CN111893199A - 一种家禽支原体pcr检测引物及应用该引物的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，涉及一种家禽支原体PCR检测引物及应用该引物的试剂盒，该试剂盒中包括引物F和引物R。引物F的序列如SEQ ID NO.1所示，引物R的序列如SEQ ID NO.2所示，该试剂盒具有特异性强、灵敏度高、快速简便等优点，适合于基层单位和科研院所应用推广，为MGC在禽类中的监测及其防控提供技术支撑。

Description

一种家禽支原体PCR检测引物及应用该引物的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及一种家禽支原体PCR检测引物及应用该引物的试剂盒。

背景技术

禽类支原体在全球范围内流行，给家禽养殖业带来极大的危害。目前常见的家禽致病性支原体主要有鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum，MG)、滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae，MS)、火鸡支原体(Mycoplasma meleagridis，MM)和衣阿华支原体(Mycoplasma iowae，MI)，MS和MG对鸡致病，MM和MI对火鸡致病。家禽支原体(Mycoplasmagallinaceum，MGC)最早发现于20世级80年代的支原体流行病学调查，陆续从英国、日本及南非等地的鸡、鸭、火鸡和鸟类的呼吸道和生殖道中分离到该菌，最初被认为是无致病性支原体，最近几年的国外研究表明，其在鸡群中阳性率为25％，与传染性支气管炎病毒在鸡气管内共感染时，可增加病毒在气管粘膜的病毒含量，我国未见有MGC的相关研究报道。

诊断支原体的标准方法是病原体的分离和鉴定，但由于支原体生长营养需求较高，培养基中需要加入血清，且支原体生长相当缓慢，通常需要培养3-10天才能形成菌落，不利于疾病的诊断。聚合酶链式反应(PCR)具有简单快捷、特异性好、敏感性高的有点，是目前应用最广的分子诊断方法，需要的仪器为普通的PCR仪在基层实验室较为常见，因此获得MGC的PCR专用试剂盒并建立MGC的PCR诊断方法在临床上具有较高的应用价值。

发明内容

针对上述情况，本发明的发明人首先提供了一种家禽支原体PCR检测引物及应用该引物的试剂盒，该试剂盒中包括引物F和引物R。引物F的序列如SEQ ID NO.1所示，引物R的序列如SEQ ID NO.2所示，该试剂盒具有特异性强、灵敏度高、快速简便等优点，适合于基层单位和科研院所应用推广，为MGC在禽类中的监测及其防控提供技术支撑。

发明人首先提供了一对特异性引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和2所示，该引物分别为引物F和引物R，可用于PCR检测家禽支原体，其具体序列为：

上游引物为F：5`-GGGATAACGCTGAGAAAT-3`，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

下游引物为R：5`-GTTAGCTGCGCCGATGAG-3`，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

上述引物是针对针对MGC16SrRNA设计获得的特异性引物，利用该引物扩增待测样品的DNA，当样品中扩增出724bp条带(其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；)时，说明该样品中含有家禽支原体，其具体步骤如下：

(1)提取待测样品的DNA；

(2)建立PCR反应体系，并利用上述引物进行PCR反应；

(3)将PCR反应产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，当样品中扩增出724bp条带时，说明该样品中含有家禽支原体。

其中，步骤(2)中PCR反应体系为：10×PCR Mix 2.5μL、dNTP Mixture2.0μL、20mmol/L的引物F和引物M各0.5μL、Taq DNA Polymerase0.25μL，待检样品DNA模板2μL，然后用RNA-free dH₂O补足终体积至25μL；

步骤(2)中PCR反应条件为：95℃5min；进入94℃30s，52℃45s，72℃50s，共进行35个循环；72℃10min，4℃结束反应。

上述检测方法具有特异性强、灵敏度高、快速简便等优点，适合于基层单位和科研院所应用推广，为MGC在禽类中的监测及其防控提供技术支撑。

发明人进一步提供了一种试剂盒，该试剂盒主要含有引物F和引物R，其具体序列为：

上游引物为F：5`-GGGATAACGCTGAGAAAT-3`，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

下游引物为R：5`-GTTAGCTGCGCCGATGAG-3`，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

除此之外试剂盒和中还包括：10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)、dNTP Mixture、Taq DNAPolymerase、RNA-free dH₂O等试剂盒常用试剂；

综上所述，利用本发明提供的引物和试剂盒，具有特异性强、灵敏度高、快速简便等优点，适合于基层单位和科研院所应用推广，为MGC在禽类中的监测及其防控提供技术支撑。

附图说明

图1为MGC PCR特异性实验结果电泳图；

图中泳道分别为：M.DL2000为DNA Marker；1为MGC Peacock20181011；2为MS H；3为MS GX11-T；4为MG CR；5为MG F-36；6为莱氏支原体NCTC10116；7为白痢沙门氏菌(CVCC1789)；8为大肠杆菌CMCC(B)44103；9为阴性对照(模板为DEPC)；

图2为MGC PCR灵敏度实验结果电泳图；

图中泳道分别为M.DNA DL2000 Marker；1为1×10⁸copies/μL；2为1×10⁷copies/μL；3为1×10⁶copies/μL；4为1×10⁵copies/μL；5为1×10⁴copies/μL；6为1×10³copies/μL；7为1×10²copies/μL，8为阴性对照。

图3为MGC PCR方法对临床样品检测结果电泳图；

图中泳道分别为M.DNA DL2000 Marker；1为阳性对照；2为阴性对照；3-24为临床样品。

具体实施方式

下面结合实施例来进一步说明本发明，可以使本领域技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明；

实施例1 PCR反应体系的建立及优化和特异性试验

1、菌株：MGC菌株(Peacock20181011)、MS菌株(H株和GX11-T株)、MG菌株(F株和CR株)、莱氏支原体NCTC10116、大肠杆菌(CMCC(B)44103)和白痢沙门氏菌(CVCC1789)；其中MS标准株GX11-T和白痢沙门氏菌(CVCC1789)购自中国兽医药品监察所，MS-H株购自澳大利亚生物资源公司，MG F株(F-36)和CR株购自青岛易邦生物工程有限公司，莱氏支原体(NCTC10116)购自德国MB公司，大肠杆菌(CMCC(B)44103)购自中国药品生物制品检定所，MGC菌株Peacock20181011，参见刘星丽，2020，47(6)，微生物学通报，一株源自孔雀的新型支原体的鉴定及其致病性和基因组分析中公开的相关信息；

2、试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒、DL2000bp DNA Marker、10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)、dNTP Mixture、Taq DNA Polymerase、MGC 16S rRNA 724bp目的DNA、RNA-free dH₂O及琼脂糖。

3、细菌基因组的提取：参照TIANGEN细菌基因组提取试剂盒使用说明，提取支原体及其它菌株基因组DNA，-20℃保存备用。

4、PCR反应体系的建立及条件优化：建立25μL反应体系：10×PCR Mix 2.5μL、dNTPMixture2.0μL、Taq DNA Polymerase0.25μL，待检样品DNA模板2μL，20mmol/L引物F和引物R分别加入0.2-1μL，共设置5个试验梯度，每个梯度递增0.2μL，最后用RNA-free补足至25μL。

同时根据浓度实验的效果再对退火温度及反应时间进行浓度的优化，最终确定该方法最终的反应体系及条件。

最终确定PCR反应的最佳体系为：10×PCR Mix 2.5μL、dNTP Mixture2.0μL、TaqDNA Polymerase0.25μL，待检样品DNA模板2μL，20mmol/L的引物F和引物R各加入量为0.6μL，用RNA-free补足至25μL；

最佳反应条件为：95℃5min；进入94℃30s，52℃45s，72℃50s，共进行35个循环；72℃10min，4℃结束反应。

5、运用上述所建立的MGC PCR检测方法按照Peacock20181011、MS-H、GX11-T、F36、CR、莱氏支原体(NCTC10116)、大肠杆菌CMCC(B)44103株和白痢沙门氏菌(CVCC1789)的DNA进行检测，验证所建立方法的特异性。

PCR反应产物通过琼脂糖凝胶电泳，电泳图为图1，从图1可以看出，用所建立的MGCPCR方法从1个MGC样品检测出了724bp的特异性条带，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；而对MS、MG、莱氏支原体、大肠杆菌、白痢沙门氏菌和阴性对照均未扩增出特异性条带，结果表明该方法具有良好的特异性。

实施例2敏感性试验

1、标准品的制备：以Peacock20181011菌株DNA为模板进行16S rRNA基因的扩增，得到其724bp目的片段，并将目的片段连接到T载体，转化大肠杆菌DH5α后并送华大基因公司进行测序。

用商品化质粒小提试剂盒提取含特异性片段的质粒，并用微量核酸检测仪对其浓度进行测定，根据相关公式计算质粒DNA的相对拷贝数，对质粒样品进行10倍的稀释，以便获得质粒DNA浓度为1×10⁸copies/μL-1×10²copies/μL的标准品。

2、敏感性试验运用上述优化好的PCR检测方法对制备好的浓度为1×10²copies/μL-1×10⁸copies/μL的质粒样品进行扩增，验证该检测方法的敏感性，PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳，电泳图为图2；

从图2中可以看出，该方法对浓度为1×10⁴copies/μL-1×10⁸copies/μL的质粒样品均有明显的特异性扩增条带出现，片段大小为724bp；对浓度等于或小于1×10³copies/μL的质粒样品均无扩增条带。由此可见，该方法最低能检测到质粒模板量为1×10⁴copies/μL的MGC 16S rRNA基因，说明本方法的检测灵敏度高。

实施例3临床样品检测

1、检测样品：从济南、潍坊和德州等养殖场的商品肉鸡、地方品种蛋鸡、白羽肉种鸡等禽类采集到22份气管棉拭子样品，提取样品DNA。

2、PCR反应体系和反应条件：

反应体系为：10×PCR Mix 2.5μL、dNTP Mixture2.0μL、Taq DNA Polymerase0.25μL，待检样品DNA模板2μL，20mmol/L的引物F和引物R各加入量为0.6μL，用RNA-free补足至25μL；

其中上游引物为F：5`-GGGATAACGCTGAGAAAT-3`，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

下游引物为R：5`-GTTAGCTGCGCCGATGAG-3`，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

反应条件为：95℃5min；进入94℃30s，52℃45s，72℃50s，共进行35个循环；72℃10min，4℃结束反应。

3、PCR反应产物使用琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图为图3，从图3中可以看出，检测的22份临床样品中有3份样品MGC阳性，能扩增出724bp的目的条带，其核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示；阳性率为13.6％。

而采用MGC接种人工培养基的方法检测阳性率是，在MGC接种人工培养基后每5天将接种样品的培养基转移至一新培养管中，连传3代，仅分离出1株MGC，阳性率为4.54％；可见采用本发明所提供的试剂盒检测上述样品的检测结果阳性率明显高于MGC接种人工培养基的分离率。

序列表

<110> 山东省农业科学院家禽研究所（山东省无特定病原鸡研究中心）

<120> 一种家禽支原体PCR检测引物及应用该引物的试剂盒

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

gggataacgc tgagaaat 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

gttagctgcg ccgatgag 18

<210> 3

<211> 724

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

gggataacgc tgagaaatta gcgctaatac cggatactta aatatctcgc atgaggtatt 60

tataaaagga gcctttaaag cttcacaagg ggatcggggt gcgtaacatt agctagttgg 120

tgaggtaatg gctcaccaag gcgatgatgt ttagcggggt tgagagactg atccgccaca 180

ctgggactga gatacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat tttccacaat 240

gggcgaaagc ctgatggagc gacacagcgt gcaggatgaa ggccttcggg ttgtaaactg 300

ctgttataag ggaagaaaaa gtcgaggagg aaatgccttg accttgacgg taccttatca 360

gaaagcaacg gctaactatg tgccagcagc cgcggtaata cataggttgc aagcgttatc 420

cggaattatt gggcgtaaag cgtctgtagg ttgtttgtta agtctggtgt gaaaacttgg 480

ggctcaaccc caaattgcat tggatactgg caaactagaa ttgtgtagag gttagcggaa 540

ttccttgtga agcggtggaa tgcgtagata taaggaagaa catcaacatg gcgaaggcag 600

ctaactggac acatattgac actgagagac gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata 660

ccctggtagt ccacgccgta aacgatgatg attagctgat ggggaactca tcggcgcagc 720

taac 724

Claims (4)

1.一种家禽支原体PCR检测引物，其特征在于：分别为引物F和引物R，其具体序列为：

上游引物为F：5`-GGGATAACGCTGAGAAAT-3`，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

下游引物为R：5`-GTTAGCTGCGCCGATGAG-3`，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种家禽支原体PCR检测试剂盒，其特征在于：其含有引物F和引物R，其具体序列为：

上游引物为F：5`-GGGATAACGCTGAGAAAT-3`，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

下游引物为R：5`-GTTAGCTGCGCCGATGAG-3`，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求2所述的家禽支原体PCR检测试剂盒，其特征在于：还包括：10×PCRBuffer、dNTP Mixture、Taq DNA Polymerase和RNA-free dH₂O。

4.根据权利要求2所述的家禽支原体PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒PCR反应体系为：10×PCR Mix 2.5μL、dNTP Mixture2.0μL、20mmol/L的引物F和引物M各0.6μL、TaqDNA Polymerase0.25μL，待检样品DNA模板2μL，然后用RNA-free dH₂O补足终体积至25μL；

PCR反应条件为：95℃5min；进入94℃30s，52℃45s，72℃50s，共进行35个循环；72℃10min，4℃结束反应。

Images