CN110066886A - 一种鉴定水稻品种的试剂、方法及应用 - Google Patents

一种鉴定水稻品种的试剂、方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110066886A
CN110066886A CN201910449220.5A CN201910449220A CN110066886A CN 110066886 A CN110066886 A CN 110066886A CN 201910449220 A CN201910449220 A CN 201910449220A CN 110066886 A CN110066886 A CN 110066886A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rice
loc
site
long
grained nonglutinous
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910449220.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110066886B (zh
Inventor
陈杰湖
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Ruike Gene Technology Co Ltd
Original Assignee
Guangzhou Ruike Gene Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Ruike Gene Technology Co Ltd filed Critical Guangzhou Ruike Gene Technology Co Ltd
Priority to CN201910449220.5A priority Critical patent/CN110066886B/zh
Publication of CN110066886A publication Critical patent/CN110066886A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110066886B publication Critical patent/CN110066886B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种鉴定水稻品种的试剂、方法及应用，涉及生物鉴别技术领域，检测目标水稻基因组上的LOC_Os02g51890.1SNP和/或LOC_Os09g38440.1SNP位点的基因型；若待测位点LOC_Os02g51890.1SNP为T，则为籼稻；若待测位点LOC_Os02g51890.1SNP为A，为粳稻；若待测位点LOC_Os09g38440.1SNP为G，则为籼稻；若待测位点LOC_Os09g38440.1SNP为C，则为粳稻。本发明提供了一种鉴定水稻品种的方法。使用该方法能快速准确的区分籼稻和粳稻，使用该方法仅仅通过电泳条带的数量就可以判断出水稻的稻型，极大简化了水稻种质资源区分的工序。还提供了一种检测水稻基因组目标位点基因型的试剂在鉴定水稻品种中的应用，通过该检测试剂能快速对籼稻和粳稻的分子标记进行扩增。

Description

一种鉴定水稻品种的试剂、方法及应用
技术领域
本发明涉及生物鉴别技术领域，具体而言，涉及一种鉴定水稻品种的试剂、方法及应用。
背景技术
“亚洲栽培稻”(Oryza sativa)是世界上最古老的农作物物种之一。亚洲栽培稻包括籼稻(Oryza saliva subsp Indica)和粳稻(Oryza saliva subsp Keng)两个主要亚种。经过长期的人工选育种植，现在已经培育出上千种籼稻和粳稻品种。籼稻和粳稻在形态、生理生化性状和品质上均产生较大的差异。籼稻适合于低纬度和低海拔的热带和亚热带环境，而粳稻更适合于高纬度和高海拔的寒冷环境。由于籼稻和粳稻的遗传分化，利用籼稻和粳稻进行有性杂交可以产生更多新的遗传重组类型。利用两个水稻品种的杂种优势，在杂交稻的培育中具有重要的价值。因此，水稻品种的鉴定尤为关键。现有技术中常常采用形态鉴定的方法，通过观察水稻的穗节长、稻壳色和叶毛等性状判断稻型。然而，这种方法受观测者的色差，环境，水稻种植时间等因素影响较大，极大阻碍了籼稻和粳稻的鉴定效率。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种鉴定水稻品种的方法。使用该方法能快速准确的区分籼稻和粳稻，使用该方法仅仅通过电泳条带的数量就可以判断出水稻的稻型，极大简化了水稻种质资源区分的工序。
本发明的第二目的在于提供一种检测水稻基因组目标位点基因型的试剂在鉴定水稻品种中的应用，通过该检测试剂能快速对籼稻和粳稻的分子标记进行扩增。
本发明的第三目的在于提供一种检测水稻基因组目标位点基因型的试剂在制备鉴定水稻品种试剂盒中的应用，通过该试剂盒极大方便了水稻品种的鉴定，该试剂盒应用范围广泛，特异性高，成本低。
本发明是这样实现的：
一种鉴定水稻品种的方法，包括：检测目标水稻基因组上的LOC_Os02g51890.1SNP和/或LOC_Os09g38440.1SNP位点的基因型；若待测位点LOC_Os02g51890.1SNP为T，则为籼稻；若待测位点LOC_Os02g51890.1SNP为A，为粳稻；若待测位点LOC_Os09g38440.1SNP为G，则为籼稻；若待测位点LOC_Os09g38440.1SNP为C，则为粳稻。
本发明提供的鉴定水稻品种的方法，可以鉴定籼稻中如下品种：
粳稻中的如下品种：
在本发明较佳的实施例中，使用第一引物对扩增覆盖LOC_Os02g51890.1SNP位点的第一片段，使用第二引物对扩增覆盖LOC_Os09g38440.1SNP位点的第二片段。
在本发明较佳的实施例中，上述第一引物对序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示，第二引物对序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。
正向引物：5’-TAAGTTTCACAGTTGGCGTTCA-3’(SEQ ID NO：5)；
反向引物：5’-CGGAGACTGGCGGAGCTGATTG-3’(SEQ ID NO：6)。
正向引物：5’-TGAAGATGCCTGTAGTGGGAGTG-3’(SEQ ID NO：7)；
反向引物：5’-TATGTTATGGCTGTCCTTGTCC-3’(SEQ ID NO：8)。
在本发明较佳的实施例中，将第一片段使用PstⅠ酶切后电泳和/或将第二片段使用PstⅠ酶切后电泳，若酶切后的电泳图显示一条电泳条带，则该水稻样品为籼稻，若酶切后的电泳图显示两条电泳条带，则该水稻样品为粳稻。
LOC_Os02g51890.1SNP位于水稻2号染色体上，其在籼稻和粳稻中的467bp处存在一个T←→A的SNP位点差异。粳稻在该SNP位点的旁邻序列具有限制性内切酶PstⅠ的酶切识别位点：CTGCAG。籼稻在该酶切识别位点存在一个碱基的突变：CAGCAG，导致限制性内切酶PstⅠ无法对该序列进行特异性识别，酶切。因此，在PstⅠ酶切识别PCR片段后，粳稻片段被酶切为470bp和270bp两条DNA片段，而籼稻仍保持737bp大小的DNA片段。因此，LOC_Os02g51890.1SNP可用于鉴别水稻的品种。LOC_Os02g51890.1为RNA结合蛋白基因。
LOC_Os09g38440.1SNP位于水稻9号染色体上，其在籼稻和粳稻的197bp处存在一个G←→C的SNP位点差异。粳稻在该SNP位点的旁邻序列具有限制性内切酶PstⅠ的酶切识别位点：CTGCAG。籼稻在该酶切识别位点存在一个碱基的突变：CTCCAG，导致限制性内切酶PstⅠ无法对该序列进行特异性识别，酶切。因此，在PstⅠ酶切识别PCR片段后，粳稻片段被酶切为199bp和343bp两条DNA片段，而籼稻仍保持537bp大小的DNA片段。因此，LOC_Os09g38440.1SNP可用于鉴别水稻的品种。LOC_Os09g38440.1为ATXR赖氨酸甲基转移酶基因。
一种鉴定水稻品种的方法，包括如下依次进行的步骤：
(1)提取水稻样品基因组DNA；
(2)使用的检测引物对步骤(1)中的基因组DNA进行PCR扩增；
(3)取步骤(2)中的PCR产物用PstⅠ酶切后电泳；
(4)电泳结果鉴定：若步骤(3)酶切后的电泳图显示一条电泳条带，则该水稻样品为籼稻；若步骤(3)酶切后的电泳图显示两条电泳条带，则该水稻样品为粳稻。
在本发明较佳的实施例中，上述PCR反应体系包括如下组分2×PCR Mix：5-250μL，DNA模板25-500ng，10nmol/L PCR引物各2-6μL，用水补充至10-500μL。
在本发明较佳的实施例中，上述PCR反应的程序包括94-105℃预变性0.5-5min，94-96℃变性30s，50-58℃退火30s，70-72℃延伸20-40s，设置循环次数为30-35；最后70-72℃延伸2-10min；
优选地，PCR反应程序的退火温度为56℃，循环次数为35次。
在本发明较佳的实施例中，对目标水稻基因组上的LOC_Os02g51890.1SNP和/或LOC_Os09g38440.1SNP进行测序，若测序后的核苷酸序列与SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：3所示的序列一致，则为籼稻，若测序后的核苷酸序列与SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：4所示的序列一致，则为粳稻。
检测水稻基因组目标位点基因型的试剂在鉴定水稻品种中的应用，目标位点包括LOC_Os02g51890.1SNP和/或LOC_Os09g38440.1位点，若待测位点LOC_Os02g51890.1SNP为T，则为籼稻；若待测位点LOC_Os02g51890.1SNP为A，为粳稻；若待测位点LOC_Os09g38440.1SNP为G，则为籼稻；若待测位点LOC_Os09g38440.1SNP为C，为粳稻。
在本发明较佳的实施例中，上述检测水稻基因组目标位点基因型的试剂为检测引物，通过检测引物扩增得到核苷酸片段。
在本发明较佳的实施例中，将核苷酸片段使用PstⅠ酶切后电泳，若酶切后的电泳图显示一条电泳条带，则该水稻样品为籼稻，若酶切后的电泳图显示两条电泳条带，则该水稻样品为粳稻。
在本发明较佳的实施例中，上述鉴定水稻品种的方法在鉴定水稻籼稻和粳稻亲本纯度检测中的应用以及在水稻群体遗传中的应用。
检测水稻基因组目标位点基因型的试剂在制备鉴定水稻品种试剂盒中的应用，检测水稻基因组目标位点基因型的试剂为检测引物。
一种鉴定水稻品种的试剂盒，试剂盒包括检测水稻基因组目标位点基因型的试剂，目标位点包括LOC_Os02g51890.1SNP和/或LOC_Os09g38440.1位点，若待测位点LOC_Os02g51890.1SNP为T，则为籼稻；若待测位点LOC_Os02g51890.1SNP为A，为粳稻；若待测位点LOC_Os09g38440.1SNP为G，则为籼稻；若待测位点LOC_Os09g38440.1SNP为C，为粳稻。
在本发明较佳的实施例中，上述试剂为检测引物，使用第一引物对扩增覆盖LOC_Os02g51890.1SNP位点的第一片段，使用第二引物对扩增覆盖LOC_Os09g38440.1SNP位点的第二片段。
本发明的有益效果包括：本发明提供了一种鉴定水稻品种的方法。使用该方法能快速准确的区分籼稻和粳稻，使用该方法仅仅通过电泳条带的数量就可以判断出水稻的稻型，极大简化了水稻种质资源区分的工序。本发明还提供了一种检测水稻基因组目标位点基因型的试剂在鉴定水稻品种中的应用，通过该检测试剂能快速对籼稻和粳稻的分子标记进行扩增。本发明还提供了一种检测水稻基因组目标位点基因型的试剂在制备鉴定水稻品种试剂盒中的应用，通过该试剂盒极大方便了水稻品种的鉴定，该试剂盒应用范围广泛，特异性高，成本低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为LOC_Os02g51890.1SNP经过PCR(上)和酶切后(下)电泳图(从左至右分别为籼稻：镇籼232，成农水晶，黄丝桂占，小红谷，香谷，二钢矮，红粳旱谷，毫荒腊；粳稻：冷水糯，半节芒，拉木加，三穗锦，木樨球，早熟农虎6，蒙古稻，武育粳20号)；
图2为LOC_Os09g38440.1SNP经过PCR(上)和酶切后(下)电泳图(从左至右分别为籼稻：镇籼232，成农水晶，黄丝桂占，小红谷，香谷，二钢矮，红粳旱谷，毫荒腊；粳稻：冷水糯，半节芒，拉木加，三穗锦，木樨球，早熟农虎6，蒙古稻，武育粳20号)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
在前期研究发现，水稻中存在着一种分子标记LOC_Os02g51890.1SNP，其在粳稻中的序列如SEQ ID NO：1所示，在籼稻中的序列如SEQ ID NO：2所示，均为737bp。
进一步地，LOC_Os02g51890.1SNP在467bp处，存在一个T←→A的SNP位点差异。
进一步地，分析粳稻和籼稻的LOC_Os02g51890.1SNP，发现粳稻在该SNP位点旁邻序列具有限制性内切酶PstI酶切识别位点：CTGCAG；而籼稻在该酶切识别位点的SNP突变CAGCAG，造成无法被限制性内切酶PstI酶切识别。
进一步地，在粳稻和籼稻的LOC_Os02g51890.1SNP上不存在其他相同的酶切识别位点，因此，可以利用分子标记鉴定籼稻和粳稻。
进一步地，用PstI酶切分子标记LOC_Os02g51890.1SNP后，粳稻品种会被酶切为470bp和272bp大小的两条DNA片段，而籼稻仍保持737bp大小的DNA片段，由此即实现籼稻和粳稻品种的鉴定。
水稻中还存在着另一种分子标记LOC_Os09g38440.1SNP，该SNP的全长为537bp。其在粳稻中的序列如SEQ ID NO：3所示，在籼稻中的序列如SEQ ID NO：4所示。
进一步地，在LOC_Os09g38440.1SNP的197bp处，存在一个G←→C的SNP位点差异。
进一步地，分析粳稻和籼稻的LOC_Os09g38440.1SNP，发现粳稻在该SNP位点旁邻序列具有限制性内切酶PstI酶切识别位点：CTGCAG；而籼稻在该酶切识别位点的SNP突变CTCCAG，造成无法被限制性内切酶PstI酶切识别。
进一步地，在粳稻和籼稻的LOC_Os09g38440.1SNP上不存在其他相同的酶切识别位点，因此，可以利用分子标记鉴定籼稻和粳稻。
进一步地，PstI酶切分子标记LOC_Os09g38440.1SNP，粳稻品种会被酶切为199bp和343bp大小的两条DNA片段，而籼稻仍保持537bp大小的DNA片段，由此来鉴定水稻的籼稻和粳稻品种。
进一步地，PCR扩增引物如下所示：
上游引物：5’-TAAGTTTCACAGTTGGCGTTCA-3’(SEQ ID NO：5)；
下游引物：5’-CGGAGACTGGCGGAGCTGATTG-3’(SEQ ID NO：6)。
上游引物：5’-TGAAGATGCCTGTAGTGGGAGTG-3’(SEQ ID NO：7)；
下游引物：5’-TATGTTATGGCTGTCCTTGTCC-3’(SEQ ID NO：8)。
PCR反应体系为2×PCR Mix50μL，10nmol/L PCR引物各4μL，DNA模板0.2μg，用水补充至100μL。
PCR反应程序为94℃预变性2min；94℃30sec，56℃30sec，72℃40sec，共35个循环；72℃延伸7min。
实施例2
试验样品：籼稻：镇籼232，成农水晶，黄丝桂占，小红谷，香谷，二钢矮，红粳旱谷，毫荒腊；粳稻：冷水糯，半节芒，拉木加，三穗锦，木樨球，早熟农虎6，蒙古稻，武育粳20号。
鉴定籼稻和粳稻的分子标记方法包括如下依次进行的步骤：
1.提取水稻样品基因组DNA
本实施例采用植物基因组DNA提取试剂盒(CWBio，cat：CW0553M)进行水稻基因组DNA提取。
具体操作方法包括：
(1)取水稻叶片约0.1g，放入预冷的研钵中，加入液氮，将叶片研磨成粉末后，放入2mL离心管中，加入700μL Buffer GP1，混匀，65℃水浴20min；
(2)向离心管中加入10ul RNase A溶液，振荡混匀，室温孵育10min；
(3)再在步骤(2)离心管加入700μL Buffer GP2，振荡混匀；
(4)转移步骤(3)离心管溶液至装有吸附柱的收集管中，10000rpm条件下离心1min，因吸附柱容积有限，需分成两次进行转移和离心，每次离心后弃去收集管中的废液；
(5)向弃去废液的收集管中加入500μL Buffer GW1(使用前确认已加乙醇)，10000rpm条件下离心1min；弃去收集管中的废液；
(6)向收集管中加入500μL Buffer GW2(使用前确认已加乙醇)，10000rpm条件下离心1min；弃去收集管中的废液；
(7)再加入500μL Buffer GW2(使用前确认已加乙醇)，12000rpm条件下离心2min；
(8)将步骤(7)的吸附柱转移至一个新的1.5mL离心管上，室温下开盖干燥5min；
(9)干燥完成后，向每个吸附柱中悬空加入100μL Buffer GE；室温孵育10min后10000rpm离心1min，所获得的溶液即为水稻基因组DNA；
(10)水稻基因组DNA样品-20℃保存备用。
2.PCR扩增反应
以实施例1的分子标记引物分别对上述水稻基因组DNA样品进行扩增；
PCR扩增反应体系为：10nmol/L PCR引物各4μL，2×PCR Mix：50μL，DNA模板0.2μg，用水补充至100μL。
PCR扩增反应在DNA扩增仪上进行，PCR反应程序为94℃预变性2min；94℃30s，56℃30s，72℃40s，共35个循环；72℃延伸7min。得到水稻样品的PCR产物，并将产物进行电泳验证，电泳图谱参照图1(上图)和图2(上图)所示。
由图1和图2可得，对16个不同水稻材料基因组DNA进行PCR扩增，均能扩增出非常清晰的单一条带，并且相同分子标记的16个条带大小相同，经3次重复，结果稳定一致。
经过正反序列测定，分子标记LOC_Os02g51890.1SNP的16个PCR产物长度均为737bp；分子标记LOC_Os09g38440.1SNP的16个PCR产物长度均为537bp；并且，PCR扩增所用的引物全部在两端被正确测出。其中，分子标记LOC_Os02g51890.1SNP的籼稻品种序列均如SEQ ID NO：1所示，粳稻序列均如SEQ ID NO：2所示；分子标记LOC_Os09g38440.1SNP的籼稻品种序列均如SEQ ID NO：3所示，粳稻序列均如SEQ ID NO：4所示。
3.酶切
对上述水稻样本的PCR扩增产物使用PstI酶进行酶切。
PstI酶切反应体系为：2μL10×buffer H，1μL PstI，2μL PCR产物，用水补至20μL。
PstI酶切反应在DNA扩增仪上进行，酶切反应条件为：37℃反应1h。
酶切完成后，在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳30min(5V/cm)，溴化乙锭(EtBr)染色，用凝胶成像系统观察并拍照记录，电泳图谱参照图1和图2所示。
由图1(下图)和图2(下图)可得，经PstI酶切后，分子标记LOC_Os02g51890.1SNP的粳稻片段被酶切为470bp和272bp大小的两条DNA片段，而籼稻仍保持737bp大小的DNA片段；分子标记LOC_Os09g38440.1SNP的粳稻片段被酶切为199bp和343bp大小的两条DNA片段，而籼稻仍保持537bp大小的DNA片段(如图2所示)。即经过酶切，籼稻均可以被酶切为两条不同大小的条带，而粳稻保持原有的条带大小。
本发明的有益效果包括：本发明提供了一种鉴定水稻品种的方法。使用该方法能快速准确的区分籼稻和粳稻，使用该方法仅仅通过电泳条带的数量就可以判断出水稻的稻型，极大简化了水稻种质资源区分的工序。本发明还提供了一种检测水稻基因组目标位点基因型的试剂在鉴定水稻品种中的应用，通过该检测试剂能快速对籼稻和粳稻的分子标记进行扩增。
本发明还提供了一种检测水稻基因组目标位点基因型的试剂在制备鉴定水稻品种试剂盒中的应用，通过该试剂盒极大方便了水稻品种的鉴定，该试剂盒应用范围广泛，特异性高，成本低。该试剂盒可以用于ELISA检测鉴定水稻的品种。
以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州瑞科基因科技有限公司
<120> 一种鉴定水稻品种的试剂、方法及应用
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 737
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
taagtttcac agttggcgtt catgttctga aactctgaac tcacaacagc taaagttgtg 60
tcctgcacct caaaagcttg aatactctaa catttagtag tattgattat ctgcacatat 120
tttctataca ccagagcact aagttatagt aatagacatc agcacaagta ctatcatctt 180
atttttccca tctaacaata tatactggaa gtatctagag tctgaatcat cttattttcc 240
atgtgtcaat atgtgctgaa actatccaat gtctgaactc ctcagcatgc cgtgtacaat 300
tcacaagcgc tacagcatta ctaccctcag ctgtatggtc caacatcccc ttcaacaccg 360
tcgtaccagt ttatggggta catgccgggt gccctgggtc caagggctgg cttctctccg 420
atgcagcaac aagctccacg gccacctttc attcagcagc ctgcgcagca gttcgacggg 480
ggctctttcc ctccaggacc ttctctccca ccggatttca gactccagtt gccccctcat 540
gcactctcaa ggcaaccaga tgaaacaacc ggtatgtcat tgttagccta ccattcagat 600
atctattact gtcatttaga aacatagtac gttcttgtca cagttgacat catttagaaa 660
caacaccatc gtgacaaatt tatgcctgac tactgctgaa tatgttgcag gtgctcaatc 720
agctccgcca gtctccg 737
<210> 2
<211> 737
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
taagtttcac agttggcgtt catgttctga aactctgaac tcacaacagc taaagttgtg 60
tcctgcacct caaaagcttg aatactctaa catttagtag tattgattat ctgcacatat 120
tttctataca ccagagcact aagttatagt aatagacatc agcacaagta ctatcatctt 180
atttttccca tctaacaata tatactggaa gtatctagag tctgaatcat cttattttcc 240
atgtgtcaat atgtgctgaa actatccaat gtctgaactc ctcagcatgc cgtgtacaat 300
tcacaagcgc tacagcatta ctaccctcag ctgtatggtc caacatcccc ttcaacaccg 360
tcgtaccagt ttatggggta catgccgggt gccctgggtc caagggctgg cttctctccg 420
atgcagcaac aagctccacg gccacctttc attcagcagc ctgcgctgca gttcgacggg 480
ggctctttcc ctccaggacc ttctctccca ccggatttca gactccagtt gccccctcat 540
gcactctcaa ggcaaccaga tgaaacaacc ggtatgtcat tgttagccta ccattcagat 600
atctattact gtcatttaga aacatagtac gttcttgtca cagttgacat catttagaaa 660
caacaccatc gtgacaaatt tatgcctgac tactgctgaa tatgttgcag gtgctcaatc 720
agctccgcca gtctccg 737
<210> 3
<211> 537
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgaagatgcc tgtagtggga gtgccagtat tgattctagt ttgattgcta caggaataac 60
taatgataat cggaaatctc ccaaaattgt tccactcaat ctgattctta aaaaggctaa 120
gagatgtcat gctatcaaac ccctcagtaa gacagaaaat atccattttt ctgaggaaaa 180
gagttcagat ggttctccag ataaatcttc ctctggtgac agaagtttca gtccacaaga 240
tgaactgtgg tctcccaaaa agaataggta ttcatctaat gtctcgaggc cacacgtcaa 300
gactgactgc caaagtccct gctgtggtat aattctgaaa actgcattac agatagtatc 360
aacatatagc taagtaactt acagtgttcc ttttagaaaa atggaattga caaaagaatc 420
tttctttttc agtacttgaa gaagatgagc ctcttagcct tgcagatatg gggacaagtc 480
agctgtcagc atcaagaagt agaggtagga gtctaggaca aggacagcca taacata 537
<210> 4
<211> 537
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgaagatgcc tgtagtggga gtgccagtat tgattctagt ttgattgcta caggaataac 60
taatgataat cggaaatctc ccaaaattgt tccactcaat ctgattctta aaaaggctaa 120
gagatgtcat gctatcaaac ccctcagtaa gacagaaaat atccattttt ctgaggaaaa 180
gagttcagat ggttctgcag ataaatcttc ctctggtgac agaagtttca gtccacaaga 240
tgaactgtgg tctcccaaaa agaataggta ttcatctaat gtctcgaggc cacacgtcaa 300
gactgactgc caaagtccct gctgtggtat aattctgaaa actgcattac agatagtatc 360
aacatatagc taagtaactt acagtgttcc ttttagaaaa atggaattga caaaagaatc 420
tttctttttc agtacttgaa gaagatgagc ctcttagcct tgcagatatg gggacaagtc 480
agctgtcagc atcaagaagt agaggtagga gtctaggaca aggacagcca taacata 537
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
taagtttcac agttggcgtt ca 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cggagactgg cggagctgat tg 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgaagatgcc tgtagtggga gtg 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tatgttatgg ctgtccttgt cc 22

Claims (11)

1.一种鉴定水稻品种的方法，其特征在于，包括：检测目标水稻基因组上的LOC_Os02g51890.1SNP和/或LOC_Os09g38440.1SNP位点的基因型；若待测位点LOC_Os02g51890.1SNP为T，则为籼稻；若待测位点LOC_Os02g51890.1SNP为A，为粳稻；若待测位点LOC_Os09g38440.1SNP为G，则为籼稻；若待测位点LOC_Os09g38440.1SNP为C，则为粳稻。
2.根据权利要求1所述的鉴定水稻品种的方法，其特征在于，使用第一引物对扩增覆盖LOC_Os02g51890.1SNP位点的第一片段，使用第二引物对扩增覆盖LOC_Os09g38440.1SNP位点的第二片段。
3.根据权利要求2所述的鉴定水稻品种的方法，其特征在于，所述第一引物对序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示，所述第二引物对序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。
4.根据权利要求2所述的鉴定水稻品种的方法，其特征在于，将第一片段使用PstⅠ酶切后电泳和/或将第二片段使用PstⅠ酶切后电泳，若酶切后的电泳图显示一条电泳条带，则该水稻样品为籼稻，若酶切后的电泳图显示两条电泳条带，则该水稻样品为粳稻。
5.根据权利要求1所述的鉴定水稻品种的方法，其特征在于，对目标水稻基因组上的LOC_Os02g51890.1SNP和/或LOC_Os09g38440.1SNP进行测序，若测序后的核苷酸序列与SEQID NO：1和/或SEQ ID NO：3所示的序列一致，则为籼稻，若测序后的核苷酸序列与SEQ IDNO：2和/或SEQ ID NO：4所示的序列一致，则为粳稻。
6.检测水稻基因组目标位点基因型的试剂在鉴定水稻品种中的应用，其特征在于，所述目标位点包括LOC_Os02g51890.1SNP和/或LOC_Os09g38440.1位点，若待测位点LOC_Os02g51890.1SNP为T，则为籼稻；若待测位点LOC_Os02g51890.1SNP为A，为粳稻；若待测位点LOC_Os09g38440.1SNP为G，则为籼稻；若待测位点LOC_Os09g38440.1SNP为C，为粳稻。
7.根据权利要求6所述的检测水稻基因组目标位点基因型的试剂在鉴定水稻品种中的应用，其特征在于，所述检测水稻基因组目标位点基因型的试剂为检测引物，通过检测引物扩增得到核苷酸片段。
8.根据权利要求7所述的检测水稻基因组目标位点基因型的试剂在鉴定水稻品种中的应用，其特征在于，将所述核苷酸片段使用PstⅠ酶切后电泳，若酶切后的电泳图显示一条电泳条带，则该水稻样品为籼稻，若酶切后的电泳图显示两条电泳条带，则该水稻样品为粳稻。
9.检测水稻基因组目标位点基因型的试剂在制备鉴定水稻品种试剂盒中的应用，其特征在于，所述检测水稻基因组目标位点基因型的试剂如权利要求7所述的检测引物。
10.一种鉴定水稻品种的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测水稻基因组目标位点基因型的试剂，所述目标位点包括LOC_Os02g51890.1SNP和/或LOC_Os09g38440.1位点，若待测位点LOC_Os02g51890.1SNP为T，则为籼稻；若待测位点LOC_Os02g51890.1SNP为A，为粳稻；若待测位点LOC_Os09g38440.1SNP为G，则为籼稻；若待测位点LOC_Os09g38440.1SNP为C，为粳稻。
11.根据权利要求10所述的鉴定水稻品种的试剂盒，其特征在于，所述试剂为检测引物，使用第一引物对扩增覆盖LOC_Os02g51890.1SNP位点的第一片段，使用第二引物对扩增覆盖LOC_Os09g38440.1SNP位点的第二片段。
CN201910449220.5A 2019-05-28 2019-05-28 一种鉴定水稻品种的试剂、方法及应用 Active CN110066886B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910449220.5A CN110066886B (zh) 2019-05-28 2019-05-28 一种鉴定水稻品种的试剂、方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910449220.5A CN110066886B (zh) 2019-05-28 2019-05-28 一种鉴定水稻品种的试剂、方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110066886A true CN110066886A (zh) 2019-07-30
CN110066886B CN110066886B (zh) 2023-07-11

Family

ID=67371659

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910449220.5A Active CN110066886B (zh) 2019-05-28 2019-05-28 一种鉴定水稻品种的试剂、方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110066886B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110527736A (zh) * 2019-08-19 2019-12-03 中国农业科学院作物科学研究所 用于水稻种质资源和品种鉴定的snp标记组合及其应用
CN112725510A (zh) * 2021-02-03 2021-04-30 中国水稻研究所 一套用于水稻品种籼粳鉴定的snp标记、引物组、试剂盒及应用
CN113322347A (zh) * 2021-07-15 2021-08-31 上海市农业科学院 一种水稻巨胚等位基因、其分子标记及应用
CN113930538A (zh) * 2021-11-02 2022-01-14 华南农业大学 一种用于鉴定水稻适种区域的试剂盒及其预测方法和预测模型的构建

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107475426A (zh) * 2017-09-25 2017-12-15 山东省水稻研究所 一种鉴别栽培稻品种籼粳稻类型的分子标记及应用
CN107630103A (zh) * 2017-10-13 2018-01-26 华南农业大学 一种鉴定水稻品种的caps分子标记方法及应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107475426A (zh) * 2017-09-25 2017-12-15 山东省水稻研究所 一种鉴别栽培稻品种籼粳稻类型的分子标记及应用
CN107630103A (zh) * 2017-10-13 2018-01-26 华南农业大学 一种鉴定水稻品种的caps分子标记方法及应用

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110527736A (zh) * 2019-08-19 2019-12-03 中国农业科学院作物科学研究所 用于水稻种质资源和品种鉴定的snp标记组合及其应用
CN112725510A (zh) * 2021-02-03 2021-04-30 中国水稻研究所 一套用于水稻品种籼粳鉴定的snp标记、引物组、试剂盒及应用
CN113322347A (zh) * 2021-07-15 2021-08-31 上海市农业科学院 一种水稻巨胚等位基因、其分子标记及应用
CN113930538A (zh) * 2021-11-02 2022-01-14 华南农业大学 一种用于鉴定水稻适种区域的试剂盒及其预测方法和预测模型的构建
CN113930538B (zh) * 2021-11-02 2024-01-23 华南农业大学 一种用于鉴定水稻适种区域的试剂盒及其预测方法和预测模型的构建

Also Published As

Publication number Publication date
CN110066886B (zh) 2023-07-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110066886A (zh) 一种鉴定水稻品种的试剂、方法及应用
CN106480228B (zh) 水稻镉低积累基因OsHMA3的SNP分子标记及其应用
CN109628627B (zh) 水稻广谱抗稻瘟病基因Pigm的SNP标记开发和应用
CN111235302B (zh) 一种鉴定小白菜品种真实性的方法及其专用ssr引物组合
CN109517925A (zh) 亚麻ssr分子标记及其应用
CN107630103A (zh) 一种鉴定水稻品种的caps分子标记方法及应用
CN106755368A (zh) 一种辅助鉴定大豆百粒重性状的分子标记hnusoy05及其应用
CN109628628A (zh) 水稻抗稻瘟病基因Pi2的SNP标记的开发和应用
CN108486265A (zh) 基于kasp技术的玉米雄性不育胞质类型的鉴定方法
CN109628629A (zh) 水稻抗白叶枯基因xa5的SNP标记开发和应用
KR100919753B1 (ko) 메론 및 참외에서 유용한 흰가루병 저항성 연관 ｓｃａｒ마커 및 이를 이용한 저항성 참외 품종 선발방법
CN117210606B (zh) 芒果细菌性角斑病抗性基因的kasp标记及应用
CN108220473B (zh) 利用叶绿体InDel标记鉴别玉米S型胞质不育材料
CN109735648A (zh) 一种筛选不同千粒重小麦的方法及其专用试剂盒
Shirasawa et al. Conversion of AFLP markers to sequence-specific markers for closely related lines in rice by use of the rice genome sequence
CN111378781A (zh) 一种快速高效鉴别水稻耐盐基因skc1的分子标记引物及应用
Saunders et al. USDA DNA fingerprinting programme for identification of Theobroma cacao accessions
CN113355451B (zh) 基于caps分子标记的油菜菌核病抗性鉴定的方法及引物和试剂盒
CN111826462B (zh) 与西伯利亚杏开花期早晚相关的标记及其检测引物、方法与应用
CN110923304B (zh) 一种用于鉴别银杏性别的分子标记、引物对和方法
CN109735646A (zh) 一种鉴定水稻品种的caps分子标记和方法及其应用
CN109628632A (zh) 一种用于转基因玉米mon87419品系特异性检测的引物组合、探针、试剂盒及方法
KR101736670B1 (ko) 호접란 품종 식별을 위한 프라이머 세트 및 이를 포함하는 마커용 조성물
CN111485031A (zh) 水稻分子标记dof8及其应用、一种利用水稻分子标记dof8鉴别粳稻和籼稻的方法
CN108486263A (zh) 利用叶绿体标记鉴别玉米雄性不育t型胞质类型

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant