CN109957534A - 一种枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌及其应用。其为保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17272的菌株。该枯草芽孢杆菌对提高金龟总科中的昆虫的产卵量、幼虫成活率、幼虫体重和卵孵化率有效。
Description
技术领域
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，特别是该枯草芽孢杆菌在提高金龟总科中的昆虫的产卵量、幼虫体重和卵孵化率中的至少一种中的应用。
背景技术
白星花金龟(Protaetia brevitaris Lewis)属鞘翅目(Coleoptera)，花金龟科(Cetoniidae)。我国古代医学将白星花金龟幼虫入药治病。《本草纲目》中记载，白星花金龟幼虫“主治目中淫肤，青翳白膜，取汁滴目，去翳障”。国内外众多学者的研究表明，白星花金龟幼虫的提取物对肺癌细胞、人宫颈癌细胞、小鼠肝癌细胞和胃癌细胞具有较显著的抑制增殖作用。白星花金龟提取物甲壳素、抗菌肽等均有广泛的用途。白星花金龟幼虫富含蛋白质，是一种优良的蛋白资源。鲜虫最受畜禽欢迎，幼虫含水量低，出粉率高，适合于调配各类家畜禽饲料。用白星金龟幼虫生产的饲用蛋白粉，在饲料性能上优于鱼粉，而价格低于鱼粉。
白星花金龟幼虫为腐食性，多在腐殖质丰富的疏松土壤或腐熟的粪堆中生活，以腐烂的秸秆、杂草及畜禽粪便为食，不危害植物，并且对土壤有机质转化为易被作物吸收利用的小分子有机物有一定作用。杨诚等研究表明，白星花金龟可以通过取食腐熟的玉米秸秆，将废弃秸秆转化为有机物，产生的粪便可以作为有机肥返回田间，因此利用白星花金龟幼虫可作为玉米秸秆资源化利用的一种新的绿色途径。
为了更好的利用和开发白星花金龟资源，白星花金龟的人工繁殖至关重要。但目前来讲，人工繁殖白星花金龟还存在许多技术难题。例如，在人工饲养过程中，成虫产卵量低，卵孵化率低，幼虫经常大批量死亡，最高可达到98％的死亡率，严重影响了人工繁殖工作，目前还没有一种有效的解决方法。而提高白星花金龟的产卵量，卵的孵化率，幼虫成活率和幼虫体重，即提高白星花金龟人工繁殖种群数量，提高养殖效率和质量，可以获得更大的收益。
发明内容
本发明之一提供了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其为保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17272的菌株。
本领域的技术人员熟知，在对一株微生物进行人工遗传改造时，一般会保留或提高其有益特性；或者减弱或去除其有害特性；至于对该菌株生长或有益特性无关的其他特性方面的改变一般并不受人们的关注。因此，本发明之二提供了一种对本发明之一所述的枯草芽孢杆菌经遗传改良后得到的第一工程菌株，且所述第一工程菌株具有与如本发明之一所述的枯草芽孢杆菌相同的功能。其中，在此所述的相同的功能指的是可以与遗传改造前的野生菌株CGMCC No.17272在相同功能(例如提高白星花金龟的产卵率)方面具有差异不显著的效果(即改造前后效果相当)；也可以比遗传改造前的野生菌株CGMCC No.17272在相同功能方面具有更优的技术效果；在某些特别的情况下，还可以比遗传改造前的野生菌株CGMCC No.17272在相同功能方面具有稍差的技术效果。需要指出的是，经过遗传改造后所得到的第一工程菌株，可以是在不影响其原功能的基础之上增加了新功能方面的效果，例如通过转入携带新的功能基因的质粒而赋予第一工程菌株新的特性。以上这些都是本领域的技术人员比较容易做到的，特别是在测序技术已经比较普遍的当下，可以对通过全基因组测序获得的微生物基因组DNA信息分析之后，再对该微生物进行改造，例如，影响基因组DNA稳定性的转座子序列普遍存在于微生物中，一般来讲对转座子基因进行改造是有利的，例如在转座子基因序列中插入功能基因，或敲除该序列等。
本领域的技术人员熟知，任何生物都存在自发突变的特性，特别是在一些微生物中，中，有的具有较高的自发突变频率，但无论自发突变到何种程度，只要其保留了其有益功能，即该有益功能与发生自发突变之前的功能在效果上相当(可以经过活性测定来确定)，甚至是高于自发突变之前，或者在一些特别的可接受的情况下，其有益功能低于自发突变之前，那么其也在本发明的保护范围之内。因此，本发明之三提供了根据本发明之一所述的枯草芽孢杆菌或如本发明之二所述的第一工程菌株经自发突变后得到的自发突变菌株，且所述自发突变菌株与如本发明之一所述的枯草芽孢杆菌具有相同的功能。
本发明之四提供了根据本发明之三所述的自发突变菌株经遗传改造后所得的第二工程菌株，且所述第二工程菌株与如本发明之一所述的枯草芽孢杆菌具有相同的功能。
本发明之五提供了一种组合物，所述组合物包含如本发明之一所述的枯草芽孢杆菌、如本发明之二所述的第一工程菌株、如本发明之三所述的自发突变菌株和如本发明之四所述的第二工程菌株中的至少一种。
在一个具体实施方式中，所述组合物中还包括产卵基质、幼虫饲料和卵孵化基质中的至少一种。
在一个具体实施方式中，所述产卵基质、幼虫饲料和卵孵化基质独立地包括玉米秸秆粉。
在一个具体实施方式中，所述玉米秸秆粉的粒径≤3mm。
在一个具体实施方式中，所述组合物中还包括水。
基于本发明的实验经验，组合物中水的用量可以在适当的范围内浮动，因此，在一个具体实施方式中，在所述组合物中，以所述玉米秸秆粉的干重计，水的用量为10％至20％。例如水的最优用量可以为15％。
本发明之六提供了如本发明之一所述的枯草芽孢杆菌、如本发明之二所述的第一工程菌株、如本发明之三所述的自发突变菌株、如本发明之四所述的第一工程菌株和如本发明之五所述的组合物中的至少一种在提高金龟总科(Scarabaeoidea)中的至少一种昆虫的产卵量、提高金龟总科(Scarabaeoidea)中的至少一种昆虫的幼虫成活率、提高金龟总科(Scarabaeoidea)中的至少一种昆虫的幼虫体重和提高金龟总科(Scarabaeoidea)中的至少一种昆虫的卵孵化率中的至少一种中的应用。
在一个具体实施方式中，所述枯草芽孢杆菌在产卵基质中的用量为1.5×1010cfu/kg以上。
在一个具体实施方式中，所述枯草芽孢杆菌在产卵基质中的用量为1.5×1010至2.55×1011cfu/kg。
在一个具体实施方式中，所述枯草芽孢杆菌在幼虫饲料中的用量为1.65×1011cfu/kg以上。
在一个具体实施方式中，所述枯草芽孢杆菌在幼虫饲料中的用量为1.65×1011至1.65×1012cfu/kg。
在一个具体实施方式中，所述枯草芽孢杆菌在卵孵化基质中的用量为7.68×106cfu/kg以上。
在一个具体实施方式中，所述枯草芽孢杆菌在卵孵化基质中的用量为7.68×109cfu/kg以上。
在一个具体实施方式中，所述枯草芽孢杆菌在卵孵化基质中的用量为7.68×109cfu/kg至7.68×1012cfu/kg。
在一个具体实施方式中，所述金龟总科(Scarabaeoidea)中的昆虫选自花金龟科(Cetoniidae)、犀金龟科(Dynastidae)、黑蜣科(Passalidae)、拟锹甲科(Sinodendridae)、锹甲科(Lucanidae)、粪金龟科(Geotrupidae)、皮金龟科(Trogidae)、蜉金龟科(Aphodiidae)、斑金龟科(Trichiidae)、胖金龟科(Valgidae)和金龟科(Scarabaeidae)中的至少一种昆虫。
在一个具体实施方式中，所述花金龟科(Cetoniidae)中的昆虫选自星花金龟属(Protaetia)中的至少一种昆虫。
在一个具体实施方式中，所述星花金龟属(Protaetia)中的昆虫为白星花金龟(Protaetia brevitarsis Lewis)。
本发明的有益效果
本发明首次发现了一株能够对金龟子产卵量、其幼虫成活率、其幼虫体重及其卵孵化率均有提高作用的枯草芽孢杆菌菌株。将其应用到金龟子的人工繁殖中，可以有效提高养殖效率，进而获得更大的收益。
附图说明
图1显示了3-2菌株的系统发育树。
菌种保藏
本发明筛选的一株细菌被定名为3-2，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17272，保藏日期为2019年2月28日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。其系统分类为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明实施例仅为示例性的说明，该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
如无特别说明，以下实施例中使用的试剂均可市售获得。
试验方案
1.试验材料
养虫盒34cm×17cm×12cm(长×宽×高，塑料)，食品塑料盒16.5cm×17cm×12cm(长×宽×高)。
在干燥玉米秸秆粉(粉碎粒度≤3mm)中均匀加入以干燥的玉米秸秆的质量为100％计的15％的无菌水，将其作为白星花金龟的成虫产卵基质、卵孵化基质及幼虫的饲料。
2.白星花金龟的饲养
在养虫盒中铺约5cm厚的成虫产卵基质，将白星花金龟成虫以雌雄1:1的比例置于养虫盒中饲养，饲养密度150头/m2，喂食苹果、梨等水果，饲养条件为28℃，14L：10D，待成虫产卵后将卵收集起来。
在新的养虫盒中铺约5cm厚的卵孵化基质，将收集到的卵埋于卵孵化基质中，孵化条件为28℃，14L：10D，待孵化出幼虫之后，在幼虫将近快吃完饲料(也是卵孵化基质)时更换饲料。
3.菌株的筛选
在成虫产卵期过半时，取成虫产卵基质(包括白星花金龟成虫产生的粪便)0.5g，放入无菌杯中，加入2ml无菌水，室温下孵育5min，期间偶尔震荡。转移得到的上清液并进行10倍梯度稀释，将不同浓度梯度稀释菌液涂LB琼脂平板上，每个梯度涂3个板，放置于28℃培养观察菌落产生情况。
通过形态学表型比较，挑取单菌落，分离到的细菌在LB平板上再进行多次分离纯化培养，得到的纯的单菌落培养菌株。其中，分离到11株细菌，其中的一株编号为3-2。
4.菌株的发酵
将菌株3-2接种到LB液体培养基中于28℃下在220rpm下进行摇瓶发酵，发酵完成后离心，去上清，收集菌株3-2的沉淀菌。
5.菌株对成虫产卵量的影响
将菌株3-2的沉淀菌制成108cfu/ml菌悬液并加入到新的成虫产卵基质中，混匀。其中，菌悬液加入比例均为1.5×1010cfu/kg干燥玉米秸秆。以不加菌的基质作为空白对照(CK)。将新羽化的成虫放到铺有上述三种成虫产卵基质的养虫盒中，每个养虫盒放置50只成虫，雌雄比为1:1，提供正常培养，28℃，14L：10D)，每天收集虫卵，调查成虫产卵量，连续调查7天。每个养虫盒作为一次重复，每个处理三个重复。结果用SPSS16.0版软件进行统计分析，单因素方差分析后采用LSD法检验处理间的差异显著性，以P<0.05作为显著性差异水平，见表1。
表1.菌株对成虫产卵量影响
经测试，菌株3-2能够及其显著地提高成虫的产卵量。
6.菌株3-2对成虫产卵量使用浓度筛选
将3-2菌株的沉淀菌配制成108至1012五个不同浓度的菌悬液，分别加入到新的成虫产卵基质中，混匀。以加无菌水的成虫产卵基质作为空白对照(CK)。将新羽化的成虫分别放到铺有上述六种处理的成虫产卵基质的养虫盒中，每个养虫盒放置100只成虫，雌雄比为1:1，提供正常培养(28℃，14L：10D)，每天收集虫卵，调查成虫产卵量，连续调查7天。每个养虫盒作为一次重复，每个处理三个重复。结果用SPSS16.0版软件进行统计分析，单因素方差分析后采用LSD法检验处理间的差异显著性，以P<0.05作为显著性差异水平，见表2。
表2
注：cfu/kg中的kg以干燥的玉米秸秆的质量计。
结合表1和表2的结果可知，在菌用量范围为1.5×1010至2.55×1011cfu/kg时，可提高成虫产卵量。
7.菌株3-2对幼虫成活率的影响
将3-2菌株的沉淀菌配制成107至1012六个不同浓度的菌悬液，分别加入到白星花金龟的幼虫饲料中，混匀。以不加菌悬液的幼虫饲料作为空白对照(CK)。将二龄初幼虫分别放到铺有上述七种处理的幼虫饲料的食品塑料盒中，每个食品塑料盒放置30头幼虫，提供正常培养(28℃，14L：10D)，每5天调查幼虫的成活率并称重，共调查20天。每个食品塑料盒作为一次重复，每个处理三个重复。结果用SPSS16.0版软件进行统计分析，单因素方差分析后采用LSD法检验处理间的差异显著性，以P<0.05作为显著性差异水平，见表3。
表3
注：cfu/kg中的kg以干燥的玉米秸秆的质量计。
结果表明，3-2对幼虫成活率无显著影响，但在1.65×1011cfu/kg浓度以上可以显著提高白星花金龟幼虫的体重。
8.菌株3-2对卵孵化率的影响
将3-2菌株的沉淀菌配制成106至1012七个不同浓度菌悬液，分别加入到卵孵化基质中，混匀。以不加菌悬液的卵孵化基质作为空白对照(CK)。将白星花金龟新产1至2天的卵放到铺有上述八种处理的卵孵化基质的养虫盒中，每个养虫盒放置100粒卵，15天后调查卵孵化率。每个养虫盒作为一次重复，每个处理三个重复。结果用SPSS16.0版软件进行统计分析，单因素方差分析后采用LSD法检验处理间的差异显著性，以P<0.05作为显著性差异水平，见表4。
表4
注：cfu/kg中的kg以干燥的玉米秸秆的质量计。
结果表明，菌株3-2在7.68×106cfu/kg以上的浓度范围内可提高白星花金龟卵的孵化率，但在7.68×106至7.68×108cfu/kg之间与空白对照差异不够显著，与7.68×109cfu/kg的处理差异也够显著；而在7.68×109cfu/kg以上的浓度范围内相对于空白对照可显著提高白星花金龟卵的孵化率，特别是在7.68×1011cfu/kg浓度下孵化率可达100％。
9.菌株3-2的菌种鉴定
利用Illumina测序技术完成3-2菌株的全基因组测序，并用IDBA_UD软件进行基因组拼接。拼接获得的基因组进一步利用genmark软件进行基因预测，在获得所有的氨基酸序列之后，将所获得的全部氨基酸序列输入http://tlife.fudan.edu.cn/cvtree/cvtree/在线软件，在与该网站上已经公布的全基因组序列的2586个原核生物全基因组的蛋白质序列进行比对后，形成系统发育树。结果见图1。结果显示该物种与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)聚集在同一簇。由此确定3-2的菌株为枯草芽孢杆菌。
Claims (10)
1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其为保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17272的菌株。
2.一种对权利要求1所述的枯草芽孢杆菌经遗传改良后得到的第一工程菌株，且所述第一工程菌株具有与如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌相同的功能。
3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌或如权利要求2所述的第一工程菌株经自发突变后得到的自发突变菌株，且所述自发突变菌株与如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌具有相同的功能。
4.根据权利要求3所述的自发突变菌株经遗传改造后所得的第二工程菌株，且所述第二工程菌株与如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌具有相同的功能。
5.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌、如权利要求2所述的第一工程菌株、如权利要求3所述的自发突变菌株和如权利要求4所述的第二工程菌株中的至少一种；优选所述组合物中还包括产卵基质、幼虫饲料和卵孵化基质中的至少一种；优选所述产卵基质、幼虫饲料和卵孵化基质独立地包括玉米秸秆粉；优选所述玉米秸秆粉的粒径≤3mm；优选所述组合物中还包括水；更优选在所述组合物中，以所述玉米秸秆粉的干重计，水的用量为10％至20％。
6.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌、如权利要求2所述的第一工程菌株、如权利要求3所述的自发突变菌株、如权利要求4所述的第二工程菌株和如权利要求5所述的组合物中的至少一种在提高金龟总科(Scarabaeoidea)中的至少一种昆虫的产卵量、提高金龟总科(Scarabaeoidea)中的至少一种昆虫的幼虫成活率、提高金龟总科(Scarabaeoidea)中的至少一种昆虫的幼虫体重和提高金龟总科(Scarabaeoidea)中的至少一种昆虫的卵孵化率中的至少一种中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌在产卵基质中的用量为1.5×1010cfu/kg以上；
优选所述枯草芽孢杆菌在产卵基质中的用量为1.5×1010至2.55×1011cfu/kg。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌在幼虫饲料中的用量为1.65×1011cfu/kg以上；优选所述枯草芽孢杆菌在幼虫饲料中的用量为1.65×1011至1.65×1012cfu/kg。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌在卵孵化基质中的用量为7.68×106cfu/kg以上；优选所述枯草芽孢杆菌在卵孵化基质中的用量为7.68×109cfu/kg以上；更优选所述枯草芽孢杆菌在卵孵化基质中的用量为7.68×109cfu/kg至7.68×1012cfu/kg。
10.根据权利要求6至9中任意一项所述的应用，其特征在于，所述金龟总科(Scarabaeoidea)中的昆虫选自花金龟科(Cetoniidae)、犀金龟科(Dynastidae)、黑蜣科(Passalidae)、拟锹甲科(Sinodendridae)、锹甲科(Lucanidae)、粪金龟科(Geotrupidae)、皮金龟科(Trogidae)、蜉金龟科(Aphodiidae)、斑金龟科(Trichiidae)、胖金龟科(Valgidae)和金龟科(Scarabaeidae)中的至少一种昆虫；
优选所述花金龟科(Cetoniidae)中的昆虫选自星花金龟属(Protaetia)中的至少一种昆虫；
更优选所述星花金龟属(Protaetia)中的昆虫为白星花金龟(Protaetia brevitarsisLewis)。
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