CN1390122A - 组织因子拮抗剂及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明包括组织因子(TF)阻断化合物,以及利用或包括一种或多种该化合物的治疗方法和药物组合物。本发明化合物可特别用于治疗及预防不良性的血栓形成。

Description

组织因子拮抗剂及其使用方法
发明领域
本发明涉及药学活性化合物以及含有该化合物的药物组合物及治疗方法。本发明优选的化合物可用以治疗或预防不良性血栓形成。本发明具有广泛的应用范围，包括其用于筛选治疗或预防血栓形成的候选化合物的用途。
发明背景
凝血是通过减少血液损失而帮助止血。凝血一般是由血管损伤所引发，需要血小板聚集、凝血因子及抑制纤维蛋白分解。凝血因子的作用是通过与血管损伤有关的级联作用而形成凝血块(参考L.Stryer，生物化学，第3版，W.H.Freeman Co.，纽约；及A.G.Gilman等人，治疗学的药理学基础，第8版，McGraw Hill Inc.，纽约，1311-1331页)。
组织因子(TF)为263个氨基酸组成的完整膜蛋白，负责激活凝血蛋白酶级联反应。血管损伤会使血液暴露于表现于皮下细胞表面上的组织因子，导致与血浆因子VII(FVII)或活化的因子VII(FVIIa)形成钙依赖性的高亲和性的复合体。与TF的结合促使酶原FVII被数种蛋白酶(如因子Xa或凝血酶)迅速地蛋白质水解为活性丝氨酸蛋白酶FVIIa。TF作为FVIIa的必需辅因子而大幅提升FVIIa对其蛋白质底物因子IX及X的催化效率。TF/VIIa复合体通过有限的蛋白质水解而活化因子IX(FIX)及X(FX)，最后导致凝血酶产生及纤维蛋白分解。在疾病状态下，例如动脉粥状硬化或微血管移植、血管造形术、部署植入装置(例如移植模、导管或动静脉分流器)或动脉内切开术的类侵入性外科程序后，TF引起的凝血可能引发血栓形成障碍而导致诸如：心脏病发作、中风、不稳定性心绞痛、移植片衰竭或其它冠状动脉疾病。
血栓形成同时亦可能并发各种血栓栓塞障碍及凝塞，分别例如肺栓塞(例如心房纤维颤动及栓塞、深度静脉血栓形成等)及播散性血管内凝血。体液操作亦可能引起不良性血栓，特别是在输血或体液抽样及涉及体外循环(例如心肺迂回补助外科手术)及透析过程中。
有些抗凝血剂被用以减轻或避免与血栓形成有关的血凝块。给予适当的抗凝血剂或其混合物常可降低或去除凝血，它包含使用一种或多种香豆素衍生物(例如华法令(warfin)及二香豆醇)或带电聚合物(例如肝磷脂、水蛭素或水蛭素类(hirulog))(参考例如上述的Gilman等人，R.J.Beigering等人，血液学年报，72：177(1996)；J.D.Willerson，循环，94：866(1996))。
有些具有抗血小板活性的抗体亦可用以减轻各种血栓形成。例如一种治疗抗体ReoProTM即常用以减轻各种由血管造形术、心肌梗塞、不稳定性心绞痛及冠状动脉狭窄症所引起的血栓栓塞障碍。此外，ReoProTM可作为降低心肌梗塞及心绞痛危险性的预防剂(J.T.Willerson，循环，94：866(1996)；M.L.Simmons等人，循环，89：596(1994))。
然而，使用先前的抗凝剂经常会并发一些副作用例如：出血、血栓形成复发、「白血块」症候群、过敏、新生儿缺陷、血小板减少及肝功能障碍。特别是长期给予抗凝剂可能提高患致命性疾病的危险性(参考例如上述的Gilman等人)。
蛋白质性药剂在本质上较为安全，但一般限于用在急性症状的处理上，且给药常限于非肠道用药。此类药剂一般认为较不适合于慢性疾病(例如动脉粥状硬化，即心脏病发作的主因)的长期治疗，由于蛋白质治疗可以增加免疫反应产生机率，其生产成本较高及/或有限的口服生物有效性。
因此亟需新式抗凝血药剂。特别是需要可长期给药以治疗慢性症状如动脉粥状硬化的新式抗凝血药剂。
发明概述
发明人等发现一种药理活性化合物，特别是一种组织因子(TF)拮抗剂，具有广泛的应用范围，包括用于不良性血栓形成的治疗和/或预防。本发明的优选化合物特别可阻断由人类组织因子/因子VIIa复合体催化的人类因子X及IX活化作用。我们还发现用此处公开的化合物及组合物来治疗或预防血栓形成的方法。
本发明更特别的方法包括给予治疗上有效量的至少一种本发明的化合物或组合物。本发明化合物或组合物典型是给予需要此种治疗的哺乳类动物，例如易患不良性血栓形成、已患该病或正从该病复原的人类患者，或已患由组织因子导致的疾病或障碍(例如心血管疾病、细胞增殖障碍、手术后并发症或免疫功能障碍)、由该病复原或对易患该病的哺乳类动物。优选化合物或组合物亦可用于治疗或预防各种血栓形成所导致的公知障碍，例如公开于此的特别的障碍。
本发明亦包含一种可阻断或抑制因子X及/或IX的组织因子依赖性活化作用的方法。该方法一般包含以TF阻断化合物与组织因子接触，从而抑制因子X或因子IX与组织因子或TF/VIIa的功能性复合体的形成。优选TF阻断化合物与组织因子结合从而抑制该功能性复合体的形成。根据本发明的抑制或防止该功能性复合体的形成，其应用范围相当广泛，包括哺乳类动物的上述疾病或障碍的治疗，特别是已患该疾病或障碍或易患该病症的人类。
在用于检测的至少一项测试中，本发明的化合物一般具有优良的阻断活性，优选的检测方法为测量TF介导的血液凝集。更特别的测试为测量特异凝血因子的标准体外分析，其中该分析是公认的在TF或TF相关复合体(如人类TF/VIIa复合体)存在下可提供最理想结果的分析。该分析中所提供的TF可为重组分子或由天然来源纯化的分子，一般取决于所选择的特异分析。
更特别的体外分析是检测及测量特异凝血因子的活性，该凝血因子具有公认的在人类TF或人类TF/VIIa复合体存在下会增强的活性。较令人感兴趣的是测量因子X至Fxa和因子IX至FIXa的TF依赖性活化作用的标准体外分析。在此有时这些分析称为“初级筛选分析”，或相关术语或词组如“发现方法”，以意指它在筛选化合物分析中的优选用途。
例如本发明的特别优选化合物在测量因子X至FXa的TF依赖性激活作用的初级筛选分析中具有优良的阻断活性。另外的优选化合物在测量因子IX至FIXa的TF依赖性激活作用的初级筛选分析中具有优良的阻断活性。
需了解词组“优良的阻断活性”或相关词组意为优选使用本发明化合物以降低或抑制因子X至Fxa和/或因子IX至FIXa的凝血激活作用。优选化合物为合成或半合成化合物，如以下公开的小分子化合物。以下提供关于初级筛选分析的更特别公开。
本发明优选的小分子化合物的IC50(相对于适当对照，抑制50％因子X活化作用所需浓度)约为100μM或更小，优选约10μM或更小。另外对TF或TF/VIIa依赖性激活作用，在分析中优选的化合物具有与其同等或大于约70％的抑制作用。在一个优选的实施方案中，初级筛选分析包含以下所有步骤：
1)在导致因子Xa形成的条件下将TF/VIIa复合体与因子X在适
  当分析溶液中混合，
2)将该溶液与可经检测标识的因子Xa底物接触；及
3)检测溶液中标识的产物，此即为因子X活化作用的指标。
该初级筛选分析的优选用途是可有效地测量候选化合物降低或消除TF或TF/VIIa依赖性因子X活化作用的能力。该分析一般是有弹性的，且可根据需要修改，以测试化合物的阻断因子X活化作用的能力。例如可在上述任一或多个步骤中加入候选化合物，但对许多筛选应用来说在步骤1)中加入化合物是优选的。
该方法中使用的优选TF/VIIa复合物包括暴露于利于较好的暴露的TF阻断位点状况的TF。用于TF的分离及使用的更特异的条件提供如下。
如上所述，另一初级筛选分析为测量TF或TF/VIIa对因子IX的活化作用的标准体外分析。在此实施例中，优选化合物具有约200μM或更小，优选约10μM或更小的IC50(相对于适当对照，抑制50％因子IX活化作用所需浓度)。在一优选的实施方案中，测量因子IX活化作用的标准分析包含以下所有步骤：
1)在有利于因子FIXa形成的条件下将TF/VIIa复合体与因子IX
  在适当分析溶液中混合，
2)将该溶液与可经检测标识的因子FIXa底物接触；及
3)检测溶液中的标识产物，此即为因子IXa活化作用的指标。
在优选的实施方案中，该筛选分析可有效地测量候选化合物的降低或消除因子IX活化作用的能力。该分析一般对TF或TF/VIIa依赖性FIXa形成作用敏感，可用于多种方面以测试所需化合物的阻断因子IX活化作用的能力。例如可在上述任一或多个步骤中加入欲进一步测试的化合物，但对大多数筛选应用来说，在步骤1)中加入化合物是优选的。典型的本发明优选化合物在此筛选分析的实施例中具有优良的阻断活性。
本发明进一步优选的初级筛选为测量外源凝血途径的凝血酶原时间(PT)测试或分析。该测试在领域中是标准的并且通常用于测量生物样品如血浆的凝血。
本发明更特别优选的化合物在PT分析中具有优良的抑制活性。典型的优选化合物在PT分析中可增加至少约5％至约10％(秒)的血浆凝集时间(相对于适当对照)。优选的PT分析用途是测量TF调节的血浆凝集时间，其实施如下：
1)在导致血浆凝血的条件下提供在适当分析溶液中的经柠檬酸
  盐处理的血浆，
2)在适于引发血浆凝血的条件下在该溶液中混合适当的组织因
  子制剂及钙，及
3)测量在该溶液中的凝血时间以测定凝血酶原凝血时间。
PT分析的优选用途为测量受试化合物延长凝血酶原凝血时间的能力。PT分析为本领域已知的，可以以单独或合并方式使用，测量化合物增加或阻断凝血酶原凝血时间的能力或潜力。
本发明的特别优选化合物在至少一种上述初级分析(因子X、因子IX活化作用及/或PT测试)中具有优良的活性。
在任一种或多种上述初级筛选分析中，至少在许多案例中的优良的TF或TF/VIIa依赖性抑制作用可归因于该化合物对TF/VIIa及/或FXa活性的效果。正如所讨论的那样，本发明的优选化合物为TF拮抗剂，且在测量TF介导的优选体外凝血分析中具有优良的阻断活性。因此一般希望进一步测量在一种或多种上述初级筛选分析中，且在至少一种及优选多于一种的下述“二级筛选分析”中具有优良阻断活性的受试化合物。这些二级分析可促进对具有所需TF拮抗剂活性的化合物进行进一步的鉴定与选择，例如删除具有非期望的其它活性的化合物，如具有蛋白酶活性者。
可根据本发明施行多种二级分析以进一步评估初级分析所鉴定的化合物，例如进一步评估初级分析所鉴定的活性，或测定某种非期望活性的存在。例如，本发明另外优选的化合物在其它非最理想化测量TF拮抗性的二级筛选分析中，具有降低的或可忽略的活性。也就是说，这些二级分析未必是TF依赖性的。这些分析的特别实例包括那些设定为测量凝血酶、胰蛋白酶或被活化的因子如FXa、FIXa或FVIIa的。优选化合物在活化部份促凝血酶原激酶时间(APTT)测试或分析中具有可以忽略的活性。这些二级筛选分析的更特异的实例将在以下的讨论及实施例中提供。
在此公开的任一或全部分析(包含上述一级筛选及二级测试中)中，侯选化合物可作为该分析中唯一的活性药剂或可与其它试剂(包含本发明的其它化合物或组合物)合并提供。在该实施方案中，筛选分析在检测中特别有用，优选化合物、药剂或组合物之间的定量协同作用。
此处公开了多种人类组织因子的抑制物。这些化合物可用于此处所述的筛选分析及本发明的治疗及预防方法。
例如，此处公开的某些化合物是此处有时称为“TF拮抗剂”、“TF阻断化合物”或类似的词组。本发明的优选化合物为小分子，不包括肽类。
优选TF拮抗剂见美国专利申请案第09/406269号(1999年9月24日申请)，及相应的PCT申请案第PCT/US99/22238号(1999年9月24日申请)，二者在此引入以供参考。该申请案公开了特别的磷酸酯化合物，包含芳基取代的磷酸酯化合物。
发明人等已经发现可用于本发明方法中的其它有用的TF拮抗剂化合物。
更特别的，本发明优选的化合物包含一个或多个特定极性官能基，特别是羧基(-COOH)、酰胺基(即在非环状或环状基团中的-C(＝O)-N-及其互变异构物)、硫代酰胺基(即在非环状或环状基中的-C(＝S)-N-及其互变异构物)、亚磺酰基(-S(O)-)、磺酰基(-S(O)2-)、磺酸根(SO3)或硝基(NO2)。本发明优选的化合物包括带有芳族基团的极性官能基，特别是碳环芳基如苯基、萘基等，或具有1至3个分离或稠合环，每环有5至8个原子及1至3个杂(N、O或S)原子的杂芳基。本发明还包括非芳族化合物。
更特别地，本发明的优选化合物包含下列通式I所示的：
          Ar-(CXY)m-(Het)0 or 1-(CX1Y1)n-C(Z)p-(T)3-p
                              I
Ar为选择性取代的碳环芳基或选择性取代的杂芳基；
Het为选择性取代的N、O或S；
各T独立为极性官能基如酰胺基(即在非环状或环状基中的-C(＝O)-N-及其互变异构物)、硫代酰胺基(即在非环状或环状基中的-C(＝S)-N-及其互变异构物)、羧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸根(SO3)或硝基；
各X、各Y、各X’、各Y’及各Z个别独立为氢原子；卤原子；羟基；氢硫基；胺基；优选具有1至约12个碳原子，更佳具有1至约6个碳原子的选择性取代的烷基；优选具有约2至12个碳原子，更佳具有约2至6个碳原子的选择性取代的烯基；优选具有约2至12个碳原子，更佳具有约2至6个碳原子的选择性取代的炔基；优选具有1至约12个碳原子，更佳具有1至约6个碳原子的选择性取代的烷氧基；优选具有约1至12个碳原子，更佳具有约1至6个碳原子的选择性取代的烷硫基；优选具有约1至12个碳原子，更佳具有约1至6个碳原子的选择性取代的烷基亚磺酰基；优选具有约1至12个碳原子，更佳具有约1至6个碳原子的选择性取代的烷基磺酰基；或优选具有约1至12个碳原子，更佳具有约1至6个碳原子的选择性取代的烷胺基；
m为0(其中杂原子直接取代于芳基上)至4的整数，优选为0、1或2；
n为0至4的整数，优选为1或2；
p为1(其中该化合物具有两个T基)或2(其中该化合物具有单个T基)；及其药学上可接受的盐。
另外的优选化合物包含上列化学式其中Ar为碳环芳基，特别是苯基者，如下列化学式II化合物：
Figure A0081476500171
其中X、Y、Het、T、X’、Y’、Z、m及p的定义均同上述化学式I；
其中各R1独立为卤原子(F、Cl、Br、I)；胺基；羟基；硝基；羧基；氢硫基；优选具有1至约20个碳原子，更佳具有1至约10个碳原子，再更佳具有1至约6个碳原子的选择性取代的烷基；优选具有2至约20个碳原子，更佳具有2至约10个碳原子，再更佳具有2至约6个碳原子的选择性取代的烯基；优选具有2至约20个碳原子，更佳具有2至约10个碳原子，再更佳具有2至约6个碳原子的选择性取代的炔基；优选具有1至约20个碳原子，更佳具有1至约10个碳原子，再更佳具有1至约6个碳原子的选择性取代的烷氧基；优选具有1至约20个碳原子，更佳具有1至约10个碳原子，再更佳具有1至约6个碳原子的选择性取代的烷硫基；优选具有1至约20个碳原子，更佳具有1至约10个碳原子，再更佳具有1至约6个碳原子的选择性取代的烷基亚磺酰基；优选具有1至约20个碳原子，更佳具有1至约10个碳原子，再更佳具有1至约6个碳原子的选择性取代的烷基磺酰基；优选具有1至约20个碳原子，更佳具有1至约10个碳原子，再更佳具有1至约6个碳原子的选择性取代的烷胺基；优选具有1至约20个碳原子，更佳具有1至约10个碳原子，再更佳具有1至约6个碳原子的选择性取代的烷酰基；选择性取代的碳环芳基；或选择性取代的芳烷基；
q为0(其中苯环位置完全被氢原子取代)至5的整数，m优选为0、1、2或3；及其药学上可接受的盐。
上列化学式I及II化合物中，另外优选化合物包含Het基为选择性取代的氮原子或氧原子者，例如下列化学式III及IV化合物：
Figure A0081476500181
其中各化学式III及IV中，T、R1、X、Y、X’、Y’、Z、q、m、n及p的定义均同上列化学式I及II中的定义；W为氢原子；优选具有1至约8个碳原子，更佳具有1至约6个碳原子的选择性取代的烷基；优选具有2至约8个碳原子，更佳具有2至约6个碳原子的选择性取代的烯基；优选具有2至约8个碳原子，更佳具有2至约6个碳原子的选择性取代的炔基；优选具有1至约8个碳原子，更佳具有1至约6个碳原子的选择性取代的烷氧基；优选具有1至约8个碳原子，更佳具有1至约6个碳原子的选择性取代的烷硫基；优选具有1至约8个碳原子，更佳具有1至约6个碳原子的选择性取代的烷基亚磺酰基；选择性取代的烷基磺酰基；选择性取代的烷胺基；优选具有1至约8个碳原子，更佳具有1至约6个碳原子的选择性取代的烷酰基；选择性取代的碳环芳基；或选择性取代的芳烷基；及其药学上可接受的盐。
另外的化学式III化合物包含其中氮原子直接为(中间无碳原子或其它原子)苯环取代基者，化学式IV的特别优选化合物包含其中氧原子直接为环取代基或具有单个亚甲基者，例如下列化学式IIIa及Iva的化合物：
其中T、R1、X’、Y’、n及q的定义均同在上列化学式I及II中的定义；及这些化合物的药学上可接受的盐。
另外的本发明的优选化合物包括那些具有选择性取代的胺部份的化合物，例如下列化学式V的化合物：
         (R2)2N-(CXY)m1-(Het)0 or 1-(CX1Y1)n-C(Z)p-(T)3-p
                               V
其中X、Y、Het、X’、Y’、Z、T、n、g、p各定义均同在上列化学式I中的定义；各R2独立为氢原子、烷基，典型为C1-8烷基、芳基，典型为碳环芳基如苯基或萘基、等；m1为0(其中杂原子直接由胺基取代)至4的整数，优选为0、1或2。依照化学式V的更佳化合物包括其中各X、Y、X’及Y’独立为氢原子；Het为O；Z为羟基；及各m1、n及p为1者。也包含化学式V所示化合物的药学上可接受的盐。
本发明进一步优选的化合物包括具有至少两个芳环的多环基结构的多环基。更佳为下列化学式VI化合物：
      Ar1-(CXY)m2-(Het)0 or 1-(CX1Y1)n-C(Z)p-(T)3-p   VI
其中各X、Y、X’、Y’、Z、n及p的定义同在上列化学式I中的定义，且Ar1表示多环芳基，优选为具有介于约2至约3个芳环如萘基、苊基(acenapthyl)等的选择性取代的碳环芳基或杂芳基，m2为0(其中多环基直接由杂原子取代)至4的整数，优选为0、1或2；及其药学上可接受的盐。
另外的上列化学式V的优选化合物包括其中Ar1基表示选择性取代的联苯基者，例如下列化学式VIa的优选化合物：
       (R1)q1-Ar1-(CXY)m2-(Het)0 or 1-(CX1Y1)n-C(Z)p-(T)3-p
                          VIa
其中R1的定义同在上列化学式II中所定义的；各X、Y、X’、Y’、Z、g、n及p的定义同上列化学式I中的定义；m2的定义同在上列化学式VI中的定义；q1为0(其中联苯基完全为氢原子取代)至7的整数，优选为0、1、2、3或4；及其药学上可接受的盐。
在上列化学式VIa的一个更优选的实施方案中，Ar1为取代的联苯基，R1为羟基，m2及n各为0，Het为氮原子，Z为氢，p为1，及q1为1、2或3；及其药学上可接受的盐。
另外的本发明的优选化合物包括脂环或杂脂环部份，例如下列化学式VII的化合物：
            B-(CXY)m3-(Het)0 or 1-(CX1Y1)n-C(Z)p-(T)3-p
                            VII
其中B为优选具有约5至约8位环，可能有一或多个内环双键的选择性取代的脂环族或杂脂环族基；各T、X、Y、X’、Y’、Z、n及p的定义同上列化学式I，m3为0(其中杂原子直接由环状烃基取代)至4的整数，优选为0、1或2；及其药学上可接受的盐。
另外的优选化合物包括上列化学式VII的那些化合物，其中B基优选为环戊基、环己基、环戊烯基、环己烯基、环戊二烯基、环己二烯基、环戊炔基或环己炔基，例如下列化学式VIIa化合物：
      (R1)q2-B-(CXY)m3-(Het)0 or 1-(CX1Y1)n-C(Z)p-(T)3-p  VIIa
其中R1的定义同上列化学式II，各X、Y、X’、Y’、Z、g、n及p的定义同上列化学式I，m3的定义同上列化学式VII，q2为0(其中B基环原子完全由氢原子取代)至10的整数，优选为0、1、2或3；及其药学上可接受的盐。
在上列化学式VIIa的一个更佳实施方案中，R1为羟基；B为环己基或环戊基；m3及n各为0；g为1；Het为氮原子；Z为氢原子；q2为1；p为2；及其药学上可接受的盐。
另外的本发明的优选化合物除了上述的T基外，还包括二酰亚胺如丁二酰亚胺或苯邻二甲酰亚胺。例如本发明的优选二酰亚胺化合物包含下列化学式VIII者：
                  (T’)q3-D-(T”)q4
                          VIII
其中T’及T”各为相同或不同，其定义同上列化学式I中的T；
D为选择性取代的二酰亚胺基如丁二酰亚胺、苯邻二甲酰亚胺或二甲酰亚胺，选择性在D与T’或T’’基中的一个或二个之间具有C1-6亚烷基连接；及其药学上可接受的盐。
上列化学式VIII的特别优选化合物包括其中T’含有直接连接至D基的氮原子的氧原子者；T”为羧基、亚磺酰基或磺酰基；q3及q4各为1；及其药学上可接受的盐。
进一步的本发明优选化合物为下列化学式IX者：
          (V)-(C＝O)-(Het)0 or 1-Ar-(R1)q5
                       IX
其中V为具有1至3个分离或稠合环，每环有5至8个原子及1至3个杂(N、O或S)原子的杂脂环或杂芳基；Ar、Het各定义同上列化学式I；R1定义同上列化学式II；q5为0(其中Ar基完全为氢原子取代)至5的整数，优选为0、1、2或3；及其药学上可接受的盐。
化学式IX的特别优选化合物包含其中V为选择性取代的呋喃基、异噁唑基、吡咯基(pyrole)、咪唑基、吡唑基、噻吩基、异噻唑基、呋咱基或三唑并苯基；及/或若有Het则为氧原子。
本发明更进一步优选的化合物包含下列化学式IXa、IXb、IXc及IXd者：
其中各R3a、R3b、R3c及R3d的定义均同上列化学式II中的R1，但R3a、R3b、R3c及R3d可以相同或不同；Het1及Het2个别独立为N、O或S，为相同或不同；各Ar2a、Ar2b、Ar2c及Ar2d独立为选择性取代的碳环芳基或选择性取代的杂芳基，可相同或不同；V的定义同上列化学式IX；q6为0(其中Ar2a基为氢原子取代)至5的整数，优选为0、1、2或3；q7与q6相同，且q6+q7不大于5；q8为0(其中Ar2b基为氢原子取代)至5的整数，优选为0、1、2或3；q9与q8相同，但q7+q8不大于5；及其药学上可接受的盐。
其中R3e的定义同上列化学式II的R1，但R3a、R3b、R3c、R3d及R3e可以相同或不同；q10为0(其中Ar2a基为氢原子取代)至5的整数，优选为0、1、2或3；q11及q12个别独立定义同于上述q10且q10+q11+q12不大于5；q13为0(其中Ar2c基为氢原子取代)至5的整数，优选为0、1、2或3；q14与上述q13相同，但q13+q14不大于5；及其药学上可接受的盐。
其中R3f的定义同上列化学式II中的R1，但R3f也可以是具有约5至约8个碳原子，优选具有约5至约6个碳原子的选择性取代的环烷基，及R3f与上述R3a、R3b及R3c可以相同或不同；q7为0(其中Ar2a基为氢原子取代)至5的整数，优选为0、1、2或3，但化学式IXc中的q6+q7不大于5；q15为0(其中碳原子与氢原子连接)至2的整数；m4为0(其中Ar2a基被Het1取代或(CXY)基与连接至Ar2a、Het1及R3f基的碳原子取代)至4的整数，优选为0、1或2；及其药学上可接受的盐。
其中各(V2a)及(V2b)的独立定义同上列化学式Ixb中的V，但V2a及V2b可以相同或不同，但V2a及V2b二者皆不为0；m6为0(其中Ar2a基直接连接至-CH-基)至4的整数，优选为0、1或2；及其药学上可接受的盐。
上列化学式IXa的特别优选化合物包括那些其中的V包括被选择性取代的碳环芳基或选择性取代的杂芳基(优选为苯基)取代的吡啶基、吡嗪基、嘧啶基或三嗪环的化合物。
上列化学式IXb的特别优选化合物包括其中Ar2a、Ar2b及Ar2c各为经取代的苯基；V为选择性取代的4-或5-吡唑啉酮基；q10、q11、q12及q13各为1；Het1及Het2各为氮原子；R3a、R3b及R3c各为卤原子，优选为氯原子；各R3d及R3e为-NO2 +基者；及其药学上可接受的盐。
上列化学式IXc的特别优选化合物包括其中Ar2a及Ar2b各为苯基，R1f为选择性取代的环戊基或环己基，各q1、q2、q3、q4、q5、q6为1，各Het1及Het2为氮原子，X及Y均为氢原子；m、m1及m2各为1，R1a、R1b及R1c各为羟基者；及其药学上可接受的盐。
上列化学式IXd的特别优选化合物包含其中Ar3a为选择性取代的苯基；R3a为卤原子，优选为溴原子；X及Y均为氢原子；m6为1；各V1a及V1b包括至少一个氮原子，优选为吲哚基、异吲哚基、吲唑基、苯并咪唑基、或三唑并苯基者；及其药学上可接受的盐。
本发明附加优选的TF拮抗剂化合物包括芳基及脂环基，例如下列化学式X的化合物：
                Ar3-(CXY)m7-(Het)0 or 1-(V)    X
其中Ar3为选择性取代的碳环芳基或杂芳基，优选为选择性取代的喹啉基；各X、Y及Het定义同于上列化学式I，且X及Y亦可共同形成羰基；m7为0(其中Ar3基直接连接至Het)至4的整数，优选为0、1或2；V定义同于上列化学式IXa；及其药学上可接受的盐。
本发明还包括不含芳基取代的磷酸酯化合物。该磷酸酯化合物在上述的美国专利申请案第09/406269号(1999年9月24日申请)有公开。优选的非芳族磷酸酯化合物具有一、二或三个磷酸根(即PO3)及3、4、5或6至约25个碳原子，且非环状及/或脂环部份具有一或多个非芳族碳-碳双键或三键，典型为零、一、二或三个碳-碳双键或三键。该化合物亦可能含有一个或多个杂原子(N、O或S)，典型为零、一、二或三个杂原子。例如在美国专利申请案第09/406269号公开的alendronic acid(Fosamax)，是为有效的TF拮抗剂化合物。
本发明的优选化合物亦包含氮环化合物，特别是含有至少一个另外的杂原子(N、O或S)的含氮环化合物，典型为一个杂原子且其它环中成员为碳原子。典型地，该环状化合物为非芳族，虽然它可能包含一或多个另外的分离或稠合的芳族或非芳族环。典型地，含氮环具有5至约10个环原子，更典型为5、6、7或8个环原子，再更典型为5或6个环原子。该氮环化合物含有下列化学式XI：
其中R1、R2、R3、X及Y的各自独立定义同上列化学式II中的R1；或本化学式XI的R1及R2可共同形成稠合的具有1-3个稠环或分离环的碳环芳基(例如苯基或萘基)、脂环基(例如环己基)、杂脂环基或杂芳基。该杂脂环基或杂芳基具有适当的杂芳基，或杂芳基具有1至3个环，每环有3至8个环成员以及1至约3个杂原子(N、O或S)，包括例如，香豆素基、喹啉基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、噁唑基、咪唑基、吲哚基、苯并呋喃基及苯并噻唑基；
Het为氧原子、选择性取代的N、S、S(O)或S(O)2，优选为氧原子；
X为1(5员环)、2(6员环)、3(7员环)或4(8员环)；及其药学上可接受的盐。
本发明的优选化合物亦包含经取代的哌嗪化合物，例如下列化学式XII的化合物：
其中各R1的独立定义同上述化学式II的R1；
x为由1至10的整数；及其药学上可接受的盐。
本发明另外的化合物可与组织因子(TF)结合而使FX无法有效地与TF/因子VIIa复合体结合，因此FX无法有效地转变为其活化的形式(FXa)。本发明的优选化合物通过有效地阻断FX与TF分子结合，抑制TF的功能。此处提及的“本发明化合物”包括所有化学式I至XII的化合物。
在优选的方面，本发明提供抑制哺乳类动物的凝血及血凝块形成的方法、抑制哺乳类动物的凝血酶生成的方法及治疗及预防哺乳类动物的血栓栓塞障碍的方法。本发明方法一般包括将治疗上有效量的本发明化合物给予哺乳类动物如灵长类动物，特别是人类。
本发明化合物特别可用以减轻受组织因子(TF)影响的各种疾病。“影响”一词是指该疾病的严重性或持续期间因为TF的存在(依照公认的分析或测试)而增加。特别的疾病包含血栓形成(尤其是再狭窄的预防或抑制)，或侵入性医疗程序(如动脉或心脏外科手术，例如血管造形术)后的其它血栓形成，包含矫形或其它外科手术并发的深度静脉血栓形成的预防。本发明化合物亦可用以降低或甚至有效地消除使用医疗器材(例如导管、移植模或其它医疗装置)所引发的凝血。本发明化合物亦可用于预防心肌梗塞的长期危险性。本发明化合物亦可用以治疗下列疾病并发的血栓形成情形：急性前骨髓细胞白血病、糖尿病、多发性骨髓瘤、脓毒性休克并发的播散性血管内凝血、感染并发的暴发性紫癣病、成人呼吸窘迫综合征、不稳定性心绞痛、及主动脉瓣或血管修复术并发的血栓形成并发症。
本发明化合物的另外用途包含其在动脉粥状硬化、炎症的预防与治疗中的应用，及其作为抗血管生成剂，尤其是对癌症的治疗，特别是固着性癌症例如存在于肺、乳房、肝、脑或其它组织中的癌症。
本发明化合物亦可用作哺乳类动物(特别是人类)的体外循环的抗凝血剂。在该方法中，在体外循环之前或期间，如可能伴随心肺旁路外科手术、器官移植外科手术或其它长时间性外科手术，给予哺乳类动物以足以抑制凝血的量的本发明的一种或多种化合物。
本发明化合物亦可用于体内诊断方法，包含患者的体内诊断影象。
本发明化合物亦可用于体外分析，例如选择性抑制因子X活化作用。本发明的该分析可用以测定患者是否存在或有可能存在凝血或血凝块。
本发明还提供了包括有效量的一种或多种本发明化合物及药学上可接受的载剂的药学组合物。
本发明的其它方面论述于下。
图式的简单说明
图1为用于下列实施例的筛选分析的流程图。
图2(表1)显示本发明的各种化合物的测试数据。
发明的详细说明
如上所述，本发明的特征为化合物，如医药活性的化合物，尤其是利用或包括一种或多种该化合物的医药组合物。优选化合物是这里公开的标准体外筛选分析测定证实有效的TF拮抗剂。尤其优选的化合物可以用于治疗及预防不良性血栓形成。本发明具有广泛的应用范围，包含用于筛选具有显著TF拮抗活性的候选化合物。
如上所述，本发明的优选化合物及组合物为优良的TF拮抗剂，在至少一种及优选全部初级筛选分析(因子X或因子IX的TF或TF/VIIa依赖性活化作用及PT分析)中具有显著的阻断活性。尤其优选的化合物在前述活化部份促凝血酶原激酶时间(APTT)分析中不具有显著的阻断活性。本发明进一步优选的化合物为在其它二级分析(如测量胰蛋白酶、凝血酶、因子Xa、因子IXa、因子VIIa的活性者)中具有不显著的活性，如下所述。
这里公开的标准体外分析是本领域中已知的且一般是有一定自由度的。此外，该分析可根据需要方便地操作以检测及定量TF拮抗活性。即使在其它具有优良抗血小板、抗血栓形成或抗凝血活性的治疗或实验药剂存在下，该分析与本发明的受试化合物或组合物的分析是一致的。此外，该分析可用以测试公认的抗TF抗体的效果。在这些实施方案中，标准体外分析尤其可用以检测，优选测量本发明化合物或组合物显示的显著的合作或协同效果。
更特别的前述初级筛选分析的实施例如下。该分析为测量TF/VIIa依赖性因子X活化作用的标准。在该分析中优选的化合物的IC50低于约100μM，优选低于约10μM，该化合物具有优良的阻断活性的例证。在一个更佳的实施方案中，初级筛选优选包含下列步骤：
1)在适当分析溶液中混合约0.1nM(脂化的)人类重组TF/VIIa复
  合体、约180nM人类FX以及介于约0.5微升至约10微升之间的
  至少一种受试物(选择性溶解于适当载剂如水或二甲基亚砜
  (DMSO)中，在37℃培养数分钟至约一小时或更久，
2)以适当螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)与溶液接触以停止因子X
  活化作用，
3)用可检测含量的FXa的特异色原底物(例如Spectrozyme FXa
  或S-2765)与溶液接触，在37℃培养；及
4)检测溶液中产生的发色基团，即为因子X活化作用的指示剂。
此处提及的“测量TF/VIIa依赖性因子X活化作用的标准分析”或类似词组优选是指以上步骤1)-4)。涉及该分析的较特异的公开见以下实施例1，其中测量TF/VIIa依赖性因子X活化作用的标准分析特别适用于FXa产生的发色团在405nm的分光光度检测。
用于该方法的优选TF/VIIa复合体含有已经暴露于适于展示较好的TF阻断位点的TF。该TF分子可以以一种或几种方法的结合得到。在一种方法中，人类TF是从生产过剩的不死细胞株或来自人脑的丙酮粉末所得到。TF优选是在至少一种非离子性界面活性剂如TRITON_X-100(聚氧乙烯(10)异辛基苯基醚)的存在下在适当的盐及pH条件(例如100mM NaCl及pH8.0)下分离的。非离子性界面活性剂的优选量根据其用途而不同，但一般为约0.05％至约0.5％(w/v)之间的量。关于分离人类TF的较特异信息见以下实施例1。
另外优选的TF暴露于标准分析的条件，以测量TF/VIIa依赖性因子X的活化作用。关于该标准分析的较明确公开见以下实施例1。
另外的本发明优选化合物于测量TF/VIIa依赖性因子IX活化作用的其它初级筛选分析中具有优良的阻断活性。于该分析中具有小于约200μM及优选小于约10μM的IC50的优选化合物即为该分析的优良阻断活性的例证。于一较特别实施方案中，标准分析优选是包含下列步骤：
1)在适当分析溶液中混合约0.7nM TF/VIIa复合体和300nM因子IX
  及1000nm因子X，及介于约0.5微升至约10微升之间的至少一种
  受试物(选择性溶解于适当载剂如水或二甲基亚砜(DMSO)，溶
  液在适于形成FIXa及FXa的条件下于37℃培养数分钟至约一小
  时；
2)以适当螯合剂如EDTA与溶液接触以停止FIX活化作用；
3)以FXa特定性色原底物(例如Spectrozyme FXa)与溶液接触，
  于37℃培养；及
4)检测溶液中的发色基团，作为因子IX活化作用的指标。
此处提及的“测量TF/VIIa依赖性因子X活化作用的标准分析”或类似术语或词组是明确指以上步骤1)-4)。特别适于优选发色基团在405nm的分光光度检测的标准分析的较明确的举例见于以下实施例1。
如上所述，另外的本发明优选化合物于PT分析中具有优良的对凝血时间的抑制作用。凝血时间优选是相对于适当对照组增加约20％至至少100％，更佳是增加约20％至至少500％。凝血时间一般是以秒测量。优选的PT分析典型是通过加入适量(例如约1至3nM)的脂化的组织因子至包含传统经柠檬酸盐处理的血浆的分析溶液而施行的。PT分析是测量TF介导的血浆凝血时间，优选是通过实施下列步骤而施行的：
1)在适当分析溶液中提供约0.1毫升的经柠檬酸盐处理的人
  类血浆，并将其与介于0.5微升至10微升之间的至少一种受
  试化合物(选择性溶解于适当载剂如水或二甲基亚砜(DMSO))
  混合，将其在室温下培养约3至10分钟，
2)将约0.2毫升(约1-3nM重组人类组织因子)及约5-10mM的
  钙混入该溶液中以引发血浆凝血；及
3)测量血浆凝血时间以测定凝血酶原凝血时间(PT)。
此处提及的“标准PT分析”或类似词组或术语是特别指以上步骤1)-3)。较明确的关于进行PT分析的公开亦见于威廉血液学，第5版(Beutler，E.等人编著)，McGraw-Hill，Inc.健康职业部门，纽约。
如上所述，本发明提供各种用于检测的分析，优选测量本发明的优选化合物拮抗优良TF活性的能力。亦如上所述，体外筛选分析的特定标准在此有时是称为“二级筛选分析”，以表示前述一种或多种或全部的初级筛选分析的优选用途。该特别的二级筛选分析与一种或多种初级筛选分析联合实施可提供广大范围的具有优良抗TF活性的有用化合物。
这里公开的是二级筛选分析，它包括那些最优检测及优选测量因子VIIa(FVIIa)、因子IXa(FIXa)、因子Xa(FXa)、凝血酶、胰蛋白酶或卢赛尔氏(Russell’s)蛇毒(RVV)的催化活性者。在大多数例子中，这些分析的最理想实施不需加入TF。本发明的优选化合物是特异的TF拮抗剂，且在这些分析中一般具有实质上降低或可忽略的活性。前述的二级筛选测试与初级及优选二级筛选分析的联合实施可促进具有特异抗TF活性的优选化合物的选择。此处提及的关于这些二级筛选分析的“降低”或“可忽略”的活性是指由适当对照组(如水或DMSO)显示的约2％至约10％之间的活性。
如上所述，本发明提供广大范围的用以治疗或预防不良性血栓形成的医药活性化合物及组合物。优选的化合物为组织因子(TF)拮抗剂，且优选可明确阻断由人类组织因子/因子VIIa复合体催化的人类因子X及IX的活化作用。本发明的举例化合物包含上述化合物，包含于上列化学式中。
上列化学式中，本发明化合物(包括例如化学式I至XII，包含定义如上的“次”化学式IIIa、IVa、VIa、VIIa、IXa、IXb、IXc、IXd)的卤原子取代基为F、Cl、Br及I。用于此处的术语烷基，除非另行更改，否则即指环状及非环状基这两者，但环状基包括至少三个碳环原子。脂环烷基一般为优选。本发明化合物的烯基及炔基具有一或多个不饱和键，典型的是1至约3或4个不饱和键。用于此处的术语“烯基”及“炔基”亦指环状及非环状基这两者，但一般优选的是直链或分枝的非环状基。本发明化合物的烷氧基具有一个或多个氧原子连接，典型的是1至约5或6个氧原子连接。本发明化合物的烷硫基具有一或多个硫醚连接，典型的是1至约5或6个硫醚连接。本发明化合物的烷基亚磺酰基具有一个或多个亚磺酰基(SO)连接，典型的是1至约5或6个亚磺酰基连接。本发明化合物的烷基磺酰基具有一个或多个磺酰基(SO2)连接，典型的是1至约5或6个磺酰基连接。本发明化合物的优选烷胺基包括具有一个或多个一级、二级和/或三级胺基者，优选是1至约3或4个胺基。适当的烷酰基具有一或多个羰基，典型是1至约4或5个羰基。适当的烷氧基、烷硫基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、烷酰基及其它官能基可为直链或分枝。用于此处的碳环芳基指具有1至3个分离或稠合环及6至约18个碳环成员的非杂芳基，可包含如苯基、萘基、联苯基、苊基(acenaphthyl)、菲酰基等。苯基及萘基通常优选。适当的杂芳基具有1至3个环、每环3至8个环成员及1至约3个杂原子(N、O或S)。明确的适当杂芳基包含例如香豆素基、喹啉基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、噁唑基、咪唑基、吲哚基、苯并呋喃基及苯并噻唑基。
如上所述，上列化学式化合物的各种取代基可为选择性取代。存在于“经取代”部份的适当的官能基包括例如卤原子如氟、氯、溴及碘；氰基；羟基；硝基；叠氮基；氢硫基；烷酰基如C-6烷酰基如乙酰基等；羧酰胺基；烷基包含具有1至约12个碳原子，优选1至约6个碳原子者；烯基及炔基包含具有一或多个不饱和连接及含2至约12个碳原子，优选含2至约6个碳原子者；具有一个或多个氧原子连接及1至约12个碳原子，优选1至约6个碳原子的烷氧基；烷硫基包含具有一或多个硫醚连接及1至约12个碳原子，优选1至约6个碳原子的部份；烷基亚磺酰基包含具有一个或多个亚磺酰基连接及1至约12个碳原子，优选1至约6个碳原子的部份；烷基磺酰基包含具有一或多个磺酰基连接及1至约12个碳原子，优选1至约6个碳原子的部份；胺烷基例如具有一或多个氮原子及1至约12个碳原子，优选1至约6个碳原子者；具有6个或更多个碳原子的碳环芳基，特别是苯基；芳氧基例如苯氧基；具有1至3个分离或稠合环及6至约18个环成员的芳烷基，优选为苄基；具有1至3个分离或稠合环及6至约18个碳环员的芳烷氧基，优选为O-苄基；或具有1至3个分离或稠合环及每环3至约8个环员及一个或多个N、O或S原子的杂芳基或杂脂环基，例如香豆素基、喹啉基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、噁唑基、咪唑基、吲哚基、苯并呋喃基及苯并噻唑基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、哌啶基、吗啉代基及吡咯烷基。本发明化合物的“经取代”的R’、W、X、Y及Z取代基或其它取代基可于一个或多个可用的位置(典型是1、2或3个位置)，由一或多个如上列的适当官能基所取代。
本发明特异优选的化合物包括化合物1至19(化合物编号在所绘的结构下方)，及这些化合物的药学上可接受的盐。这些化合物编号亦用于本公开其他地方，明确指具有下列所示结构的化合物。
Figure A0081476500321
Compound  1                           Compound  2                               Compound  3
Figure A0081476500322
Compound  4                                  Compound  5                           Compound  6 Compound  7                                 Compound  8
Figure A0081476500324
Compound  9                                 Compound  10                  Compound  11
Figure A0081476500331
Compound  12                          Compound  13                   Compound  14
Figure A0081476500332
Compound  15                           Compound  16
Figure A0081476500333
Compound  17                   Compound  18                     Coumpound  19
本发明优选化合物可通过本领域已知程序制备。见March，高等有机化学(第4版，1992)。例如，化学式I至IV(包含化学式IIIa及IVa)可通过芳族化合物的极性官能基(例如取代酚型、苯胺或苄基化合物，或其它具有如适合取代反应的亲电官能基的取代芳族化合物)适当地取代而合成。本发明其它化合物可类似地加以制备。例如，化学式VIII的酰亚胺化合物可经直接取代市售化合物而制备。
此处提及的“TF阻断化合物”、“TF拮抗剂”或相关术语一般包括此处公开的化合物，所述的化合物在至少一种初级筛选分析如FX活化作用分析或PT分析中具有良好阻断活性。较特别的TF阻断化合物与TF特异结合。在不限于推测的情况下，相信该化合物可以以一种足以降低或阻断FX或FIX活化作用的方式，阻断FX或FIX与TF的结合。
提及组合物的“治疗上有效量”是例如在宿主如哺乳类动物，尤其是灵长类动物如人类患者中可产生预期效果的量。该效果优选可使用几个本领域已知的终点加以监测。例如，一种预期效果是增加或稳定心血管功能，其测量可通过增加心功能，特别是在受试者血管内的血流。就疗效(例如改善的心血管功能，已受损害的心功能或相关血管功能的一种或多种指示性症状，或其它特别的生理分析)而言该影响是可监测及通常可测量的。这些特异的方法无意限制包含范围，适于特异应用(如凝血酶、癌症或动脉粥状硬化)的进一步方法对本领域熟练技术人员来说是显而易见的。
如上所述，本发明化合物可给予哺乳类动物，优选为灵长类动物如人类，以预防或降低血栓形成。使用本发明化合物的疗法包含下列疾病的治疗及预防：静脉血栓形成及肺栓塞、动脉血栓形成如心肌梗塞、不稳定性心绞痛、血栓形成性中风及周围动脉血栓形成。本发明化合物亦可用以治疗及预防动脉粥样硬化性疾病，例如冠状动脉疾病、脑动脉疾病及周围动脉疾病。本发明化合物亦可用于抗凝血治疗，包含人工器官、心瓣膜、医疗器材(例如留置装置如导管、移植模等)等。本发明化合物亦可用于其它障碍或疾病的治疗，其中可能包含凝血相关障碍，例如癌症、炎症性疾病特别是关节炎及糖尿病。
在一个特别疗法中，也可给予一种或多种TF拮抗剂化合物作为唯一治疗剂，或可将本发明化合物与其它治疗剂(例如目标为凝血机制中相互作用的医药，如链激酶、tPA、尿激酶及其它溶解血凝块的药剂)一同给予。本发明化合物亦可与其它药剂一同给予，例如一种或多种其它抗凝血剂(例如肝磷脂、水蛭素或类水蛭素)或抗血小板剂(例如ReoPro或阿司匹林)。在该组合疗法中，本发明化合物可在给予一种或多种其它适当抗凝血剂、抗血小板剂、血栓溶解剂或其它药剂之前或之后给予，以促进或延长期望的抗凝血活性。
本发明化合物可经鼻内、口服或注射(例如肌肉内、腹膜内、皮下或静脉内注射)给药，或以经皮、眼内或肠内的方法。静脉内或非肠内给药包含例如：皮下、腹膜内或肌肉内给药。一般优选是口服给药。最理想剂量是通过传统方法测定的。本发明化合物适合以质子化或水溶形式(例如药学上可接受的有机或无机酸盐，如盐酸盐、硫酸盐、半硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、醋酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、顺丁烯二酸盐、甲磺酸盐等)给予对象。
本发明化合物可单独或与一种或多种上述其它治疗剂组合使用，与传统的赋形剂混合而作为药物组合物，该赋形剂即适合于非肠内、肠内或鼻内应用的药学上可接受的有机或无机载剂，它不会有害地与活性成份作用且对其接受者也无害。
适当的药学上可接受的载剂包含(但不限于)：水、盐溶液、醇类、蔬菜油、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、硅酸、粘性石蜡、精油、脂肪酸单甘油及双甘油酯、石油醚脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。医药制剂可加以消毒且可依需要与下列不会有害地与活性化合物作用的辅剂混合：例如润滑剂、防腐剂、安定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐类、缓冲剂、着色剂、香味剂及/或芳族物质等。
此处提及的药学上可接受的平衡离子意指带有负电或正电，可与化合物形成离子键的原子或分子。可接受的带负电原子或分子包含：氯、溴、碘、醋酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、顺丁烯二酸盐等。举例的药学上可接受的带正电原子或分子包含：钠、钾及铵离子。另外的药学上可接受的对离子实例见于下述的雷明顿氏(Remington’s)医药科学。
对于非肠内应用，特别适合的是溶液，优选为油性或水性溶液及悬浮液、乳液或植入物，包含塞剂。安瓿为方便的单位剂量。
对于肠内应用，特别适合的是具有滑石粉及/或碳水化合物载剂、黏结剂等的锭剂、糖衣锭或胶囊，该载剂优选为乳糖及/或玉米淀粉及/或马铃薯淀粉。使用甜的载剂时可使用糖浆、酏剂等。可配制缓释组合物，包含其中活性成份用不同的降解涂层(例如微封胶囊、多层涂层等)保护。
关于合适给药配方的讨论一般见于雷明顿氏(Remington’s)医药科学，(Mack出版公司，Easton PA，(1980))。
可以理解在一种给定疗法中应用实际优选数量的活性化合物将根据所用的特异化合物、配制的特别组合物、应用模式、给药的特别位置、等而不同。本领域熟练技术人员依照上述方针施行传统的剂量测定试验即可容易地确定最理想的给药方式。一般来说，化学式I的一种或多种化合物的适当有效剂量是介于约0.01至100毫克/公斤接受者体重/天之间，优选是介于约0.01至20至50毫克/公斤接受者体重/天之间。
此处提及的所有文件全部并入以供参考。下列非限制性的实施例为本发明的举例。实施例1  筛选
在本实施例中，纯化的人类因子VIIa、IX及X、凝血酶及卢赛尔氏蛇毒是得自酵素研发实验室公司。胰蛋白酶是得自BoehrigerMannheim。发色团底物S-2222、S-2288、S-2238及S-2765是得自DiaPharma集团公司，Spectrozyme FXa是得自美国诊断公司。截切的重组人类组织因子(例如由243个氨基酸组成)是表现于大肠杆菌中并以免疫亲和层析法纯化的。优选截切的重组人类组织因子缺少细胞质区域。天然的人类TF是以50mM Tris-HCl(pH8.0，含有0.1M NaCl，1mM EDTA，0.3％Triton X-100)由人类癌细胞株J82提取而得。天然的其它来源的TF是以相同缓冲溶液由动物的脑丙酮粉末提取而得。所有其它试剂皆得自Sigma。
抑制组织因子/因子VIIa(TF/VIIa)的化合物的初级筛选是基于TF/VIIa依赖性FX活化作用(见图式第1图的流程图)。在本分析中，TF/VIIa复合体活化FX的能力是在两个不连续阶段中测定。在第一阶段(FX活化作用)中，不具活性的FX被TF/VIIa在磷脂及钙的存在下转变为活性酵素形式(FXa)。在第二阶段(FXa活性分析)中，在指示时间加入EDTA到FX活化作用混合物中以螯合钙，导致FX→FXa转变的终止。TF/VIIa的活性需要钙。接着藉FXa依赖性发色团底物如S-2222、S-2765或Spectrozyme FXa以测量TF/VIIa的活性。在初级筛选中，来自以前制备的化学药品库的化合物首先在TF/VIIa依赖性FX活化作用分析中以高浓度(～0.833mM)测试，以鉴定潜在的TF途径拮抗剂的效果(见第1图)。然而，化合物在该结合酵素的分析中对TF/VIIa依赖性FX活化作用的抑制作用明确地可归因于化合物对TF/VIIa及/或FXa活性的效果。因此，二级筛选测试的目的是测定抑制反应是如何发生及抑制机制。在二级筛选实验中，初级筛选所鉴定的化合物的效果以下列化合物的催化活性测试：因子VIIa(FVIIa)、因子IXa(FIXa)、因子Xa(FXa)、凝血酶、卢赛尔氏(Russell’s)蛇毒(RVV)及胰蛋白酶。施行另外的测试如TF/VIIa依赖性因子IX活化作用分析及凝血酶原时间(PT)分析以确认期望的活性，并施行二级测试以进一步选择具有优良TF拮抗活性且不具非期望活性的化合物。
A.初级筛选：TF/VIIa依赖性FX活化作用
初级筛选是使用TF/VIIa依赖性FX活化作用分析在96孔盘中重复操作。所有筛选化合物皆溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，其它试剂则制备或稀释于25mM HEPES-NaOH(含5mM CaCl2，150mM NaCl，0.1％BSA，pH7.5)中。在使用TF的分析中，纯化的人类重组TF(100nM)首先于50mMTris-HCl(pH7.5，含0.1％牛血清白蛋白(BSA))中以磷脂酰胆碱(0.07毫克/毫升)及磷脂酰丝胺酸(0.03毫克/毫升)在37℃脂化30分钟。然后将等体积的100nM脂化的TF与100nM FVIIa结合以制备TF/VIIa复合体的库存溶液。该复合体于37℃培养30分钟，然后分装并储存于-70℃供未来使用。
在筛选分析时，将5微升各化合物(约10mM于DMSO中)或DMSO置于96孔盘的各孔中，接着加入45微升TF/VIIa复合体(0.1nM)。以微量吸管尖端混合各孔中的成份，或于Lab-Line滴定盘震荡器上使该盘震荡30秒。将该盘于37℃培养15分钟后，加入10微升人类FX(180nM)至各孔中，并如上述方法混合。然后将该盘于37℃培养3至15分钟，接着加入10微升EDTA(400mM于144mM HEPES，864mM NaCl，0.576％BSA中，pH调整至7.5)至各孔中以终止FX活化作用。加入10微升FXa底物(5mM Spectrozyme FXa或3.2mM S-2765)至各孔中以测量FXa活性。该盘混合如上，约于37℃培养15分钟后，以20微升50％醋酸抑制FXa活性。然后以ELISA读取机读取405nm的吸收度。将OD405nm值转换为微软Excel档案，并以下列公式计算TF/VIIa依赖性FX活化作用的抑制作用百分比：
                 抑制作用％＝100-(100×A/B)其中A及B分别为化合物存在及不存在下的OD值。任何具有等于或大于70％TF/VIIa依赖性FX活化作用的抑制作用的化合物便指定为二级筛选测试的候选者。
B.二级筛选
初级分析所鉴定的化合物于10、50或100倍稀释浓度以TF/VIIa依赖性FX活化作用分析再次测试(见图式第1图的流程图)。在稀释浓度不具有显著抑制作用的化合物表示其抑制作用为非特异性或非常微弱，即不须再进一步测试的。在稀释浓度仍可抑制TF/VIIa依赖性FX活化作用的化合物即进一步测试其对下列蛋白酶活性的抑制能力：胰蛋白酶、RVV、凝血酶、FXa、FVIIa及FIXa。目标为鉴定可明确防止FX(及FIX)与TF/VIIa复合体结合，或干扰TF与VIIa的相互作用而阻断FX(及FIX)活化作用的化合物。然而，本发明并未进一步研究具有抑制数种蛋白酶活性的广泛能力(非特异性)的化合物。选择了适合指定标准，也就是可在较低浓度(＜0.1mM)下抑制TF/VIIa依赖性FX活化作用，但对蛋白酶活性不具有显著效果的化合物，它包括上述结构的化合物1至19，这些化合物即被鉴定为强TF拮抗剂并进一步研究的。这些化合物的测试数据见图2的表I。
已经详细叙述了关于本发明的优选的实施方案。然而，在考虑到本公开的内容上，本领域熟练技术人员可以在本发明的精神及范围内作修改和改进是可以理解的。

Claims (28)

1.一种治疗易患、已患由组织因子(TF)引起的疾病或正从该病恢复的哺乳动物的方法，该方法包括使用治疗上有效量的至少一种TF阻断化合物以治疗该病。
2.根据权利要求1所述的的方法，其中所述的疾病选自心血管疾病、凝血障碍、细胞增殖障碍、手术后并发症或免疫功能紊乱。
3.一种阻断或抑制组织因子依赖性因子X及/或因子IX活化作用的方法，它包括将组织因子与TF阻断化合物接触，从而抑制因子X或因子IX与组织因子或TF/VIIa的活化或功能性的复合体的形成。
4.根据权利要求3所述的的方法，其中所述的TF阻断化合物是与组织因子结合从而抑制功能性复合体的形成。
5.根据权利要求1-4项的任一项所述的方法，其中所述的组织因子阻断化合物的IC50较在测量TF/VIIa依赖性因子X活化作用的标准分析中的IC50低约100μM。
6.根据权利要求1-4项的任一项所述的方法，其中所述的组织因子阻断化合物的IC50较在测量TF/VIIa依赖性因子X活化作用的标准分析中的IC50低约200μM或更低。
7.根据权利要求1-6项的任一项所述的方法，其中所述的组织因子阻断化合物包括一种选自羧基、硫酰胺基、亚磺酰基、磺酰基、亚硫酸根、酰胺基或硝基的取代基。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述的组织因子阻断化合物进一步包括选择性取代的碳环芳基或选择性取代的杂芳基。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述的组织因子阻断化合物进一步包括选择性取代的苯基。
10.根据权利要求1-6项的任一项所述的方法，其中所述的组织因子阻断化合物具有下列任一如本文所定义的化学式的结构：I、II、III、IIIa、IV、IVa、V、VI、VIa、VII、VIII、IX、IXa、IXb、IXc、IXd、X、XI、或XII。
11.根据权利要求1-6项的任一项所述的方法，其中所述的组织因子阻断化合物为下列之一：Compound  1                           Compound  2                              Compound  3
Figure A0081476500042
Compound  4                          Compound  5                         Compound  6
Figure A0081476500043
Compound  7                      Compound  8
Figure A0081476500044
Compound  9                        Compound  10                        Compound  11
Figure A0081476500051
Compound  12                  Compound  13                   Compound  14
Figure A0081476500052
Compound  15                 Compound  16
Figure A0081476500053
Compound  17                 Compound  18               Coumpound  19
12.一种如本发明所定义的化学式I、II、III、IIIa、IV、IVa、V、VI、VIa、VII、VIII、IX、IXa、IXb、IXc、IXd、X、XI、或XII任一化合物。
13.根据权利要求12所述的化合物，其中所述的化合物的IC50较在测量TF/VIIa依赖性因子X活化作用的标准分析中低约100μM。
14.根据权利要求12所述的化合物，其中所述的化合物的IC50较在测量TF/VIIa依赖性因子X活化作用的标准分析中低约100μM或更低。
15.一种具下列结构的化合物，
Figure A0081476500061
Compound  1                      Compound  2                    Compound  3
Compound  4                       Compound  5                   Compound  6
Figure A0081476500063
Compound  7                         Compound  8
Figure A0081476500064
Compound  9                         Compound  10                 Compound  11
Compound  12              Compound  13             Compound  14
Figure A0081476500072
Compound  15            Compound  16
Figure A0081476500073
Compound  17           Compound  18             Coumpound  19
16.一种药剂学组合物，它包括如权利要求12或15所述的化合物和药剂学活性的载体。
17.一种治疗哺乳动物已患或易患由组织因子影响的疾病的治疗方法，它包括给所述的哺乳类动物使用有效量的如权利要求12至16中任一项所述的化合物或组合物。
18.一种治疗哺乳动物已患或易患心血管疾病、凝血障碍、细胞增殖障碍、手术后并发症、免疫功能紊乱、动脉粥状硬化、炎症、或癌症的治疗方法，所述的方法包括给该哺乳类动物使用有效量的如权利要求12至16项任一项所述的化合物或组合物。
19.一种抑制哺乳类动物的凝血的方法，它包括给所述的哺乳动物使用有效量的如权利要求12至16项中的任一项所述的化合物或组合物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述的哺乳动物是已患血栓形成、怀疑患有该病或由该病复原者。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述的哺乳类动物是已患、易患与侵入性医疗程序相关的再狭窄或由该疾患复原者。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述的侵入性医疗程序为：血管成形术、动脉内切开术、应用移植模、导管的使用、移植片的植入或动静脉分流器的使用。
23.根据权利要求19所述的方法，其中所述的哺乳类动物是已患--有继续发展的危险--与心血管疾病、传染性疾病、肿瘤疾病或使用血栓溶解剂相关的血栓栓塞状态或正从这类疾病复原者。
24.根据权利要求19-23中的任一项所述的方法，其中至少一种抗血小板组合物、血栓溶解组合物或抗凝血组合物与在测量TF/VIIa依赖性因子X活化作用的标准分析中的IC50低于约100μM的组织因子阻断化合物合并使用。
25.一种治疗或预防哺乳动物血栓栓塞性疾病的方法，它包括给所述的哺乳动物使用有效量的根据权利要求12至16中的任一项所述的TF阻断化合物或组合物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述的哺乳类动物是已患--有继续发展的危险--与心血管疾病、传染性疾病、肿瘤疾病或使用血栓溶解剂或抗血小板制剂相关的血栓栓塞状态或正从这类疾病复原者。
27.根据权利要求25所述的方法，其中至少一种抗血小板、血栓溶解或抗凝血组合物与在测量TF/VIIa依赖性因子X活化作用的标准分析中的IC50低于约100μM的组织因子阻断化合物合并使用。
28.根据权利要求17-27中的任一项所述的方法，其中所述的哺乳类动物是人类。
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