CN110090211A - 叶绿素衍生物改善微循环障碍的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，涉及叶绿素衍生物改善微循环障碍的用途，特别是叶绿素衍生物在制备用于治疗和/或预防微循环障碍的药物中的用途。本发明所述的叶绿素衍生物，例如叶绿素提取物及蚕砂提取物等对改善各部位及整体微循环障碍均具有较好疗效。所述叶绿素衍生物还可通过在多个环节中的作用，综合预防和改善整体及部分部位的微循环障碍。并且，所述叶绿素衍生物的毒副作用得到改善，适用人群广泛且安全，可应用于治疗儿童、老年人、孕妇和哺乳期妇女。此外，所述叶绿素衍生物的制备方法及应用于制备药物时的工艺较为简便，成本得到有效控制。

Description

叶绿素衍生物改善微循环障碍的用途

技术领域

本发明属于医药领域，涉及叶绿素衍生物改善微循环障碍的用途，特别是叶绿素衍生物在制备用于治疗和/或预防微循环障碍的药物中的用途。

背景技术

微循环是指微动脉与微静脉之间毛细血管中的血液循环。它是心血管系统与组织细胞的直接接触部分。微循环的基本功能是进行新陈代谢及物质交换，是血液循环的重要组成部分，可称为人体的“第二心脏”。在进化过程中，脏器微血管和其实质细胞形成密切协调、高度适应的立体结构。为便于研究，通常将脏器微血管的构型归纳为发夹型、树枝型、网囊型、丝球型、密网型和珊瑚型。一般认为，随脏器功能的变化，微血管构型状态也可发生变化，脏器病变时也是如此。

随着人们生活水平的提高、饮食结构的改善、生活方式的变化以及遗传基因等因素的影响，微循环障碍的发病率呈明显上升趋势，患病率高、复发率高是微循环障碍疾病的主要特点。微循环对各种致病因素，如物理的、化学的以及生物的刺激都十分敏感。在致病因素作用下，可能出现局部或全身性微循环的病理变化。例如，如果微循环功能出现障碍，将不能满足组织细胞氧及营养代谢的需要，直接影响各器官的生理功能。此类病况被称为微循环障碍。许多疾病的发生、发展与转归，均与微循环障碍密切相关，而微循环的状况可直接影响疾病的治疗。例如，当人患有脑微循环障碍时，身体会产生很多疾病，通常会出现神经衰弱、失眠健忘、注意力不集中、思维迟钝、头痛、头晕，甚至严重时会产生恶性病症的面瘫、中风、痴呆等病症。据报道，这是由于出现脑微循环障碍时，脑细胞得不到充足的氧气、养料，代谢产物不能充分顺利排除。

在改善微循环功能方面，中西医作了很多研究，而开发有切实疗效的药物仍然是目前研究的方向。西医主要以扩充血容量和运用血管活性药物来改善因休克所导致的微循环障碍，但对于慢性以及轻度微循环障碍却无确切疗效。中医学认为微循环障碍是由于淤血和痰饮所造成，将其描述为血瘀证和痰饮证，主要以益气养阴、活血化瘀的药物治疗为主。

目前常用的改善微循环障碍药物主要是通过保护血管、抗凝血、溶栓去纤、抗血小板、扩张血管、降低血粘度和活血化瘀改善微循环障碍，包括：

血管保护药物主要有多贝斯、导升明(2，5-二羟基苯磺酸钙)、递法明。该类药物可以抑制毛细血管的高通透性、血液的高粘滞性和血小板的高凝聚性。

抗凝血药主要有肝素、速碧林(低分子肝素钙)、华法林。该类药物的主要功能是防治凝血因子的消耗，及时中止凝血过程，阻止阻塞微循环血流的微血栓继续形成。

溶栓去纤药主要有第一代溶栓剂链激酶(SK)和尿激酶(UK)、第二代溶栓剂组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、第三代溶栓剂以单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(Scu-PA)和乙酰化纤溶酶原-链激酶激活剂复合物(APSAC)。该类药物主要是通过溶解微血栓使血流再通。

抗血小板药主要有阿司匹林、双嘧达莫(潘生丁)、噻氯匹啶等，该类药物通过抑制血小板的粘附、聚集和释放功能，从而防止血栓形成、延长已活化的血小板生存期。

血管扩张药主要有己酮可可碱、克林澳(马来酸桂哌齐特)和胰激肽原酶。该类药物通过扩张小血管和毛细血管，增加毛细血管血流量。

降低血粘度药物主要有低分子右旋糖酐、生理盐水、706代血浆和葡萄糖液等，该类药物通过稀释血液和降脂恢复微循环障碍。

活血化瘀药物主要以中药为主，如地奥心血康、复方丹参滴丸和步长脑心通。

但是，目前改善微循环障碍的药物还存在诸多问题或缺点。首先，现有药物的治疗部位和功效较为单一。目前，临床上使用的改善微循环障碍的药物，无论是西药还是中药制剂，大多只能治疗特定部位微循环障碍形成的症状，如脑部、心脏等器官的微循环障碍症状，不能综合改善微循环障碍。一般情况下，微循环障碍在中早期无症状或症状不明显，或者仅在局部部位的表征较为明显，因此，容易形成“头痛医头、脚痛医脚”的应付式治疗，只有针对整个机体微循环系统都有效的药物，才是治疗和预防微循环障碍的优先选择。并且，即使仅针对特定部位的治疗，现有药物的疗效也有待提高。进一步地，现有药物不仅毒副作用明显，容易引起胃部不适、恶心、胃灼热、食欲下降、皮疹和引发出血等不良反应和副作用，而且使用人群受限，不适合或不建议儿童、老年人、孕妇、哺乳期妇女服用。此外，现有药物往往价格高昂。

因此，亟需开发新的可以有效预防和改善多部位微循环障碍，在特定部位的药效也得到改善，和/或可避免上述缺陷的药物。

发明内容

为了改善现有技术中的上述缺陷，本发明提供一种叶绿素衍生物在制备用于治疗和/或预防微循环障碍的药物的用途。

根据本发明，所述微循环障碍可以是高分子右旋糖酐导致的微循环障碍。

根据本发明，所述微循环障碍可以是急性微循环障碍或慢性微循环障碍。

根据本发明，所述微循环障碍可以是例如选自脑、肌肉、肠系膜和/或耳的微循环障碍，特别是脑微循环障碍，例如脑急性微循环障碍。

本发明还提供叶绿素衍生物在制备用于改善血流灌注量的药物的用途。

本发明还提供叶绿素衍生物在制备用于改善运动血细胞浓度的药物的用途。

本发明还提供叶绿素衍生物在制备用于改善运动血细胞速率的药物的用途。

根据本发明，所述叶绿素衍生物可以商购获得或者提取自含有叶绿素和/或其衍生物的各种生物材料，包括但不限于蚕砂、竹叶、杜仲、雏菊、大麦苗、菠菜、空心菜、芹菜、莴笋、甘蓝、油菜、豆芽菜苗、西兰花叶、三叶草、雪松、绿藻、青草、仙人掌、芦荟、甘蔗叶、猕猴桃叶、桃叶、大叶黄杨、绞股蓝叶、牡丹叶、紫丁香叶、乔木叶片(女贞)、海桐叶片、石楠、冬青叶片、宁箭荷花叶片、桑叶等，优选蚕砂。

根据本发明，所述叶绿素衍生物可以为叶绿素提取物，如蚕砂提取物。

根据本发明，所述叶绿素衍生物可以包含过渡金属螯合的叶绿酸碱金属盐、过渡金属螯合的叶绿酸碱土金属盐中的一种或多种。其中，所述过渡金属可以选自铁、铜、锌、锰、钴、镍、铬等中的一种或多种。

作为实例，所述过渡金属螯合的叶绿酸碱金属盐可以选自铁叶绿酸钠、铜叶绿酸钠、锌叶绿酸钠、锰叶绿酸钠、钴叶绿酸钠、镍叶绿酸钠、铬叶绿酸钠、铁叶绿酸钾、铜叶绿酸钾、锌叶绿酸钾、锰叶绿酸钾、钴叶绿酸钾、镍叶绿酸钾、铬叶绿酸钾中的一种或多种。所述过渡金属螯合的叶绿酸碱土金属盐可以选自铁叶绿酸钙、铜叶绿酸钙、锌叶绿酸钙、锰叶绿酸钙、钴叶绿酸钙、镍叶绿酸钙、铬叶绿酸钙、铁叶绿酸镁、铜叶绿酸镁、锌叶绿酸镁、锰叶绿酸镁、钴叶绿酸镁、镍叶绿酸镁、铬叶绿酸镁中的一种或多种。

作为选择，所述叶绿素衍生物也可以选自所述过渡金属螯合的叶绿酸碱金属盐、过渡金属螯合的叶绿酸碱土金属盐中的一种或多种。

优选地，所述叶绿素衍生物中，铁叶绿酸钠的重量百分比含量为5％以上，例如10％以上，如15％以上、22.5％以上、25％以上、28％以上、30％以上、35％以上或37％以上。此时，作为实例，所述叶绿素衍生物中还可以包含其他叶绿素衍生物，其中所述其他叶绿素衍生物包含但不限于上述除铁叶绿酸钠之外的过渡金属螯合的叶绿酸碱金属盐，以及任选存在的额外的叶绿素衍生物。所述其他叶绿素衍生物的总重量百分比含量，以铁叶绿酸(b)(C₃₄H₃₀O₆N₄Fe)计，为15％以上，例如30％以上，如50％以上、55％以上、58％以上或60％以上、63％以上、65％以上或70％以上。

根据本发明的实施方案，所述额外的叶绿素衍生物可以包括但不限于选自下列的衍生物：叶绿酸钠、铁叶绿酸b、脱镁叶绿素酸a、焦脱镁叶绿酸a、二氢卟吩e6、二氢卟吩e4、二氢卟吩p6、二氢卟吩f、紫红素-18、叶绿卟啉等。

本发明还提供一种用于治疗和/或预防所述微循环障碍的药物组合物，包含所述叶绿素衍生物。

本发明还提供一种用于改善血流灌注量的药物组合物，包含所述叶绿素衍生物。

本发明还提供一种用于改善运动血细胞浓度的药物组合物，包含所述叶绿素衍生物。

本发明还提供一种用于改善运动血细胞速率的药物组合物，包含所述叶绿素衍生物。

对于本发明的叶绿素衍生物，例如叶绿素提取物及蚕砂提取物的制备方法均没有特别限制。本领域技术人员可以理解，可以通过本领域已知的制备方法(例如提取、分离等)得到本发明的叶绿素衍生物。

例如，所述叶绿素衍生物，例如叶绿素提取物的制备方法包括如下步骤：

(1)提取叶绿素；优选地，进一步对提取得到的提取物进行精制；

(2)皂化；优选地，进一步用有机溶剂洗涤皂化液；

(3)铁化；

(4)碱化。

在上述步骤(1)中，优选取含有叶绿素和/或其衍生物的各种生物材料(优选蚕砂)，用有机溶剂或有机溶剂与水的混合物提取，回收有机溶剂后得叶绿素。

优选地，有机溶剂可以为丙酮、乙醇、石油醚、正己烷、汽油(如120号汽油)、甲苯或其中两种或多种的混合物；进一步优选地，有机溶剂为丙酮、乙醇或其混合物。

优选地，提取方法为回流、萃取、渗滤、微波或使用超微震动磨等。

在优选的实施方案中，通过用去离子水洗涤或者通过用大孔吸附树脂吸附进行精制。

优选地，进行精制以用于去除非叶绿素类物质。

在上述步骤(2)中，优选将叶绿素用有机溶剂溶解，加入碱溶液使其皂化；其中，有机溶剂优选为汽油、丙酮或其混合物，汽油优选为120号汽油；碱溶液优选为NaOH水溶液或KOH水溶液，进一步优选地，碱溶液的浓度为25-35％。皂化是为了去除类胡萝卜素。

在上述步骤(3)中，优选调节皂化液的pH值至2-4，析出沉淀，加入有机溶剂或有机溶剂与水的混合物使其溶解，再加入亚铁盐，加热至溶液呈深绿色为止，回收有机溶剂后得铁代产物。

优选地，有机溶剂可以为丙酮、乙醇或其混合物；

优选地，亚铁盐可以为硫酸亚铁、氯化亚铁或其混合物；

优选地，加热使溶液保持微沸。

根据本发明，进行铁化以获得铁叶绿酸。

在上述步骤(4)中，优选取铁代产物用去离子水洗至无游离铁离子，加入有机溶剂使其溶解，再加入碱进行碱化。

优选地，有机溶剂可以为丙酮、乙醇或其混合物；

作为实例，所述碱可以是碱的水溶液或醇溶液，例如NaOH水溶液或NaOH乙醇溶液。

优选地，所述碱化进行至不再有沉淀产生为止。

优选地，碱的水溶液或醇溶液中，碱的质量百分比浓度可以为25-35％。

根据本发明，优选地，进行碱化以获得铁叶绿酸钠。

本发明还提供所述叶绿素衍生物用于治疗和/或预防微循环障碍的用途。

本发明还提供叶绿素衍生物用于改善血流灌注量的用途。

本发明还提供叶绿素衍生物用于改善运动血细胞浓度的用途。

本发明还提供叶绿素衍生物用于改善运动血细胞速率的用途。

有益效果

申请人意外地发现，本发明所述的叶绿素衍生物，例如叶绿素提取物及蚕砂提取物等对改善各部位及整体微循环障碍均具有较好疗效。所述叶绿素衍生物还可通过在多个环节中的作用，综合预防和改善整体及部分部位的微循环障碍。并且，所述叶绿素衍生物的毒副作用得到改善，适用人群广泛且安全，可应用于治疗儿童、老年人、孕妇和哺乳期妇女。此外，所述叶绿素衍生物的制备方法及应用于制备药物时的工艺较为简便，成本得到有效控制。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的通式化合物及其制备方法和应用做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

1.试验材料、仪器及方法

1.1药品与试剂

蚕砂提取物由武汉联合药业有限责任公司提供，根据中国专利申请201110031023.5公开的方法制备获得。试验时蚕砂提取物用纯水配制成浓度为16mg/ml(高剂量)、8mg/ml(中剂量)、4mg/ml(低剂量)的溶液，每日新鲜配制。

右旋糖酐T250(分子量为25万)：规格：D-T250。购于汉邦环宇多糖生物科技(河源)有限公司。批号：D-15021。

氨基甲酸乙酯(乌来糖)：AR级，购于成都科龙化工试剂厂，批号：20160811。试验时用纯水配制成浓度为20％的溶液。

1.2铁叶绿酸钠含量测定方法

对照品溶液的制备：精密称取经130℃干燥至恒重的光谱纯的三氧化二铁0.143g，置烧杯中，加盐酸溶液(1→2)5ml使溶解，移至100ml量瓶中，加盐酸溶液(1→2)4ml，加水至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得每1ml约含Fe100μg的溶液。分别精密量取上述溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8及1.0ml，置10ml量瓶中，加硝酸溶液(1→500)至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液的制备：取样品适量，研细，精密称取10mg，置50ml烧杯中，加硝酸1.5ml，高氯酸3滴，盖上表面皿，150～160℃加热至近干后，加硝酸(1→2)2ml，盖上表面皿，继续加热至近干，取出烧杯，放冷，加硝酸溶液(1→500)适量使溶解，移至25ml量瓶中，加硝酸溶液(1→500)至刻度，摇匀，即得。

测定法：取对照品溶液及供试品溶液，照原子吸收分光光度法(中国药典2015年版一部含量测定第一法)，在248nm波长处测定，计算铁的百分含量，乘以12.32，即得。本品按干燥品计算，含铁叶绿酸钠以铁叶绿酸钠(b)(C₃₄H₂₈O₆N₄FeNa₂)计算。

1.3其他叶绿素衍生物的含量测定方法

取样品细粉约0.18g，精密称定，加稀盐酸10ml，超声处理15分钟，减压抽滤，弃去酸水，用水洗涤残渣至水洗液呈中性(甲基红指示液显黄色，溴麝香草酚蓝指示液显黄绿色)，将残渣连同滤纸剪碎后，转移至烧杯中，精密加入氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)20ml，盖上表面皿，热水浴中加热15分钟，冷却至室温，加水5ml，摇匀，同法制备空白溶液。照电位滴定法(中国药典2015年版一部)用盐酸滴定液(0.1mol/L)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正，计算，即得。

V_空：空白溶液消耗盐酸滴定液(0.1mol/L)的体积(ml)；

V_样：供试液消耗盐酸滴定液(0.1mol/L)的体积(ml)；

W：供试品取样量(g)；

F：盐酸滴定液(0.1mol/L)的浓度校正因子。

本品按干燥品计算，含其他叶绿素衍生物以铁叶绿酸(b)(C₃₄H₃₀O₆N₄Fe)计算。

1.4试验动物与饲养

1.4.1试验动物新西兰兔，雌雄兼用，体重1.8～2.0kg，购置于成都达硕实验动物有限公司。生产许可证号：SCXK(川)2014-028。于恒温环境中进行适应性饲养，保持环境清洁，饮水进食不限，持续1周。

1.4.2饲料

名称：实验兔配合饲料(8011)；来源：成都达硕实验动物有限公司；执行标准：GB14924.3—2010；生产批号：20160821；营养成分符合实兔的配合饲料要求，营养成分和污染物质符合GB14924.1-2001和《实验动物饲养管理规程》要求。具体值(以每千克饲料计)为：粗蛋白，≥140g；粗纤维，100～150g；粗脂肪，≥30g；粗灰分，≤90g；水分，≤110g；钙︰磷，1.0～1.8︰0.6～1.2；赖氨酸，≥7g；蛋氨酸+胱氨酸，≥5g。

给予方法：将饲料放置于兔笼前面的饲养槽内，自由摄食。

1.4.3饮用水

名称：生活用自来水；质量要求符合《生活饮用水卫生标准》。

给水方式：饮用水瓶放置于兔笼前面专用位置，自由饮水。

1.5试验仪器

电子天平：BP221S型，由德国SARTORIUS生产。

激光多普勒PeriFlux 5000系统，由瑞典PERIMED生产。

2.实验模型和方法

2.1试验分组及给药

取雌雄各半新西兰兔24只随机分为4组，每组6只。分别为：阴性对照组，蚕砂提取物高(80mg/kg/d)、中(40mg/kg/d)、低(20mg/kg/d)剂量组。于造模前20d开始给蚕砂提取物高、中、低剂量组灌胃给药，给药体积为5ml/kg，每日一次，连续20d。

2.2急性微循环障碍模型建立

经兔耳缘静脉注射浓度为10％的右旋糖酐T250(分子量为25万单位)1ml/kg建立急性微循环障碍模型。具体操作为：耳缘静脉注射20％氨基甲酸乙酯5ml/kg进行麻醉，先用激光多普勒血流仪测量耳、脑、肌肉以及肠系膜的微循环灌注量(PU)、血细胞聚集程度(CMBC)以及运动血细胞的速率(V)，然后耳缘静脉注射右旋糖酐T250，给药30min后再用激光多普勒血流仪测量耳、脑、肌肉以及肠系膜的PU、CMBC、V。

2.3观察指标

将阴性对照组、蚕砂提取物高、中、低剂量组连续给药20d后，于最后一次给药后2h，分别于造模前和造模30min后测量耳部微循环变化情况(PU、CMBC、V)、脑部微循环变化情况(PU、CMBC、V)、肌肉微循环变化情况(PU、CMBC、V)以及肠系膜微循环变化情况(PU、CMBC、V)。计算造模前后微循环变化率(激光多普勒血流仪的PF5010-LDPM单元为测量局部组织微循环，且不同组织的不同部位微循环差异较为明显，为保证每次测量数据的客观性，我们用变化率来计算微循环的变化情况)。

2.4统计学方法

分析实验中计量资料的数据一般以“平均值±标准差”表示。组间差异的显著性检验运用Prism5windows软件提供的非参数检验或单因素方差分析方法；首先对各组数据进行正态检验，符合正态分布时采用单因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)，不符合时采用非参数检验(Nonparametric Tests)。

计数数据一般采用非参数检验(如卡方检验)进行组间的差异性比较。“*”、“#”(P<0.05)为均数间的差异有显著的统计学意义，“**”、“##”(P<0.01)为均数间的差异有非常明显地统计学意义。

实施例1蚕砂提取物对脑急性微循环障碍的保护作用

根据上述方法，取铁叶绿酸钠重量百分比含量为约37.6％、其他叶绿素衍生物以铁叶绿酸(b)计为60.0％以上的蚕砂提取物，就其对兔脑急性微循环障碍的作用进行测试，结果如下。

表1蚕砂提取物对兔脑微循环变化率影响

注：与阴性对照组比：*：P<0.05，**：P<0.01

表1显示，与阴性对照组相比，蚕砂提取物高剂量组血流灌注量(PU)、运动血细胞速率(V)变化率显著降低(P<0.01)，蚕砂提取物高剂量组血细胞聚集程度(CMBC)变化率及中、低剂量组各考核指标呈现下降趋势，说明铁叶绿酸钠能改善脑部微循环障碍。

实施例2蚕砂提取物对肌肉急性微循环障碍的保护作用

根据上述方法，取铁叶绿酸钠重量百分比含量为约37.6％、其他叶绿素衍生物以铁叶绿酸(b)计为60.0％以上的蚕砂提取物，就其对兔肌肉急性微循环障碍的作用进行测试，结果如下。

表2蚕砂提取物对兔肌肉微循环变化率影响

注：与阴性对照组比：*：P<0.05，**：P<0.01

表2显示，与阴性对照组相比，蚕砂提取物高、中剂量组血流灌注量(PU)变化率显著降低(P<0.01)；蚕砂提取物高剂量组血细胞聚集程度(CMBC)变化率显著降低(P<0.01)。蚕砂提取物高剂量组运动血细胞速率(V)变化率，以及蚕砂提取物中剂量组血细胞聚集程度(CMBC)、运动血细胞速率(V)变化率，以及蚕砂提取物低剂量组血流灌注量(PU)、血细胞聚集程度(CMBC)、运动血细胞速率(V)变化率均有下降趋势，说明铁叶绿酸钠能改善肌肉组织微循环障碍。

实施例3蚕砂提取物对肠系膜急性微循环障碍的保护作用

根据上述方法，取铁叶绿酸钠重量百分比含量为约37.6％、其他叶绿素衍生物以铁叶绿酸(b)计为60.0％以上的蚕砂提取物，就其对兔肠系膜急性微循环障碍的作用进行测试，结果如下。

表3蚕砂提取物对兔肠系膜微循环变化率影响

注：与阴性对照组比：*：P<0.05，**：P<0.01

表3显示，与阴性对照组相比，蚕砂提取物高剂量组血流灌注量(PU)、血细胞聚集程度(CMBC)和运动血细胞速率(V)变化率均显著降低(P<0.01)，蚕砂提取物中、低剂量组各考核指标呈下降趋势，说明铁叶绿酸钠能改善肠系膜微循环障碍。

实施例4蚕砂提取物对耳急性微循环障碍的保护作用

根据上述方法，取铁叶绿酸钠重量百分比含量为约37.6％、其他叶绿素衍生物以铁叶绿酸(b)计为60.0％以上的蚕砂提取物，就其对兔耳急性微循环障碍的作用进行测试，结果如下。

表4蚕砂提取物对兔耳微循环变化率影响

注：与阴性对照组比：*：P<0.05，**：P<0.01

表4显示，与阴性对照组相比，蚕砂提取物高剂量组血细胞聚集程度(CMBC)变化率显著降低(P<0.05)，蚕砂提取物高、中、低剂量组其他考核指标均有下降趋势，说明铁叶绿酸钠能改善耳急性微循环障碍。

实施例5蚕砂提取物对急性微循环障碍的保护作用

重复实施例1-4的实验，所不同的是取铁叶绿酸钠重量百分比含量为约29.1％、其他叶绿素衍生物以铁叶绿酸(b)计为60.0％以上的蚕砂提取物进行实验。结果表明，高、中、低剂量组血流灌注量(PU)、血细胞聚集程度(CMBC)、运动血细胞速率(V)变化率均出现下降，可知受试兔的脑、肌肉、肠系膜及耳微循环障碍得到改善。

由以上实施例可知，铁叶绿酸钠及含有铁叶绿酸钠的叶绿素衍生物(如蚕砂提取物)可有效改善或调节血流灌注量、运动血细胞浓度以及运动血细胞速率，从而改善脑、肌肉、肠系膜、耳的急性微循环障碍，继而改善整体微循环障碍。

实施例6蚕砂提取物及铁叶绿酸钠长期毒性实验

Beagle犬按1000、500和250mg蚕砂提取物/kg口服给药，相当于该品临床成人重度患者最大用量的100、50和25倍，每天1次，每周休息1天，连续给药180天，然后停药恢复30天。观察Beagle犬给药期间和停药期间出现的毒性反应症状，预测蚕砂提取物可能引起的临床不良反应，结果如下：

(1)一般情况观察

各给药组Beagle犬行为正常，未见不正常尖叫声、躁动不安、抽搐、震颤、共济失调、局部肌肉抽动和强迫运动等异常反应；对刺激的反应未见烦躁易怒，或冷漠或抑制状态，或感觉过敏；神经反射无迟钝或丧失现象；肌张力无松弛或僵硬表现。

给药期间主要异常表现为受试Beagle犬粪便被供试品蚕砂提取物黑染，其它未见异常。

(2)摄食量

给药期和停药恢复期，各组Beagle犬摄食量均无异常。

(3)体重

给药期及恢复期，各组Beagle犬体重均未出现异常，蚕砂提取物各给药组体重测定值与对照组比较无统计学差异(p>0.05)，但体重增长率比对照组高10％左右。

(4)心电图检查

给药180天和停药30天Beagle犬ECG检查，蚕砂提取物各给药组和对照组各指标比较均无明显差异(p>0.05)。

(5)体温检查

给药180天和停药30天Beagle犬体温检查，蚕砂提取物各给药组和对照组比较均无明显差异(p>0.05)。

(6)血压检查

给药180天和停药30天Beagle犬血压检查，蚕砂提取物各给药组和对照组血压各指标比较均无明显差异(p>0.05)。

(7)眼科检查

给药期和停药恢复期观察Beagle犬眼睑、结膜、角膜、虹膜、巩膜、瞳孔、角膜、玻璃体、晶状体和眼底，各项指标均正常，未发现异常情况。

(8)尿常规检查

给药90天、180天和停药恢复30天，各给药组与对照组比较，各指标均未见明显异常(p>0.05)。

(9)粪便常规检查

给药90天和给药180天粪便常规检查，蚕砂提取物各给药组均出现黑便情况，其它未见异常。

(10)血常规及网织红细胞检查

给药90天高、中剂量组RDWS(红细胞体积分布宽度)分别显著、明显降低(p<0.01、p<0.05)。给药180天中剂量组RDWS(红细胞体积分布宽度)明显降低(p<0.05)，推测与药物无关，属动物生理值波动。其它血常规检查指标未见明显异常。

(11)凝血功能

出现凝血功能检查值波动，无剂量-反应关系和时间-反应关系，推测与药物无关。

(12)血液生化检查

[1]肝功能：①给药90天、给药180天低剂量组Beagle犬γ-GT明显降低(p<0.05)。恢复期检查，高、中和低剂量组γ-GT分别呈现明显、显著、明显降低(p<0.05、p<0.01、p<0.05)，由于同期对照组γ-GT检查值比给药前有较大幅度波动，故推测与药物无关，属动物生理值波动。②停药30天高剂量组TP明显升高(p<0.05)，高剂量组停药30天TP检查值与给药180天检查值几乎一致，但给药180天无统计学差异(p>0.05)。分析发现高剂量组停药30天TP比对照组仅升高了5.8％，升高幅度较小，无临床意义，而且对照组停药30天TP值比给药180天降低了5.7％，说明是对照组生理值波动引起该异常，与药物无关。③给药90天高剂量组白蛋白降低3.7％，降低幅度较小，且比给药前测定值还高，但给药前并无统计学差异或降低作用，分析认为给药90天对照组白蛋白测定值比给药前测定值升高10.8％，可能与此有关，属生理值波动。高剂量组给药180天白蛋白测定值比给药90天测定值还高，说明不存时间-反应关系，与药物无关。

[2]肾功能

①给药90天低剂量组Crea明显升高(p<0.05)，升高幅度为5.4％，但高剂量组无明显升高，无剂量-反应关系；其给药180天低剂量组Crea测定值比给药90天还低，说明无时间-反应关系，推测与药物无关。②恢复30天后高剂量组Crea明显升高(p<0.05)，恢复期测定值比给药90天测定值还低，说明存在生理值波动，与药物无关。

[3]血糖血脂和心肌酶谱

给药90天低剂量组Beagle犬GLU明显降低(p<0.05)，无剂量-反应关系，推测与药物无关。给药180天和停药恢复30天，各给药组与对照组比较，各指标均未见明显异常(p>0.05)，推测与药物无关，属动物生理值波动。

(13)血清电解质检查

给药90天、给药180天和停药30天，各给药组与对照组比较，各指标均未见明显异常(p>0.05)，但检疫期检查值出现波动，无剂量-反应关系和时间-反应关系，推测与药物无关，属动物生理值波动。

(14)骨髓检查

给药180天高、中、低剂量组Beagle犬骨髓巨核细胞数出现明显增加(p<0.05)，恢复期结束，低剂量组与对照组比较巨核细胞数出现明显增加(p<0.05)，呈时间-反应关系，判断与药物生血功能有关。

(15)系统尸解

给药180天和停药恢复30天检查，各组Beagle犬营养状态、尸体特征及体格检查均无异常表现，各天然孔窍未见异常分泌物，口腔、鼻腔及主要内脏组织未见明显异常表现。呼吸道检查气管及支气管未见明显异常，肺组织未见粘连、气肿、肿物或萎缩等病变。

(16)脏器指数检查

给药180天和停药恢复30天心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、子宫、卵巢、睾丸、附睾、甲状腺、胸腺、脑、膀胱、前列腺和胰腺的脏器指数检查，各给药组与对照组比较未见明显差异(p>0.05)。

(17)病理组织学检查

蚕砂提取物给药180天和停药30天后组织病理学镜下检查，各组织各指标均未发现具有统计学差异的病理变化(p>0.05)。

结论：蚕砂提取物及铁叶绿酸钠除引起粪便黑染和骨髓巨核细胞增殖反应外，未见毒性反应。1000mg蚕砂提取物/kg及以下剂量为安全剂量范围。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.叶绿素衍生物在制备用于治疗和/或预防微循环障碍的药物、和/或改善血流灌注量的药物、和/或改善运动血细胞浓度的药物、和/或改善运动血细胞速率的药物的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述微循环障碍可以是高分子右旋糖酐导致的微循环障碍；

优选地，所述微循环障碍可以是急性微循环障碍或慢性微循环障碍；

优选地，所述微循环障碍可以是例如选自脑、肌肉、肠系膜和/或耳的微循环障碍，特别是脑微循环障碍，例如脑急性微循环障碍；

优选地，所述叶绿素衍生物可以商购获得或者提取自含有叶绿素和/或其衍生物的各种生物材料，包括但不限于蚕砂、竹叶、杜仲、雏菊、大麦苗、菠菜、空心菜、芹菜、莴笋、甘蓝、油菜、豆芽菜苗、西兰花叶、三叶草、雪松、绿藻、青草、仙人掌、芦荟、甘蔗叶、猕猴桃叶、桃叶、大叶黄杨、绞股蓝叶、牡丹叶、紫丁香叶、乔木叶片(女贞)、海桐叶片、石楠、冬青叶片、宁箭荷花叶片、桑叶等，优选蚕砂；

优选地，所述叶绿素衍生物可以为叶绿素提取物，如蚕砂提取物；

优选地，所述叶绿素衍生物可以包含过渡金属螯合的叶绿酸碱金属盐、过渡金属螯合的叶绿酸碱土金属盐中的一种或多种；其中，所述过渡金属可以选自铁、铜、锌、锰、钴、镍、铬等中的一种或多种；

优选地，所述过渡金属螯合的叶绿酸碱金属盐可以选自铁叶绿酸钠、铜叶绿酸钠、锌叶绿酸钠、锰叶绿酸钠、钴叶绿酸钠、镍叶绿酸钠、铬叶绿酸钠、铁叶绿酸钾、铜叶绿酸钾、锌叶绿酸钾、锰叶绿酸钾、钴叶绿酸钾、镍叶绿酸钾、铬叶绿酸钾中的一种或多种；所述过渡金属螯合的叶绿酸碱土金属盐可以选自铁叶绿酸钙、铜叶绿酸钙、锌叶绿酸钙、锰叶绿酸钙、钴叶绿酸钙、镍叶绿酸钙、铬叶绿酸钙、铁叶绿酸镁、铜叶绿酸镁、锌叶绿酸镁、锰叶绿酸镁、钴叶绿酸镁、镍叶绿酸镁、铬叶绿酸镁中的一种或多种；

优选地，所述叶绿素衍生物也可以选自所述过渡金属螯合的叶绿酸碱金属盐、过渡金属螯合的叶绿酸碱土金属盐中的一种或多种；

优选地，所述叶绿素衍生物中，铁叶绿酸钠的重量百分比含量为5％以上，例如10％以上，如15％以上、22.5％以上、25％以上、28％以上、30％以上、35％以上或37％以上；并且，所述叶绿素衍生物中还可以包含其他叶绿素衍生物，其中所述其他叶绿素衍生物包含但不限于上述除铁叶绿酸钠之外的过渡金属螯合的叶绿酸碱金属盐，以及任选存在的额外的叶绿素衍生物；所述其他叶绿素衍生物的总重量百分比含量，以铁叶绿酸(b)计，为15％以上，例如30％以上，如50％以上、55％以上、58％以上、60％以上、63％以上、65％以上或70％以上；

优选地，所述额外的叶绿素衍生物可以包括但不限于选自下列的衍生物：叶绿酸钠、铁叶绿酸b、脱镁叶绿素酸a、焦脱镁叶绿酸a、二氢卟吩e6、二氢卟吩e4、二氢卟吩p6、二氢卟吩f、紫红素-18、叶绿卟啉等。

3.一种用于治疗和/或预防微循环障碍的药物组合物，其特征在于，包含叶绿素衍生物，其中所述叶绿素衍生物具有权利要求2的定义。

4.一种用于改善血流灌注量的药物组合物，其特征在于，包含叶绿素衍生物，其中所述叶绿素衍生物具有权利要求2的定义。

5.一种用于改善运动血细胞浓度的药物组合物，其特征在于，包含叶绿素衍生物，其中所述叶绿素衍生物具有权利要求2的定义。

6.一种用于改善运动血细胞速率的药物组合物，其特征在于，包含叶绿素衍生物，其中所述叶绿素衍生物具有权利要求2的定义。

7.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述叶绿素衍生物(如叶绿素提取物)的制备方法包括如下步骤：

(1)提取叶绿素；优选地，进一步对提取得到的提取物进行精制；

(2)皂化；优选地，进一步用有机溶剂洗涤皂化液；

(3)铁化；

(4)碱化。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，在步骤(1)中，优选取含有叶绿素和/或其衍生物的各种生物材料(优选蚕砂)，用有机溶剂或有机溶剂与水的混合物提取，回收有机溶剂后得叶绿素；

优选地，有机溶剂可以为丙酮、乙醇、石油醚、正己烷、汽油(如120号汽油)、甲苯或其中两种或多种的混合物；进一步优选地，有机溶剂为丙酮、乙醇或其混合物；

优选地，提取方法为回流、萃取、渗滤、微波或使用超微震动磨等；

优选地，通过用去离子水洗涤或者通过用大孔吸附树脂吸附进行精制。

9.根据权利要求7或8所述的用途，其特征在于，在步骤(2)中，优选将叶绿素用有机溶剂溶解，加入碱溶液使其皂化；其中，有机溶剂优选为汽油、丙酮或其混合物，汽油优选为120号汽油；碱溶液优选为NaOH水溶液或KOH水溶液，进一步优选地，碱溶液的浓度为25-35％。

10.根据权利要求7-9任一项所述的用途，其特征在于，在步骤(3)中，优选调节皂化液的pH值至2-4，析出沉淀，加入有机溶剂或有机溶剂与水的混合物使其溶解，再加入亚铁盐，加热至溶液呈深绿色为止，回收有机溶剂后得铁代产物；

优选地，有机溶剂可以为丙酮、乙醇或其混合物；

优选地，亚铁盐可以为硫酸亚铁、氯化亚铁或其混合物；

优选地，加热使溶液保持微沸；

在步骤(4)中，优选取铁代产物用去离子水洗至无游离铁离子，加入有机溶剂使其溶解，再加入碱进行碱化；

优选地，有机溶剂可以为丙酮、乙醇或其混合物；

优选地，所述碱可以是碱的水溶液或醇溶液，例如NaOH水溶液或NaOH乙醇溶液；

优选地，所述碱化进行至不再有沉淀产生为止；

优选地，碱的水溶液或醇溶液中，碱的质量百分比浓度可以为25-35％。