CN110423831A

CN110423831A - 基于rpa技术检测鸡毒支原体(mg)的引物、探针、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN110423831A
Application number: CN201910788243.9A
Authority: CN
Inventors: 宋玲玲; 亓丽红; 艾武; 刘涛; 鞠艳
Original assignee: Poultry Research Institute Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Poultry Research Institute Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-08-26
Filing date: 2019-08-26
Publication date: 2019-11-08

Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种基于RPA技术检测鸡毒支原体(MG)的引物、探针、试剂盒及其应用。该引物上游序列如SEQ ID NO.1所示，下游序列如SEQ ID NO.2所示，探针如SEQ ID NO.3所示。本发明通过特殊引物和探针设计，进行鸡毒支原体(MG)检测，具有更高的灵敏度和特异性，可排除假阳性、操作简便，方便快捷，实现了现场直接检测，应用前景广泛。

Description

基于RPA技术检测鸡毒支原体(MG)的引物、探针、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种基于RPA技术检测鸡毒支原体(MG)的引物、探针、试剂盒及其应用。

背景技术

鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum，MG)又称禽霉形体，主要导致鸡慢性呼吸道疾病(Chronicrespiratory disease,CRD)。MG在禽体内潜伏6d-21d后，感染鸡通常表现的症状是气管锣音、咳嗽、流鼻涕、流眼泪，一侧或两眼睑肿胀或粘合。雏鸡表现为生长迟缓、发育不良、病弱雏增多，淘汰率增加；蛋鸡多表现为产蛋下降，这种产蛋率下降通常会维持在一个低的产蛋水平上，会持续几十天至几个月不发生变化，因不象其它疾病引起的产蛋率下降那样突然和明显，往往会被养鸡人员所忽视。通常情况下，其产蛋率会下降10％左右，严重时可达20-30％。对肉鸡来说，由于生长迟缓，造成上市时间迟，生产效率下降。如果没有并发感染其它疾病，一般死亡率不高，病理剖检上主要表现为鼻窦炎、结膜炎和肺炎的病理变化；如伴有其它病毒性和细菌性疾病，特别是伴有大肠杆菌感染时，表现为严重的肝周炎和心包炎的变化，死亡率也较高。随着养鸡规模加大、饲养方式改变和饲养密度提高，该病发病率越来越高，主要影响雏鸡生长、使成年鸡产蛋减少，造成养鸡业经济上的重大损失，危害性日益突出，受到养鸡业者的普遍关注。因此，加强鸡毒支原体(MG)的监测和研究具有重要的现实意义。

尽早准确检测MG直接影响着家禽健康与经济效益，关系到我国现代化家禽业发展。目前MG的检测常采用血清学方法，如ELISA、血清平板凝集(SPA)、病原分离培养和PCR方法作为确证方法，但该方法灵敏度低，存在交叉反应，培养周期长或样品易污染等方面不足。随着分子生物学技术的发展，应用较多病毒检测方法有聚合酶链式反应(PCR)、巢式PCR和荧光定量PCR等技术。但PCR技术本身存在反应时间久，成本高、时效性低，对实验环境要求高、操作复杂繁琐、并且需要具有一定分子生物学基础及操作技术的专业人员才能完成，不能满足家禽养殖现场检测诊断的需求。

恒温检测技术不但摆脱了变温仪，而且在保证检测结果准确的前提下，极大的缩短了反应时间。RPA(recombinase polymerase amplification)等温扩增技术被公认是可以替代PCR的核酸检测技术。其原理利用重组酶与引物结合形成蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。另外，在37-42℃间，20分钟内就可以对含有靶标序列的样品进行扩增,扩增效率远远高于传统的PCR技术。由于RPA技术具有扩增用时短、不需要昂贵仪器、特异性好等特点，使其应用越来越广泛。采用RPA进行鸡毒支原体(MG)的专一检测的技术目前尚未见报道，要获得灵敏度及专一性强的特殊引物，在RPA技术进行设计的基础上，还需要考虑引物长度及特异性探针序列。

发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种基于RPA技术检测鸡毒支原体(MG)的引物、探针、试剂盒及其应用；该引物和探针具有高度的特异性和专一性，扩增效率高，灵敏度高，准确率高，重现性好，检测周期短，且能实时检测DNA扩增反应，具有很高的可行性与应用前景。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种基于RPA技术检测鸡毒支原体(MG)的引物和探针组合物，正向引物如SEQ IDNO.1所示，反向引物如SEQ ID NO.2所示，探针如SEQ ID NO.3所示；

上游引物QF：5'-TATTCCATCATCATTCTTTGAAAACAAAAT-3'(SEQ ID NO.1)；

下游引物QR:5'-TGAGGTAATAACTTAATGAAGTCATTAGTTGCTCT-3'(SEQ ID NO.2)；

探针QP：5'-AATATCAGGATTGTTTTGAGGTGGAGTATATCTGTAAATTGAATTA-3'(SEQ IDNO.3)。

探针序列中荧光报告基团(FAM)、荧光淬灭基团(BHQ1)、四氢呋喃位点(THF)的磷酸基团(phosphate)的具体位置如下：

AATATCAGGATTGTTTTGAGGTGGAGTATA(FAM-dT)T(THF)C(BHQ1-dT)TGTAAATTGAATTA(phosphate)。

一种含有所述的基于RPA技术检测鸡毒支原体(MG)的引物和探针组合物的试剂盒。

所述试剂盒包括酶混合液、ddH₂O、再水化缓冲液。

所述酶混合液包括重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶。

所述试剂盒还包括鸡毒支原体(MG)阳性对照品DNA和280mM醋酸镁溶液。

所述的试剂盒在检测鸡毒支原体(MG)中的应用。

一种检测鸡毒支原体(MG)的方法，包括如下操作步骤：

(1)引物组和探针合成：合成权利要求1或2中的引物和探针；

(2)提取鸡毒支原体(MG)的DNA；

(3)采用含有步骤(1)的引物和探针的RPA扩增体系，进行RPA扩增反应及实时荧光检测；

(4)设立阳性对照和空白对照，若得到明显的扩增曲线，表明检出鸡毒支原体(MG)。

步骤(3)的RPA扩增体系以20μl计，包括：RPA-鸡毒支原体(MG)检测试剂18μL，280mM的醋酸镁(MgAc)溶液1μL，模板DNA1μL。

所述RPA-鸡毒支原体(MG)检测试剂包含：再水化缓冲液(Buffer)11.8μL，10μM上下游引物各0.55μL，探针0.25μL，酶混合液4μL，ddH₂O 0.85μL。8、根据权利要求5所述的方法，其特征在于，RPA扩增反应的扩增条件为37℃-42℃、扩增反应15-20min。

上述RPA扩增反应在实时荧光检测仪中进行。

本发明的有益效果:

本发明相比现有LAMP法、qPCR技术，对温度要求低，在37-42℃的等温条件下即可进行，检测时间短，检测效率高。通过将RPA技术与荧光探针结合，可以直接从反映出来的荧光信号值判断结果，直观可靠。本发明通过特殊引物和探针设计，进行鸡毒支原体(MG)检测，具有更高的灵敏度和特异性，可排除假阳性、操作简便，方便快捷，实现了现场直接检测，应用前景广泛。本发明检测方法用于鸡发病前期及病害预测预防，对于确定防治期、有效防病治病具有重要意义。

附图说明

图1为本发明鸡毒支原体(MG)RPA特异性扩增曲线图；

图2为本发明鸡毒支原体(MG)RPA检测灵敏度扩增曲线图。

图3为本发明鸡毒支原体(MG)RPA的4条探针的对此优化扩增曲线图。

具体实施方式

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，并结合其附图，对本发明进行详细阐述。

若未特别指明，以下实时例均照常规实验条件进行操作，实时例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

以下实施例中使用RPA试剂盒为Basic试剂盒，购置英国TwistDXInc公司；其中，能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶是以冻干粉状态存在于试剂盒所提供的RPA反应管中，使用时直接用试剂盒所带的反应缓冲液稀释。整个RPA反应过程在RPA反应管中进行。

实施例1：引物和探针的合成

RPA反应工作原理：在RPA反应中，需要三种酶的参与，分别是重组酶、单链结合蛋白以及DNA聚合酶。在RPA扩增时，重组酶首先与上、下游引物结合，寻找同源的双链DNA，一旦定位，发生链交换，单链结合蛋白与亲本链绑定，阻止其与脱离的模板链发生相互作用；接着，DNA聚合酶从上、下游引物的3’端启动模板合成，形成两条双链DNA，如此循环往复进而实现扩增。

根据鸡毒支原体(MG)gapA基因保守区序列作为靶基因。按照5碱基平移的方法进行筛选，设计的引物长度在30-35nt，5’端避免连续G，3’端的G、C会对酶识别的稳定性更有益。在RPA荧光探针设计方面，由于修饰的基团较多包括FAM荧光基团、BHQ1淬灭基团、THF脱碱基位点、3’端的封闭等，除了避免自身存在二级结构，尽量避免与引物有重叠部分，因为合成的引物能够被探针识别检测。为了获得更好的实验结果，为了获得更好的实验结果，对4条探针进行筛选，4条探针扩增对此见图3，探针1最优；筛选的探针及最优引物序列见表1：

筛选后的引物及探针见表1：

表1引物及探针的核苷酸序列

其中，探针序列中的荧光报告基团(FAM)、荧光淬灭基团(BHQ1)、四氢呋喃位点(THF)的磷酸基团(phosphate)的具体位置如下：

其中选用gapA靶基因序列，扩增片段大小为198bp，其序列结构如SEQ IDNo.4

TATTCCATCATCATTCTTTGAAAACAAAATTAATGATATTGTAACTATAGAAGCAGATGGTACAGAAGTATTAGATAGTAAATACATTAATTCAATTTACAGATATACTCCACCTCAAAACAATCCTGATATTAGATTAAGATTATTAGTAATTGATCGTTCTAGAGCAACTAATGACTTCATTAAGTTATTACCTCA。

实施例2：DNA提取

根据细菌DNA快速提取试剂盒说明书，提取鸡毒支原体(MG)，提取的基因组DNA，-20℃保存。

实施例3：RPA检测

RPA扩增体系组成为：总体系20μL，包含RPA-鸡毒支原体(MG)检测试剂18μL，280mM的醋酸镁(MgAc)溶液1μL，模板DNA1μL；

其中18μL的RPA-鸡毒支原体(MG)检测试剂包含：再水化缓冲液(RT-Buffer)11.8μL，10μM上下游引物各0.55μL，探针0.25μL，酶混合液4μL，ddH₂O 0.85μL。

上述酶混合液包括重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶。

表2 RPA反应体系

组分名称	浓度	加量
			上游引物	10μM	0.55μl
下游引物	10μM	0.55μl
			探针	10μM	0.25μl
Rehydration Buffer		11.8μl
			酶混合液		4μl
MgAc	280mM	1μl
			template	1-20ng/μl	2μl
ddH<sub>2</sub>O		0.85μl

RPA扩增程序为：温度37℃-42℃，反应15分钟。RPA扩增反应在荧光检测仪中进行。

实施例4：特异性验证

材料：上述实施例1合成的引物和探针；

鸡毒支原体(MG)标准参考毒株、H1～H15亚型AIV、N1亚型AIV、鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、传染性喉气管炎病毒、马立克氏病毒及鸡痘病毒等毒株，由山东省农科院家禽所研究室保存并提供。

以上述材料提取的RNA或DNA为模板，进行RPA检测，验证其引物和探针的特异性。其结果见表3，结果表明本研究所设计的探针及引物具有很强的特异性。

表3特异性验证试验

病毒类型	鸡毒支原体(MG)特异探针QP	检测结果
			鸡毒支原体(MG)	17.46±0.19	阳性
H1亚型AIV	N	阴性
			H2亚型AIV	N	阴性
H3亚型AIV菌	N	阴性
			H4亚型AIV	N	阴性
H5亚型AIV	N	阴性
			H6亚型AIV	N	阴性
H7亚型AIV	N	阴性
			H8亚型AIV	N	阴性
H9亚型AIV	N	阴性
			N1亚型AIV	N	阴性
鸡新城疫病毒	N	阴性
			传染性支气管炎病毒	N	阴性
传染性法氏囊病毒	N	阴性
			传染性喉气管炎病毒	N	阴性
马立克氏病毒	N	阴性
			鸡痘病毒	N	阴性

实施例5：灵敏度检测

将鸡毒支原体(MG)标准参考株DNA分别到50ng/μL，按10×梯度稀释，每个梯度均取2.0μL为模板量，(即：10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng)进行RPA检测，评估本发明的灵敏度。结果显示见图2，本检测方法灵敏度为0.01ng。

实施例6临床可疑样本检测

本发明所建立的对鸡毒支原体(MG)RPA检测方法对24份临床可疑样本进行检测，样本类型包括寿光、烟台、泰安、济南等不同地区的病料和血清。同时使用PCR-测序法进行检测。其RPA检测结果见表4，结果显示本发明所建立的方法与PCR-测序法测序结果验证完全一致，本方法准确、可靠。

表4临床样本检测

样本名称	鸡毒支原体(MG)特异探针QP	检测结果
			阳性对照	6.62±0.34	鸡毒支原体(MG)
S1(血)	N	阴性
			S2(血)	N	阴性
S3(血)	N	阴性
			S4(血)	N	阴性
S5(血)	N	阴性
			S6(血)	7.25±0.39	鸡毒支原体(MG)
S7(血)	N	阴性
			S8(血)	N	阴性
S9(血)	8.69±0.23	鸡毒支原体(MG)
			S10(血)	N	阴性
S11(血)	N	阴性
			S12(血)	N	阴性
S13(血)	N	阴性
			S14(血)	N	阴性
S15(病料)	N	阴性
			S16(病料)	6.46±0.17	鸡毒支原体(MG)
S17(病料)	N	阴性
			S18(病料)	N	阴性
S19(病料)	N	阴性
			S20(病料)	8.35±0.20	鸡毒支原体(MG)
S21(病料)	N	阴性
			S22(病料)	N	阴性
S23(病料)	N	阴性
			S24(病料)	N	阴性

上述具体实施方式不能作为对本发明保护范围的限制，对于本技术领域的技术人员来说，对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内。

本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。

序列表

<110> 山东省农业科学院家禽研究所

<120> 基于RPA 技术检测鸡毒支原体(MG)的引物、探针、试剂盒及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tattccatca tcattctttg aaaacaaaat 30

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgaggtaata acttaatgaa gtcattagtt gctct 35

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aatatcagga ttgttttgag gtggagtata tctgtaaatt gaatta 46

<210> 4

<211> 198

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tattccatca tcattctttg aaaacaaaat taatgatatt gtaactatag aagcagatgg 60

tacagaagta ttagatagta aatacattaa ttcaatttac agatatactc cacctcaaaa 120

caatcctgat attagattaa gattattagt aattgatcgt tctagagcaa ctaatgactt 180

2

cattaagtta ttacctca 198

Claims

1.一种基于RPA技术检测鸡毒支原体(MG)的引物和探针组合物，其特征在于，引物和探针的核苷酸序列为：

上游引物QF：5'-TATTCCATCATCATTCTTTGAAAACAAAAT-3'(SEQ ID NO.1)；

下游引物QR：5'-TGAGGTAATAACTTAATGAAGTCATTAGTTGCTCT-3'(SEQ ID NO.2)；

探针QP：5'-AATATCAGGATTGTTTTGAGGTGGAGTATATCTGTAAATTGAATTA-3'(SEQ ID NO.3)。

2.根据权利要求1所述的基于RPA技术检测鸡毒支原体(MG)的引物和探针组合物，其特征在于，探针序列中荧光报告基团(FAM)、荧光淬灭基团(BHQ1)、四氢呋喃位点(THF)的磷酸基团(phosphate)的具体位置如下：

AATATCAGGATTGTTTTGAGGTGGAGTATA(FAM-dT)T(THF)C(BHQ1-dT)TGTAAATTG AATTA(phosphate)。

3.一种含有权利要求1或2所述的基于RPA技术检测鸡毒支原体(MG)的引物和探针组合物的试剂盒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒在检测鸡毒支原体(MG)中的应用。

5.一种检测鸡毒支原体(MG)的方法，其特征在于，包括如下操作步骤：

(1)引物组和探针合成：合成权利要求1或2中的引物和探针；

(2)提取鸡毒支原体(MG)的DNA；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)的RPA扩增体系以20μl计，包括：RPA-鸡毒支原体(MG)检测试剂18μL，280mM的醋酸镁(MgAc)溶液1μL，模板DNA1μL。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述RPA-鸡毒支原体(MG)检测试剂包含：再水化缓冲液(Buffer)11.8μL，10μM上下游引物各0.55μL，探针0.25μL，酶混合液4μL，ddH₂O 0.85μL。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，RPA扩增反应的扩增条件为37℃-42℃、扩增反应15-20min。