CN110004240A - 基于rpa的鸡毒支原体的实时荧光检测试剂盒、试纸条检测试剂盒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于重组酶聚合酶扩增技术(RPA)的鸡毒支原体实时荧光试剂盒及其用途，同时还提供了一种检测鸡毒支原体的试纸条试剂盒及其用途。这两种试剂盒均根据鸡毒支原体基因MGA_0878序列设计并筛选出一套各自检测的引物及探针组合，虽然两个试剂盒针对同一靶标序列，但是引物和探针的修饰碱基和检测平台不一致。实验证明这两个试剂盒特异性强、灵敏度高，与qPCR的符合率均为100％，不仅为有效检测和鉴定鸡毒支原体提供了技术手段，而且操作简便、快速、成本低，适用于基层兽医现场诊断，也能够用于鸡毒支原体的科学研究。

Description

基于RPA的鸡毒支原体的实时荧光检测试剂盒、试纸条检测试 剂盒及其用途

技术领域

本发明属于预防兽医学检验领域，涉及一种检测鸡毒支原体的试剂盒及其用途，特别涉及一种基于RPA的快速检测鸡毒支原体的实时荧光试剂盒以及试纸条试剂盒，还涉及二者在检测鸡毒支原体中的用途。

背景技术

鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum，MG)属于支原体目、支原体科、支原体属，是一种具有高度传染性的能够引起鸡、火鸡、鸭、鹅等禽类呼吸系统疾病的重要病原体之一。鸡群感染MG后表现为咳嗽、流鼻涕、流眼泪，严重时呼吸困难或张口呼吸；该病发病率高，病程长，造成雏鸡的淘汰率上升和成年鸡的产蛋率下降，在我国几乎100％的鸡场都有感染，严重危害养鸡业的发展；考虑到我国鸡群的养殖模式、商业化MG弱毒苗的安全性及抗生素的耐药性的问题，MG的防治难度越来越大，因此只有对该病进行快速诊断，才能为该病的防控争取时间，最大限度的减少疫病的传播和经济的损失。

目前检测MG的方法包括：支原体的分离培养、血清学抗体检测及分子基因诊断，其中分离培养是诊断支原体感染性疾病的金标准，但支原体对培养基的营养要求高，生长缓慢，分离难度大，只适用于实验室检测；血清学检测如平板凝集试验(SPA)和血凝抑制试验(HI)，这两种方法均涉及制备抗原的菌株来源问题，具有灵敏度低、特异性差、结果判断主观性强和不适合大批量检测等特点，限制了它们在临床中的广泛应用。ELISA诊断法以针对粘附蛋白或热休克蛋白较多，但这些支原体膜相关抗原的某些表位与其它支原体，如模仿支原体相似，容易出现交叉反应和假阳性。如专利CN201110094758.2公开了一种检测MG抗体的ELISA试剂盒，该试剂盒是以MG粘附素蛋白PvpA为包被抗原建立的MG间接ELISA抗体检测方法，但该方法只针对特定一种动物开发的试剂盒，使用范围窄，不适合其他感染MG的禽类。目前，商业化的MG间接ELISA试剂盒，主要来自美国和欧洲，虽然特异性高，但对不同菌株感染的抗体检测敏感度不同，且价格昂贵，一份血样的检测费用高达11.5元，限制了养殖户的使用，仅限实验室研究用。传统的聚合酶链反应(PCR)和实时荧光定量PCR(real-timePCR)是目前应用最多的分子诊断方法，但是这两种技术都需要昂贵的热循环仪器及熟练的操作人员，费时费力，难以现场进行操作和向基层推广，如孙俊颖等(2015)公开了一种基于SYBR Green I的用于检测MG 16S rDNA的实时荧光定量PCR检测方法，但由于SYBR GreenⅠ非特异性的结合所有双链DNA，因此特异性相对较差，且该方法需要昂贵的硬件设备和专业的操作人员、耗时较长，只适合实验室进行检测；赵杰等(2015)公开了一种检测MG mgc2基因的套氏PCR检测的方法，虽特异性高，敏感性强，但需要用核酸电泳对扩增产物进行检测，增加了污染的可能性且费时费力。

RPA技术是由以英国剑桥Babraham研究院建立的并由Twist Dx生物技术公司发明的(http://www.twistdx.co.uk/)。该技术以T4噬菌体的核酸复制机制为原理，反应所需原料有T4噬菌体编码的重组酶蛋白uvsX和uvsY、单链结合蛋白gp32、DNA聚合酶以及寡聚核苷酸；同时还需要引物、探针、模板、ddH₂O和Mg²⁺等。该技术基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟生物体内DNA复制，在常温下即可对目标片段进行等温扩增，摆脱了对热循环仪器的要求，可在短时间内快速扩增出目的片段，具有简便，快速，灵敏等优点。目前RPA技术已经在一系列病原微生物的分子检测中得到应用，如结核分枝杆菌、口蹄疫病毒、犬细小病毒、非洲猪瘟等。但据我们所知，国内外未见RPA技术在MG检测中的应用。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明针对鸡毒支原体脂蛋白MGA_0878基因，建立并评估了基于RPA的实时荧光检测试剂盒和试纸条试剂盒，以期实现快速诊断的目的，能够用于鸡毒支原体的科学研究。

为了实现本发明的目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明根据鸡毒支原体的MGA_0878基因设计引物和探针；同时通过对来自GenBank中的CP003511.1，CP003510.1，CP001872.1，AE015450.2，CP003512.1，LS991952.1，CP006916.3，CP003513.1，CP001873.1，WP027122358.1的MGA_0878基因同源序列进行比对分析，进一步明确鸡毒支原体MGA_0878基因的保守区域，针对该区域设计引物和探针，以期能够检测到尽可能多的鸡毒支原体。针对RPA实时荧光(real-time RPA)与RPA试纸条(LFSRPA，Recombinase Polymerase Amplication Assay Combined With Lateral Flow StripTest)不同的检测特点，本发明分别设计合成了三对上游引物和三对下游引物，通过对引物与探针组合进行扩增效果评价，最终选出能产生强扩增信号的引物与探针组合应用到本发明中。两种试剂盒针对同一靶标序列，但引物和探针的修饰碱基和检测平台不同。所有的引物和探针都由金斯瑞(南京，中国)合成。

本发明提供一种基于RPA的鸡毒支原体实时荧光检测试剂盒，所述实时荧光检测试剂盒包括下述的引物对和探针：

上游引物：5’-AGTGGGAAGATGGAAGCAGATCGTTCTAGTG-3’

下游引物：5’-GTAAATTAAATGAGATTTGCCCTTCACGATCGTC-3’

探针：5’-CTGATCTAGTAACTCAAGCAAG[dT-Fam]C[dSpacer]G[dT-BHQ1]GTGGTTATAGTC[C3-Spacer]-3’。

探针序列中具有荧光基团FAM和猝灭基团BHQ1，两个基团之间由dSpacer隔开，3’端由C3 Spacer修饰。

作为优选，所述上游引物、下游引物和探针在所述RPA试剂盒中的终浓度为10μM。

作为优选，所述试剂盒的50μL反应体系如下：29.5μL水解缓冲液，10μM上下游引物各2μL，10μM探针0.5μL，去离子水9.5μL，模板或标准质粒4μL及2.5μL 280mmol/L的醋酸镁溶液。

本发明提供实时荧光检测试剂盒在检测鸡毒支原体中的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的。

本发明的试剂盒能够用于鸡毒支原体的科学研究。

本发明提供鸡毒支原体的检测方法，所述检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的，包括以下步骤：以待检测DNA为模板，采用权利要求1所述的引物对和探针进行重组酶聚合酶扩增，对扩增结果进行分析：荧光曲线上升的则含有鸡毒支原体基因组DNA，平滑的直线则不含有鸡毒支原体基因组DNA；

作为优选，所述重组酶聚合酶扩增时，反应温度为37-40℃，反应时间为20min-1h。

作为优选，所述重组酶聚合酶扩增时，反应温度为37℃，反应时间为20min。

本发明提供一种基于RPA的鸡毒支原体试纸条检测试剂盒，所述试剂盒包括侧流层析试纸条(Hybridetect 2T，Milenia Biotec GmbH，Germany)，还包括下述的引物对和探针：

上游引物：5’-AGTGGGAAGATGGAAGCAGATCGTTCTAGTG-3’

下游引物：5’-biotin-GTAAATTAAATGAGATTTGCCCTTCACGATCGTC-3’

探针：5’-FAM-GATCTAGTAACTCAAGCAAGC[dSpacer]GGTGGTTATAG[C3-Spacer]-3’。

所述的下游引物序列5’端采用biotin进行标记，所述的探针5’端具有荧光基团FAM，之间由dSpacer连接，3’端由C3Spacer修饰。

作为优选，所述上游引物、下游引物和探针在所述试剂盒中的终浓度为10μM。

作为优选，所述试剂盒的50μL反应体系如下：29.5μL水解缓冲液，10μM上下游引物各2μL，10μM探针0.5μL，去离子水9.5μL，模板或标准质粒4μL及2.5μL 280mmol/L的醋酸镁溶液。

本发明提供基于RPA的鸡毒支原体试纸条检测试剂盒在检测鸡毒支原体中的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的。

本发明提供鸡毒支原体的检测方法，所述检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的，包括以下步骤：首先，在鸡毒支原体试纸条的质控线包被标准质粒，然后以待检测DNA为模板，采用权利要求6-8任一项所述的试剂盒进行重组酶聚合酶扩增，扩增结束后使用侧流层析试纸条(Hybridetect 2T，Milenia Biotec GmbH，Germany)对结果进行检测：试纸条质控线和检测线同时出现条带为阳性；试纸条质控线出现条带，但检测线没有条带为阴性；

作为优选，所述重组酶聚合酶扩增的条件为于35-42℃孵育15-40min；

作为优选，所述重组酶聚合酶扩增的条件为于37℃孵育20min。

相较于现有技术，本发明的方法具有以下优点：

A.节约时间：RPA整个实验过程只需要20min，该时间远远低于qPCR的1.5h。

B.降低反应温度：RPA在恒温37℃即可完成实验，该温度远远低于qPCR的60-95℃。

C.方法简单便于携带：扩增所需要的酶和其他一些必要的东西已经冻干保存，能常温放置，扩增时只需要加入水解缓冲液、引物、探针和模板，并加入镁离子起始反应即可，而试纸条RPA只需要一个水浴锅即可完成实验，对操作人员专业要求低，适用于基层兽医现场诊断，也能够用于鸡毒支原体的科学研究。

D.特异性强：本发明试剂盒中添加了探针，增加了检测的特异性，与现有的qPCR方法的符合度为100％。

E.不易于污染：本发明试剂盒中添加了核酸外切酶Ⅲ，对扩增产物进行切割，因此降低了产物污染的可能性。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为RPA实时荧光检测方法灵敏度分析。

图2为RPA实时荧光检测方法特异性分析。

图3为RPA试纸条方法的敏感性检测。

图4为RPA试纸条方法的特异性检测。

具体实施方式

在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用的原料、化学试剂均为常规市售商品，所用的技术手段为本领域技术人员所公知的常规手段。

实施例1基于RPA的鸡毒支原体的实时荧光(Real-time PRA)检测试剂盒及检测方法的建立

1.引物及探针序列的设计及制备

本发明根据鸡毒支原体的MGA_0878基因设计引物和探针；同时通过对来自GenBank中的CP003511.1，CP003510.1，CP001872.1，AE015450.2，CP003512.1，LS991952.1，CP006916.3，CP003513.1，CP001873.1，WP027122358.1的MGA_0878基因同源序列进行比对分析，进一步明确鸡毒支原体MGA_0878基因的保守区域，针对该区域设计引物和探针，以期能够检测到尽可能多的鸡毒支原体。所有的引物和探针都由金斯瑞(南京，中国)合成。本发明分别设计合成三对上游引物，三对下游引物以及一条探针序列，如表1所示。

表1鸡毒支原体real-time RPA引物和探针

2.菌株、病毒基因组及临床样品

本发明中所使用的鸡毒支原体菌株(MG Rlow)、鸡滑液囊支原体菌株(WVU1853)、模仿支原体(CHN-JNSH03-2015)、鸭支原体(CHN-BZY10-2015)、鸡新城疫病毒(Lasota)及鸡传染性支气管炎病毒(H120)基因组由本实验室保存。本申请发明人分别收集来自甘肃、河南、山东三省的60份临床棉拭子样本及10份健康鸡的棉拭子进行试验。

3.支原体基因组提取

使用高纯度的支原体核酸提取试剂盒(QIAamp cador Pathogen Mini Kit)，按照说明书来提取支原体DNA，并最终用50μL的无RNase水洗脱。提取的DNA存放到-20℃备用。

4.标准质粒制备

提取鸡毒支原体DNA。设计扩增MGA_0878片段的引物

上游引物F：5’-ATGCTTAAAAAAATATTGAAATGG-3’,

下游引物R：5’-TTAGTTCATTGGTAAGGTCGATATGG-3’

以提取到的鸡毒支原体DNA为模板，扩增条件为94℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火45s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃再延伸10min，4℃5min。PCR产物于10g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，以确定扩增得到大小为1206bp的目的基因片段。用胶回收试剂盒进行回收PCR产物，与pMD-19T克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞JM109，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养12h。筛选出阳性单菌落到含有氨苄青霉素的液体培养基中，37℃培养，取菌液2mL，提取质粒，测定序列为阳性的pMG-19T-1206。

标准质粒的核苷酸序列为：

ATGCTTAAAAAAATATTGAAATGGTTTTTACTAGCTTCTTTTGTAGCGGTGCCATTATCTTCTTGTACAAACAAGAATAAGAAAGAGATGGTTAGTAATTCACCTCCTAATATGGATCCAGGTAATACCTCAGGTACTAATGAAAATAATAACCCAAGAGAACCTTTACCCCCTATAAATCGATCTGAAGGGATGAAGTCAGAAGATAAAAGTGGGAAGATGGAAGCAGATCGTTCTAGTGATAGTAGTAATGAAACAAAAAGTTTACAATTAAGTCTAAAGTCTAAAGCTGTTATAGCATCTGATCTAGTAACTCAAGCAAGCGGTGGTTATAGTCTTAACTGGTCAAAGTTTATGACCAATCTTAATTCAGAAGAACAGACAAACTCAAGATTGTTAAACTTAATTGTTGACGATCGTGAAGGGCAAATCTCATTTAATTTACAAGTAGGTGGAAATCAAAAGCTAAGCTTTAAAGAAAAAGTCGATTTTGATTTTCAGTTCTTAAAAGCTTTAACTTTAAATTGGACTGATACTAAACCCACAACAACCAATAGTTCATTAACCCAACTTCAAAAGGTGACTAACGCCCAAGGATTATCTGAATTTGCTACCCCCGTTTTATCAGTAGCATCTGATGATTCAACCAATTACTTCACTTATCTAAGTGATTGGTTCGATGTTAATCTAACATATGTAAGTGTTGATAAGAAATTAGAACAAAACGATCTTACTTTTGATTATCAACTAACAATAAATCCAAATAAAAGATCGTTTTATCAGATTGAGAATAATTCTAAACAACCTCAACTTTGGCACAGCGATAAAGATAGAACAGTTTTAAGCTATCCGTCAGATTTATCTAAAGCTGCAGCTGATGTAATCATCAACAAGACAAGTGAATTGTTTGATAAACCAATCGATTATTTCTATGATACAACAAATCATACAGTTAAAACTGATCAATTAGAAGTAACTGCTAGAAACAATGGGCTAATTAAGTTTTCTAACAGTAAATACAATGATCAGTTTGCAATTACTTTAGTGCAAAACTCAGCTAGTTTCAATACTGATAGGAACGAACTAACATTTACTGTCGAAATCAAACCAAAAGATAGTAACGAATTTAATAGTATGGGGGGGATTGGAAGAACTTTCACAATAACAACCTACAGATGGACCATATCGACCTTACCAATGAACTAA

5.Real-time RPA试验扩增条件优化

以提取纯化的支原体DNA或标准质粒为模板进行扩增试验，实验体系如下：29.5μL水解缓冲液(rehydration buffer,TwistDx exo kit,Cambridge,United Kingdom)，上下游引物(10μM)各2μL，探针(10μM)0.5μL，去离子水9.5μL，模板4μL及2.5μL 280mmol/L的醋酸镁溶液。

其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：

上游引物：5’-AGTGGGAAGATGGAAGCAGATCGTTCTAGTG-3’

下游引物：5’-GTAAATTAAATGAGATTTGCCCTTCACGATCGTC-3’

探针：5’-CTGATCTAGTAACTCAAGCAAG[dT-Fam]C[dSpacer]G[dT-BHQ1]GTGGTTATAGTC[C3-Spacer]-3’。

在确定RPA引物的反应温度时，按照上述体系加入反应物。我们分别试验了37℃、38℃、39℃和40℃四个不同的反应温度，反应时间为20min，结束后通过Bio-Rad的实时荧光定量PCR仪软件对结果进行分析。通过对结果分析表明，37℃扩增结果最佳。所以本发明所设计的鸡毒支原体real-time RPA扩增温度设定为37℃。在确定PRA反应时间时，我们同样按照上述体系加入反应物，我们在37℃下设定了3个不同的时间，分别为20min、30min和1h，结果表明，扩增20min和扩增1h的阴性及阳性结果一致，因此，本发明所设计的鸡毒支原体real-time RPA扩增时间设定为20min。

同时本发明用该扩增体系分别对三对引物和探针的组合进行评价，结果表明其中一对引物(表1中的MGA_0878RPA F1/R1)和表1中的探针的组合能产生强的扩增信号，因此本发明选用该引物和探针组合。

Real-time RPA试验结果判定：含有鸡毒支原体基因组DNA的反应管荧光曲线上升，阴性对照为平滑的直线。

6.Real-time RPA试剂盒和使用方法

Real-time RPA试剂盒包括以下成分：

水解缓冲液(rehydration buffer,TwistDx exo kit,Cambridge,UnitedKingdom)，上下游引物，探针，去离子水，标准质粒，280mmol/L的醋酸镁溶液。

50μL反应体系如下：

29.5μL水解缓冲液(rehydration buffer,TwistDx exo kit,Cambridge,UnitedKingdom)，上下游引物(10μM)各2μL，探针(10μM)0.5μL，去离子水9.5μL，模板或标准质粒4μL及2.5μL 280mmol/L的醋酸镁溶液。

引物为表1中的MGA_0878RPA F1/R1，探针为表1中所述探针。

RPA扩增条件为：37℃扩增20min。

判断标准：含有鸡毒支原体基因组DNA的反应管荧光曲线上升，阴性对照为平滑的直线。

7.Real-time RPA试验灵敏度和特异性检测：

灵敏度检测：通过核酸测定仪测定阳性质粒pMD-19T-1206的浓度为94ng/μL，pMD-19T载体的碱基数为2692bp，扩增产物大小为1206bp，每个碱基的平均分子量为660道尔顿/bp，每μL样品中检测基因拷贝数按照公式计算：样本拷贝数(copies/μL)＝阿伏伽德罗常数(6.02×10²³)×质粒浓度ng/μL×10^-9/(660×重组质粒碱基数)，其中，重组质粒碱基数＝载体序列碱基数+插入序列碱基数，那么计算得出的拷贝数为2.14×10¹⁰copies/μL。对阳性质粒进行10倍倍比稀释，使其浓度在10⁶～10¹copies/μL之间，并将其作为RPA反应的模板。在温度为37℃的qPCR仪中进行扩增反应，时间设定为20min，1min收集一次荧光信号，采集扩增曲线，结果如图1所示，随着模板拷贝数的降低，扩增曲线时间和荧光信号值逐渐的下降，在拷贝数为10²时仍有扩增曲线，当拷贝数为10¹时没有明显的扩增曲线；表明在10⁶～10²copies/μL范围内的样品均能被检测出来。

图1为RPA实时荧光检测方法灵敏度分析。

特异性检测：按照上述体系添加反应物进行Real-time RPA检测，其中使用模板分别为鸡毒支原体(阳性对照)、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡滑液囊支原体、鸭支原体和模仿支原体，扩增反应在37℃的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为20min，1min收集一次荧光信号，采集扩增曲线；结果如图2所示，只有鸡毒支原体能够进行很好的扩增，其他均未产生扩增曲线，说明该方法对检测鸡毒支原体有较强的特异性。

图2为RPA实时荧光检测方法特异性分析；其中，A：阳性对照；B：鸡滑液囊支原体；C：模仿支原体；D：鸭支原体；E:鸡新城疫病毒；F：鸡传染性支气管炎病毒；G：阴性对照(NC)。

8.Real-time RPA试验对临床样品的检测

我们用建立的real-time RPA方法来检测采集自甘肃、河南、山东三省的60份临床棉拭子样本及10份健康鸡的棉拭子样本，并将结果与qPCR的间接结果相比较。结果如表2所示：在60份临床样品中，real-time RPA方法检测出25份阳性样品，与qPCR检测结果完全一致；10份健康鸡的血清样品real-time RPA检测结果和qPCR检测结果一致，均都为阴性，符合率为100％。其中，qPCR方法参照文献(Raviv Z,Kleven SH.The development ofdiagnostic real-time TaqMan PCRs for four pathogenic avian mycoplasma.AvianDis.2009,53(1):103-107.)方法进行。

表2比较Real-time RPA和qPCR方法的临床样品检测结果

9.重复性实验

按上述反应体系，以pMD-19T-1206标准质粒(2.14×10²拷贝/μL～2.14×10⁶拷贝/μL)为模板进行稳定性检测。在同一个试验中对每个稀释度的标准质粒做3个重复孔，以分析组内差异；用上述相同条件分别进行3次独立重复实验，分析组间差异，计算其变异系数，变异系数(CV)＝标准偏差(SD)/平均数(X)。采用SPSS19.0软件进行统计学分析，方差分析用于比较不同样本之间的差异，P＜0.05有统计学意义。结果表明：组内各孔之间CV值在0.29％～0.68％之间，组间重复测定CV值在0.67％～0.93％之间，均小于1％(表3)。

表3 Real-time RPA检测鸡毒支原体组内和组间重复性

注：表中为平均值，S为标准差，CV为变异系数。

综上，本发明设计的一种基于重组酶聚合酶扩增技术(RPA)的鸡毒支原体实时荧光试剂盒可以快速诊断鸡毒支原体，而且检测方法简单、快速、检测结果真实可靠。

实施例2快速检测鸡毒支原体的PRA试纸条(LFS PRA)检测试剂盒及检测方法的建立

1.引物及探针序列的设计及制备

本发明根据鸡毒支原体的MGA_0878基因设计引物和探针；同时通过对来自GenBank中的CP003511.1，CP003510.1，CP001872.1，AE015450.2，CP003512.1，LS991952.1，CP006916.3，CP003513.1，CP001873.1，WP027122358.1的MGA_0878基因同源序列进行比对分析，进一步明确鸡毒支原体MGA_0878基因的保守区域，针对该区域设计引物和探针，以期能够检测到尽可能多的鸡毒支原体。所有的引物和探针都由金斯瑞(南京，中国)合成。本发明分别设计合成三对上游引物，三对下游引物以及一条探针序列，如下表4所示。

表4鸡毒支原体LFS RPA引物和探针

2.菌株、病毒基因组及临床样品

本发明中所使用的鸡毒支原体菌株(MG Rlow)、鸡滑液囊支原体菌株(WVU1853)、模仿支原体(CHN-JNSH03-2015)、鸭支原体(CHN-BZY10-2015)、鸡新城疫病毒(Lasota)及鸡传染性支气管炎病毒(H120)基因组由本实验室保存。本申请发明人分别收集来自甘肃、河南、山东三省的60份临床棉拭子样本及10份健康鸡的棉拭子进行试验。

3.支原体基因组提取

使用高纯度的支原体核酸提取试剂盒(QIAamp cador Pathogen Mini Kit)，按照说明书来提取支原体DNA，并最终用50μL的无RNase水洗脱。提取的DNA存放到-20℃备用。

4.标准质粒制备

提取鸡毒支原体DNA。设计扩增MGA_0878片段的引物

上游引物F：5’-ATGCTTAAAAAAATATTGAAATGG-3’,

下游引物R：5’-TTAGTTCATTGGTAAGGTCGATATGG-3’

以提取到的鸡毒支原体DNA为模板，扩增条件为94℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火45s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃再延伸10min，4℃5min。PCR产物于10g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，以确定扩增得到大小为1206bp的目的基因片段。用胶回收试剂盒进行回收PCR产物，与pMD-19T克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞JM109，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养12h。筛选出阳性单菌落到含有氨苄青霉素的液体培养基中，37℃培养，取菌液2mL，提取质粒，测定序列为阳性的pMG-19T-1206。

5.LFS RPA试验扩增条件优化

以提取纯化的支原体DNA或标准质粒为模板进行扩增试验，实验体系如下：29.5μL水解缓冲液(rehydration buffer,TwistDx exo kit,Cambridge,United Kingdom)，上下游引物(10μM)各2μL，探针(10μM)0.5μL，去离子水9.5μL，模板4μL及2.5μL 280mmol/L的醋酸镁溶液。

其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：

上游引物：5’-AGTGGGAAGATGGAAGCAGATCGTTCTAGTG-3’

下游引物：5’-biotin-GTAAATTAAATGAGATTTGCCCTTCACGATCGTC-3’

探针：5’-FAM-GATCTAGTAACTCAAGCAAGC[dSpacer]GGTGGTTATAG[C3-Spacer]-3’。

在确定LFS RPA方法的最佳反应温度时，按照上述体系加入反应物，我们分别试验了15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、42℃、45℃、50℃不同反应温度，并将孵育时间设定为30min。结果表明反应温度低于30℃，试纸条上没有出现试验条带，在30℃时出现较弱的试验条带、在35℃-42℃之间试纸条有明显清晰的条带且无差异，当温度为45℃和50℃时，条带变弱不清晰，结果表明该试验的最佳反应温度为35℃-42℃，我们选择37℃作为该方法的最佳温度。在确定PRA反应时间时，我们同样按照上述体系加入反应物，我们在37℃下设定了8个不同的时间，分别为0min、1min、5min、10min、15min、20min、25min、30min的试验结果，结果表明在扩增10min的时候在试纸条上出现微弱条带，当反应时间在15min-30min时，试验条带没有出现观测的差异，因此我们选择20min为最佳孵育时间。

同时本发明用该扩增体系分别对三对引物和探针的组合进行评价，结果表明其中一对引物(表4中的MGA_0878RPA F1/R1)和表4中的探针的组合能产生强的扩增信号，因此本发明选用该引物和探针组合。

LFS RPA试验结果判定：试纸条质控线和检测线同时出现条带为阳性；试纸条质控线出现条带，但检测线没有条带为阴性。

6.LFS RPA试纸条试剂盒及使用方法

LFS RPA试纸条试剂盒包括LFS RPA试纸条(Hybridetect 2T，Milenia BiotecGmbH，Germany)，水解缓冲液(rehydration buffer,TwistDx exo kit,Cambridge,UnitedKingdom)，上下游引物，探针，去离子水，标准质粒，280mmol/L的醋酸镁溶液。

50μL反应体系如下：

29.5μL水解缓冲液(rehydration buffer,TwistDx exo kit,Cambridge,UnitedKingdom)，上下游引物(10μM)各2μL，探针(10μM)0.5μL，去离子水9.5μL，模板或标准质粒4μL及2.5μL 280mmol/L的醋酸镁溶液。

引物为表4中的MGA_0878RPA F1/R1，探针为表4中所述探针。

RPA扩增条件为：37℃孵育20min。

判断标准：采用上述试剂盒进行重组酶聚合酶扩增，扩增结束后使用侧流层析试纸条(Hybridetect 2T，Milenia Biotec GmbH，Germany)对结果进行检测：试纸条质控线和检测线同时出现条带为阳性；试纸条质控线出现条带，但检测线没有条带为阴性。

所述重组酶聚合酶扩增的条件为于35-42℃孵育15-40min；

优选所述重组酶聚合酶扩增的条件为于37℃孵育20min。

7.LFS RPA试验灵敏度和特异性检测：

灵敏度检测：通过核酸测定仪测定阳性质粒pMD-19T-1206的浓度为94ng/μL，pMD-19T载体的碱基数为2692bp，扩增产物大小为1206bp，每个碱基的平均分子量为660道尔顿/bp，每μL样品中检测基因拷贝数按照公式计算：样本拷贝数(copies/μL)＝阿伏伽德罗常数(6.02×10²³)×质粒浓度ng/μL×10^-9/(660×重组质粒碱基数)，其中，重组质粒碱基数＝载体序列碱基数+插入序列碱基数，那么计算得出的拷贝数为2.14×10¹⁰copies/μL。对阳性质粒进行10倍倍比稀释，使其浓度在10⁶～10¹copies/μL之间，并将其作为RPA反应的模板。在温度为37℃的水浴锅中进行扩增反应，时间设定为20min，通过试纸条终点检测扩增结果，结果如图3所示，随着模板拷贝数的降低，扩增曲线时间和荧光信号值逐渐的下降，在拷贝数为10²时仍有扩增曲线，当拷贝数为10¹时没有明显的扩增曲线；表明在10⁶～10²copies/μL范围内的样品均能被检测出来。

图3为RPA试纸条方法的敏感性检测；其中，模板为10⁶-10¹copies/μL的质粒DNA，NC代表阴性对照。

特异性检测：按照上述体系添加反应物进行LFS RPA检测，其中使用模板分别为鸡毒支原体(阳性对照)、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡滑液囊支原体、鸭支原体和模仿支原体，扩增反应在37℃的水浴锅中进行，反应时间为20min，结束后使用侧流层析试纸条对结果进行检测，如图4所示，只有鸡毒支原体能够进行很好的扩增，检测线出现条带，其他均未在检测线出现条带，说明该方法对检测鸡毒支原体有较强的特异性。

图4为RPA试纸条方法的特异性检测；其中，A：阳性对照；B：鸡滑液囊支原体；C：模仿支原体；D：鸭支原体；E：鸡新城疫病毒；F：鸡传染性支气管炎病毒；G：阴性对照(NC)。

8.LFS RPA试验对临床样品的检测

本申请发明人用建立的LFS RPA方法来检测采集自甘肃、河南、山东三省的60份临床棉拭子样本及10份健康鸡的棉拭子样本，并将结果与qPCR的检测结果相比较。结果如表5所示：在60份临床样品中，LFS RPA方法检测出25份阳性样品，与qPCR检测结果完全一致；10份健康鸡的血清样品LFS RPA检测结果和qPCR检测结果一致，均都为阴性，符合率为100％。其中，qPCR方法参照文献(Raviv Z,Kleven SH.The development of diagnostic real-time TaqMan PCRs for four pathogenic avian mycoplasma.Avian Dis.2009,53(1):103-107.)方法进行。

表5比较LFS RPA和qPCR方法的临床样品检测结果

综上，本发明设计的一种基于重组酶聚合酶扩增技术(RPA)的鸡毒支原体试纸条和试剂盒可以快速诊断鸡毒支原体，而且检测方法简单、快速、检测结果真实可靠。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 基于RPA的鸡毒支原体的实时荧光检测试剂盒、试纸条检测试剂盒及其用途

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1206

<212> DNA

<213> 鸡毒支原体脂蛋白(Mycoplasma gallinaceum lipoprotein)

<400> 1

atgcttaaaa aaatattgaa atggttttta ctagcttctt ttgtagcggt gccattatct 60

tcttgtacaa acaagaataa gaaagagatg gttagtaatt cacctcctaa tatggatcca 120

ggtaatacct caggtactaa tgaaaataat aacccaagag aacctttacc ccctataaat 180

cgatctgaag ggatgaagtc agaagataaa agtgggaaga tggaagcaga tcgttctagt 240

gatagtagta atgaaacaaa aagtttacaa ttaagtctaa agtctaaagc tgttatagca 300

tctgatctag taactcaagc aagcggtggt tatagtctta actggtcaaa gtttatgacc 360

aatcttaatt cagaagaaca gacaaactca agattgttaa acttaattgt tgacgatcgt 420

gaagggcaaa tctcatttaa tttacaagta ggtggaaatc aaaagctaag ctttaaagaa 480

aaagtcgatt ttgattttca gttcttaaaa gctttaactt taaattggac tgatactaaa 540

cccacaacaa ccaatagttc attaacccaa cttcaaaagg tgactaacgc ccaaggatta 600

tctgaatttg ctacccccgt tttatcagta gcatctgatg attcaaccaa ttacttcact 660

tatctaagtg attggttcga tgttaatcta acatatgtaa gtgttgataa gaaattagaa 720

caaaacgatc ttacttttga ttatcaacta acaataaatc caaataaaag atcgttttat 780

cagattgaga ataattctaa acaacctcaa ctttggcaca gcgataaaga tagaacagtt 840

ttaagctatc cgtcagattt atctaaagct gcagctgatg taatcatcaa caagacaagt 900

gaattgtttg ataaaccaat cgattatttc tatgatacaa caaatcatac agttaaaact 960

gatcaattag aagtaactgc tagaaacaat gggctaatta agttttctaa cagtaaatac 1020

aatgatcagt ttgcaattac tttagtgcaa aactcagcta gtttcaatac tgataggaac 1080

gaactaacat ttactgtcga aatcaaacca aaagatagta acgaatttaa tagtatgggg 1140

gggattggaa gaactttcac aataacaacc tacagatgga ccatatcgac cttaccaatg 1200

aactaa 1206

Claims (10)

1.一种基于RPA的鸡毒支原体实时荧光检测试剂盒，其特征在于：所述实时荧光检测试剂盒包括下述的引物对和探针：

上游引物：5’-AGTGGGAAGATGGAAGCAGATCGTTCTAGTG-3’

下游引物：5’-GTAAATTAAATGAGATTTGCCCTTCACGATCGTC-3’

探针：5’-CTGATCTAGTAACTCAAGCAAG[dT-Fam]C[dSpacer]G[dT-BHQ1]GTGGTTATAGTC[C3-Spacer]-3’。

2.根据权利要求1所述的实时荧光检测试剂盒，其特征在于：所述上游引物、下游引物和探针在所述RPA试剂盒中的终浓度为10μM。

3.根据权利要求1所述的实时荧光检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的50μL反应体系如下：29.5μL水解缓冲液，10μM上下游引物各2μL，10μM探针0.5μL，去离子水9.5μL，模板或标准质粒4μL及2.5μL 280mmol/L的醋酸镁溶液。

4.权利要求1-3任一项所述的实时荧光检测试剂盒在检测鸡毒支原体中的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的。

5.鸡毒支原体的检测方法，所述检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的，其特征在于：包括以下步骤：以待检测DNA为模板，采用权利要求1所述的引物对和探针进行重组酶聚合酶扩增，对扩增结果进行分析：荧光曲线上升的则含有鸡毒支原体基因组DNA，平滑的直线则不含有鸡毒支原体基因组DNA；

作为优选，所述重组酶聚合酶扩增时，反应温度为37-40℃，反应时间为20min-1h。

作为优选，所述重组酶聚合酶扩增时，反应温度为37℃，反应时间为20min。

6.一种基于RPA的鸡毒支原体试纸条检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括侧流层析试纸条，还包括下述的引物对和探针：

上游引物：5’-AGTGGGAAGATGGAAGCAGATCGTTCTAGTG-3’

下游引物：5’-biotin-GTAAATTAAATGAGATTTGCCCTTCACGATCGTC-3’

探针：5’-FAM-GATCTAGTAACTCAAGCAAGC[dSpacer]GGTGGTTATAG[C3-Spacer]-3’。

7.根据权利要求6所述的基于RPA的鸡毒支原体试纸条检测试剂盒，其特征在于：所述上游引物、下游引物和探针在所述试剂盒中的终浓度为10μM。

8.根据权利要求6所述的基于RPA的鸡毒支原体试纸条检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的50μL反应体系如下：29.5μL水解缓冲液，10μM上下游引物各2μL，10μM探针0.5μL，去离子水9.5μL，模板或标准质粒4μL及2.5μL 280mmol/L的醋酸镁溶液。

9.权利要求6-8任一项所述的基于RPA的鸡毒支原体试纸条检测试剂盒在检测鸡毒支原体中的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的。

10.鸡毒支原体的检测方法，所述检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的，其特征在于：包括以下步骤：以待检测DNA为模板，采用权利要求6所述的引物对和探针进行重组酶聚合酶扩增，扩增结束后使用侧流层析试纸条对结果进行检测：试纸条质控线和检测线同时出现条带为阳性；试纸条质控线出现条带，但检测线没有条带为阴性；

作为优选，所述重组酶聚合酶扩增的条件为于35-42℃孵育15-40min；

作为优选，所述重组酶聚合酶扩增的条件为于37℃孵育20min。