CN110123945A - 一种利用枯草芽孢杆菌固态发酵黄精的工艺方法 - Google Patents

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徐静
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殷中琼
邹元锋
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Abstract

本发明提供一种利用枯草芽孢杆菌固态发酵黄精的工艺方法,包括以下步骤：取干净鲜黄精，蒸2～3h后切1～2mm厚片，烘干后紫外线照射30～40min，得到发酵底物；取枯草芽孢杆菌BS01菌种，在固体培养基上划线培养，将获得的单菌落用液体培养基培养；将步骤2中的菌液按照1:100的比例接入液体培养基培养至对数期末期，得到枯草芽孢杆菌发酵液；将步骤1中的发酵底物和步骤3中的发酵液进行固态发酵；固态发酵结束后，将发酵混合物烘干后粉碎。本发明利用枯草芽孢杆菌发酵黄精，采用固态发酵方式，不但可显著降低黄精的刺激性，缩短黄精加工时间，提高黄精药材中的多糖含量，而且所制备的黄精在对小鼠的药理实验中呈现较好结果。

Description

一种利用枯草芽孢杆菌固态发酵黄精的工艺方法
技术领域
本发明涉及一种发酵黄精的工艺方法，具体涉及一种利用枯草芽孢杆菌固态发酵黄精的工艺方法。
背景技术
黄精为滇黄精Polygonatum kingianum coll.et Hemsl.、黄精Polygonatumsibirifum Red.和多花黄精Polygonatum cyrtonema Hua的干燥根茎。黄精味甘，能够补气养阴，健脾，润肺，益肾，是中医常用药物之一。黄精主要成分有多糖、皂苷、生物碱、木脂素、黄酮及挥发油等，多糖占4.47％～21.34％左右，其中多糖和皂苷是主要药效成分。现代研究表明黄精具有降血糖、调血脂、调节免疫力、抗肿瘤、抗衰老、抗菌和改善学习记忆等药理作用。
生黄精具有麻味，生品服用时，口舌麻木，刺激咽喉，且容易导致腹泻。古人对于黄精的加工多采用“九蒸九晒”的方法，这种传统工艺也一直沿用至今，但该方法所需时间长，工艺较为复杂，费工费时。因此，从长远的经济效益出发，黄精的加工工艺急需注入新的技术，来解决当前存在的问题。
枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，为需氧菌，有致病菌类型也有益生菌类型，广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。枯草芽苞杆菌生长速度快、营养需求简单且易于存活，还可以分泌多种酶，如蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、果胶酶、木聚糖酶等。益生菌类型的菌株目前被广泛应用于饲料、污水处理及生物肥发酵，也有少数将该菌用于制备保健酒或酵素的研究。鉴于枯草芽孢杆菌易于存活，生长速度快，其在芽孢状态下具有稳定性好，可耐氧化、耐挤压、长期耐60℃高温、耐酸碱等特性。在酸性胃环境中能保持活性，可以耐唾液和胆汁的攻击，是微生物中可100％直达大小肠的活菌。益生型枯草芽孢杆菌对人体可产生促进有益厌氧菌生长、刺激人体免疫器官生长发育、提高免疫力、促进消化、合成B族维生素等特点，故将其引入黄精的加工，以期利用枯草芽孢杆菌的发酵过程，去除黄精的麻味刺喉感，并为黄精药材引入益生菌，增强其补益作用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种利用枯草芽孢杆菌固态发酵黄精的工艺方法，该方法可显著降低黄精的刺激性，缩短黄精加工时间，提高黄精药材的药效。本发明的技术方案为：
一种利用枯草芽孢杆菌固态发酵黄精的工艺方法，包括以下步骤：
步骤1、取干净鲜黄精，蒸2～3h后切1～2mm厚片，烘干后紫外线照射30～40min，得到发酵底物；
步骤2、取枯草芽孢杆菌BS01菌种，在固体培养基上划线培养，将获得的单菌落用液体培养基培养；
步骤3、将步骤2中的菌液按照1:100的比例接入液体培养基培养至对数期末期，得到枯草芽孢杆菌发酵液；
步骤4、将步骤1中的发酵底物和步骤3中的发酵液进行固态发酵；
步骤5、固态发酵结束后，将发酵混合物烘干后粉碎。
进一步地，所述枯草芽孢杆菌BS01的菌株保藏号为CCTCC NO：M2012485。
进一步地，所述步骤2中在固体培养基上划线培养的时间为10～14h。
进一步地，所述固体培养基的组成为：营养肉汤培养基0.018g/mL，琼脂0.02g/mL。
进一步地，所述步骤2中将获得的单菌落用液体培养基培养的条件为：温度37℃，转速120rpm，培养时间7～10h。
进一步地，所述步骤3中的培养条件为：温度37℃，转速120rpm。
进一步地，所述液体培养基的组成为：营养肉汤培养基0.018g/mL。
进一步地，所述步骤4中固态发酵的条件为：菌料比15～27％，发酵温度37℃，时间36～60h。
进一步地，所述步骤4中固态发酵的条件优选为：菌料比22％，发酵温度37℃，时间41h。
进一步地，所述烘干的条件为：温度45～65℃，时间5～14h。
本发明的有益效果是：本发明利用枯草芽孢杆菌发酵黄精，采用固态发酵方式，不但可显著降低黄精的刺激性，缩短黄精加工时间，提高黄精药材中的多糖含量，而且所制备的黄精在对小鼠的药理实验中呈现较好的结果，此外，本发明还具有工艺简单、节水节能的独特优势。
具体实施方式
本发明具体实施例采用的枯草芽孢杆菌BS01的菌株在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M2012485。
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
本实施例提供一种利用枯草芽孢杆菌固态发酵黄精的工艺方法，包括以下步骤：
步骤1、取干净鲜黄精，蒸2h后切2mm厚片，于60℃烘8h后用紫外灯照射30min，得到发酵底物；
步骤2、取枯草芽孢杆菌BS01菌种，在固体培养基上划线培养10h，将获得的单菌落用液体培养基于37℃、转速120rpm、培养7h；
步骤3、将步骤2中的菌液按照1:100的比例接入液体培养基，于37℃、120rpm的条件下培养至对数期末期，得到发酵液；
步骤4、将步骤1中的发酵底物和步骤3中的发酵液进行固态发酵，固态发酵条件为：菌料比15％，发酵温度37℃，时间36h；
步骤5、固态发酵结束后，将发酵混合物于60℃烘8h后粉碎。
所述固体培养基的组成为：营养肉汤培养基0.018g/mL，琼脂0.02g/mL。
所述液体培养基的组成为：营养肉汤培养基0.018g/mL。
实施例2
本实施例提供一种利用枯草芽孢杆菌固态发酵黄精的工艺方法，包括以下步骤：
步骤1、取干净鲜黄精，蒸2h后切2mm厚片，于60℃烘11h后用紫外灯照射30min，得到发酵底物；
步骤2、取枯草芽孢杆菌BS01菌种，在固体培养基上划线培养12h，将获得的单菌落用液体培养基于37℃、转速120rpm、培养10h；
步骤3、将步骤2中的菌液按照1:100的比例接入液体培养基，于37℃、120rpm的条件下培养至对数期末期，得到发酵液；
步骤4、将步骤1中的发酵底物和步骤3中的发酵液进行固态发酵，固态发酵条件为：菌料比22％，发酵温度37℃，时间41h；
步骤5、固态发酵结束后，将发酵混合物于60℃烘11h后粉碎。
所述固体培养基的组成为：营养肉汤培养基0.018g/mL，琼脂0.02g/mL。
所述液体培养基的组成为：营养肉汤培养基0.018g/mL。
实施例3
本实施例提供一种利用枯草芽孢杆菌固态发酵黄精的工艺方法，包括以下步骤：
步骤1、取干净鲜黄精，蒸2h后切2mm厚片，于60℃烘14h后用紫外灯照射30min，得到发酵底物；
步骤2、取枯草芽孢杆菌BS01菌种，在固体培养基上划线培养12h，将获得的单菌落用液体培养基于37℃、转速120rpm、培养8h；
步骤3、将步骤2中的菌液按照1:100的比例接入液体培养基，于37℃、120rpm的条件下培养至对数期末期，得到发酵液；
步骤4、将步骤1中的发酵底物和步骤3中的发酵液进行固态发酵，固态发酵条件为：菌料比25％，发酵温度37℃，时间60h；
步骤5、固态发酵结束后，将发酵混合物于60℃烘14h后粉碎。
所述固体培养基的组成为：营养肉汤培养基0.018g/mL，琼脂0.02g/mL。
所述液体培养基的组成为：营养肉汤培养基0.018g/mL。
对比例1
本实施例提供一种发酵黄精的工艺方法，按照传统“九蒸九晒”的工艺方法，具体操作为：将干净鲜黄精去须根，上锅蒸6h，取出晾干，晒一日再蒸，如此反复3～4次，直到内心出现黑色，浊润时为止，取出晒干或用微火烘干，粉碎。
实施例4
对实施例1～3、对比例1制备的黄精粉以及生黄精进行性状鉴别、多糖含量和浸出物含量的检测：
1)黄精性状鉴别
采用药材颜色、气、味观察的方法对不同样品进行比较。发酵后性状比较结果如表1所示。
表1黄精性状比较
2)黄精多糖含量的测定
应用苯酚-硫酸法，以无水葡萄糖为对照品，配制对照品溶液，取溶液0.2mL于洁净玻璃试管中，加5％苯酚溶液0.2mL，摇匀，迅速加入浓硫酸1mL，摇匀后置于室温下反应40min。取反应后的溶液0.2mL于96孔板中，用酶标仪测定葡萄糖溶液在490nm波长下的吸光度，绘制标准曲线(Y＝4.0062X+0.0734，R2＝0.9981，浓度在0.1～0.4mg/mL时线性关系良好)。
取实施例1～3、对比例1制备的黄精粉以及鲜黄精样本，运用中华人民共和国药典2015版(一部)中黄精多糖的提取方法，获得供试品溶液。同对照品的方法测定供试品溶液的吸光度，根据标准曲线获得样品中无水葡萄糖的浓度(mg/mL)，最后确定发酵后黄精的多糖含量，测定结果如表2所示，公式如[1]所示：
表2黄精多糖含量
3)黄精浸出物含量的测定
取实施例1～3和对比例1以及鲜黄精样品，每个样品约2g。精密称定，置100ml的锥形瓶中，精密加乙醇50ml，密塞，称定重量。静置1小时后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1小时。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过。精密量取滤液25mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后。于105℃干燥3小时，置干燥器中冷却30分钟，迅速精密称定重量。以干燥品计算供试品中水溶性浸出物的含量(％)。测定结果如表3所示，计算公式如式[2]所示：
水溶性浸出物的含量(％)＝【m2-m0】*V/25m1*100％，[2]
(m0为干燥至恒重的蒸发皿重量，m1为供试品质量，m2为干燥至恒重的蒸发皿和供试品的总重量，V为滤液的体积)
表3黄精浸出物含量
通过表1～3的数据，可以看出，黄精经过枯草芽孢杆菌固态发酵后，有香气，并且味甜、无麻舌感，浸出物和多糖的含量同传统“九蒸九制”所得样品和生黄精相比均有所增加，其中以实施例2条件发酵后含量最高。可见，用枯草芽孢杆菌固态发酵黄精后，不仅去除了它的麻味和刺喉感，增加了香气，还使得有效成分含量明显增加。
实施例5
药理试验
一、受试物药物的制备
(1)发酵黄精提取液的制备
取实施例1～3和对比例1制备的黄精，加10倍量蒸馏水，浸泡30min，用文火煎煮0.5h，第二次加8倍量的蒸馏水文火煎煮0.5h，合并2次煎出液，静置过滤去渣，浓缩为生药量0.60g/mL的黄精提取液，备用。
(2)生黄精和人参提取液的制备
取生黄精和人参，分别加10倍量蒸馏水，浸泡30min，用文火煎煮0.5h，第二次加8倍量的蒸馏水文火煎煮0.5h，合并2次煎出液，静置过滤去渣，浓缩为生药量0.60g/mL的生黄精提取液和人参提取液。
二、实验动物分组及处理
清洁级雄性昆明种小鼠70只。随机分为7组，每组10只，分别为实施例1～3组，对比例1组，生黄精对照组，人参对照组和空白组。各给药组药液浓度均为生药量0.60g/mL。以上7组，按灌胃体积0.1mL/10g灌胃给药，阴性对照组(空白组)灌以相同体积的生理盐水。每天早晚各灌胃1次，连续灌胃15d，末次给药30min后，进行负重游泳力竭实验。
三、小鼠力竭游泳实验方法
在小鼠尾根部负以牛津杯(小鼠体重的5％)，放入水温(25.0±0.5)℃，水深40cm的游泳箱中，用秒表记录自游泳开始至力竭的时间。力竭的评判标准为小鼠沉没后5s仍不能浮出水面。
四、血清MDA含量测定
小鼠进行游泳力竭实验后，眼球采血，放入4℃冰箱中保存。取血液在4℃下离心，转速为3500r/min，取上层清液，按试剂盒测定方法检测血清MDA含量。
五、肝糖元和肌糖元的测定
游泳结束，立即处死小鼠，取出肝脏和肌肉，放入-80℃冰箱中保存。用糖元测试试剂盒进行测定。
六、胸腺指数和脾脏指数的测定
将小鼠处死，立即取出胸腺和脾脏，用生理盐水洗净，吸干，称重，以脏器湿重(mg/g)表示胸腺指数和脾脏指数。
七、结果统计
采用统计学方法进行据分析。应用SPSS20统计软件，进行单因素方差分析，计量资料以平均值表示。以P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异极具统计学意义。
1)力竭游泳实验结果
如表4数据所示，6个给药组和生理盐水组相比，均能显著提高小鼠力竭游泳时间，其中人参对照组和实施例2组有极显著差异，实施例2组时间最长，可见不同黄精给药组和人参对照组均具有抗疲劳的作用，其中以实施例2组作用最强。和人参对照组相比，生理盐水组、生黄精对照组和对比例组的小鼠力竭游泳时间均显著降低，而实施例1、3组，时间降低，但无统计学差异，实施例2组时间高于人参对照组，但无统计学差异。可见固态发酵后的黄精的抗疲劳效果显著增加，和人参相当。
表4黄精提取液对小鼠游泳时间的影响(n＝10)
注：“*”代表与生理盐水组作对照有显著性，“**”代表与生理盐水组作对照有极显著性；
“△”代表与人参组做对照有显著性，“△△”代表与人参组做对照有极显著性。
2)糖原测定
如表5数据所示，6个给药组和生理盐水组相比，均能显著增加肝糖原和肌糖原的含量，其中人参对照组和实施例2组有极显著差异，实施例2组肝糖原和肌糖原含量最高，可见不同黄精给药组和人参对照组均具有抗疲劳的作用，其中以实施例2组作用最强。和人参对照组相比，生理盐水组、生黄精对照组和对比例组的肝糖原和肌糖原含量均显著降低，实施例1、3组虽有降低，但无统计学差异，实施例2组的含量高于人参对照组，但无统计学差异。可见固态发酵后的黄精的抗疲劳效果显著增加，其中实施例2的黄精和人参相当。
表5黄精提取液对运动疲劳小鼠糖原的影响
注：“*”代表与生理盐水组作对照有显著性，“**”代表与生理盐水组作对照有极显著性；
“△”代表与人参组做对照有显著性，“△△”代表与人参组做对照有极显著性。
3)血清MDA测定
如表6数据所示，6个给药组和生理盐水组相比，均能显著降低MDA的含量，其中人参对照组和实施例2组有极显著差异，实施例2组MDA含量最低，可见不同黄精给药组和人参对照组均具有抗氧化的作用，其中以实施例2组作用最强。和人参对照组相比，除生理盐水组和生黄精对照组MDA含量显著高于对照组外，其余各组均无统计学意义的差异，实施例2组的MDA含量略低于人参对照组，黄精各加工组的含量均低于生黄精对照组，可见黄精经过加工后，能提高其抗氧化效果，其中实施例2的效果最好。
表6黄精提取液对运动疲劳小鼠血清MDA的影响
注：“*”代表与生理盐水组作对照有显著性，“**”代表与生理盐水组作对照有极显著性；
“△”代表与人参组做对照有显著性，“△△”代表与人参组做对照有极显著性。
4)脏器指数测定
如表7数据所示，黄精加工组和生理盐水组相比，均能显著增加脾脏和胸腺指数，其中人参对照组和实施例2组有极显著差异，实施例2组脾脏指数最高，生黄精对照组和生理盐水组无显著差异，可见不同加工后的黄精给药组和人参对照组均具有免疫增强的作用。和人参对照组相比，除生理盐水组和生黄精对照组脾脏指数和胸腺指数显著低于对照组外，其余各组均无统计学意义的差异，实施例2组的脾脏指数高于于人参对照组，可见黄精经过加工后，能提高其免疫增强作用，其中实施例2的效果最好。
表7黄精提取液对运动疲劳小鼠脏器指数的影响
注：“*”代表与生理盐水组作对照有显著性，“**”代表与生理盐水组作对照有极显著性；
“△”代表与人参组做对照有显著性，“△△”代表与人参组做对照有极显著性。
综上，黄精经过加工后可以提高其抗疲劳、抗氧化和增强免疫的作用，利用枯草芽孢杆菌固态发酵比传统加工方法的增强效果更明显，其中以实施例2组效果最好。因此，采用本发明加工黄精，能够达到增强黄精疗效的实际应用效果。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种利用枯草芽孢杆菌固态发酵黄精的工艺方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、取干净鲜黄精，蒸2～3h后切1～2mm厚片，烘干后紫外线照射30～40min，得到发酵底物；
步骤2、取枯草芽孢杆菌BS01菌种，在固体培养基上划线培养，将获得的单菌落用液体培养基培养；
步骤3、将步骤2中的菌液按照1:100的比例接入液体培养基培养至对数期末期，得到枯草芽孢杆菌发酵液；
步骤4、将步骤1中的发酵底物和步骤3中的发酵液进行固态发酵；
步骤5、固态发酵结束后，将发酵混合物烘干后粉碎。
2.根据权利要求1所述的一种利用枯草芽孢杆菌固态发酵黄精的工艺方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌BS01的菌株保藏号为CCTCC NO：M2012485。
3.根据权利要求1所述的一种利用枯草芽孢杆菌固态发酵黄精的工艺方法，其特征在于，所述步骤2中在固体培养基上划线培养的时间为10～14h。
4.根据权利要求1或3所述的一种利用枯草芽孢杆菌固态发酵黄精的工艺方法，其特征在于，所述固体培养基的组成为：营养肉汤培养基0.018g/mL，琼脂0.02g/mL。
5.根据权利要求1所述的一种利用枯草芽孢杆菌固态发酵黄精的工艺方法，其特征在于，所述步骤2中将获得的单菌落用液体培养基培养的条件为：温度37℃，转速120rpm，培养时间7～10h。
6.根据权利要求1所述的一种利用枯草芽孢杆菌固态发酵黄精的工艺方法，其特征在于，所述步骤3中的培养条件为：温度37℃，转速120rpm。
7.根据权利要求1、5、6任意一项权利要求所述的一种利用枯草芽孢杆菌固态发酵黄精的工艺方法，其特征在于，所述液体培养基的组成为：营养肉汤培养基0.018g/mL。
8.根据权利要求1所述的一种利用枯草芽孢杆菌固态发酵黄精的工艺方法，其特征在于，所述步骤4中所述固态发酵的条件为：菌料比15～27％，发酵温度37℃，时间36～60h。
9.根据权利要求8所述的一种利用枯草芽孢杆菌固态发酵黄精的工艺方法，其特征在于，所述步骤4中固态发酵的条件优选为：菌料比22％，发酵温度37℃，时间41h。
10.根据权利要求1所述的一种利用枯草芽孢杆菌固态发酵黄精的工艺方法，其特征在于，所述烘干的条件为：温度45～65℃，时间5～14h。
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