；
S4，将上述S3中配制的试剂放置在相应的凝血分析仪上测定质控品，将测试质控品的结果调整至质控品靶值范围内即为适配相应机型凝血酶原时间(PT)测定试剂的最终配比。再以确定的最终配比重复步骤S1～S3，最后进行配制分装，于2～8℃冷藏保存。
本发明通过研制配套试剂，利用凝血活酶激活外源性凝血途径，在钙离子的参与下完成血浆的凝集过程，其中，待测血浆与凝血酶原时间(PT)测定试剂的体积比为1:2。本发明试剂盒有性能稳定、重复性好、对抗凝药物敏感、开瓶即用等优点。利用本发明的试剂进行凝血酶原时间(PT)测定，开瓶即用，适用于市面上多数品牌全自动/半自动凝血分析仪，且测定结果与市面上广受好评的西门子凝血酶原时间测定试剂盒测试结果一致性良好。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用原材料未注明生产厂商者，均为可以通过市面购买获得的常规产品。其中：
人组织因子脂化物：购买自太原博奥特生物技术有限公司。
市购的凝血酶原时间测定试剂盒(凝固法)，厂家：Siemens HealthcareDiagnostics Products GmbH
测试用凝血分析仪：Sysmex CA-1500
实施例1凝血酶原时间(PT)测定试剂的制备
本实施例提供了按照如下配方配制凝血酶原时间(PT)测定试剂，包括如下各组：
实验组1按照如下步骤制备得到凝血酶原时间(PT)测定试剂
步骤(1)：PBS缓冲液的制备：称取磷酸氢二钠与磷酸二氢钠于纯化水中，根据一般PBS配制方法制备pH为6.0～8.0的缓冲液1000mL，更为优选的pH为6.2～7.0；
步骤(2)：在步骤(1)的缓冲液中加入氯化钙2.2g、牛血清白蛋白1.0g和Proclin300 1.0g，搅拌使其充分溶解；
步骤(3)：在步骤(2)的溶液中分别加入0.05wt％，0.10wt％，0.15wt％，0.20wt％和0.25wt％的人组织因子脂化物，温和搅拌，持续搅拌时间不低于0.5h，制成凝血酶原时间(PT)测定试剂。
将由步骤(3)配制的不同浓度人组织因子脂化物的PT试剂依次标记为A试剂、B试剂、C试剂、D试剂、E试剂。将A试剂～E试剂分装成2mL/瓶，至于2～8℃储存。
实验组2按照如下步骤制备得到凝血酶原时间(PT)测定试剂
步骤(1)：Tris-HCl缓冲液的制备：称取三羟甲基氨基甲烷于纯化水中，根据Tris-HCl的配制方法制备pH为6.0～8.0的缓冲液1000mL，更为优选的pH值为6.2～7.0；
步骤(2)：在步骤(1)的缓冲液中加入氯化钙2.2g、牛血清白蛋白1.0g和Proclin300 1.0g，搅拌使其充分溶解；
步骤(3)：在步骤(2)的溶液中加0.10wt％人组织因子脂化物，温和搅拌，持续搅拌时间不低于0.5h，制成凝血酶原时间(PT)测定试剂。
上述方法制得的凝血酶原时间(PT)测定试剂标记为T试剂，分装成2mL/瓶，至于2～8℃储存。
实验组3按照如下步骤制备得到凝血酶原时间(PT)测定试剂
步骤(1)：HEPES缓冲液的制备：称取4-羟乙基哌嗪乙磺酸于纯化水中，根据HEPES的配置方法制备pH为6.0～8.0的缓冲液1000mL，更为优选的pH值为6.2～7.0；
步骤(2)：在步骤(1)的缓冲液中加入氯化钙2.2g、牛血清白蛋白1.0g和Proclin300 1.0g，搅拌使其充分溶解；
步骤(3)：在步骤(2)的溶液中加0.10wt％人组织因子脂化物，温和搅拌，持续搅拌时间不低于0.5h，制成凝血酶原时间(PT)测定试剂。
上述方法制得的凝血酶原时间(PT)测定试剂标记为H试剂，分装成2mL/瓶，至于2～8℃储存。
实验组4按照如下步骤制备得到凝血酶原时间(PT)测定试剂
步骤(1)：MOPS缓冲液的制备：称取3-吗啉丙磺酸于纯化水中，根据MOPS缓冲液的配制方法制备pH为6.0～8.0的缓冲液1000mL，更为优选的pH值为6.2～7.0；
步骤(2)：在步骤(1)的缓冲液中加入氯化钙2.2g、牛血清白蛋白1.0g和Proclin3001.0g，搅拌使其充分溶解；
步骤(3)：在步骤(2)的溶液中加0.10wt％人组织因子脂化物，温和搅拌，持续搅拌时间不低于0.5h，制成凝血酶原时间(PT)测定试剂。
上述方法制得的凝血酶原时间(PT)测定试剂标记为M试剂，分装成2mL/瓶，至于2～8℃储存。
实验组5按照如下步骤制备得到凝血酶原时间(PT)测定试剂
步骤(1)：PIPES缓冲液的制备：称取哌嗪-1,4-二乙磺酸于纯化水中，根据PIPES缓冲液的配制方法制备pH为6.0～8.0的缓冲液1000mL，更为优选的pH值为7.0；
步骤(2)：在步骤(1)的缓冲液中加入氯化钙2.2g、牛血清白蛋白1.0g和Proclin300 1.0g，搅拌使其充分溶解；
步骤(3)：在步骤(2)的溶液中加0.10wt％人组织因子脂化物，温和搅拌，持续搅拌时间不低于0.5h，制成凝血酶原时间(PT)测定试剂。
上述方法制得的凝血酶原时间(PT)测定试剂标记为P试剂，分装成2mL/瓶，至于2～8℃储存。
实施例2凝血酶原时间(PT)测定试剂对抗凝药物敏感性检测
选取十份PT结果不同的枸橼酸抗凝血浆，分别用实验组1中的5种试剂与进口的凝血酶原时间测定试剂盒(凝固法)对样本进行测试，将结果进行对比。
对比试剂采用其试剂盒对应的流程进行操作。
实施例1中获得的试剂，测定流程具体如下：
S1.按仪器说明书打开CA-1500仪器；
S2.将冷藏的试剂取出，置于CA-1500该项目对应的试剂位上；
S3.将编好号的样本置于样本架上；
S4.在仪器工作菜单上选择PT项目测试；
S5.点击“Start”，仪器自动进行测试。
测试结果如下表1所示。
表1：凝血酶原时间(PT)测定试剂对抗凝药物敏感性检测(一)
从表1可以看出，本发明实施例的含人组织因子脂化物浓度不同，INR值差异较大，其中B试剂中含人组织因子脂化物的浓度为0.10wt％，其测试结果与西门子试剂(本领域技术人员公认的对抗凝药物极其敏感的试剂)测试结果具有高度一致性，说明本发明实施例的凝血酶原时间(PT)测定试剂对抗凝药物极敏感，可替代进口试剂。
另外，分别用B试剂以及实验组2～5中的4种试剂对样本进行测试，将结果进行对比，测试结果如下表2所示。
表2：凝血酶原时间(PT)测定试剂对抗凝药物敏感性检测(二)
从表2可以看出，在含人组织因子脂化物最优选浓度均为0.1wt％的本发明PT试剂中，不同辅料对INR值的影响不大，说明凝血活酶选用人组织因子脂化物可提高试剂对抗凝药物的敏感性。
实施例3凝血酶原时间(PT)测定试剂批间差测试
针对实施例1制备得到的试剂任选3个实验组配制的试剂，如：B、H和P试剂，分别连续配制三批试剂，取同一批正常凝血质控品，用于B、H和P试剂的批间差测试。测定流程与实施例2相同，结果如下表3所示。
表3：凝血酶原时间(PT)测定试剂批间差测试(结果单位：s)
从表3可以看出，本发明实施例的试剂批间差的变异系数均小于2.0％，说明本发明实施例的凝血酶原时间(PT)测定试剂批间差小。
备注：批间差计算方法引用YY/T 1158-2009。
实施例4凝血酶原时间(PT)测定试剂的加速稳定性测试
针对实施例1制备得到的B、T、H、M和P试剂，分别在37℃恒温箱中加速0、3、7、10、13、15天，取同一批正常凝血质控品、异常凝血质控品，用加速后的试剂进行PT测试。
对比试剂采用其试剂盒对应的流程进行操作。
针对实施例1制备的B、T、H、M和P试剂，测定流程与实施例2相同，测试结果如下表4所示。
表4：凝血酶原时间(PT)测定试剂加速稳定性测试(结果单位：s)
从表4可以看出，本发明实施例的试剂加速15天后的偏差均在10％左右，而外购的进口试剂于同样条件下加速15天后的偏差已超过20％，说明本发明实施例的凝血酶原时间(PT)测定试剂加速稳定性显著优于外购的进口试剂。
实施例5凝血酶原时间(PT)测定试剂的开瓶稳定性测试
针对实施例1制备得到的B、T、H、M和P试剂，分别开瓶后于2～8℃冷藏储存，第0、3、7、10、13、15天，取同一批正常凝血质控品、异常凝血质控品，用开瓶后的试剂进行PT测试。
对比试剂采用其试剂盒对应的流程进行操作。
针对实施例1制备的B、T、H、M和P试剂，测定流程与实施例2相同，测试结果如下表5所示。
表5：凝血酶原时间(PT)测定试剂开瓶稳定性测试(结果单位：s)
从表5可以看出，本发明实施例的试剂开瓶31天后的偏差均在10％左右，而外购的进口试剂于同样条件下开瓶31天后的偏差已超过30％，说明本发明实施例的凝血酶原时间(PT)测定试剂开瓶稳定性显著优于外购的进口试剂。
实施例6凝血酶原时间(PT)测定试剂的长期稳定性测试
针对实施例1制备得到的B、T、H、M和P试剂，分别在2～8℃冷藏环境下贮存0、3、6、9、12、14个月，取同一批正常凝血质控品、异常凝血质控品，用实验的试剂进行PT测试。
针对实施例1制备的B、T、H、M和P试剂，测定流程与实施例2相同，测试结果如下表6所示。
表6：凝血酶原时间(PT)测定试剂长期稳定性测试(结果单位：s)
从表6可以看出，本发明实施例的凝血酶原时间(PT)测定试剂于2～8℃存储14个月后的偏差均在10％左右，说明本发明实施例的凝血酶原时间(PT)测定试剂的长期稳定性非常好。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (9)

1.一种凝血酶原时间测定试剂，其特征在于，包括：凝血活酶、钙离子试剂、缓冲液和保护剂，所述凝血活酶为人组织因子脂化物。
2.根据权利要求1所述的凝血酶原时间测定试剂，其特征在于，所述钙离子试剂为氯化钙；
任选地，所述保护剂包括选自牛血清白蛋白、酪蛋白、人血清白蛋白的至少之一。
3.根据权利要求1所述的凝血酶原时间测定试剂，其特征在于，所述缓冲液包括选自Tris-HCl、HEPES、PIPES、PBS、甘氨酸、MOPS缓冲液的至少之一；
任选地，所述缓冲液的pH为6.0～8.0；
任选地，所述缓冲液的pH为6.2～7.0；
任选地，所述缓冲液的浓度为0.05～0.20mol/L。
4.根据权利要求1所述的凝血酶原时间测定试剂，其特征在于，基于所述凝血酶原时间测定试剂的总体积，所述凝血活酶的质量百分比为0.01～0.5wt％，所述钙离子试剂的质量百分比为0.1～0.5wt％，所述保护剂的浓度为0.1～5.0g/L。
5.根据权利要求1所述的凝血酶原时间测定试剂，其特征在于，基于所述凝血酶原时间测定试剂的总体积，所述凝血活酶的质量百分比为0.06～0.14wt％，所述钙离子试剂的质量百分比为0.15～0.3wt％，所述保护剂的浓度为0.1～2.0g/L。
6.根据权利要求1所述的凝血酶原时间测定试剂，其特征在于，基于所述凝血酶原时间测定试剂的总体积，所述凝血活酶的质量百分比为0.08～0.12wt％，所述钙离子试剂的质量百分比为0.2～0.25wt％，所述保护剂的浓度为0.5～1.5g/L。
7.根据权利要求1所述的凝血酶原时间测定试剂，其特征在于，进一步包括：防腐剂；
任选地，所述防腐剂包括选自Proclin300、山梨酸钾和对羟基苯甲酸甲酯的至少之一；
任选地，基于所述凝血酶原时间测定试剂的总体积，所述防腐剂的质量百分比为0.01～1wt％；
任选地，基于所述凝血酶原时间测定试剂的总体积，所述防腐剂的质量百分比为0.01～0.5wt％；
任选地，基于所述凝血酶原时间测定试剂的总体积，所述防腐剂的质量百分比为0.01～0.2wt％。
8.一种凝血酶原时间测定试剂，其特征在于，包括：缓冲液、氯化钙、牛血清白蛋白、Proclin300和人组织因子脂化物，所述缓冲液为Tris-HCl、HEPES、PIPES、PBS或MOPS缓冲液，所述缓冲液的pH为6.2～7.0，其中：基于所述凝血酶原时间测定试剂的总体积，所述氯化钙的质量百分比为0.22wt％，所述牛血清白蛋白的浓度为1.0g/L，所述Proclin300的质量百分比为0.1wt％，所述人组织因子脂化物的质量百分比为0.1wt％。
9.一种测定凝血酶原时间的方法，所述方法用于非诊断目的，其特征在于，包括：
将枸橼酸抗凝血浆与权利要求1～8任一项所述的凝血酶原时间测定试剂进行混合，以便形成血浆凝块；
基于所述血浆凝块的形成时间，确定所述凝血酶原时间。
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