CN109971868A - 一组用于鉴定鹿角的特异性引物及鹿角真伪鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一组用于鉴定鹿角的特异性引物及鹿角鉴定方法，属于中药材的分子生物学鉴定技术领域。本发明首先制备DNA供试品溶液，并以此为模板，选用经设计与筛选得到的特异性核苷酸序列为引物进行PCR扩增，继而将产物进行琼脂糖凝胶电泳分析与凝胶成像系统检测，最终依据检测结果判别鹿角的真伪和掺伪情况。本发明操作简单，无需测序，结果直观，能够检识掺伪品，同时抗干扰能力强，重复性好，可用于鹿角药材的准确鉴定，并为检测鹿角产品提供了高效快捷的方法，具有较好的应用价值。

Description

一组用于鉴定鹿角的特异性引物及鹿角真伪鉴定方法
技术领域
本发明涉及一组用于鉴定鹿角的特异性引物及鹿角真伪或掺伪的鉴定方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
《中国药典》(2015年版一部)规定鹿角为鹿科动物马鹿(Cervus elaphusLinnaeus)或梅花鹿(Cervus nippon Temminck)已骨化的角或锯茸后翌年春季脱落的角基，分别习称“马鹿角”、“梅花鹿角”、“鹿角脱盘”，具有温肾阳，强筋骨，行血消肿等功效。在中药材市场上，随着近年来鹿角市场需求的增加，导致鹿角资源有限，价格昂贵，常出现使用其他动物角类冒充正品以及混伪品、掺伪品进行销售等现象，如驯鹿角代替鹿角，严重影响了其临床用药的安全与疗效。目前，鹿角类药材的鉴别主要依靠传统的性状鉴别、显微特征等方法，但其主观性强，准确性存疑；尤其是经过加工后的饮片在形态上难以分辨，因此仅依赖传统的鉴别方法不足以可靠地鉴别该类中药的真伪及其来源。
DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段保守的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别方法的有效补充。目前，鹿角类DNA条形码的研究主要基于COI、Cytb、16SrRNA等序列进行，其中以COI序列最为常见。比如，中国专利CN107365839A公开了了一种鹿科动物COI基因片段特异性引物，主要采用序列的通用引物进行扩增，然后对得到的结果进行测序，并与数据库中的物种序列进行比对，得出鉴定结果。然而，这类方法不能应用于准确鉴定纯度较低的DNA样本或各种动物来源的混合物，如掺伪品或受其他物种轻微污染的中药。同时，COI条形码也不能有效地抑制干扰，且对扩增产物需要进行较繁琐的DNA测序过程，较为费时、代价较高。更重要的是，药材在炮制加工后，原始DNA往往会被降解成很短的片段，极大增加了利用COI条形码技术对中药饮片鉴定的难度。
发明内容
为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一种利用特异性引物扩增技术鉴别鹿角的新方法。该方法操作简单，无需测序，鉴别快速，能准确直观的实现鹿角真伪和掺伪的鉴定。
为了实现本发明的目的，发明人研究了马鹿(Cervus elaphus Linnaeus)和梅花鹿(Cervus nippon Temminck)以及常见伪品物种鹿角的基因序列，并结合多年来的科研经验设计特异性引物，以达到快速鉴定鹿角真伪的目的。具体地，本发明的技术方案概况如下：
一组用于鉴定鹿角的特异性引物，所述引物对为PC，具体如下所示：
PC上下游引物分别为：
PC-F：TGATATATACACTCAGACCCCA，如SEQ ID NO.1所示；
PC-R：GCTGTATTTGCGTCTGCTC，如SEQ ID NO.2所示。
所述引物对PC来自于马鹿(Cervus elaphus Linnaeus)和梅花鹿(Cervus nipponTemminck)，能达到鉴定正品鹿角的目的。
所述用于鉴定鹿角的特异性引物还包括引物对PRT和PRU，具体如下所示：
PRT上下游引物分别为：
PRT-F：CGCTAACACGTCATATACCAA，如SEQ ID NO.3所示；
PRT-R：CTGCGAATAGACTTCCGAT，如SEQ ID NO.4所示。
PRU上下游引物分别为：
PRU-F：CATTTATCATCGCGGCACT，如SEQ ID NO.5所示；
PRU-R：AGGAATTTTATCTGCGTCTGA，如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供一种特异性鉴定鹿角的试剂盒，所述试剂盒包括上述的特异性引物PC引物对、DNA阳性对照、PCR反应体系、电泳鉴定体系。
在上述特异性引物鉴定过程中，若受试样品为完整的鹿角且结果显示为阳性，则判断为正品鹿角，若受试样品为鹿角饮片或粉末，即为非完整的鹿角且结果显示为阳性，则需进一步鉴定是否为掺伪品(含有伪品驯鹿和(或)水鹿)，因此试剂盒还包括特异性引物PRT引物对及PRU引物对。
另外，本发明还提供一种特异性鉴定鹿角真伪或掺伪的方法，首先制备DNA供试品溶液，随后利用PCR扩增技术及琼脂糖凝胶电泳技术快速检测目标片段。该方法包括如下步骤：
(1)制备DNA供试品溶液；
(2)以制备的DNA供试品溶液为反应模板，以权利要求1所述特异性引物作为PCR扩增引物，配制PCR反应体系，设置扩增程序，进行PCR扩增；
(3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，于凝胶成像分析系统判定结果，判定标准为：
a.若受试样品为完整的鹿角且通过特异性引物PC进行扩增、电泳后在187bp处产生条带，则判断为正品鹿角，否则为伪品鹿角；
b.若受试样品为鹿角饮片或粉末，且通过特异性引物PC进行扩增、电泳后在187bp处产生条带，以及通过特异性引物PRT和PRU进行扩增、电泳后在200bp和101bp处均不产生条带，则判断为正品鹿角饮片或粉末；
c.若受试样品为鹿角饮片或粉末，且通过特异性引物PC进行扩增、电泳后在187bp处产生条带，以及通过特异性引物PRT和PRU进行扩增、电泳后在200bp或101bp处产生条带，则判断为掺伪鹿角饮片或粉末。
进一步优选地，如上所述鉴定鹿角真伪或掺伪的方法，其中步骤(1)中所述DNA供试品溶液的制备方法按照下述步骤进行：
(1)将鹿角产品粉碎，收集细粉，加入蛋白酶K和SDS裂解液，料液比50～200:1mg/mL，充分混匀，于54-58℃孵浴提取4-10h，离心后取上清液；
(2)加入与上清液等体积Tris-平衡酚，充分混合，离心后取上清液，继续加入与上清液等量的体积比25:24:1的Tris-平衡酚-三氯甲烷-异戊醇，充分混合，离心后取上清液；
(3)加入与上清液等量的体积比24:1的三氯甲烷-异戊醇，充分混合，离心后取上清液，再加入上清液1/10倍量4-6M乙酸钾溶液和1.5-3.0倍量预冷的95-97％乙醇，充分混合，-21～-19℃冷冻过夜，离心后弃去上清液；
(4)加入预冷的68-72％乙醇洗涤沉淀，离心后弃去上清液，沉淀物于室温下晾干或冻干，用TE缓冲液溶解，保存，备用。
进一步优选地，如上所述鉴定鹿角真伪或掺伪的方法，其中步骤(2)中所述的PCR反应体系，以总体积25μL为例，包括：1×PCR缓冲液、2.0mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTPs、0.2μmol/L～0.4μmol/L引物对、0.625U TaqDNA聚合酶、模板DNA100ng，加灭菌双蒸水补足至25μL。
进一步优选地，如上鉴定鹿角真伪或掺伪的方法，其中步骤(2)中所述的PCR扩增程序为：95℃3min；95℃30s，61℃～64℃10s～30s，72℃1min，循环数33；72℃，5min～7min。
进一步优选地，如上鉴定鹿角真伪或掺伪的方法，其中步骤(2)中所述的电泳检测是指扩增产物采用含荧光染料EB的2％～3％琼脂糖凝胶进行分析后以凝胶成像系统检测，制胶及电泳的缓冲液均为TBE，上样量为10μL。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括如下：
(1)本发明鉴定方法中模板DNA的制备以SDS裂解液和蛋白酶K为提取溶剂，用恒温混匀仪孵浴，从鹿角产品中提取DNA，然后以酚仿法进行纯化，该方法与柱纯化相比，大大降低了成本，样品用量范围更加灵活，也扩大了适用范围。
(2)与现有的基于COI、ITS序列等的DNA条形码鉴定技术相比，本发明不需要扩增后再测序的繁琐步骤，直接查看目的条带的位置就能够判断物种，结果直观准确，操作方便快捷，经济高效。
(3)本发明能够检识掺伪品，同时抗干扰能力强，重复性好，为鹿角的掺伪鉴别提供一条新的途径，有助于监控鹿角药材的质量，从而为临床用药的安全和疗效提供保障，具有极高的应用价值。
附图说明
图1是引物PC特异性验证的电泳结果图；
图2是引物PC对4批市售马鹿鹿角及4批市售梅花鹿鹿角样品检测电泳结果图；
图3是引物PRT特异性验证的电泳结果图；
图4是引物PRT对6批市售驯鹿角样品检测电泳结果图；
图5是引物PRU特异性验证的电泳结果图；
图6是引物PRU对3批市售水鹿角样品检测电泳结果；
图7是自制鹿角掺伪品检测电泳结果图；
图1-7中，CE：马鹿；CN：梅花鹿；RT：驯鹿；RU：水鹿；M：Mark；N：阴性对照；下角标数字代表不同批次。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施例进一步描述，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神下可以对技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
本发明中涉及到的检测样品材料均来自市售。
本发明中涉及各样品分别为：CE：马鹿角样品，来自吉林长春；CN：梅花鹿角样品，来自山东济宁；RT：驯鹿角样品，其中RT1来自河北保定，RT2来自江苏无锡；RU：水鹿角样品；N：阴性对照；M：Mark。
四批市售马鹿鹿角样品中：1、2均来吉林长春，3来自山东济宁，4来自安徽亳州；
四批市售梅花鹿鹿角样品中：1来自辽宁铁岭，2、3均来自吉林通化，4来自吉林辽源。
六批市售驯鹿角样品中：1来自河北保定，2来自江苏无锡，3来自辽宁大连，4来自吉林白山，5来自吉林通化，6来自吉林松原。
三批市售水鹿角样品中：1、2均来自东南亚，3均来自辽宁铁岭。
实施例1：鹿角试剂盒特异性引物的设计及验证
(1)试剂
十二烷基硫酸钠、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、乙二胺四乙酸二钠、蛋白酶K(20mg/mL，Sigma-Aldrich，P6556)、Tris平衡酚(LIFESCIENCES，T0250)、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒(生工，B518251)、DreamTaqGreen DNA Polymerase(Thermo Scientific，#EP0712)、dNTP Mix(Thermo Scientific，#R0192)、Agarose、Ethidium Bromide(SunShineBio，SN314-1)、硼酸，试剂均为分析纯。
(2)方法
A.异性引物的设计
根据鹿角正品(梅花鹿和马鹿)及伪品驯鹿、水鹿的基因差异，设计特异性引物，如表1所示，由上海生工有限公司合成。
表1：各引物序列详细信息
B.引物特异性验证
将鹿角药材样品(包括其常见伪品驯鹿角及水鹿角)粉碎，称取40目以下粉末50mg，加入990μL的SDS裂解液和10μL蛋白酶K，涡旋混匀，56℃下于恒温混匀仪(拓普森科学仪器有限公司)600rpm提取6h，离心取上清液；依次将与上清液等体积的Tris平衡酚、酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24:1)、三氯甲烷-异戊醇(24:1)分别与上清液混合，离心取上清液；在上清液中加入上清液体积0.1倍量的5M乙酸钾溶液和上清液2倍量的96％预冷乙醇，混合，置-20℃过夜，离心后弃去上清液；加入500μL预冷的70％乙醇洗涤沉淀，离心弃上清；室温晾干或冻干，以适量TE缓冲液溶解，得到基因组DNA供试品溶液，质量检查，-20℃或4℃下保存，备用。
配制PCR反应体系：1×PCR缓冲液，2.0mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTPs，0.2-0.4μmol/L引物对，0.625UTaqDNA聚合酶，模板DNA100ng，加灭菌双蒸水补足至25μL。离心后，置于PCR仪(2720@Applied Biosystems)进行扩增，反应条件：95℃3min；95℃30s，61℃～64℃30s，72℃1min，33个循环；72℃7min。10μL扩增产物采用含EB的2-3％琼脂糖凝胶进行分析。电泳结束后，通过凝胶成像系统检测，并根据各电泳条带的有无及亮度、分子量大小以筛选特异性引物。
结果如图1、3、5所示，图1中模板DNA为100ng，引物浓度0.4μmol/L，退火温度64℃；图3中模板DNA为100ng，引物浓度0.2μmol/L，退火温度63℃；图5中模板DNA为100ng，引物浓度0.2μmol/L，退火温度61℃。由图可见，各特异性引物对其相应物种进行扩增分析结果均有明亮的条带，其分子量与预期扩增的目的片段长度相一致。
实施例2：本发明的特异性引物对市售鹿角样品的检测
将不同批次市售鹿角样品(包括伪品驯鹿角及水鹿角)粉碎，称取40目以下粉末50mg，通过SDS法进行提取纯化及质量检查，得到DNA供试品溶液，具体操作如下：
(1)将鹿角产品粉碎，40目过筛，收集细粉，加入适量的SDS裂解液和蛋白酶K(料液比：50～200:1mg/mL)，充分混匀，于56℃孵浴提取6h，离心后取上清液；
(2)加入与上清液等体积Tris-平衡酚，充分混合，离心后取上清液，加入与上清液等量的Tris-平衡酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24:1)，充分混合，离心后取上清液；
(3)加入与上清液等量三氯甲烷-异戊醇(24:1)，充分混合，离心后取上清液，再加入上清液1/10倍量5M乙酸钾溶液和2倍量预冷的96％乙醇，充分混合，-20℃冷冻过夜，离心后弃去上清液；
(4)加入预冷的70％乙醇500μL洗涤沉淀，离心后弃去上清液，沉淀物于室温下晾干或冻干，用适量TE缓冲液溶解，-20℃或4℃下保存，备用。
此后，配制PCR反应体系，将其置PCR仪按实施例1中的条件进行扩增。随后，将10μL扩增产物采用含EB的2-3％琼脂糖凝胶及TBE缓冲液进行分析，电泳结束后，通过凝胶成像系统检测，并根据电泳条带的有无以及分子量大小以判定鹿角的真伪。
结果如图2、4、6所示，各批次样品的DNA通过鹿角试剂盒引物检测后，样品中正品马鹿角和梅花鹿角的DNA通过特异性引物进行扩增后在187bp处产生条带；其常见混伪品驯鹿角与水鹿角分别在200bp、101bp处产生条带，而且与正品马鹿角和梅花鹿角的特异性引物无交叉反应，体现出了很强的专属性，表明该试剂盒能够很好的完成对鹿角品种的鉴定。
实施例3：鹿角试剂盒对自制掺伪品的检测
用预先粉碎的正品鹿角及伪品驯鹿角、水鹿角样品按5种不同的比例(9:1、7:3、5:5、3:7、1:9)混合制备鹿角掺伪品，每个样品的终质量为50mg。然后通过SDS法进行提取纯化，按照实施例2的方法进行分析。CN:RT、CN:RU、CE:RT、CE:RU分别为梅花鹿与驯鹿、水鹿混合的自制掺伪品，马鹿与驯鹿、水鹿混合的自制掺伪品；9:1、7:3、5:5、3:7、1:9为两种正品鹿角分别与伪品驯鹿角、水鹿角不同的掺伪比例；N：阴性对照。
如图7所示，5种不同比例的进行混合的鹿角掺伪品由相应物种的特异性引物扩增分析，其条带位置与预期扩增的目的片段长度相一致，表明特异性引物能鉴定出掺伪品中的相应物种。
序列表
<110> 镇江市食品药品监督检验中心
江苏大学
<120> 一组用于鉴定鹿角的特异性引物及鹿角真伪鉴定方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgatatatac actcagaccc ca 22
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctgtatttg cgtctgctc 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgctaacacg tcatatacca a 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgcgaatag acttccgat 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
catttatcat cgcggcact 19
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aggaatttta tctgcgtctg a 21

Claims (10)

1.一组用于鉴定鹿角的特异性引物，其特征在于，所述的特异性引物选自如下的一种或两种或三种引物对：PC、PRT、PRU；
所述的引物对PC的上下游引物分别为PC-F、PC-R，所述的PC-F含有SEQ ID NO.1所示的序列，所述的PC-R含有SEQ ID NO.2所示的序列；
所述的引物对PRT的上下游引物分别为PRT-F、PRT-R，所述的PRT-F含有SEQ ID NO.3所示的序列，所述的PRT-R含有SEQ ID NO.4所示的序列；
所述的引物对PRU的上下游引物分别为PRU-F、PRU-R，所述的PRU-F含有SEQ ID NO.5所示的序列，所述的PRU-R含有SEQ ID NO.6所示的序列。
2.根据权利要求1所述用于鉴定鹿角的特异性引物，其特征在于，所述的特异性引物为PC。
3.根据权利要求1所述用于鉴定鹿角的特异性引物，其特征在于，所述的特异性引物为三种引物对PC、PRT和PRU的组合。
4.权利要求2所述的特异性引物在鉴定鹿角真伪中的应用。
5.权利要求3所述的特异性引物在鉴定鹿角掺伪中的应用。
6.一种特异性鉴定鹿角的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1所述的特异性引物、DNA阳性对照、PCR反应体系、电泳鉴定体系。
7.一种鉴定鹿角真伪或掺伪的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)制备DNA供试品溶液；
(2)以制备的DNA供试品溶液为反应模板，以权利要求1所述特异性引物作为PCR扩增引物，配制PCR反应体系，设置扩增程序，进行PCR扩增；
(3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，于凝胶成像分析系统判定结果，判定标准为：
a.若受试样品为完整的鹿角且通过特异性引物PC进行扩增、电泳后在187bp处产生条带，则判断为正品鹿角，否则为伪品鹿角；
b.若受试样品为鹿角饮片或粉末，且通过特异性引物PC进行扩增、电泳后在187bp处产生条带，以及通过特异性引物PRT和PRU进行扩增、电泳后在200bp和101bp处均不产生条带，则判断为正品鹿角饮片或粉末；
c.若受试样品为鹿角饮片或粉末，且通过特异性引物PC进行扩增、电泳后在187bp处产生条带，以及通过特异性引物PRT和PRU进行扩增、电泳后在200bp或101bp处产生条带，则判断为掺伪鹿角饮片或粉末。
8.根据权利要求7所述鉴定鹿角真伪或掺伪的方法，其特征在于，步骤(1)中所述DNA供试品溶液的制备方法按照下述步骤进行：
(1)将鹿角产品粉碎，收集细粉，加入蛋白酶K和SDS裂解液，料液比50～200:1mg/mL，充分混匀，于54-58℃孵浴提取4-10h，离心后取上清液；
(2)加入与上清液等体积Tris-平衡酚，充分混合，离心后取上清液，继续加入与上清液等量的体积比25:24:1的Tris-平衡酚-三氯甲烷-异戊醇，充分混合，离心后取上清液；
(3)加入与上清液等量的体积比24:1的三氯甲烷-异戊醇，充分混合，离心后取上清液，再加入上清液1/10倍量4-6M乙酸钾溶液和1.5-3.0倍量预冷的95-97％乙醇，充分混合，-21～-19℃冷冻过夜，离心后弃去上清液；
(4)加入预冷的68-72％乙醇洗涤沉淀，离心后弃去上清液，沉淀物于室温下晾干或冻干，用TE缓冲液溶解，保存，备用。
9.根据权利要求7所述鉴定鹿角真伪或掺伪的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的PCR反应体系包括：1×PCR缓冲液、2.0mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTPs、0.2μmol/L～0.4μmol/L引物对、0.625U TaqDNA聚合酶、模板DNA 100ng，加灭菌双蒸水补足至25μL。
10.根据权利要求7所述鉴定鹿角真伪或掺伪的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的PCR扩增程序为：95℃3min；95℃30s，61℃～64℃10s～30s，72℃1min，循环数33；72℃，5min～7min。
CN201910375416.4A 2019-05-07 2019-05-07 一组用于鉴定鹿角的特异性引物及鹿角真伪鉴定方法 Pending CN109971868A (zh)

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