CN109971809A - 一种糖肽类抗生素中间体的发酵制备方法 - Google Patents

一种糖肽类抗生素中间体的发酵制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种发酵制备A82846B的方法。该方法为将东方拟无枝酸菌进行发酵培养后得到的发酵培养液进行提取后，提取得到的杂质废液进行酸降解，得到酸降解液。将酸降解液加入到发酵培养基后，再次进行发酵，培养25‑35h后，补加氯化钙，继续发酵。添加不同浓度的杂质酸降解液，且在发酵培养30h左右补加氯化钙，A82846B发酵单位有了大幅提高，同时组分有了显著改善。

Description

一种糖肽类抗生素中间体的发酵制备方法
技术领域
本发明属于微生物发酵生产技术领域，涉及糖肽类抗生素的发酵方法，具体涉及一种通过发酵制备奥利万星中间体A82846B的方法。
背景技术
糖肽抗生素是由微生物产生，或由微生物产生并进行部分修饰的一大类物质。万古霉素和替考拉宁为市售的抗菌产品。在上世纪九十年代发现的糖肽中，包括称作A82846A(也称作ereomomycin)、A82846B(也称作氯东方霉素chloroorienticinA)、A82846C(也称作东方霉素orienticinC)及东方霉素A。已经对天然存在的糖肽进行了多种修饰，其中一种是对糖肽中的反应性胺的还原烷基化的修饰。
2014年8月7日FDA批准抗生素奥利万星(oritavancin)用于由敏感革兰氏阳性菌导致的急性细菌性皮肤和皮肤结构感染成人患者的治疗。奥利万星是一种单剂量治疗方案的抗生素,具有良好的市场前景。
A82846B是合成奥利万星的关键中间体，可由东方拟无枝酸菌(Amycolatopsisorientalis)发酵产生。除了A82846B，东方拟无枝酸菌发酵时还会产生两种主要成分A82846A和A82846C，其结构式如下：
A82846A分子式为C73H89N10O26Cl，A82846B分子式为C73H88N10O26Cl2，A82846C分子式为C73H90N10O26。
由上可知，三种物质结构非常接近，分离纯化工作相当困难，生产成本因此而提高，发酵液中A82846B的组分比例(A82846B在三种物质中所占比例)的高低将极大影响提取收率。目前我国关于A82846B的研究较少，发酵单位和组分比例都较低，导致生产成本居高不下。
发明内容
本发明公开了一种发酵制备A82846B的新方法，通过优化A82846B发酵的工艺，不仅提高了发酵单位，而且也提高了A82846B的组分比例，提高了收率，降低了生产成本。
在发酵制备A82846B的整个过程中，发酵后的提取过程中会产生大量杂质废液，这些杂质废液中包含发酵过程中产生的大部分A82846A和A82846C，以及部分A82846B。本发明技术人员通过研究利用这些杂质废液，意外地发现这些杂质废液的降解产物中的某些成分可以作为A82846B合成的前体，有助于提高A82846B的发酵单位和组分比例，从而降低生产成本。
本发明发酵制备奥利万星中间体A82846B的方法为：
(1)将东方拟无枝酸菌接种到种子培养基中进行培养，得到种子液；
(2)将种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养；
(3)对发酵得到的发酵液进行提取，提取得到的A82846B纯度在90％以上部分用于提取产品，纯度在90％以下的则是杂质废液；
(4)将上述杂质废液进行酸降解，得到酸降解液；
(5)将步骤(4)得到的酸降解液加入到发酵培养基后，将步骤(1)得到的种子液接种于该发酵培养基进行发酵，发酵培养得到A82846B。
其中，步骤(1)中，所述的东方拟无枝酸菌可为本领域常规使用能产生奥利万星中间体A82846B的东方拟无枝酸菌菌株，优选东方拟无枝酸菌NRRL18099。
步骤(1)中，所述的种子培养基可为本领域常规使用的种子培养基。优选的种子培养基包含麦芽糊精、葡萄糖、黄豆粉、酵母提取物和碳酸钙。所述的种子培养基的pH值为6.5～7.5，优选为7.0。
步骤(2)和步骤(5)中，所述的发酵培养的方法和条件可为本领域常规的方法和条件。所述的发酵培养基可为利用东方诺卡菌进行发酵时所使用的常规发酵液。优选包含麦芽糊精、糖蜜、黄豆粉、酵母粉、碳酸钙的培养基。进一步优选包含麦芽糊精、糖蜜、黄豆粉、酵母粉、碳酸钙和氯化盐的培养基。所述的氯化盐可为任何可提供氯离子的无机盐，优选氯化钠、氯化钾、氯化钙和氯化铵中的一种或多种。所述的发酵培养基的pH值为6.5～7.5，优选为7.0。
步骤(3)中，所述的提取的方法可为本领域现有技术公开的提取东方拟无枝酸菌发酵制备A82846B的发酵液的方法。例如，可按照WO2006061166、CN101440127、CN87106483、CN107434823、CN106928323所公开的方法进行提取。用以上方法进行提取时，得到的杂质废液包含发酵过程中产生的大部分A82846A和A82846C，以及部分A82846B。典型的方法为中国专利申请CN106928323所公开的方法，其具体为：
将步骤(2)得到的发酵培养液pH调节至10～11，固液分离得到滤液；将滤液pH调节至9.0-9.5后导入大孔吸附树脂进行富集；将树脂净化，然后用解吸液进行解吸并收集组分，得到A82846B解吸混合液；将解吸混合液进行浓缩后，进行反相填料层析分离，用极性溶剂与盐水的解吸混合液进行解吸，将层析分离得到的解析液，A82846B纯度在90％以上部分用于提取产品。解析液A82846B纯度在90％以下则是杂质废液。
上述所述的固液分离方法优选为离心、板框压滤、或减压抽滤。
上述所述的大孔吸附树脂独立的选自弱极性或非极性树脂；优选为LX18、XAD1600、HP20、或HZ816，其吸附量为5-10g/L，优选6-8g/L。
上述所述的树脂净化是采用pH为7-9的纯化水净化树脂柱，优选用量为2-4BV。
上述所述的解吸液为0.5％-1.5％(v/v)醋酸水溶液，优选解析液为1％醋酸水溶液，其用量为2-5BV。
上述所述的浓缩方式为纳滤，浓缩至浓度为20-50mg/ml。
上述所述的反相填料为采用聚苯乙烯或聚丙烯酸酯及其衍生物制备的聚合物微球、ODS C18或Fraclite800；所述的极性溶剂与盐水的解吸混合液中，以解析液总体积计算，盐水为0.5％-1％(w/v)NH4H2PO4；极性溶剂为2-10％(v/v)的甲醇或乙腈，优选2-5％(v/v)的甲醇或乙腈，解吸液用量为3-5BV。
步骤(4)中，所述的酸降解是在pH不大于2.0的环境下进行水解的，优选的pH为1.0-2.0。
在步骤(5)的发酵过程中，需要在发酵培养25-35h后，补加氯化钙。具体的发酵过程为：将步骤(4)得到的酸降解液以发酵体积计1.5％～6％的量加入到发酵培养基后，将步骤(1)得到的种子液接种于该发酵培养基，培养25-35h后，补加氯化钙，补加的量为10g/L(以发酵体积计)，发酵培养5天。
发酵培养基中的氯化钙对A82846B的生物合成起重要作用，在其浓度低于10g/L时，浓度越高，A82846B的发酵单位和组分就越好；但浓度一旦高于12g/L时，菌体生长就会受到抑制，A82846B的发酵单位也会显著下降。
由A82846B发酵过程数据可知，发酵30h左右，菌体生物量已经接近高峰，但此时发酵单位却极低，表明菌体生长和产物合成并不是同步的。A82846B发酵在较低氯化盐浓度下进行菌体生长、在较高氯化盐浓度下进行产物合成的条件，发酵单位和组分可进一步改善。
本发明方法通过在发酵过程中加入杂质废液的酸降解液和在发酵30h左右补加氯化钙这两个手段，使得A82846B发酵单位有了大幅提高，同时组分有了显著改善。
具体实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不意味着对本发明有任何限制
实施例1种子液的制备
种子培养基：麦芽糊精20g/L，葡萄糖10g/L，黄豆粉15g/L，酵母提取物3g/L，碳酸钙1g/L，pH7.0。
750ml三角瓶装150ml种子培养基，120℃灭菌30min待用。
将低温保存的A82846B生产菌种东方诺卡菌NRRL 18098接种到准备好的种子瓶中，在温度30℃、转速250rpm下摇瓶培养40-50h，即可得到成熟的摇瓶种子。
实施例2
发酵培养基：麦芽糊精40g/L，糖蜜20g/L，黄豆粉20g/L，酵母粉10g/L，碳酸钙3g/L，氯化钙10g/L，pH7.0。
50L发酵罐装35L发酵培养基，120℃灭菌30min待用。
将3.5L成熟的摇瓶种子接种到装有35L料液的发酵罐中，培养条件：温度30℃，通气量1VVM，罐压0.05Mpa，初始转速200rpm，通过调整转速控制溶氧30％以上。培养5天得到发酵液，发酵单位为515mg/L。
实施例3
将实施例2得到的发酵液用NaOH溶液调节pH＝10.3，搅拌2h后进行板框压滤，得到35L压滤液，将压滤液调节pH＝9.2，然后将其导入LX18吸附树脂。树脂用pH为8的水净化9L后，再用8L1.0％醋酸水溶液进行解吸，并将浓度大于500mg/L的组分混合，组成一次解吸混合液，然后将解吸混合液进行纳滤，浓缩至单位为35000mg/L。
将浓缩液导入已平衡好的C18柱，用洗脱液(5％乙腈:0.5％NH4H2PO4＝3:97(v/v))进行洗脱，收集纯度为90％以上的组分用于提取产品。A82846B纯度在90％以下的则为杂质废液。
收集杂质废液，纳滤浓缩，浓缩至A82846A、A82846B、A82846C三者含量总和大约为3％～5％，典型批次杂质浓缩液组分如下：
组分 A82846A A82846B A82846C 总计
含量 3.20％ 1.45％ 0.35％ 5.0％
实施例4
取200ml杂质废液，硫酸调节pH至2.0，50-60℃水浴。水浴5h后开始取样液相分析，当A82846A、A82846B和A82846C完全检测不到的时候，停止水浴。杂质降解液冷却后，氢氧化钠调节pH至中性，无菌过滤后冷藏备用，得到的为酸降解液。
实施例5
按照实施例2所示的配方配制发酵瓶，250ml三角瓶装50ml发酵培养基，120℃灭菌30min待用。
将准备好的发酵瓶加入实施例4得到的酸降解液，加入量分别为1ml、2ml和3ml，为一、二、三组。不加入酸降解液的发酵瓶为第四组和第五组，为对照组。
将5ml成熟的摇瓶种子接种到上述各组发酵瓶中，在温度30℃、转速250rpm下摇瓶培养，培养30h后，向第一组、第二组、第三组、第四组发酵瓶中加入氯化钙溶液2ml(250g/L)，第五组不补加氯化钙溶液，继续培养到5天，液相分析。试验结果见下表：
由结果可以看出，添加不同浓度的杂质酸降解液，且在发酵培养30h左右补加氯化钙，A82846B发酵单位有了大幅提高，同时组分有了显著改善。

Claims (10)

1.一种发酵制备奥利万星中间体A82846B的方法，该方法包括：
(1)将东方拟无枝酸菌NRRL 18099接种到种子培养基中进行培养，得到种子液；
(2)将种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养；
(3)对发酵得到的发酵液进行提取，提取得到的A82846B纯度在90％以上部分用于提取产品，纯度在90％以下的则是杂质废液；
(4)将上述杂质废液进行酸降解，得到酸降解液；
(5)将步骤(4)得到的酸降解液加入到发酵培养基后，将步骤(1)得到的种子液接种于该发酵培养基进行发酵，发酵培养25-35h后，补加氯化钙，继续发酵培养得到A82846B。
2.如权利要求1所述的方法，步骤(1)的种子培养基为麦芽糊精20g/L，葡萄糖10g/L，黄豆粉15g/L，酵母提取物3g/L，碳酸钙1g/L，pH7.0。
3.如权利要求1所述的方法，步骤(2)和步骤(5)的发酵培养基为麦芽糊精40g/L，糖蜜20g/L，黄豆粉20g/L，酵母粉10g/L，碳酸钙3g/L，氯化钙10g/L，pH7.0。
4.如权利要求1所述的方法，步骤(3)提取的方法为：将步骤(2)得到的发酵培养液pH调节至10～11，固液分离得到滤液；将滤液pH调节至9.0-9.5后导入大孔吸附树脂进行富集；将树脂净化，然后用解吸液进行解吸并收集组分，得到A82846B解吸混合液；将解吸混合液进行浓缩后，进行反相填料层析分离，用极性溶剂与盐水的解吸混合液进行解吸，将层析分离得到的解析液，A82846B纯度在90％以上部分用于提取产品。
5.如权利要求4所述的方法，步骤(3)提取的方法为：将步骤(2)得到的发酵培养液pH调节至10.3，搅拌后进行板框压滤，得到压滤液，将压滤液调节pH＝9.2，将其导入LX18吸附树脂，树脂用水净化后，再用1.0％醋酸水溶液进行解吸，并将浓度大于500mg/L的组分混合，组成一次解吸混合液，然后将解吸混合液进行纳滤，浓缩至单位为35000mg/L，将浓缩液导入已平衡好的C18柱，用洗脱液进行洗脱，该洗脱液为按体积计5％乙腈:0.5％NH4H2PO4＝3:97，收集纯度为90％以上的组分用于提取产品。
6.如权利要求1所述的方法，步骤(4)所述的酸降解是步骤(3)得到的杂质废液在pH不大于2.0的环境下进行水解的。
7.如权利要求6所述的方法，步骤(4)所述的酸降解是步骤(3)得到的杂质废液在pH为1.0-2.0的环境下进行水解的。
8.如权利要求7所述的方法，步骤(4)所述的酸降解为：取步骤(3)得到的杂质废液，调节pH至2.0，50-60℃水浴，水浴5h后开始取样液相分析，当A82846A、A82846B和A82846C完全检测不到的时候，停止水浴，杂质降解液冷却后，调节pH至中性，得到的为酸降解液。
9.如利要求1所述的方法，以发酵体积计，步骤(5)中加入1.5％～6％的酸降解液。
10.如利要求1所述的方法，以发酵体积计，步骤(5)中加入10g/L的氯化钙。
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