CN110007040A - 一种关节腔内外源kgn含量测定方法 - Google Patents

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陈海敏
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Abstract

本发明公开了一种关节腔内外源KGN含量测定方法，其包括如下步骤，步骤S1：KGN标准储备液的制备，步骤S2：关节取样，步骤S3：标准曲线梯度溶液制备，步骤S4：标准曲线测定和KGN用药模型关节腔中KGN含量测定，利用KGN标品与KGN未用药模型的关节滑液或关节软骨组织的研磨液配合成标准曲线的梯度溶液在HPLC系统来制作标准曲线，其中标准曲线以峰面积为横坐标，浓度为纵坐标，再在同条件下利用HPLC系统测量KGN用药模型的关节滑液或是关节软骨组织中的KGN的所得的峰面积，然后根据其峰面积对应所述标准曲线的纵坐标即为其KGN含量，同时该测量方法简便、快捷、省时、低成本、准确度高且专属性好。

Description

一种关节腔内外源KGN含量测定方法
技术领域
本发明涉及KGN含量测定的方法，尤其涉及一种KGN用药模型关节腔内外源KGN含量测定的方法。
背景技术
Kartogenin(KGN)是最近几年发现的一种人工合成的小分子杂环化合物，能够诱导内源性间充质干细胞(MSCs)分化成软骨细胞，起初是在骨关节炎软骨修复研究中被发现的。KGN的IUPAC命名为2-[((1,1'-Biphenyl)-4-ylamino)carbonyl]benzoic acid，分子式为C20H15NO3·1/4 H2O，溶于DMSO，性状为灰白色固体，无嗅或近乎无嗅，在《中华人民共和国药典》上尚未见收载。由于骨关节缺乏明显的软骨血管组织，关节滑液和关节软骨组织中的药物一般通过淋巴循环进入体内，KGN的给药方式主要为关节腔内注射给药。目前，KGN与靶向纳米材料的结合应用广泛，靶向纳米载体可以延长KGN在关节腔内的滞留时间，研究其滞留时间则需要检测KGN在不同时间点残存于关节腔内的含量。但目前关于KGN在关节滑液和关节软骨内含量的检测方法尚未见相关文献报道。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种利用HPLC准确测量KGN用药后关节处KGN含量的方法。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：一种关节腔内外源KGN含量测定方法，其包括如下步骤，
步骤S1：KGN标准储备液的制备，在常温下称取KGN标准品，并用适量DMSO溶剂完全溶解后加纯水稀释定容至浓度为1mg/mL，所得溶液即为KGN标准储备液；
步骤S2：关节取样，分别取KGN用药模型和KGN未用药模型的关节滑液作为关节样品液或分别取KGN用药模型和KGN未用药模型的关节软骨组织并加入的生理盐水后充分研磨后得到溶液作为关节样品液，其中，所述关节软骨组织与所述生理盐水的质量体积比为20mg/mL；
步骤S3：标准曲线梯度溶液制备，分别量取多份由步骤S1所得KGN储备液，并分别加纯水稀释定容得到不同浓度的标准工作液，再将多份标准工作液分别加入四倍体积如步骤S2所得KGN未用药模型的关节样品液进行稀释，稀释后充分混匀得到多份标准工作液浓度梯度稀释液；
步骤S4：标准曲线测定和KGN用药模型关节腔中KGN含量测定，分别将步骤S2中所得KGN用药模型的关节样品液和步骤S3中所得多份标准工作液浓度梯度稀释液取相同体积后并分别加入等体积的浓度为0.1mol/L的NaOH甲醇溶液后得测定液，再向所述测定液中加入四倍体积的乙腈，混匀后离心，将所得上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后分别经HPLC进行分析，将多个标准工作液浓度梯度稀释液所测得结果制作标准曲线，将KGN用药模型的关节样品液所测得的结果与标准曲线进行比对得到对应KGN用药模型关节腔内KGN含量。
上述技术方案中所述步骤S1中KGN标准品与DMSO溶剂的质量体积比为3-10mg/mL。
上述技术方案中所述步骤S2中KGN用药模型和KGN未用药模型均为人或大白鼠。
上述技术方案中所述步骤S4中离心条件为3800-4200r/min，离心时间为5-15min。
上述技术方案中所述步骤S4中HPLC的色谱条件为：色谱柱为ZORBAX300SB-C18column 4.6mm×250mm；其中，流动相A为含有0.1％H3PO4的超纯水，流动相B为乙腈；流动相流速为1mL/min；检测波长为280nm；进样体积为10μL；柱温为30℃。
上述技术方案中所述步骤S4中HPLC的梯度洗脱条件：0-15min，A相在0-3.5min为10％，在3.5-8min为95％，在8-10min为95％逐渐减小到10％，10-15min为10％，运行至梯度洗脱结束。
上述技术方案的有益效果在于，利用KGN标品与KGN未用药模型的关节滑液或关节软骨组织的研磨液配合成标准曲线的梯度溶液在HPLC系统来制作标准曲线，其中标准曲线以峰面积为横坐标，浓度为纵坐标，再在同条件下利用HPLC系统测量KGN用药模型的关节滑液或是关节软骨组织中的KGN的所得的峰面积，然后根据其峰面积对应所述标准曲线的纵坐标即为其KGN含量，同时该测量方法简便、快捷、省时、低成本、准确度高且专属性好。
附图说明
图1为本实施例大鼠关节滑液中KGN的标准曲线(浓度ug/mL)；
图2为大鼠关节软骨组织研磨液中KGN的标准曲线(浓度ug/mL)；
图3为人关节滑液中KGN的标准曲线(浓度ug/mL)。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本实施例中所使用的KGN标准品购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其生产批号为1802066，其高效液相色谱(HPLC)测定纯度≥98％，十二只SD成年雄性大鼠：体重约160-200g，由广西医科大学动物实验中心提供(实验动物通过伦理委员会审核)，而人的关节滑液由广西医科大学第一附属医院提供。
1、标准储备液的配置
精密称取10mg KGN标准，置于10mL容量瓶中，加入1-3mL DMSO溶解，优选的为1mL，并用纯水稀释到刻度，摇匀，即得浓度为1mg/mL的标准储备液。而KGN在DMSO中具有良好的溶解性，但为了不影响HPLC的灵敏性故DMSO的用量不能过多，避免对实验动物和HPLC设备造成损害。
2、动物模型构建
将十二只SD成年雄性大鼠随机等分为两组，其中一组为KGN用药模型，另一组为KGN未用药模型，同时精密量取KGN储备液，加超纯水或生理盐水配成KGN浓度为317μg/mL的注射液，其中，KGN用药模型对应的六只SD成年雄性大鼠关节腔注射上述注射液200μL，并将随机其等分为两组，其中一组在注射后0.5h用3％戊巴比妥麻醉，用200μL生理盐水回抽关节滑液，吸出50μL关节滑液，并取其关节软骨组织10mg，另一组在注射后6h用3％戊巴比妥麻醉，用200μL生理盐水回抽关节滑液，分别吸出50μL关节滑液留存备用，并分别取其关节软骨组织10mg；而KGN未用药模型组的六只SD成年雄性大鼠直接用3％戊巴比妥麻醉，用200μL生理盐水回抽关节滑液，分别吸出50μL关节滑液，并分别取其关节软骨组织10mg，再将六只SD成年雄性大鼠的关节滑液充分混合后备用。
3、软骨组织预处理
将KGN用药模型组六只SD成年雄性大鼠10mg关节软骨组织分别加500μL生理盐水，用样品快速研磨仪研磨5min，然后置于超声波处理器破碎关节软骨组织，并分别精密吸取待研磨液样品50μL作为KGN用药模型组每只SD成年雄性大鼠关节样品液；
将KGN未用药模型组六只SD成年雄性大鼠10mg关节软骨组织混合分别加3mL生理盐水，用样品快速研磨仪研磨5min，然后置于超声波处理器破碎关节软骨组织得到KGN未用药模型关节样品液；
4、标准曲线的制定
4.1标准工作液浓度梯度溶液制备
精密量取KGN储备液七份，稀释成15，25，50，100，250，500，1000μg/mL的标准工作液，上述系列标准液中每个标准液取甲乙两份，每份均为10μL，其中甲份对应的七个梯度标准液中分别加入KGN未用药模型混合后的关节滑液40μL得到标准工作液浓度梯度稀释液,而乙份对应的七个梯度标准液中分别加入KGN未用药模型混合后关节样品液标准工作液浓度梯度稀释液；将甲乙两组标准工作液浓度梯度稀释液中每个浓度梯队对应的稀释液分别置于离心管，涡旋混匀3min，分别加入0.1mol/L NaOH甲醇溶液50μL和乙腈400μL，涡旋混匀3min，4000r/min离心10min，取上清，微孔滤膜过滤，并将滤液经HPLC进行分析，其中，甲乙两组标准工作液浓度梯度稀释液中对应的KGN浓度梯度为3，5，10，20，50，100，200μg/mL，且甲乙组标准工作液浓度梯度稀释液经HPLC分析后所得数据指定的标准曲线分别为大鼠关节滑液中KGN标准曲线和大鼠关节软骨组织中KGN标准曲线，分别如图1和图2所示(需要注意的是标准曲线以峰面积为横坐标，浓度为纵坐标)，且大鼠关节滑液中KGN标准曲线的回归方程为：y＝2.130096e-004x-2.863827，R2＝0.9994096，大鼠关节软骨组织研磨液中KGN回归方程为：y＝1.933455e-004x-1.391917，R2＝0.9996482，这表明KGN关节滑液和关节软骨组织研磨液中KGN含量在3-200μg/mL范围内线性关系均良好。
其中，制作标准曲线时，HPLC的色谱柱为ZORBAX300SB-C18 column 4.6mm×250mm；其中，流动相A为含有0.1％H3PO4的超纯水(即每1L超纯水中加入1mLH3PO4)，流动相B为乙腈；流动相流速为1mL/min；检测波长为280nm；进样体积为10μL；柱温为30℃，其梯度洗脱条件：0-15min，A相在0-3.5min为10％，在3.5-8min为95％，在8-10min为95％逐渐减小到10％，10-15min为10％，运行至梯度洗脱结束。
5、KGN用药模型组关节滑液和关节软骨组织中KGN含量的测定
将KGN用药模型组的六只SD成年雄性大鼠所得到的六个关节滑液样品和六个关节样品液，(每个关节滑液样品和关节样品液均为50μL)置于2mL离心管中，加0.1mol/L NaOH甲醇溶液50μL，再加入乙腈400μL，涡旋混匀3min后，离心(4000r/min)10min，取上清液，0.22μm微孔滤膜过滤，在与制作标准曲线时同条件下进行HPLC分析分别测得六只SD成年雄性大鼠关节滑液和关节软骨组织研磨液中KGN的含量，如表1所示：
表1大鼠关节滑液和关节软骨组织研磨液中KGN的含量(n＝3，x±s)
HPLC具有快速准确，操作简单，检测灵敏度高的特点，被广泛应用于药物浓度的检测，包括血浆、各组织等药物浓度的检测。KGN溶于DMSO，因此采用DMSO配置KGN母液。关节滑液内含有蛋白质、酶类、黏蛋白等成分，关节软骨组织具有胶原蛋白和蛋白多糖等成分，在样品预处理中加入乙腈，可以沉淀蛋白并解脂，防止蛋白等物质堵塞高效液相仪器进样管。以甲醇作为提取剂，具有简便、实用的优点。将流动相改为0.1％H3PO4的超纯水－乙腈进行梯度洗脱后，获得较好的色谱峰及分离度。其原因是因为纯水中加入少量磷酸，减少KGN的解离，从而获得较好的峰形和分离效果。在大鼠关节腔内关节滑液及关节软骨组织研磨液中KGN含量测定中，关节液浓度随着时间增加浓度减小；关节软骨组织研磨液随着时间增高浓度逐渐增大，原因可能是药物进入关节腔后，通过淋巴循环进入体内，关节液中药物减少；药物部分停留在软骨，软骨研磨液中药物浓度增加。
6、人关节滑液中KGN标准曲线制备
同上述大鼠关节滑液对应标准曲线的制备方法类似，以人关节滑液提到老鼠关节滑液，所得人关节液在KGN浓度梯度为3-200μg/mL范围内标准曲线如图3所示，其回归方程为：y＝2.247607e-004x-8.677074，R2＝0.9999034。该HPLC具有良好的灵敏度、重复性及可行性，试验样品的前处理简单、方便、易于操作，可为检测KGN在关节滑液和关节软骨内含量提供新的方法和思路。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种关节腔内外源KGN含量测定方法，其特征在于，其包括如下步骤，
步骤S1：KGN标准储备液的制备，在常温下称取KGN标准品，并用适量DMSO溶剂完全溶解后加纯水稀释定容至浓度为1mg/mL，所得溶液即为KGN标准储备液；
步骤S2：关节取样，分别取KGN用药模型和KGN未用药模型的关节滑液作为关节样品液，或分别取KGN用药模型和KGN未用药模型的关节软骨组织并加入的生理盐水后充分研磨后得到溶液作为关节样品液，其中，所述关节软骨组织与所述生理盐水的质量体积比为20mg/mL；
步骤S3：标准曲线梯度溶液制备，分别量取多份由步骤S1所得KGN储备液，并分别加纯水稀释定容得到不同浓度的标准工作液，再将多份标准工作液分别加入四倍体积如步骤S2所得KGN未用药模型的关节样品液进行稀释，稀释后充分混匀得到多份标准工作液浓度梯度稀释液；
步骤S4：标准曲线测定和KGN用药模型关节腔中KGN含量测定，分别将步骤S2中所得KGN用药模型的关节样品液和步骤S3中所得多份标准工作液浓度梯度稀释液取相同体积后并分别加入等体积的浓度为0.1mol/L的NaOH甲醇溶液后得测定液，再向所述测定液中加入四倍体积的乙腈，混匀后离心，将所得上清液经微孔滤膜过滤后分别经HPLC进行分析，将多个标准工作液浓度梯度稀释液所测得结果制作标准曲线，将KGN用药模型的关节样品液所测得的结果与标准曲线进行比对得到对应KGN用药模型关节腔内KGN含量。
2.根据权利要求1所述的关节腔内外源KGN含量测定方法，其特征在于，所述步骤S1中KGN标准品与DMSO溶剂的质量体积比为3-10mg/mL。
3.根据权利要求1所述的关节腔内外源KGN含量测定方法，其特征在于，所述步骤S2中KGN用药模型和KGN未用药模型均为人或大白鼠。
4.根据权利要求1所述的关节腔内外源KGN含量测定方法，其特征在于，所述步骤S4中离心条件为3800-4200r/min，离心时间为5-15min。
5.根据权利要求1至4任一项所述的关节腔内外源KGN含量测定方法，其特征在于，所述步骤S4中HPLC的色谱条件为：色谱柱为ZORBAX300SB-C18column 4.6mm×250mm；其中，流动相A为含有0.1％H3PO4的超纯水，流动相B为乙腈；流动相流速为1mL/min；检测波长为280nm；进样体积为10μL；柱温为30℃。
6.根据权利要求5所述的关节腔内外源KGN含量测定方法，其特征在于，所述步骤S4中HPLC的梯度洗脱条件：0-15min，A相在0-3.5min为10％，在3.5-8min为95％，在8-10min为95％逐渐减小到10％，10-15min为10％，运行至梯度洗脱结束。
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