CN110003301B - 用于治疗和/或预防fxr和tgr5/gpbar1介导的疾病的胆烷衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及式(I)的具有胆烷骨架的化合物，所述化合物用于治疗和/或预防FXR和TGR5/GPBAR1介导的疾病。

Description

用于治疗和/或预防FXR和TGR5/GPBAR1介导的疾病的胆烷衍 生物
本申请是申请日为2015年5月28日、发明名称为“用于治疗和/或预防FXR和TGR5/GPBAR1介导的疾病的胆烷衍生物”的中国专利申请No.201580028528.2的分案申请。
发明领域
本发明涉及具有胆烷骨架的化合物，所述化合物用于治疗和/或预防FXR和TGR5/GPBAR1介导的疾病。
背景技术
胆汁酸(BA)是与两种类型的专用细胞受体(细胞内核受体和细胞表面受体)相互作用的信号传导分子。核受体包括类法尼醇X受体(FXR)，其被鉴别为内源性胆汁酸传感器(Makishima等人，Science 1999,284,1362；Parks等人，Science 1999,284,1365)。
在肠-肝组织(肝脏和肠)中高度表达的FXR调节胆汁酸内稳态、代谢途径，还包括脂质和葡萄糖内稳态(Zhang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2006,103,1006)。另外，FXR激动剂提供抗炎和抗纤维化以及抗癌效果(Renga等人，FASEB J.2012,26,3021-3031)。
胆汁酸细胞表面受体(GPBAR1、M-BAR1、GP-BAR1、TGR5)属于G蛋白质偶联受体的视紫质样超家族(Takeda等人，FEBS Lett.2002,520,97；Kawamata等人，J.Biol.Chem.2003,278,9435)。
与TGR5/GPBAR1结合的配体导致细胞内cAMP水平升高，伴随作为结果的信号传导级联的激活。GPBAR1在肝脏中和在肠中高度表达，而且还在肌肉、脑、脂肪组织、巨噬细胞和内皮细胞中高度表达。在肌肉和褐色脂肪组织中，TGR5/GPBAR1增加肠-内分泌L细胞中的能量支出和氧消耗(Watanabe等人，Nature 2006,439,484)，TGR5/GPBAR1激活刺激胰高血糖素样肽(GLP)-1(一种提高胰腺胰岛素释放的肠促胰岛素)的分泌，因此调节葡萄糖血液水平、胃肠运动和食欲(Thomas等人，Cell.Metab.2009,10,167)。
Figure BDA0001967068730000021
化学中，BA是截短的胆固醇侧链衍生物。它们的分子目录首先在肝脏随着初级胆汁酸、胆酸(CA)和鹅脱氧胆酸(CDCA)的产生而生成。在肠中的微生物转化生成次级胆汁酸、脱氧胆酸(DCA)和石胆酸(LCA)。在人体中，胆汁酸与甘氨酸和牛磺酸缀合。针对两种BA受体的活性是依赖CDCA(最有效的内源性FXR活化剂)以及LCA和TLCA(TGR5/GPBAR1的最强天然激动剂)的结构。
已经注意到胆汁淤积性瘙痒(cholestatic pruritus)为与在PBC中使用FXR激动剂相关的严重副作用，并且近期的研究指出TGR5/GPBAR1为在发展这种副作用中涉及的分子靶标(Alemi等人，J.Clin.Invest.2013,123,1513–1530)。
WO2013192097描述了6-α-乙基-鹅脱氧胆酸(6-ECDCA)，一种具有抗胆汁淤积效果的有效和选择性的FXR激动剂。
WO2008002573描述了作为用于预防或治疗FXR介导的疾病或病况的FXR配体的胆汁酸衍生物。
WO2010014836和Sato H.(J Med Chem.2008,51,4849)描述了TGR5调节剂。
D’Amore C.等人(J.Med.Chem.2014,57,937)描述了GP-BAR1/FXR双重激动剂的设计、合成和生物学评价。D’Amore等人描述了作为合成中间体的化合物BAR502和BAR504。
Iguchi Y.等人(J Lipid Res.2010,51,1432)描述了起TGR5的配体的作用的胆汁醇。
由Kihira K.等人(Steroids 1992,57(4),193-198)公开了作为合成中间体的化合物BAR107。
在肠胆汁酸载体的分子建模中，Swaan P.W.等人(J.Comp.-Aid.Mol.Des.1997,11,581-588)测试了一组胆汁酸-缀合物中的熊胆酸盐(ursocholate)(在该文中为化合物15，在本文中为BARn406)。BARn406结果是具有不可检测的抑制牛磺胆酸(taurocholicacid)在CaCo-2细胞中的输送的能力。
Burns等人(Steroids 2011,76(3),291-300)描述了在海七鳃鳗(Petromyzonmarinus)中的非天然的硫酸化5-胆汁酸衍生物的合成和嗅觉活性。在其中公开的化合物9e(在本文中为化合物BAR407)不引起嗅觉响应。
本发明的目标是鉴别含有胆烷化学骨架并且调节FXR和/或TGR5/GPBAR1的新型化合物。
发明概述
本发明的主题是式(I)的化合物：
Figure BDA0001967068730000031
其中
R1是OH或H；
R2是Et、＝CH-CH3或H；
R3是OH或H；
n是0、1或3；
R是CH2OH、COOH、CH2OSO3H或CN；
条件是
当R2是Et或＝CH-CH3并且R3是OH时：
如果n是0或1，则当R1是α-OH时，R是CH2OH或CN，或者当R1是β-OH或H时，R是COOH、CH2OH或CH2OSO3H；
如果n是3，则R1和R如上所定义；
当R2是H时：
如果R1是α-OH并且R3是β-OH，则当n是0时，R是CH2OH或CH2OSO3H，或者当n是3时，R是CH2OH或COOH；
如果R1是H、n是1并且R3是α-OH，则R是CH2OSO3H；
如果R1和R3是H，则当n是0时，R是CH2OSO3H或COOH，
或者当n是1时，R是CH2OSO3H；
所述化合物包括其无机和有机药用盐、溶剂化物和氨基酸缀合物；
所述化合物不包括这样的化合物，其中
化合物ID n R<sub>1</sub> R<sub>2</sub> R<sub>3</sub> R
BAR107 0 α-OH H β-OH CH2OH
BARn406 0 H H H COOH
BAR504 1 α-OH α-Et α-OH CH2OH
BAR407 1 H H H CH2OSO3H
BAR502 0 α-OH α-Et α-OH CH2OH
已经发现如以上所述的化合物是FXR或/和TGR5/GPBAR1调节剂并且因此可用于治疗FXR和TGR5/GPBAR1介导的疾病。
因此，对于一个方面，本发明涉及用作药物的化合物，所述化合物是式(I)的化合物
其中
R1是OH或H；
R2是Et、＝CH-CH3或H；
R3是OH或H；
n是0、1或3；
R是CH2OH、COOH、CH2OSO3H或CN；
条件是
当R2是Et或＝CH-CH3并且R3是OH时：
如果n是0或1，则当R1是α-OH时，R是CH2OH或CN，或者当R1是β-OH或H时，R是COOH、CH2OH或CH2OSO3H；
如果n是3，则R1和R如上所定义；
当R2是H时：
如果R1是α-OH并且R3是β-OH，则当n是0时，R是CH2OH
或CH2OSO3H，或者当n是3时，R是CH2OH或COOH；
如果R1是H、n是1并且R3是α-OH，则R是CH2OSO3H；
如果R1和R3是H，则当n是0时，R是CH2OSO3H或COOH，
或者当n是1时，R是CH2OSO3H；
所述化合物包括其无机和有机药用盐、溶剂化物和氨基酸缀合物。
对于另一个方面，本发明涉及如以上所述的式(I)的化合物，包括化合物BAR107、BARn406、BAR504、BAR407和BAR502，其用于预防和/或治疗胃肠病症(gastrointestinaldisorders)、肝脏疾病(liver diseases)、心血管疾病(cardiovascular diseases)、动脉粥样硬化(atherosclerosis)、代谢疾病(metabolic diseases)、感染性疾病(infectiousdiseases)、癌症(cancer)、肾脏病症(renal disorders)、炎性病症(inflammatorydisorders)和神经病症(neurological disorders)(如中风(stroke))，所述化合物为如以上所述的式(I)的化合物。
本发明还涉及用于制备如以上所述的化合物的方法。
发明详述
根据本发明，优选的是那些化合物，其中R2是Et或＝CH-CH3并且R3是OH；更优选那些化合物，其中n是0或1，R是CH2OH或CN并且R1是α-OH，或者n是0或1，R是COOH、CH2OH或CH2OSO3H并且R1是β-OH或H。
当R2是Et或＝CH-CH3并且R3是OH时，优选的是选自由以下各项组成的组的化合物：
Figure BDA0001967068730000061
根据本发明，还优选的是那些化合物，其中R2是Et或＝CH-CH3，R3是OH，n是3，并且R1和R是如以上所定义的；更优选的是那些化合物，其中R2是Et，R3是α-OH，n是3并且R1是α-OH，并且R是如以上所定义的。
优选的是选自由以下各项组成的组的化合物：
Figure BDA0001967068730000062
根据本发明，还优选的是那些化合物，其中R2是H，并且
如果R1是α-OH并且R3是β-OH，则当n是0时，R是CH2OH或CH2OSO3H，或者当n是3时，R是CH2OH或COOH；
如果R1是H、n是1并且R3是α-OH，则R是CH2OSO3H；
如果R1和R3是H，则当n是0时，R是CH2OSO3H或COOH，或者当n是1时，R是CH2OSO3H；
在这些中，优选的是选自由以下各项组成的组的化合物：
Figure BDA0001967068730000071
特别优选的是选自由以下各项组成的组的根据本发明的化合物：
Figure BDA0001967068730000072
已经发现根据本发明的化合物，包括化合物BAR107、BARn406、BAR504、BAR407和BAR502，是高度选择性的FXR或TGR5/GPBAR1调节剂或双重FXR和TGR5/GPBAR1调节剂，并且因此可用作药物，尤其是用于预防和/或治疗胃肠病症、肝脏疾病、心血管疾病、动脉粥样硬化、代谢疾病、代谢病症、感染性疾病、癌症、肾脏病症、炎性病症和神经病症(如中风)。
在某些实施方案中，肝脏疾病选自由以下各项组成的组：慢性肝脏疾病，包括原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)、脑腱黄瘤病(cerebrotendinousxanthomatosis，CTX)、原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis，PSC)、药物诱发的胆汁淤积症(drug induced cholestasis)、妊娠肝内胆汁淤积症(intrahepaticcholestasis of pregnancy)、肠胃外营养相关的胆汁淤积症(parenteral nutritionassociated cholestasis)、细菌过度生长和脓毒症相关的胆汁淤积症(bacterialovergrowth and sepsis associated cholestasis)、自身免疫性肝炎(autoimmunehepatitis)、慢性病毒性肝炎(chronic viral hepatitis)、酒精性肝脏疾病(alcoholicliver disease)、非酒精性脂肪性肝脏疾病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH))、肝脏移植相关的移植物抗宿主病(liver transplant associated graft versus host disease)、活体供体移植(living donor transplant)、肝再生(liver regeneration)、先天性肝纤维化(congenital hepatic fibrosis)、肉芽肿性肝脏疾病(granulomatous liver disease)、肝内或肝外恶性肿瘤(intra-or extrahepatic malignancy)、威尔逊病(Wilson'sdisease)、血色沉着症(hemochromatosis)和α1-抗胰蛋白酶缺乏症(alpha 1-antitrypsindeficiency)。
在某些实施方案中，胃肠疾病选自由以下各项组成的组：炎性肠病(inflammatorybowel disease，IBD)(包括克罗恩病(Crohn's disease)、溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis)和不确定结肠炎(undetermined colitis))、肠易激综合征(irritable bowelsyndrome，IBS)、细菌过度生长、急性和慢性胰腺炎(pancreatitis)、吸收障碍(malabsorption)、辐射后结肠炎(post-radiation colitis)和微观结肠炎(microscopiccolitis)。
在某些实施方案中，肾脏疾病选自由以下各项组成的组：糖尿病肾病(diabeticnephropathy)、高血压肾病(hypertensive nephropathy)、包括慢性血管球性肾炎(chronic glomerulonephritis)和慢性移植肾小球病(chronic transplantglomerulopathy)在内的慢性肾小球疾病、慢性肾小管间质疾病(chronictubulointerstitial disease)和肾脏的血管病症(vascular disorders of thekidney)。
在某些实施方案中，心血管疾病选自由以下各项组成的组：动脉粥样硬化(atherosclerosis)、异常脂血症(dyslipidemia)、高胆固醇血(hypercholesterolemia)、高甘油三酯血(hypertriglyceridemia)、也被称为动脉高血压(hypertension)的高血压(hypertension)、包括心肌炎(myocarditis)和心内膜炎(endocarditis)的炎性心脏病(inflammatory heart disease)、缺血性心脏病(ischemic heart disease)、稳定型心绞痛(stable angina)、不稳定型心绞痛(unstable angina)、心肌梗死(myocardialinfarction)、包括肺动脉高压(pulmonary hypertension)在内的肺源性心脏病(pulmonary heart disease)、也被称为外周血管疾病(peripheral vascular disease，PVD)的外周动脉疾病(peripheral artery disease，PAD)、外周动脉闭塞性疾病(peripheral artery occlusive disease)和外周闭塞性动脉病(peripheralobliterative arteriopathy)。
在某些实施方案中，肝脏疾病选自由以下各项组成的组：胰岛素抗性(insulinresistance)、代谢综合征(metabolic syndrome)、I型和II型糖尿病(Type I and Type IIdiabetes)、低血糖症(hypoglycemia)、包括肾上腺皮质功能不全(adrenal cortexinsufficiency)在内的肾上腺皮质的病症(disorders of adrenal cortex)。
在某些实施方案中，代谢病症选自由以下各项组成的组：肥胖，和与减肥手术(bariatric surgery)相关的病况。
在某些实施方案中，癌症在下列各项的组中选择：肝癌、胆管癌、胰腺癌、胃癌、结肠-直肠癌、乳腺癌、卵巢癌和与化疗耐药性相关的病况。
在某些实施方案中，传染性病症选自以下各项的组：人类免疫缺陷相关疾病(AIDS)和相关病症、病毒B和病毒C感染。
在某些实施方案中，炎性病症选自以下各项的组：类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis)、纤维肌痛(fibromyalgia)、斯耶格伦氏综合征(Sjogren’s syndrome)、硬皮病(scleroderma)、贝赫切特氏综合征(Behcet’s syndrome)、血管炎(vasculitis)和全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)。
在以下表中描述了关于本发明的某些化合物对FXR和TGR5/GPBAR1的活性的数据。在该表中，将本发明的化合物对FXR和GPBAR1的活性与参比化合物(即CDCA，用于FXR，和TLCA，用于TGR5/GPBAR1)的那些进行比较。在10μM的浓度下测试每种化合物并且认为CDCA对FXR和TLCA对CRE(即TGR5/GPBAR1)的反式激活活性(transactivation activity)等于至100％。
表1
Figure BDA0001967068730000101
对于一个方面，本发明涉及式(I)的化合物，其中所述化合物是FXR和TGR5/GPBAR1双重激动剂。在该组中选择的实例是BAR502。出人意料地，当施用于由于施用ANIT或雌激素而导致胆汁淤积的动物时，BAR502不引起瘙痒。在胆汁淤积综合征中，认为胆汁酸的身体积累导致瘙痒。最近，TGR5/GPBAR1显示介导由于皮内施用DCA和LCA导致的瘙痒(Alemi等人，J.Clin.Invest.2013,123,1513–1530)。在临床试验中，对还原原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)的患者施用奥贝胆酸(obeticholic acid)已经在大约80％的患者中引起了严重的瘙痒。BAR502的一个特定且出人意料的优点是，当施用于由于施用α-萘基-异硫氰酸酯(ANIT)或17α-乙炔基雌二醇(胆汁淤积症的两个验证模型)而导致胆汁淤积时，这种试剂不引起瘙痒。在这些实验环境中，BAR502施用增加了存活，减弱了血清碱性磷酸酶水平并且稳健地调节了包括OSTα、BSEP、SHP和MDR1在内的典型FXR靶基因的肝脏表达，而不引起瘙痒症。在17α-乙炔基雌二醇模型中，BAR502减弱了胆汁淤积症并且重塑了胆汁酸池而不引起瘙痒，证实在非阻塞性胆汁淤积症的模型中，BAR502减弱肝脏损伤而不引起瘙痒。
在一个方面，本发明涉及式(I)的化合物，其中所述化合物当单独施用时是高选择性的FXR激动剂而对GPBAR1没有作用，但是在抑制由TLCA(10μm)导致的GPBAR1激活方面有效，因此表现为GPBAR1拮抗剂。在一个方面，本发明涉及式(I)的化合物，其中所述化合物是高选择性的GPBAR1激动剂而对FXR没有作用。在一个方面，本发明涉及式(I)的化合物，其中所述化合物是高选择性的GPBAR1拮抗剂而对FXR没有作用。
本发明还涉及用于制备如以上所述的式(I)的化合物的方法。
对于一个方面，本发明涉及用于制备如以上所述的式(I)的化合物的方法，其中R是CH2OH，所述方法包括使其中R是COOMe的相应的式(I)的化合物与LiBH4接触。
对于一个方面，本发明涉及用于制备如以上所述的式(I)的化合物的方法，其中R是COOH，所述方法包括对其中R是COOMe的相应的式(I)的化合物进行碱性水解；优选使用在MeOH/H2O中的NaOH 5％。
对于一个方面，本发明涉及用于制备如以上所述的式(I)的化合物的方法，其中R是CH2OSO3H及其盐，所述方法包括使相应的式(II)的化合物与三烷基胺-三氧化硫接触，
Figure BDA0001967068730000121
其中n和R2如上所述并且R4和R5如果不是H则是OP，其中P是醇保护官能团，以获得式(III)的化合物，
Figure BDA0001967068730000122
其中n、R2、R4和R5如上所述。
然后，根据如以上所述的式(III)的化合物，通过使在C3和C7的羟基官能团的去保护，可以获得相应的式(I)的化合物。
对于一个方面，本发明涉及用于制备如以上所述的式(I)的化合物的方法，其中n＝3，所述方法包括对相应的式(IV)的化合物进行一锅法Swern氧化/Wittig C2同系化，
Figure BDA0001967068730000123
其中m＝n-2＝1，R4和R5如果不是H则是OP，其中P是醇保护官能团并且R2如上所述(优选R2是H或αEt)，以获得受保护的式(V)的甲基酯，
Figure BDA0001967068730000124
其中m＝1，R2如上所述(优选R2是H或α-Et)，R4和R5如果不是H则是OP，其中P是醇保护官能团。
Swern氧化是其中使用草酰氯、二甲亚砜(DMSO)和有机碱如三乙胺将伯醇或仲醇氧化为醛或酮的化学反应。
Wittig反应或Wittig烯化是醛或酮与三苯基膦叶立德(triphenylphosphoniumylide)(通常被称为Wittig试剂)的化学反应以得到烯烃和三苯基氧化膦。三苯基膦叶立德优选为(三苯基膦烯)乙酸甲酯(methyl(triphenylphosphoranylidene)acetate)。
优选地，以上方法还可以包括对如以上所述的式(V)的化合物进行催化氢化，从而得到式(VI)的化合物，
Figure BDA0001967068730000131
其中n＝m+2＝3，R2如上所述，R4和R5如果不是H则是OP，其中P是醇保护官能团。
优选地，OP是甲硅烷基醚，更优选叔丁基二甲基甲硅烷基醚。因此，去保护优选通过酸性水解进行，优选通过用HCl处理进行。
对于一个方面，本发明涉及用于制备如以上的所述的式(I)的化合物的方法，其中n＝0，所述方法包括使式(XII)的化合物与HCOOH和HClO4接触，
Figure BDA0001967068730000132
并且随后使所得的化合物与TFA、三氟乙酸酐和NaNO2接触，以获得式(VII)的化合物，
Figure BDA0001967068730000141
简单和众所周知的化学转化之后可以将式(VII)的化合物转变为如以上所述的式(I)的化合物，使得可以将-CN基团水解为COOH，并且可以将OCHO基团水解为羟基，或者可以将＝O基团还原为羟基。
对于一个方面，本发明涉及用于制备如以上所述的式(I)的化合物的方法，其中R2是＝CH-CH3或Et并且R3不是H，所述方法包括对式(VIII)的化合物进行羟醛缩合，从而使式(VIII)的化合物与烷基锂如nBuLi接触，
Figure BDA0001967068730000142
其中n＝0、1，P是醇保护官能团，优选OAc，并且随后与乙醛接触，优选还在BF3(OEt)2存在下进行，以获得式(IX)的化合物，
Figure BDA0001967068730000143
其中n和P如上所述。
羟醛缩合是可能涉及酮烯醇化物至醛的亲核加成的羟醛加成反应，其中在形成后，羟醛产物即失去一分子水而形成α,β-不饱和羰基化合物。
对式(IX)的化合物进行催化氢化，优选在Pd(OH)2/C存在下利用H2，可以得到式(X)的化合物
Figure BDA0001967068730000151
对于一个方面，本发明涉及用于制备式(I)的化合物的方法，其中R2是α-Et，所述方法包括使式(XIV)的化合物与MeONa/MeOH接触，
Figure BDA0001967068730000152
其中n是0或1，R8是β-OH、OAc或H；
以获得C6立构中心的差向异构化，从而获得式(XI)的化合物
Figure BDA0001967068730000153
其中n是0或1，R8如上所述。在R8是OAc的情况下，利用MeONa/MeOH的处理同时提供了C3乙酰氧基水解，从而得到其中R8是OH的式(XI)的化合物。
通过使式(X)的化合物与NaBH4或Ca(BH4)2接触可以获得在C7的羰基的还原，以获得在C7的β-OH(在化合物BAR501和BARn501的情况中高达70％)和α-OH的混合物。随后的利用LiBH4的处理将如果存在的侧链中的甲基酯官能团还原为-CH2OH并且将在C3的OAc保护基还原为OH。
通过使式(XI)的化合物或在侧链具有COOH的相应化合物与LiBH4接触，可以获得在C7的羰基的还原，得到在C7的几乎仅有(排他地)α-OH。同时，利用LiBH4的处理将如果存在的侧链中的甲基酯官能团还原为-CH2OH并且将在C3的OAc保护基还原为OH。对式(IX)的化合物进行NaBH4还原接着用LiBH4处理，在C7和在侧链产生了还原以及同时在C3的去保护，尤其是脱乙酰化，以获得式(I)的化合物，其中R1是α-OH，R2是＝CH-CH3，R3是β-OH，n＝0、1并且R是CH2OH。
对以上式(I)的化合物(其中R1是α-OH，R2是＝CH-CH3，R3是β-OH，n＝0、1并且R是CH2OH)进行催化氢化，优选用H2和Pd(OH)2/C进行，可以获得式(I)的化合物，其中R1是α-OH，R2是α-Et，R3是β-OH，n＝0、1并且R是CH2OH。
对于一个方面，本发明涉及用于制备式(I)的化合物的方法，其中R1是β-OH，所述方法包括从式(XIII)的化合物开始,
Figure BDA0001967068730000161
其中R2是Et或H，优选Et，并且通过在碱存在下用甲苯磺酰氯处理然后用CH3COOK处理来使C3羟基构型反转。
对于一个方面，本发明涉及用于制备式(I)的化合物的方法，其中R1是H，所述方法包括对如以上所述的式(XIII)(XIII)的化合物进行在C-3羟基的甲苯磺酰化和消除，接着进行双键还原。
甲苯磺酰化优选为利用TsCl和吡啶进行。
消除优选利用LiBr和Li2CO3在DMF中在回流温度下进行。
双键还原优选通过催化氢化进行，优选利用H2和Pd(OH)2/C进行。
依照以下实施例和实验部分可以更好地理解本发明。
实验部分
化学
实施例1.其中R2＝H的式(I)的化合物的制备
实施例1A.双高熊脱氧胆烷(bis-homoursodeoxycholane)衍生物的合成
在1上的四步反应过程，包括在C3和C7的醇官能团的保护、侧链甲基酯的还原和随后的一锅法Swern氧化/Wittig C2同系化，得到受保护的Δ24,25-双-高UDCA的甲基酯。侧链双键氢化和醇官能团去保护得到双-高UDCA甲基酯4，其通过分别用LiOH和LiBH4处理，在BAR305以及其相应的醇BAR304的制备中用作起始材料。
Figure BDA0001967068730000171
a)2,6-二甲基吡啶，叔丁基二甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯，CH2Cl2，0℃；b)LiBH4，无水MeOH，THF，0℃，两步的定量收率；c)DMSO，草酰氯，无水TEA，CH2Cl2，-78℃，然后(三苯基膦烯)乙酸甲酯，76％；d)H2，Degussa型Pd(OH)2/C，THF/MeOH1:1，定量收率；e)HCl 37％，MeOH，定量收率；f)在MeOH/H2O 1:1v/v中的NaOH5％，60％；g)LiBH4，无水MeOH，THF，0℃，77％。
步骤a、b)3α,7β-二(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-5β-胆烷-24-醇(2)的制备
按照J.Med.Chem.2014,57,937中描述的相同合成过程，在两个醇官能团处对化合物1(1.2g，3mmol)进行保护，以得到1.9g的无色针状物形式的3α,7β-二(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-5□-胆烷-24-酸甲酯(定量收率)，其没有任何纯化下进行下一步骤。
按照J.Med.Chem.2014,57,937中描述的相同合成过程，在0℃将甲醇(850μL，21mmol)和LiBH4(10.5mL，2M在THF中，21mmol)加入至甲基酯(1.9g，3mmol)在无水THF(30mL)中的溶液中。通过硅胶(己烷/乙酸乙酯99:1和0.5％TEA)纯化，得到作为白色固体的2(1.8g，定量收率)。
步骤c)3α,7β-二(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-25,26-双高-5β-胆-24-烯-26-酸甲酯(3)的一锅法制备。
在-78℃在氩气氛下，在15min内将DMSO(2.1mL，30mmol)逐滴加入至草酰氯(7.5mL，15mmol)在无水二氯甲烷(30mL)中的溶液中。在30min之后，经由插管加入2(1.8g，3mmol)在无水CH2Cl2中的溶液中，并且将混合物在-78℃搅拌30min。逐滴加入Et3N(2.5mL，18mmol)。在1h之后，加入(三苯基膦烯)乙酸甲酯(2.0g，6mmol)，并且使混合物升温至室温。加入NaCl饱和溶液并且用二乙醚(3×100mL)萃取水相。将合并的有机相用水洗涤，干燥(Na2SO4)并且浓缩。通过硅胶(己烷-乙酸乙酯95:5和0.5％TEA)纯化，得到作为无色油状物的化合物3(1.5g，76％)。
步骤d)3α,7β-二(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-25,26-二高-5β-胆烷-26-酸甲酯的制备。按照J.Med.Chem.2014,57,937中描述的相同合成过程，在在Degussa型活性炭(20mg)上的Pd(OH)2 5重量％存在下，将化合物3(1.5g，2.3mmol)在THF无水/无水MeOH(25mL/25mL，v/v)中的溶液氢化，得到3α,7β-二(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-25,26-双高-5β-胆烷-26-酸甲酯(1.5g，定量收率)，其在没有纯化下进行步骤e)。
步骤e)甲基3α,7β-二羟基-25,26-二高-5β-胆烷-26-酸酯(4)的制备
将3α,7β-二(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-25,26-双高-5β-胆烷-26-酸甲酯(1.5g)溶解于甲醇(70mL)中。按照J.Med.Chem.2014,57,937中描述的相同合成过程，在溶液中加入HCl(2mL，37％v/v)，得到作为无色非结晶固体的4(1.0g，定量收率)。
步骤f)3α,7β-二羟基-25,26-双高-5β-胆烷-26-酸(BAR305)的制备。用在MeOH:H2O 1:1v/v(20mL)的溶液中的NaOH(400mg，10mmol)将一部分化合物4(430mg，1mmol)在回流下水解4h。通过在Nucleodur 100-5C18(5μm；4.6mm i.d.x 250mm)上用MeOH/H2O(95:5)作为洗脱液(流动速率1mL/分钟)的HPLC将分析样品纯化(tR＝5min)。
BAR305：C26H44O4
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.47(2H,m,H-3和H-7),2.27(2H，t,J＝7.2Hz,H2-25),0.96(3H，s，H3-19),0.94(3H,d,J＝6.5Hz,H3-21),0.70(3H,s，H3-18)。
在Varian Inova 100MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ178.2,72.1,71.9,57.6,56.7,44.8,44.5,44.0,41.6,40.7,38.6,38.0,36.9,36.8,36.1,35.3,35.2,30.9,29.8,27.9,26.7,26.6,23.9,22.4，19.3,12.7。
步骤g)25,26-双高-5β-胆烷-3α,7β,26-三醇(BAR304)。在步骤b)中描述的相同操作条件下，将化合物4(500mg，1.2mmol)还原。通过硅胶(CH2Cl2/甲醇9:1)纯化，得到作为无色油状物的BAR304(375mg，77％)。通过在Nucleodur 100-5C18(5μm；4.6mm i.d.x 250mm)上用MeOH/H2O(85:15)作为洗脱液(流动速率1mL/分钟)的HPLC将分析样品纯化(tR＝9min)。
BAR 304：C26H46O3
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.53(2H,t,J＝6.5Hz,H2-26),3.48(2H，m,H-3和H-7),0.95(3H,s,H3-19),0.93(3H,d,J＝6.5Hz,H3-21),0.70(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 100MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ72.1,71.9,63.0,57.5,56.7,44.7,44.4,44.0,41.6，40.7，38.5，37.9，37.2,37.0,36.1,35.2,33.7,30.9,29.8,27.9,27.4,27.1,23.9,22.4,19.4,12.7。
实施例1B.3α,7β-二羟基-24-降-5β-胆烷-23-基-23-硫酸钠(BAR106)和3α，7β-二羟基-24-降-5β-胆烷-23-醇(BAR107)的合成
通过包括在羟基的过甲酰化(performylation)、在C24的Beckmann一碳降解和C23羧基转化为相应的甲基酯中间体的反应过程，从UDCA开始制备BAR106。对作为甲硅烷基醚的在C-3和C-7的羟基的保护、在C23甲基酯的还原、在C23伯醇官能团的硫酸化和最后的去保护，得到作为铵盐的粗BAR106。在Amberlite上纯化之后通过HPLC，得到作为钠盐的标题BAR106。
Figure BDA0001967068730000191
a)HCOOH，HClO4，96％；b)TFA，三氟乙酸酐，NaNO2，96％；c)在MeOH/H2O1:1v/v中的KOH 30％，97％；d)p-TsOH，无水MeOH，98％；e)2,6-二甲基吡啶，叔丁基二甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯，CH2Cl2，0℃，88％；f)LiBH4，无水MeOH，THF，0℃，定量收率；g)Et3N.SO3，DMF，95℃；h)HCl 37％，MeOH，然后Amberlite CG-120，MeOH，经过两步86％；i)LiBH4，无水MeOH，THF，0℃，定量收率。
步骤a、d)3α,7β-二羟基-24-降-5β-胆烷-23-酸甲酯(6)的制备。
按照J.Med.Chem.2014,57,937中描述的相同合成过程，将熊脱氧胆酸(2.0g，5.1mmol)转化为3α,7β-二羟基-24-降-5β-胆烷-23-酸甲酯(6，1.6g，87％)。
步骤e)3α,7β-二(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-5β-胆烷-24-酸甲酯的制备。
在实施例1A的步骤a)中描述的相同操作条件下，在羟基对化合物6(1.2g，3.0mmol)进行保护。通过在硅胶上使用己烷/乙酸乙酯9:1和0.5％的三乙胺作为洗脱液的急骤色谱法纯化，得到受保护的甲基酯(1.6g，88％)。
步骤f)3α,7β-二(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-5β-胆烷-24-醇(7)的制备
在实施例1A的步骤b)中描述的相同操作条件下，将侧链甲基酯(818mg，1.3mmol)还原。通过在硅胶上使用己烷/乙酸乙酯98:2和0.5％的三乙胺作为洗脱液的急骤色谱法纯化，得到7(770mg，定量收率)。
步骤g、h)3α,7β-二羟基-24-降-5β-胆烷-23-基-23-硫酸钠(BAR106)的制备
按照J.Med.Chem.2014,57,937中描述的相同合成过程，将三乙胺-三氧化硫复合物(2.0g，11mmol)加入至7(660mg，1.1mmol)在无水DMF(25mL)中的溶液中。通过在Nucleodur 100-5C18(5μm；10mm i.d.x 250mm)上用MeOH/H2O(65:35)作为洗脱液(流动速率3mL/分钟)的HPLC，得到442mg(经过两步86％)的BAR106(tR＝8.4min)。
BAR 106：C23H39NaO6S
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ4.04(2H,m,H2-23),3.48(2H,m,H-3和H-7),1.00(3H,d,J＝6.5Hz,H3-21),0.97(3H,s,H3-19),0.72(3H,s,H3-18)。
步骤i)3α,7β-二羟基-24-降-5β-胆烷-23-醇(BAR107)的制备
在步骤f中描述的相同操作条件下，将化合物6转化为BAR107。
BAR107：C23H40O3
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.60(1H,m,H-7),3.51(1H,m,H-3),3.50(2H,m,H2-23),0.97(3H,d,ovl,H3-21),0.96(3H,s,H3-19),0.72(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 100MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ72.1,71.9,60.8,57.5,57.1,44.8,44.5,44.0,41.6,40.7,39.9,38.6,38.0,36.1,35.2,34.1,31.0,29.8,27.9,23.9,22.4,19.5,12.6；
实施例1C.7α-羟基-5β-胆烷-24-基-24-硫酸钠(BAR402)的合成
在甲基酯8上的C-3羟基进行甲苯磺酰化和消除反应，接着进行双键还原，随后在C-24伯羟基进行LiBH4处理和区域选择性(regioselective)硫酸化，得到BAR402。
Figure BDA0001967068730000211
a)p-TsCl，吡啶，定量收率；b)LiBr，Li2CO3，DMF，回流，c)H2，Pd(OH)2，THF/MeOH1:1，室温，定量收率；d)LiBH4，无水MeOH，THF，0℃，79％；e)Et3N.SO3，DMF，95℃。
步骤a-c)7-酮基-5β-胆烷-24-酸甲酯(9)的制备
向8(965mg，2.5mmol)在无水吡啶(100mL)中的溶液中加入甲苯磺酰氯(4.7g，25.0mmol)，并且将混合物在室温下搅拌4h。将其倒入冷水(150mL)中并且用CH2Cl2萃取(3×150mL)。将合并的有机层用饱和NaHCO3溶液(150mL)和水(150mL)洗涤，并且之后用无水MgSO4干燥并且在真空中蒸发，得到1.4g的3α-甲苯磺酰氧基-7-酮基-5β-胆烷-24-酸甲酯(定量收率)。将溴化锂(434mg，5.0mmol)和碳酸锂(370mg，5.0mmol)加入至3α-甲苯磺酰氧基-7-酮基-5β-胆烷-24-酸酯(1.4g，2.5mmol)在无水DMF(30mL)中的溶液中，并且将混合物回流2h。在冷却至室温之后，将混合物缓慢倒入10％HCl溶液(20mL)中并且用CH2Cl2萃取(3×50mL)。将合并的有机层相继用水、饱和NaHCO3溶液和水洗涤，之后用无水MgSO4干燥并且蒸发至干，得到965mg的油状物(oleo)残余物(定量收率)，其没有任何纯化下进行下一步骤。
在实施例1A的步骤d中描述的相同操作条件下，在Pd(OH)2上进行氢化，得到975mg的9(定量收率)，其没有任何纯化下进行下一步骤。
步骤d)5β-胆烷-7α,24-二醇的制备
在实施例1A的步骤b中描述的相同操作条件下，对化合物9进行LiBH4处理并且通过硅胶(乙酸乙酯-己烷，85:15)纯化，得到作为白色固体的5β-胆烷-7α,24-二醇(714mg，79％)。
步骤e)7α-羟基-5β-胆烷-24-基-24-硫酸钠(BAR402)的制备。在实施例1B的步骤g)中描述的相同操作条件下，在C24上进行硫酸化，得到作为铵盐的粗BAR402。通过在Nucleodur 100-5C18(5μm；10mm i.d.x 250mm)上用MeOH/H2O(90:10)作为洗脱液(流动速率3mL/分钟)的RP18/HPLC，得到作为钠盐的BAR402(tR＝6.6min)。
BAR402：C24H41NaO5S
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.96(2H，t,J＝6.6Hz,H2-24),3.78(1H,br s,H-7),0.96(3H,d,J＝6.5Hz,H3-21),0.92(3H,s,H3-19),0.69(3H,s,H3-18)；
在Varian Inova 100MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ69.7,69.4,57.7,51.6,45.0,43.8,41.2,41.0,39.0,37.1，37.0 36.3，34.2，33.3,31.7,29.5,29.0,27.3,24.8，24.3，22.7，21.9，19.2，12.3。
实施例2.其中R2＝Et或＝CH-CH3的式(I)的化合物的制备
实施例2A.6β-乙基-3α,7β-二羟基-5β-胆烷-24-醇(BAR501)的合成
通过在7-KLCA上的C-3羟基处的甲基酯形成和乙酰化，经过两步以84％收率得到中间体10。对甲硅烷基烯醇醚中间体的羟醛加成(aldolicaddition)生成11，其环外双键的氢化(H2，在Pd(OH)2上)，经过三步以80％收率得到12。通过在甲醇中进行NaBH4处理，接着对粗反应产物进行LiBH4还原，得到混合物，其进行HPLC纯化(88％MeOH:H2O)，相对于其C7差向异构体BAR504-6b以79％收率得到纯BAR501。
Figure BDA0001967068730000231
a)p-TsOH，无水MeOH；b)乙酸酐，吡啶，经过两步84％收率；c)DIPA，n-BuLi，TMSCl，无水TEA，无水THF，-78℃；d)乙醛，BF3(OEt)2，CH2Cl2，-60℃，经过两步80％；e)H2，Pd(OH)2，THF/MeOH 1:1，定量收率；f)NaBH4，MeOH；g)LiBH4，无水MeOH，THF，0℃，经过两步79％。
步骤a-d)3α-乙酰氧基-6-亚乙基(乙撑，ethylidene)-7-酮基-5β-胆烷-24-酸甲酯(11)的制备
向7-酮基石胆酸(5g，12.8mmol)溶解于100mL的无水甲醇中的溶液中加入对苯甲磺酸(11g，64.1mmol)。将溶液在室温下留置2h。通过加入NaHCO3饱和溶液将混合物猝灭。在将甲醇蒸发之后，用EtOAc萃取残余物(3x150mL)。将合并的萃取物用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，并且蒸发，得到作为非结晶固体的甲基酯(5.13g，定量收率)。
向所述甲基酯(5.13g，12.7mmol)在无水吡啶(100mL)中的溶液中加入过量的乙酸酐(8.4mL，89mmol)。当反应完成时，将吡啶在真空下浓缩。将残余物倒入冷水(100mL)中并且用AcOEt萃取(3×150mL)。将合并的有机相干燥(Na2SO4)并且浓缩，得到残余物，将其通过在硅胶上使用己烷/乙酸乙酯8:2和0.5％的三乙胺作为洗脱液的急骤色谱法进一步纯化(4.8g的作为白色固体的10，经过两步84％收率)。
在-78℃向二异丙基胺(23mL，0.16mol)在无水THF(50mL)中的溶液中逐滴加入正丁基锂(60mL，2.5M，在己烷中，0.15mol)的溶液。在30min之后，加入三甲基氯硅烷(27.1mL，0.21mol)。在另外的30min之后，加入化合物10(4.8g，10.7mmol)在无水THF(70mL)中的溶液。将反应在-78℃搅拌另外的45min之后加入三乙胺(54mL，0.38mol)。在1h之后，使反应混合物升温至-20℃，用NaHCO3的水性饱和溶液(100mL)处理，并且在2h内升温至室温。将水相用乙酸乙酯萃取(3x50mL)。然后合并的有机相用NaHCO3、水和盐水的饱和溶液洗涤。在用无水Na2SO4干燥之后，将残余物在真空下蒸发，得到6g的黄色残余物，将其在无水CH2Cl2(50mL)中稀释并且在-78℃冷却。向该搅拌溶液中逐滴加入乙醛(3mL，53mmol)和BF3·OEt2(13.5mL，0.107mol)。在-60℃将反应混合物搅拌2h并且使其升温至室温。将混合物用NaHCO3的饱和水溶液猝灭并且用CH2Cl2萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥并且在真空下浓缩。
通过硅胶(己烷-乙酸乙酯9:1和0.5％TEA)纯化，得到化合物11(4.1g，80％)。NMR分析显示非对映体比率E/Z＞95％。通过在Noesy光谱(400MHz，混合时间400ms)中将H3-26(δ1.67)/H-5(δ2.62)偶极耦合(dipolarcoupling)，确立在环外双键的E构型。
(E)-3α-乙酰氧基-6-亚乙基-7-酮基-5β-胆烷-24-酸酯(11)：C29H44O5
在Varian Inova 400MHz上，使用CDCl3作为溶剂，记录1H NMR：δ6.16(1H,q,J＝7.0Hz,H-25),4.74(1H,m,H-3),3.64(3H,s,COOCH3),2.62(1H,dd,J＝13.0,3.6Hz,H-5),1.98(3H,s,COCH3),1.67(3H,d,J＝7.0Hz,H3-26),1.00(3H,s,H3-19),0.92(3H,d,J＝6.0Hz,H3-21),0.67(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 100MHz上，使用CDCl3作为溶剂，记录13C NMR：δ204.5,174.6,170.7，143.1，130.2，72.5，54.5，51.4，50.7，48.6，45.2，43.5，39.1，38.9，35.1，34.9，34.1，33.4，31.0，30.9，28.4，25.9(2C)，22.8，21.4，21.2,18.4,12.7,12.2。
步骤e)3α-乙酰氧基-6β-乙基-7-酮基-5β-胆烷-24-酸甲酯(12)的制备。
在Pd(OH)2 20重量％存在下在degussa型活性炭(100mg)上将11(4.0g，8.5mmol)在无水THF/无水MeOH(100mL，1:1v/v)中的溶液氢化。将混合物转移至标准PARR装置并且用氮气然后用氢气冲洗数次。将该装置置于50psi的H2下。将反应在室温下搅拌8h。将催化剂通过硅藻土过滤，并且将回收的滤液在真空下浓缩，得到12(4.0g，定量收率)。
3α-乙酰氧基-6β-乙基-7-酮基-5β-胆烷-24-酸甲酯(12)：C29H46O5
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ4.65(1H,m,H-3),3.66(3H,s,COOCH3),2.56(1H,t,J＝11.5Hz,H-8),2.35(1H,m,H-23a)，2.22(1H,m，H-23b),1.99(3H,s,COCH3),1.22(3H,s,H3-19),0.92(3H,d,J＝6.3Hz,H3-21),0.83(3H,t,J＝7.2Hz,H3-26),0.67(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 100MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ214.7,174.3,170.2,72.6,61.7,54.8,51.3,49.0,48.5,45.3,42.7,42.3(2C),38.6,35.4,35.1,35.0,31.0，30.8，28.0(2C)，26.4，25.7，24.7,21.3,21.1,18.2,12.9,11.9。
通过在Noesy光谱(400MHz，混合时间400ms)中将H3-26(δ0.83)/H3-19(δ1.22)和H-8(δ2.56)/H-25(δ1.83)偶极耦合来确定在C-6的乙基的β构型。
步骤f、g)6β-乙基-3α，7β-二羟基-5β-胆烷-24-醇(BAR501)的制备。
在0℃向化合物12(1.18g，2.5mmol)的甲醇溶液加入大大过量的NaBH4。将混合物在室温下静置2h，之后逐滴加入水和MeOH，在0℃在15min的期间，观察到泡腾现象(effervescence)。在将溶剂蒸发之后，将残余物用水稀释并且用AcOEt萃取(3x50mL)。将合并的萃取物用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，并且蒸发，得到1.3g的粗残余物，其在没有进一步纯化下进行下一步骤。在实施例1A的步骤b)中描述的相同操作条件下，用LiBH4(2M，在THF中)处理粗残余物。通过在Nucleodur 100-5C18(5μm；10mm i.d.x 250mm)上用MeOH/H2O(88:12)作为洗脱液(流动速率3mL/分钟)的HPLC纯化，得到802mg的BAR501(79％，tR＝11min)。
备选地，用原位产生的Ca(BH4)2进行步骤f。
在0℃，向化合物12(500mg，1.05mmol)和无水乙醇(4mL)的溶液中加入CaCl2(466mg，4.2mmol)。向相同的溶液中加入NaBH4(159mg，4.2mmol)在无水乙醇(4mL)中的溶液。在4h之后，在-5℃，逐滴加入MeOH。然后，在将溶剂蒸发之后，将残余物用水稀释并且用AcOEt萃取(3x50mL)。将合并的萃取物用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，并且蒸发，得到500mg的粗残余物，其在没有进一步纯化下进行步骤g。
BAR501：C26H46O3
在Varian Inova 700MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.74(1H,dd,J＝10.3,6.0Hz,H-7),3.51(1H,ovl,H-3),3.49(2H,ovl,H2-24),1.00(3H,s,H3-19),0.97(3H,d,J＝6.5Hz,H3-21),0.96(3H,t,J＝7.6Hz,H3-26),0.72(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 175MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ75.3 71.9，63.6，57.5,56.5,51.6,45.7,44.9,42.1，41.5，40.4,40.3,37.1,35.8,32.4,30.7,30.3,29.7,29.6,28.3,26.2,23.4,22.1,19.4,14.8,12.7。
实施例2B.6β-乙基-3α,7α-二羟基-5β-胆烷-24-醇(BAR504-6b)的制备
如实施例2A中描述制备BAR504-6b(tR＝20.4min)。
BAR504-6b：C26H46O3
在Varian Inova 700MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.60(1H,s,H-7),3.51(2H,m,H2-24),3.35(1H,ovl,H-3),2.30(1H,q,J＝13.5Hz,H-4a),0.97(3H,d,J＝6.8Hz,H3-21),0.95(3H,t,J＝7.3Hz,H3-26),0.94(3H,s,H3-19),0.70(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 175MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ71.9，71.8，62.7，56.8,51.7,50.5，46.7,42.5,41.4,40.1,36.6,36.4,36.2,36.0,33.2,32.4,30.1,29.5,28.8,28.5,25.3,23.9,20.7,18.4,13.7,11.4。
实施例2C.6α-乙基-3α,7α-二羟基-24-降-5β-胆烷-23-醇(BAR502)、6β-乙基-3α,7β-二羟基-24-降-5β-胆烷-23-醇(BARn501)和6β-乙基-3α,7α-二羟基-24-降-5β-胆烷-23-醇(BARn504-6b)的合成
对7-KLCA(1g，2.56mmol)进行在C24的Beckmann降解和在C-23的甲基化，以66％收率得到13。通过在C-3的乙酰化和烷基化，得到14，将其氢化得到15。通过MeONa/MeOH处理，得到随后的在C-3的水解和在C-6的差向异构化。同时，通过在C-23甲基酯官能团和在C-7羰基的还原，以89％收率得到BAR502。在BARn501和BARn504-6b的制备中，还使用中间体15(250mg，0.54mmol)作为起始材料。
Figure BDA0001967068730000271
a)HCOOH，HClO4；b)TFA，三氟乙酸酐，NaNO2；c)在MeOH/H2O 1:1v/v中的KOH 30％，经过三步88％；d)对TsOH，无水MeOH；e)乙酸酐，吡啶；f)DIPA，n-BuLi，TMSCl，无水TEA，无水THF，-78℃；g)乙醛，BF3(OEt)2，CH2Cl2，-60℃，经过四步60％；h)H2，Pd(OH)2，THF/MeOH 1:1，定量收率；i)MeONa，MeOH；j)LiBH4，MeOH，无水THF，0℃，经过两步70％；k)NaBH4，无水MeOH，0℃；l)LiBH4，MeOH，无水THF，0℃，经过两步77％。
步骤a-d)7-酮基-24-降-LCA甲酯(13)的制备
在实施例1B的步骤a-d)中描述的相同操作条件下，从7-KLCA制备化合物13(660mg，1.69mmol，经过四步66％)。
步骤e-h)3α-乙酰氧基-6β-乙基-7-酮基-24-降-5β-胆烷-23-酸甲酯(15)的制备。使化合物13(660mg，1.69mmol)经历实施例2A的步骤b-d中描述的相同操作条件，得到603mg的14(经过三步78％)。NMR分析显示非对映体比率E/Z>95％。通过在Noesy光谱(400MHz，混合时间400ms)中将H3-25(δ1.67)/H-5(δ2.61)偶极耦合，确立在环外双键的E构型。
(E)-3α-乙酰氧基-6-亚乙基-7-酮基-24-降-5β-胆烷-23-酸酯(14)：C28H42O5
在Varian Inova 400MHz上，使用CDCl3作为溶剂，记录1H NMR：δ6.17(1H,q,J＝7.2Hz，H-24),4.75(1H,m,H-3),3.64(3H,s,COOCH3),2.61(1H,dd,J＝13.1,4.0Hz,H-5),1.98(3H,s,COCH3),1.67(3H,d,J＝7.2Hz,H3-25),1.00(3H,s,H3-19),0.97(3H,d,J＝6.8Hz,H3-21),0.67(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 100MHz上，使用CDCl3作为溶剂，记录13C NMR：δ204.5,174.2,170.5,143.0,130.6,72.5,54.7,51.4,50.7,48.6,45.3,43.7,41.5,39.1,38.8,34.6,34.2,33.6,33.4,28.5,25.9(2C),22.8,21.3(2C),19.7,12.7,12.1。
在实施例2A的步骤e中描述的相同操作条件下，在Pd(OH)2上进行氢化，得到600mg的15(定量收率)。
通过在Noesy光谱(400MHz，混合时间400ms)中将H3-25(δ0.83)/H3-19(δ1.22)偶极耦合来确定在C-6的乙基的β构型。
3α-乙酰氧基-6β-乙基-7-酮基-24-降-5β-胆烷-23-酸酯(15)：C28H44O5
在Varian Inova 400MHz上，使用CDCl3作为溶剂，记录1H NMR：δ4.65(1H,m,H-3),3.67(3H,s,COOCH3),2.60(1H,t,J＝11.2Hz,H-8),2.43(1H,dd,J＝14.2,2.6Hz,H-22a)，1.98(3H，s，COCH3)，1.88(1H,m ovl,H-6),1.22(3H,s,H3-19),0.98(3H,d,J＝6.4Hz,H3-21),0.83(3H,t,J＝7.0Hz,H3-25)，0.70(3H，s，H3-18)。
在Varian Inova 100MHz上，使用CDCl3作为溶剂，记录13C NMR：δ215.3,174.0,170.5,72.8,61.9,55.0,51.4,49.2,48.7,45.5,42.9,42.6,41.4,38.7(2C),35.6,35.3,34.9,28.3(2C),26.5,25.9,24.8,21.4,21.3,19.6,13.0,12.1。
步骤i、j)6α-乙基-3α,7α-二羟基-24-降-5β-胆烷-23-醇(BAR502)的制备
向化合物15(450mg，1.0mmol)和无水甲醇(4mL)的溶液中加入MeONa(20mL，0.5M，在MeOH中，10mmol)。在24h之后，逐滴加入H2O。然后，在将溶剂蒸发之后，将残余物用水稀释并且用AcOEt萃取(3x50mL)。将合并的萃取物用水洗涤，用Na2SO4干燥，并且蒸发，得到16，其在没有进一步纯化下进行步骤g。
6α-乙基-3α-羟基-7-酮基-24-降-5β-胆烷-23-酸甲酯(16)：C26H42O4
在Varian Inova 400MHz上，使用CDCl3作为溶剂，记录1H NMR：δ3.64(3H，s，COOCH3),3.45(1H,m,H-3),2.83(1H,q,J＝7.3Hz,H-6),2.51(1H,t,J＝11.2Hz,H-8),2.45(1H,dd,J＝14.5,3.2Hz,H-22a),1.26(3H,s,H3-19),0.98(3H,d,J＝6.6Hz,H3-21),0.81(3H,t,J＝7.0Hz,H3-25),0.73(3H,s，H3-18)。
在Varian Inova 100MHz上，使用CDCl3作为溶剂，记录13C NMR：δ214.9,175.4,71.6,56.2,53.2,52.0，51.9,51.0,50.5,45.2,43.8，42.2,40.2,36.7,35.3,34.8,32.5,30.5,29.4,25.6,24.0,22.9,20.1,20.0,12.6，12.4。
在实施例1A的步骤g中描述的相同操作条件下，对化合物16进行LiBH4还原。通过用己烷/EtOAc 6:4洗脱的硅胶色谱法，得到BAR502(274mg，经过两步70％)。通过在Nucleodur 100-5C18(5μm；4.6mm i.d.x 250mm)上用MeOH/H2O(88:12)作为洗脱液的HPLC得到分析样品(流动速率1mL/分钟，tR＝10.8min)。
BAR502：C25H44O3
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.65(1H,s,H-7),3.61(1H,m,H-23a),3.53(1H，m，H-23b)3.31(1H,m,H-3),0.97(3H,d,J＝6.6Hz,H3-21),0.92(3H,s,H3-19),0.91(3H,t,J＝7.0Hz,H3-25)，0.71(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 100MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ73.2，71.1，60.7,57.7,51.4,46.9,43.8,42.9，41.3,40.9,39.8,36.7,36.5,34.6,34.5,34.2,31.2,29.4,24.5,23.7，23.4,21.8,19.3,12.1,11.9。
步骤k、l)6β-乙基-3α,7β-二羟基-24-降-5β-胆烷-23-醇(BARn501)和6β-乙基-3α,7α-二羟基-24-降-5β-胆烷-23-醇(BARn504-6b)的制备。使化合物15(100mg，0.22mmol)经历在实施例2A的步骤f-g中描述的相同操作条件。通过在Nucleodur 100-5C18(5μm；10mmi.d.x 250mm)上用MeOH/H2O(86:14)作为洗脱液(流动速率3mL/分钟)的HPLC纯化，得到47mg的BARn501(54％，tR＝11min)和20mg的BARn504-6b(23％，tR＝15min)。
BARn501：C25H44O3
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.73(1H,dd,J＝10.5,5.5Hz,H-7),3.61(1H,m,H-23a),3.51(1H,m,ovl,H-23b),3.51(1H,m,ovl,H-3),0.98(3H,d,ovl,H3-21),0.97(3H,s,H3-19),0.96(3H,t,ovl,H3-25),0.70(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 100MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ75.2,71.8,60.8,57.5,56.6,51.5,45.5,44.8,42.0,41.4,40.7,40.3,39.9,36.9,36.0,34.2,30.5,29.6,28.3,26.2,23.4,22.0,19.4,14.7,12.9。
BARn504-6b：C25H44O3
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.63(1H,m,H-23a),3.60(1H,m,H-7),3.55(1H,m,H-23b),3.37(1H,m,H-3),2.30(1H,q,J＝12.5Hz,H-4a),0.97(3H,d,J＝6.6Hz,H3-21),0.95(3H,s,H3-19),0.95(3H,t,J＝7.0Hz,H3-25)，0.72(3H，s，H3-18)。
在Varian Inova 100MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ72.8,72.7,60.8,57.9,52.7，51.4，47.5，43.7,42.3,41.0,39.9,37.5,37.3,36.7,34.2,33.3,31.0,29.6,29.4,26.2,24.8,21.6,19.3,14.5,12.1.
实施例2D.6-亚乙基-3α,7β-二羟基-5β-胆烷-24-醇(BAR503)、6α-乙基-3α,7β-二羟基-5β-胆烷-24-醇(BAR501-6a)、6-亚乙基-3α，7β-二羟基-24-降-5β-胆烷-23-醇(BARn503)和6α-乙基-3α,7β-二羟基-24-降-5β-胆烷-23-醇(BARn501-6a)的合成
对中间体11进行NaBH4还原，接着用LiBH4进行处理。备选地，以直接的方式进行LiAlH4处理，提供在C-24和C-7的伴随还原。通过在Pd(OH)2催化剂上的氢化，还使用BAR503作为用于BAR501-6a的起始材料。对中间体14进行相同的合成方案，制备相应的23-衍生物BARn503和BARn501-6a。
Figure BDA0001967068730000301
a)NaBH4，MeOH；b)LiBH4，无水MeOH，THF，0℃，经过两步85％；c)H2，Pd(OH)2，THF:MeOH 1:1v/v。
步骤a、b).6-亚乙基-3α,7β-二羟基-5β-胆烷-24-醇(BAR503)和6-亚乙基-3α,7β-二羟基-24-降-5β-胆烷-23-醇(BARn503)的制备。
化合物11(1g，2.11mmol)经历在实施例2A的步骤f、g中描述的相同操作条件。通过在Nucleodur 100-5C18(5μm；10mm i.d.x 250mm)上用MeOH/H2O(88:12)作为洗脱液(流动速率3mL/分钟)的HPLC纯化，得到727mg的BAR503(经过两步85％，tR＝9.2min)。备选地，通过对11进行LiAlH4处理，得到BAR503。
BAR503：C26H44O3
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ5.66(1H,q,J＝6.9Hz,H-25),3.90(1H,d,J＝9.8Hz,H-7),3.55(1H,m,H-3),3.50(2H,m,H2-24),2.50(1H,dd,J＝4.0,13.1Hz,H-5),1.62(3H,d,J＝6.9Hz,H3-26),0.97(3H,d,J＝6.8Hz,H3-21),0.81(3H,s,H3-19),0.70(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 100MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ142.7，114.5，73.4，71.1，63.6，57.1，56.1,45.2,44.9，44.2，40.7，40.2，36.3,36.2,35.9,34.7,32.4,30.2,29.5,28.8,27.4,22.6,21.5,18.5,11.8,11.7。
对中间体14进行相同的合成方案。通过在Nucleodur 100-5C18(5μm；10mm i.d.x250mm)上用MeOH/H2O(86:14)作为洗脱液(流动速率3mL/分钟)的HPLC纯化，得到BARn503(tR＝8min)。
BARn503：C25H42O3
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ5.66(1H,q,J＝6.8Hz,H-24),3.92(1H，d,J＝9.9Hz,H-7),3.60(1H,m,H-23a),3.56(1H,m,H-3),3.55(1H,m,H-23b)，2.52(1H，dd，J＝3.7，13.2Hz，H-5),1.63(3H,d,J＝6.8Hz,H3-25),0.98(3H,d,J＝6.5Hz,H3-21),0.95(3H,s,H3-19)，0.71(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 100MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ143.7,115.4，74.1，71.8,60.8,58.0,57.1,46.1,45.9,45.1,41.6,41.1,39.9,37.0,36.4,35.8,34.1,30.9,29.8,28.1,23.5,22.5,19.5,12.7,12.6。
步骤c).6α-乙基-3α,7β-二羟基-5β-胆烷-24-醇(BAR501-6a)和6α-乙基-3α,7β-二羟基-24-降-5β-胆烷-23-醇(BARn501-6a)的制备
BAR503(350mg，0.86mmol)经历实施例2A的步骤e中描述的相同操作条件，以定量收率得到BAR501-6a。
BAR501-6a：C26H46O3
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.50(2H,t,J＝6.8Hz,H3-24),3.44(1H,m,H-3),3.07(1H,t,J＝9.8Hz,H-7),0.96(3H,d,J＝6.8Hz,H3-21),0.95(3H,s,H3-19),0.86(3H,t,J＝7.4Hz,H3-26),0.71(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 100MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ76.5,72.3,63.6,57.9,57.3,46.3,45.0,44.8,41.8,41.0,39.9,37.0,36.4,35.5,33.3,31.3,31.0,30.3,29.8,27.8,24.3,22.5,22.0,19.3,12.8,11.8。
BARn503经历实施例2A的步骤e中描述的相同操作条件，以定量收率得到BARn501-6a。
BARn501-6a：C25H44O3
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.62(1H,m,H-23a),3.54(1H,m,H-23b),3.45(1H,m,H-3),3.08(1H,t,J＝9.8Hz,H-7),0.97(3H,d,J＝6.5Hz,H3-21),0.95(3H,s,H3-19),0.86(3H,t,J＝7.4Hz,H3-25),0.73(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 100MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ76.4,72.5,60.8,57.9,57.2,46.2,45.1,44.7,41.8,41.2,40.0,39.8,36.5,35.6,34.2,31.2,30.9,29.9,27.9,24.1,22.7,22.0,19.5,12.7,11.7。
实施例2E.6α-乙基-3α,7α-二羟基-24-降-5β-胆烷-23-腈(BAR506)的合成
按照实施例1B的步骤a-b中描述的相同合成过程，将7-KLCA转化为腈17。分别在实施例2A的步骤c-d和实施例2C的步骤i中描述的相同操作条件下，进行烷基化，接着进行双键还原和在C-6的差向异构化，得到18。与在实施例2C的步骤j中一样进行LiBH4处理，得到BAR506中所需的7α羟基。
Figure BDA0001967068730000321
a)HCOOH，HClO4；b)TFA，三氟乙酸酐，NaNO2；c)DIPA，n-BuLi，TMSCl，无水TEA，无水THF，-78℃；d)乙醛，BF3(OEt)2，CH2Cl2，-60℃；e)H2，Pd(OH)2，THF/MeOH 1:1；f)MeONa，MeOH；g)LiBH4，MeOH，无水THF，0℃
BAR506：C25H41NO2
在Varian Inova 700MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.66(1H,br s,H-7),3.31(1H,ovl,H-3),2.46(1H,dd,J＝3.8,16.9Hz,H-22a),2.34(1H,dd,J＝7.4,16.9Hz,H-22b),1.16(3H,d,J＝6.5Hz,H3-21)，0.91(3H,t,J＝7.5Hz,H3-25)，0.92(3H,s,H3-19),0.73(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 175MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ120.3,72.9,70.9,56.1,51.5,46.7,43.4,42.9,41.4,40.2,36.5,36.2,34.3(2C),34.2,30.7,29.2,24.9,24.4,23.4，23.3，21.9,18.5,12.1,11.6。
实施例2F.6α-乙基-7α-羟基-5β-胆烷-24-醇(BAR701)、6α-乙基-7α-羟基-5β-胆烷-24-基24-硫酸钠(BAR701solf)、6β-乙基-7β-羟基-5β-胆烷-24-醇(BAR702)、6α-乙基-7β-羟基-5β-胆烷-24-醇(BAR703)、6α-乙基-7α-羟基-5β-胆烷-24-酸(BAR704)、6α-乙基-7α-羟基-5β-胆烷-24-酰基牛磺酸钠(BART704)、6β-乙基-7α-羟基-5β-胆烷-24-醇(BAR705)和6α-乙基-7β-羟基-5β-胆烷-24-酸(BAR711)的合成
用MeONa在甲醇中处理化合物12，以获得在C-3的脱乙酰和在C-6的反转(inversion)。通过环A上的双键的甲苯磺酰化、消除反应和氢化，得到20。在甲基酯官能团进行水解，接着进行LiBH4处理，以高化学收率得到BAR704。还使用中间体20作为用于BAR701的起始材料。对BAR701的小试样在C-24上进行硫酸化，得到BAR701solf。
Figure BDA0001967068730000331
a)MeONa，MeOH；b)p-TsCl，吡啶，经过两步定量收率；c)LiBr，Li2CO3，DMF，回流，d)H2，Pd(OH)2，THF/MeOH 1:1，室温，经过两步88％；e)NaOH，MeOH:H2O1:1v/v，82％；f)LiBH4，无水MeOH，THF，0℃，83％；g)DMT-MM，Et3N，牛磺酸，无水DMF；h)LiBH4，无水MeOH，THF，0℃，77％；i)Et3N.SO3，DMF，95℃。
步骤a-f)6α-乙基-7α-羟基-5β-胆烷-24-酸(BAR704)的制备。
在实施例2C的步骤i的相同操作条件下，用MeONa(2.1mL，0.5M，在MeOH中，1.05mmol)在MeOH(5mL)中过夜处理化合物12(500mg，1.05mmol)。在实施例1C的步骤a的相同操作条件下，对粗反应产物进行甲苯磺酰化，得到19(620mg，经过两步定量收率)。中间体19(500mg，0.85mmol)经历实施例1C的步骤b、c的相同操作条件，获得312mg的20(经过两步88％)。在实施例1A的步骤f的相同操作条件下，将化合物20(200mg，0.48mmol)用NaOH(96mg，2.4mmol)在MeOH:H2O 1:1v/v(10mL)的溶液中水解。将粗羧酸中间体(190mg，0.47mmol)用LiBH4(1.65mL，2M，在THF中，3.3mmol)和在无水THF(5mL)中的MeOH(133μL，3.3mmol)处理。通过硅胶(CH2Cl2-MeOH 99:1)纯化，得到157mg的BAR704(83％)。在相同的实施方案中，在碱水解之后的LiBH4处理得到少量(约10％)的6α-乙基-7β-羟基-5β-胆烷-24-酸(BAR711)，其通过在Nucleodur 100-5C18(5μm；10mm i.d.x 250mm)上用MeOH/H2O(88:12)作为洗脱液的HPLC纯化(流动速率3mL/分钟，tR＝16min)分离。
BAR704：C26H44O3
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.65(1H,br s,H-7),2.34(1H,m,H-23a),2.20(1H,m,H-23b),0.96(3H,d，J＝6.3Hz,H3-21),0.92(3H,s，H3-19),0.89(3H,t,J＝7.4Hz,H3-26),0.70(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 100MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ178.0,71.6,57.4，51.7，48.7,43.8,43.3,41.5，41.1,39.3,37.4，36.8，34.6,32.5(2C),29.3,28.8,25.1,24.6(2C),23.5，22.5,22.0,18.8,12.2,12.1。
BAR711：C26H44O3
在Varian Inova 500MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.08(1H,t,J＝9.6Hz,H-7),2.32(1H,m,H-23a),2.20(1H,m，H-23b)，0.96(3H，d,J＝6.2Hz,H3-21),0.95(3H,s,H3-19),0.85(3H,t,J＝7.0Hz,H3-26),0.70(3H,s,H3-18)。
步骤g)6α-乙基-7α-羟基-5β-胆烷-24-酰基牛磺酸钠(BART704)的制备
将在无水DMF(5mL)中的BAR704的试样(10mg，0.024mmol)用DMT-MM(20.5mg，0.07mmol)和三乙胺(83μL，0.6mmol)处理，并且将混合物在室温下搅拌10min。然后向混合物中加入牛磺酸(18mg，0.14mmol)。在3h之后，将反应混合物在真空下浓缩并且溶解于水中(5mL)。进行在C18硅胶柱上的纯化，之后进行在Nucleodur 100-5C18(5μm；10mm i.d.x250mm)用MeOH/H2O(83:17)作为洗脱液(流动速率3mL/分钟)的HPLC，得到4.5mg BART704(tR＝10min)。
BART704：C28H48NNaO5S
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.65(1H,br s,H-7),3.58(2H,t,J＝7.0Hz,CH2-N)，2.96(2H，t,J＝9.6Hz,CH2-S),2.25(1H,m,H-23a),2.10(1H,m，H-23b),0.97(3H,d,J＝6.4Hz,H3-21),0.92(3H,s,H3-19),0.89(3H,t,J＝7.1Hz,H3-26),0.70(3H,s,H3-18)。
步骤h)6α-乙基-7α-羟基-5β-胆烷-24-醇(BAR701)的制备
在实施例2C的步骤j的相同操作条件下处理化合物20(100mg，0.24mmol)。通过在Nucleodur 100-5C18(5μm；10mm i.d.x 250mm)上用MeOH/H2O(92:8)作为洗脱液(流动速率3mL/分钟)的HPLC纯化，得到64mg的BAR701(tR＝31min)和少量的6α-乙基-7β-羟基-5β-胆烷-24-醇(BAR703)(8mg，tR＝24.8min)。
BAR701：C26H46O2
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.65(1H,br s,H-7),3.51(2H,m,H2-24),0.97(3H,d,J＝6.3Hz,H3-21)，0.92(3H,s,H3-19),0.89(3H,t,J＝7.3Hz，H3-26),0.71(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 100MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ71.6,63.6,57.6,51.8,48.7,43.7,43.3,41.5,41.1,39.3,37.5,37.0,34.6,33.2,30.3，29.4,28.8,25.1,24.6(2C)，23.5,22.5,22.0,19.2,12.3,12.1。
BAR703C26H46O2
在Varian Inova 500MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.51(2H,m,H2-24),3.07(1H,t，J＝10.0Hz,H-7),0.96(3H,d,J＝6.6Hz,H3-21),0.84(3H,t,J＝7.0Hz,H3-26)，0.95(3H,s,H3-19),0.71(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 100MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ76.3,63.6,57.9,56.8,46.3，45.3,45.0,44.7,41.7,41.1,38.8,37.0,36.3,33.3,30.3,28.1，27.9(2C)，25.0(2C),22.0,21.9(2C),19.4,12.7,11.6。
步骤i)6α-乙基-7α-羟基-5β-胆烷-24-基24-硫酸钠(BAR701solf)的制备
在实施例1B的步骤g)中描述的相同操作条件下，对BAR701的小试样在C-24上进行硫酸化，得到作为铵盐的粗BAR701solf。通过在Nucleodur100-5C18(5μm；10mm i.d.x250mm)上用MeOH/H2O(82:18)作为洗脱液(流动速率3mL/分钟)的RP18/HPLC，得到作为钠盐的BAR701solf(tR＝14.2min)。
BAR701solf：C26H45NaO5S
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.96(2H,t,J＝6.3Hz,H2-24),3.64(1H,br s，H-7),0.96(3H，d,J＝6.6Hz,H3-21),0.91(3H,s,H3-19),0.88(3H,t,J＝7.4Hz,H3-26),0.69(3H,s,H3-18)。
6β-乙基-7β-羟基-5β-胆烷-24-醇(BAR702)和6β-乙基-7α-羟基-5β-胆烷-24-醇(BAR705)的制备
除了反应时间(2h)之外，在实施例2C的步骤i的相同操作条件下，用MeONa(2.1mL，0.5M，在MeOH中，1.05mmol)在MeOH(10mL)中处理化合物12(500mg，1.05mmol)。在实施例1C的步骤a的相同操作条件下，对粗反应产物进行甲苯磺酰化，得到21(620mg，经过两步定量收率)。中间体21(600mg，1.02mmol)经历实施例1C的步骤b、c的相同操作条件，获得400mg的22(94％)。在实施例2A的步骤f、g的相同操作条件下，用NaBH4/LiBH4将化合物22(350mg、0.84mmol)还原。通过在Nucleodur 100-5C18(5μm；10mm i.d.x 250mm)上用MeOH/H2O(92:8)作为洗脱液(流动速率3mL/分钟)的HPLC纯化，得到180mg的BAR702(tR＝25min)和75.4mg的BAR705(tR＝13min)。备选地，用原位产生的Ca(BH4)2进行步骤e。
Figure BDA0001967068730000361
a)MeONa，MeOH；b)p-TsCl，吡啶，经过两步定量收率；c)LiBr，Li2CO3，DMF，回流；d)H2，Pd(OH)2，THF/MeOH 1:1，室温，经过两步94％；e)NaBH4，MeOH；f)LiBH4，无水MeOH，THF，0℃，经过两步78％。
BAR702：C26H46O2
在Varian Inova 700MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.67(1H,dd,J＝8.7,4.7Hz,H-7),3.51(2H,m,H2-24),0.98(3H,s，H3-19),0.97(3H,d,J＝6.6Hz,H3-21),0.96(3H，t,J＝7.4Hz,H3-26)，0.71(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 175MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ75.5,63.8,57.6,56.5,44.2,43.7,42.8,41.0,40.9,40.8,38.2(2C),36.9,34.4,32.8,29.7,28.9,27.0,26.1,24.7,22.2,22.0(2C),19.2,13.9,12.3。
BAR705：C26H46O2
在Varian Inova 700MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.59(1H,br s,H-7),3.51(2H,m,H2-24),2.23(1H,dq,J＝13.9,4.0Hz,H-4a),0.97(3H,d,J＝6.6,H3-21),0.95(3H,t,J＝7.1Hz,H3-26),0.94(3H,s,H3-19),0.70(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 175MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ73.1,63.2，57.3,52.8,51.4,49.4,43.8,41.3,39.7,37.4(2C),37.2，34.2，32.6(2C)，29.9,29.5,28.9,28.3,27.3,24.5,21.7,21.2,18.8,14.3,12.3。
实施例2G.6α-乙基-3β，7α-二羟基-5β-胆烷-24-酸(BAR710)、6α-乙基-3β，7α-二羟基-5β-胆烷-24-酰基牛磺酸钠(BART710)、6α-乙基-3β,7α-二羟基-5β-胆烷-24-醇(BAR706)、6α-乙基-3β，7α-二羟基-5β-胆烷-24-基24-硫酸钠(BAR706solf)、6α-乙基-3β、7β-二羟基-5β-胆烷-24-醇(BAR707)、6β-乙基-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-醇(BAR708)和6β-乙基-3β,7α-二羟基-5β-胆烷-24-醇(BAR709)和6α-乙基-3β，7β-二羟基-5β-胆烷-24-酸(BAR712)的合成。
在会聚方案中，对衍生物19进行在C-3的反转，接着用MeONa/MeOH进行处理，得到23，其在BAR706、BAR706solf、BAR710和BART710的合成中用作起始材料。进行在C-3的反转，接着进行在C-7和C-24的还原，制得BAR708和BAR709。
Figure BDA0001967068730000381
a)CH3COOK，DMF：H2O 5:1v/v；b)NaOMe，MeOH、经过两步74％；c)NaOH，MeOH:H2O 1:1v/v；d)LiBH4，无水MeOH，THF，0℃，经过两步65％；e)DMT-MM，Et3N，牛磺酸，无水DMF；f)LiBH4，无水MeOH，THF，0℃，58％；g)Et3N.SO3，DMF，95℃；h)CH3COOK，DMF：H2O 5:1；i)NaBH4，MeOH；j)LiBH4，无水MeOH，THF，0℃，经过三步74％。
步骤a-d)6α-乙基-3β，7α-二羟基-5β-胆烷-24-酸(BAR710)的制备
将21(600mg，1.0mmol)和CH3COOK(98mg，1.0mmol)溶解于水(2mL)和N,N’-二甲基甲酰胺(DMF，10mL)中的溶液回流2h。将溶液在室温下冷却，之后加入乙酸乙酯和水。将分离的水相用乙酸乙酯萃取(3x 30mL)。将合并的有机相用水洗涤，干燥(Na2SO4)并且蒸发至干，得到600mg的混合物。通过硅胶(己烷-乙酸乙酯8:2和0.5％TEA)纯化，得到350mg的油状物(oleos oil)。在与实施例2C的步骤i中描述相同的操作条件下进行C-6反转，得到23(320mg，经过两步74％)，对其进行水解，接着如在实施例2F的步骤e、f中描述的处理进行LiBH4处理。通过在Nucleodur100-5C18(5μm；10mm i.d.x 250mm)上用MeOH/H2O(88:12)作为洗脱液(流动速率3mL/分钟)的HPLC纯化，得到208mg的BAR710(65％，tR＝11min)。备选地，对21进行在C-3的反转，接着进行碱水解，之后进行LiBH4处理，以直接方式得到BAR710。
在相同的实施方案中，在碱水解之后的LiBH4处理得到少量(约10％)的6α-乙基-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酸(BAR712)，其通过在Nucleodur100-5C18(5μm；10mm i.d.x250mm)上用MeOH/H2O(88:12)作为洗脱液的HPLC纯化(流动速率3mL/分钟，tR＝8min)分离
BAR710：C26H44O4
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.97(1H,br s,H-3),3.67(1H,br s,H-7),2.33(1H,m,H-23a),2.21(1H,m,H-23b)，0.96(3H,d,J＝6.5Hz,H3-21),0.94(3H,s，H3-19),0.91(3H,t,J＝7.6Hz,H3-26),0.70(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 100MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ178.3,71.3,67.5,57.4,51.7,43.8,42.8,41.5,41.2,41.0,37.0,36.7,33.8,32.4，32.0，31.1(2C)，29.3，28.3，24.6,24.2,23.3,22.2,18.8,12.3,12.2。
BAR712：C26H44O4
在Varian Inova 500MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ4.01(1H，br s，H-3)，3.06(1H,t,J＝9.7Hz,H-7),2.32(1H,m,H-23a),2.19(1H,m,H-23b),0.97(3H,s,H3-19),0.96(3H,d,ovl,H3-21),0.87(3H,t,J＝7.7Hz,H3-26),0.71(3H,s,H3-18)。
步骤e)6α-乙基-3β,7α-二羟基-5β-胆烷-24-酰基牛磺酸钠(BART710)的制备
在实施例2F的步骤g的相同操作条件下处理BAR710的试样(10mg)。
BART710：C28H48NNaO6S
在Varian Inova 500MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.97(1H,br s,H-3),3.67(1H,br s,H-7),3.59(2H,t,J＝6.8Hz,CH2-N),2,96(2H,t,J＝6.8Hz,CH2-S),0.97(3H,d,J＝6.4Hz，H3-21)，0.95(3H，s，H3-19)，0.91(3H，t，J＝7.1Hz,H3-26),0.70(3H,s,H3-18)。
步骤f)6α-乙基-3β,7α-二羟基-5β-胆烷-24-醇(BAR706)和6α-乙基-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-醇(BAR707)的制备
如实施例2C的步骤j中描述的，将中间体23(500mg，1.16mmol)用在无水THF(10mL)中的LiBH4(4mL，8.1mmol)和MeOH(327μL，8.1mmol)处理。通过在Nucleodur 100-5C18(5μm；10mm i.d.x 250mm)上用MeOH/H2O(88:12)作为洗脱液(流动速率3mL/分钟)的HPLC纯化，得到BAR706(250mg，tR＝12.6min)和少量的6α-乙基-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-醇(BAR707)(23mg，tR＝8.2min)。
BAR706：C26H46O3
在Varian Inova 500MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.97(1H,br s,H-3),3.66(1H，br s，H-7)，3.51(2H，m，H2-24)，0.96(3H,d,J＝6.6Hz，H3-21),0.94(3H,s,H3-19),0.91(3H,t,J＝7.5Hz,H3-26),0.70(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 125MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ71.4,67.4,63.6,57.6,51.7,43.7,42.8,41.5，41.2,41.1,37.1(2C),33.8，33.2,31.3(2C),30.3,29.4,28.3，24.6,24.2,23.3,22.3，19.2,12.7,12.1。
BAR707：C26H46O3
在Varian Inova 500MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ4.01(1H,br s,H-3),3.51(2H,m,H2-24),3.05(1H,t,J＝9.7Hz,H-7),0.97(3H,s,H3-19),0.96(3H,d,J＝6.4Hz,H3-21),0.88(3H,t,J＝7.6Hz,H3-26),0.72(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 100MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ76.3,67.1,63.6,57.8,56.8,45.0,44.8,44.5,41.7,40.3,39.1,37.0,35.9,33.0,31.2,30.2,29.8,28.4,28.0,27.9,24.8,22.9,21.8,19.3,12.8,11.6。
步骤g)6α-乙基-3β,7α-二羟基-5β-胆烷-24-基24-硫酸钠(BAR706solf)的制备
在实施例1B的步骤g)中描述的相同操作条件下对BAR706的小试样在C-24上进行硫酸化。
BAR706solf：C26H45NaO6S
在Varian Inova 500MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.97(1H,br sovl,H-3),3.96(2H,t ovl,H2-24),3.65(1H,br s,H-7),0.96(3H,d，J＝6.6Hz,H3-21),0.94(3H,s,H3-19)，0.90(3H,t,J＝7.5Hz,H3-26),0.70(3H,s,H3-18)。
步骤h、i、j)6β-乙基-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-醇(BAR708)和6β-乙基-3β,7α-二羟基-5β-胆烷-24-醇(BAR709)的制备。
在步骤a的相同操作条件下处理化合物19。在实施例2A的步骤f、g的相同操作条件下进行100mg(0.23mmol)的NaBH4/LiBH4还原，得到混合物，对其进行HPLC纯化(88％MeOH:H2O)，得到纯净的6β-乙基-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-醇(BAR708)(48.3mg，tR＝11min)和6β-乙基-3β,7α-二羟基-5β-胆烷-24-醇(BAR709)(20.7mg，tR＝13min)。备选地，用原位产生的Ca(BH4)2进行步骤i。
BAR708：C26H46O3
在Varian Inova 700MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.59(1H,br s,H-3),3.57(1H,dd，J＝12.6,2.3Hz,H-7)，3.51(2H,m,H2-24),0.98(3H,s,H3-19),0.96(3H,ovl,H3-21),0.96(3H,t,ovl,H3-26),0.70(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 175MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ75.2,68.3，63.6,58.3,57.1,45.7(2C),44.2,41.8(2C),41.2,40.0,37.0,35.9,33.3,31.1,30.3,29.4(2C),26.6(2C),23.2(2C),19.3,13.0,12.3。
BAR709：C26H46O3
在Varian Inova 700MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.91(1H,br s,H-3),3.60(1H,br s,H-7),3.51(2H,m,H2-24),2.45(1H,t,J＝13.3Hz,H-4a),0.97(3H,s,H3-19)，0.97(3H，ovl,H3-21)，0.95(3H,t,J＝7.4Hz,H3-26),0.71(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 175MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ72.8,67.4,63.4,57.2,51.3,51.2，43.2,41.6,40.5,37.3,37.1(2C),36.9，34.0,33.3,32.1,30.3，29.3,28.9,28.6,26.3,24.9,22.0，19.3,13.8,12.1。
实施例2H.6α-乙基-7α-羟基-24-降-5β-胆烷-23-酸(BARn704)、6α-乙基-7α-羟基-24-降-5β-胆烷-23-酰基牛磺酸钠(BARTn704)、6α-乙基-7α-羟基-24-降-5β-胆烷-23-醇(BARn701)和6α-乙基-7α-羟基-24-降-5β-胆烷-23-基23-硫酸钠(BARn701solf)的合成
从15开始并且按照针对它们的C24同系物描述的合成方案(实施例2F的步骤a-i)制备BARn704、BARTn704、BARn701和BARn701solf。
Figure BDA0001967068730000421
a)MeONa，MeOH；b)p-TsCl，吡啶，经过两步73％；c)LiBr，Li2CO3，DMF，回流，d)H2，Pd(OH)2，THF/MeOH 1:1，室温，经过两步定量收率；e)NaOH，MeOH：H2O 1:1v/v，80％；f)LiBH4，无水MeOH，THF，0℃，92％；g)DMT-MM，Et3N，牛磺酸，无水DMF；h)LiBH4，无水MeOH，THF，0℃，70％；i)Et3N.SO3，DMF，95℃。
BARn704：C25H42O3
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.64(1H,br s,H-7),2.41(1H,dd,J＝11.0,2.6Hz,H-22a),1.00(3H，d，J＝6.0Hz,H3-21),0.90(3H,s,H3-19),0.87(3H，t,J＝7.4Hz,H3-25),0.71(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 100MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ178.9,71.6，57.5,51.7，48.6，43.8,43.4,43.3,41.5,40.9,39.1,37.4,35.2,34.6,29.4，28.8,25.0,24.6(2C)，23.5,22.4,22.0,20.1,12.2,12.1。
BARTn704：C27H46NNaO5S
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.64(1H,br s,H-7)，3.59(2H,t,J＝6.8Hz,CH2-N)，2.96(2H,t,J＝6.8Hz,CH2-S),2.40(1H,dd,J＝11.0,2.8Hz,H-22a)，1.00(3H，d,J＝6.0Hz,H3-21),0.89(3H,s,H3-19),0.86(3H,t,J＝7.4Hz,H3-25),0.70(3H,s,H3-18)。
BARn701：C25H44O2
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.66(1H,br s,H-7),3.61(1H,m,H-23a),3.54(1H，m,H-23b)，0.96(3H,d,J＝6.7Hz,H3-21),0.91(3H,s,H3-19),0.89(3H,t,J＝7.3Hz,H3-25),0.70(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 100MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ71.5,60.8,57.8,51.7,48.6,43.8,43.3,41.5,41.1,39.9,39.2,37.4,34.5,34.2,29.4,28.8,25.0,24.6(2C),23.5，22.5,22.0，19.4,12.2，12.1。
BARn701solf：C25H43NaO5S
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ4.02(2H,m,H2-23),3.65(1H,br s,H-7),0.97(3H,d,J＝6.7Hz,H3-21),0.91(3H,s,H3-19),0.88(3H,t,J＝7.5Hz,H3-25),0.70(3H,s,H3-18)。
实施例2I.6α-乙基-3β,7α-二羟基-24-降-5β-胆烷-23-酸(BARn710)、6α-乙基-3β,7α-二羟基-24-降-5β-胆烷-23-酰基牛磺酸钠(BARTn710)、6α-乙基-3β,7α-二羟基-24-降-5β-胆烷-23-醇(BARn706)和6α-乙基-3β,7α-二羟基-24-降-5β-胆烷-23-基23-硫酸钠(BARn706solf)的合成
Figure BDA0001967068730000431
a)CH3COOK，DMF：H2O 5:1v/v；b)NaOH，MeOH：H2O 1:1v/v；c)LiBH4，无水MeOH，THF，0℃，经过两步58％；d)DMT-MM，Et3N，牛磺酸，无水DMF；e)LiBH4，无水MeOH，THF，0℃，57％；f)Et3N.SO3，DMF，95℃。
从24开始并且按照针对它们的C24同系物描述的合成方案(实施例2G的步骤c-g)制备BARn710、BARTn710、BARn706和BARn706solf。
BARn710：C25H42O4
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.97(1H,br s,H-3),3.66(1H,br s,H-7),2.42(1H,dd,J＝11.3,3.3Hz,H-22a),1.02(3H,d，J＝6.0Hz,H3-21),0.94(3H,s,H3-19)，0.91(3H,t,J＝7.3Hz,H3-25),0.73(3H,s，H3-18)。
在Varian Inova 100MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ177.7，71.3,67.4，57.4,51.8,43.8(2C)，42.8,41.5,41.2,41.0,37.0,35.1,33.8，31.3,31.2,29.4,28.3，24.6，24.2,23.3,22.2,20.0,12.2,12.1。
BARTn710：C27H46NNaO6S
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.97(1H,br s,H-3),3.66(1H,br s,H-7),3.59(2H,t,J＝6.8Hz,CH2-N),2.96(2H,t，J＝6.8Hz，CH2-S),2.42(1H,dd,J＝11.3，3.3Hz,H-22a),1.00(3H,d,J＝6.3Hz,H3-21),0.94(3H,s,H3-19),0.90(3H,t,J＝7.0Hz,H3-25),0.70(3H,s,H3-18)。
BARn706：C25H44O3
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.97(1H,br s,H-3),3.67(1H,br s,H-7),3.61(1H,m,H-23a),3.55(1H,m,H-23b),0.97(3H,d,J＝6.6Hz，H3-21),0.95(3H,s,H3-19),0.91(3H，t，J＝7.4Hz,H3-25),0.71(3H,s，H3-18)。
在Varian Inova 100MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ71.4,67.4,60.8,57.9,51.8,43.8,42.8,41.5,41.2,41.1,39.9,37.0,34.2，33.8，31.3，31.2,29.4,28.3,24.6,24.2,23.3,22.3,19.4,12.2,12.1。
BARn706solf：C25H43NaO6S
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ4.05(2H,m，H2-23)，3.97(1H，br s,H-3),3.66(1H,br s,H-7),1.00(3H,d,J＝6.0Hz,H3-21),0.94(3H,s,H3-19),0.91(3H,t,J＝6.9Hz,H3-25),0.71(3H,s,H3-18)。
实施例2J.6α-乙基-3α,7α-二羟基-25,26-双高-5β-胆烷-26-酸(BAR802)、6α-乙基-3α,7α-二羟基-25,26-双高-5β-胆烷-26-醇(BAR803)和6α-乙基-3α,7α-二羟基-25,26-双高-5β-胆烷-26-基-26-硫酸钠(BAR804)的制备
Figure BDA0001967068730000451
a)2,6-二甲基吡啶，叔丁基二甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯，CH2Cl2，0℃；b)LiBH4，无水MeOH，THF，0℃，经过两步68％；c)DMSO，草酰氯，无水TEA，CH2Cl2，-78℃，然后(三苯基膦烯)乙酸甲酯、79％；d)H2，Degussa型Pd(OH)2/C，THF/MeOH 1:1，定量收率；e)HCl 37％，MeOH，87％；f)在MeOH/H2O中的NaOH 5％，1:1v/v，89％；g)LiBH4，无水MeOH，THF，0℃，78％；h)Et3N.SO3，DMF，95℃，25％。
按照与在实施例1A的步骤a-g中相同的合成方案制备BAR802-804。在实施例1B的步骤g的相同的操作条件下对BAR803的小试样进行硫酸化，得到BAR804。
BAR802：C28H48O4
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.66(1H,br s,H-7),3.31(1H,m ovl,H-3),2.24(2H,t,J＝7.3Hz,H2-25),0.95(3H,d,J＝6.4Hz,H3-21),0.92(3H，s，H3-19),0.91(3H,t,J＝6.9Hz,H3-28)，0.70(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 175MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ186.7,73.3,71.3,57.7,51.7,47.0,43.7,43.1,41.6，41.1，37.1,36.9,36.8,36.6,34.5，34.4(2C),31.3,29.4,27.0(2C),24.6,23.8,23.5，22.0，19.2,12.2,12.0。BAR803：C28H50O3
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.64(1H,br s,H-7),3.53(2H，t，J＝6.6Hz,H2-26),3.30(1H,m ovl,H-3),0.94(3H,d,J＝6.7Hz,H3-21),0.91(3H，s,H3-19),0.90(3H,t,J＝7.0Hz,H3-28),0.68(3H,s,H3-18)。
在Varian Inova 175MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录13C NMR：δ73.3,71.3,63.1,57.7,51.7,47.0,43.7,43.1,41.6,41.1,37.1，36.8(2C),36.6,34.5,34.4,33.7,31.3,29.5,27.4，27.0，24.6,23.8,23.5,22.0,19.3,12.3,12.0。BAR804：C28H49NaO6S
在Varian Inova 400MHz上，使用CD3OD作为溶剂，记录1H NMR：δ3.99(2H,t,J＝6.6Hz，H2-26),3.65(1H,br s,H-7),3.31(1H，m ovl,H-3),0.94(3H,d,J＝6.2Hz,H3-21),0.91(3H,s,H3-19),0.90(3H,t,J＝7.0Hz,H3-28),0.69(3H,s,H3-18)。
生物活性。在体外使用利用报告基因转染的全细胞模型测试所选择的化合物的活性以确立表1中所示的化合物针对FXR和TGR5/GPBAR1的选择性(与鹅脱氧胆酸(CDCA)和TLCA相比)。CDCA是初级胆汁酸，其充当用于FXR的内源性配体，而TLCA是用于TGR5/GPBAR1的生理学配体。在该测定中，在37℃，在具有含有10％胎牛血清(FBS)、1％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的Earl氏盐的最小必需培养基中，培养HepG2细胞(源自肝脏的细胞系)。在37℃，在含有10％胎牛血清(FBS)、1％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的D-MEM中，培养HEK-293T细胞。根据制造说明书使用Fugene HD进行转染实验。以5×104细胞/孔将细胞接种在24孔板中。针对FXR介导的反式激活，利用100ng的pSG5-FXR、100ng的pSG5-RXR、100ng的pGL 4.70(即编码人海肾基因(human Renilla gene)的载体)和250ng的含有由热休克蛋白27(hsp27)的启动子克隆的FXR响应元件IR1的报告载体p(hsp27)-TK-LUC，将HepG2细胞转染。
针对GPBAR1介导的反式激活，利用200ng的pGL 4.29，即含有驱动荧光素酶报告基因luc2P的转录的cAMP响应元件(CRE)的报告载体，利用100ng的pCMVSPORT6-人GPBAR1，并且利用100ng的pGL 4.70，即编码人海肾基因的载体，将HEK-293T细胞转染。在对照实验中，仅用载体pGL 4.29和pGL 4.70将HEK-293T细胞转染，以排除化合物可能以不依赖GPBAR1的方式激活CRE的任何可能性。在转染后24h，用10μmTLCA作为对照试剂或者用相同浓度的公认GPBAR1激动剂刺激细胞18h。在处理之后，将细胞在100μL的裂解缓冲液(25mM Tris-磷酸盐，pH 7.8；2mM DTT；10％甘油；1％Triton X-100)中裂解，并且使用荧光素酶测定系统测定20μL的细胞溶解产物的荧光素酶活性。使用Glomax 20/20照度计测量发光。荧光素酶活性针对海肾活性标准化。利用作为激动作用的实例的TLCA的活性，以在反式激活测定中活性的百分数测量针对FXR或GPBAR1/TGR5的拮抗作用。
动物和方案。将GPBAR1裸鼠(GPBAR1-B6＝GPBAR12/2小鼠，直接生成为C57BL/6NCrl背景)和C57BL/6NCrl上的同基因型同窝出生仔畜在受控温度(22℃)和光周期(12:12小时的亮/暗周期)下圈养，允许不受限制获得标准鼠粮和自来水，并且允许在进入实验之前对这些条件适应至少5天。
搔抓试验。将雄性GPBAR1-/-小鼠和它们的同基因型同窝出生仔畜(8-12周龄)用于该研究。将颈部基底的毛剃去，并且将小鼠置于在玻璃架上的单个圆筒中。在颈部中画近似0.5cm直径的圆周，并且在该区域中注射试验试剂。在实验之前连续2天的2h时间段使小鼠适应实验房间、约束装置和研究人员。由2名不知晓测试的试剂或基因型的观察者来量化搔抓行为。搔抓被定义为将后肢抬起到注射部位之后将爪放在地上，而不考虑敲击的次数。如果在30分钟的时间段内计数差异大于5次搔抓，则两名观察者对记录进行重新评价。结果表示为在30或60min的观察期间搔抓事件的数量。测试的试剂是：DCA(25μg)、TLCA(25μg)、UDCA(25μg)和BAR502(25μg)，或者利用桦木酸(50μg)、齐墩果酸(50μg)。将LCA和DCA溶解于DMSO中并且将其他试剂溶解于0.9％NaCl(10μL)中。在另一个实验设置中，对GPBAR1-/-小鼠和它们的同基因型同窝出生仔畜施用溶解于橄榄油的α-萘基异硫氰酸酯(ANIT)(25mg/kg，口服(per os))或单独橄榄油(对照小鼠)，或施用ANIT加上BAR502的组合(15mg/kg，每天一次，口服)，持续10天。在第5天，在60min内并且在皮下注射25μg DCA之后评价自发性搔抓。通过在Hitachi 717自动分析仪上进行的常规临床化学测试来测量总的胆红素、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和碱性磷酸酶的血清水平。对于雌激素模型，在8天内，对野生型C57BL6小鼠腹膜内(i.p.)施用10mg/kg的溶解于PEG中的17α-乙炔基雌二醇(17αE2)或单独的PEG(对照小鼠)或17αE2和BAR502的组合(每天15mg/kg，口服)。在研究结束时，记录自发性搔抓和由皮下注入25μg DCA引起的搔抓。还测量了胆囊重量以及胆红素和碱性磷酸酶的血清水平。在整个研究中，由研究人员并且由包括动物设施的兽医在内的严格训练的动物设施人员，从周一到周五对动物视觉评估每天至少两次，并且在周末每天一次。每天对动物称重，并且在指定的时间点或当它们的临床状况变得危急(通过在7天内高于基础体重25％的体重降低评估)时处死。另外，当在每天评价时它们显示出不能站立或走动时将动物处死。小鼠通过过量剂量的戊巴比妥钠(＞100mg/kg腹膜内(i.p.))安乐死。

Claims (5)

1.选自由以下组成的组的化合物：
Figure FDA0003531585870000011
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是6α-乙基-7α-羟基-5β-胆烷-24-酸。
3.根据权利要求1或2所述的化合物用于制备药物的用途。
4.根据权利要求1或2所述的化合物，作为FXR和/或TGR5/GPBAR1调节剂，用于制备药物的用途，所述药物用于预防和/或治疗胃肠病症、肝脏疾病、心血管疾病、动脉粥样硬化、代谢疾病、感染性疾病、癌症、肾脏病症、炎性病症和神经病症。
5.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1或2所述的化合物和至少另一种药物成分。
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