CN109952111A - 包括假俭草提取物或其分离物作为活性成分的用于预防或治疗脱发的药物组合物 - Google Patents

包括假俭草提取物或其分离物作为活性成分的用于预防或治疗脱发的药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种包括假俭草提取物作为活性成分的用于预防或治疗脱发的组合物。具体地，本发明的假俭草提取物增加毛发生长相关因子的表达并促进毛发生长，因此可有效用于预防或治疗脱发。

Description

包括假俭草提取物或其分离物作为活性成分的用于预防或治 疗脱发的药物组合物
技术领域
本发明涉及一种用于预防或治疗脱发的组合物，所述组合物包括假俭草(Eremochloa ophiuroides)提取物或其分离物(fraction)作为活性成分。
本发明还涉及一种用于预防或治疗脱发的方法，所述方法包含向受试者给予药物有效剂量的假俭草提取物或其分离物的步骤。
本发明还涉及一种包括假俭草提取物或其分离物作为活性成分的药物组合物用于预防、改善或治疗脱发的用途。
本发明还涉及一种包括假俭草提取物或其分离物作为活性成分的健康功能食品组合物或毛发生长组合物用于预防、改善或治疗脱发的用途。
背景技术
当毛发通常生长的地方无毛发时表明为脱发。通常，当头皮失去黑且浓密的头发时，称为脱发。脱发的原因是多种多样的。已知遗传原因和雄性激素(男性荷尔蒙)是秃头发展的关键因素。推测部分女性型脱发与男性型脱发以相同途径发生，但在临床特征上有差异。
男性型脱发在具有例如稀疏头发症状的家族史的人中、从20岁或30岁开始发展。此时，前额与头发之间的分界线向后推，因此随着前额变宽、两颞区呈字母M的形状，头顶的脱发也在缓慢发展。同时，在女性型脱发的情况中，前额上方的发际线保留，但是头中央的头发变得更稀疏并且发量收缩。女性型脱发不如男性型脱发严重而且几乎不变成宽前额的彻底的秃头。
FDA许可的最具代表性的促进毛发生长的药物是米诺地尔和非那斯特莱。然而，长时间的施用米诺地尔具有例如水肿或心率不齐和在不希望的区域多毛等副作用。药物的效果在使用后6个月至1年最好，然后逐渐减少。非那斯特莱是可以抑制作为参与毛囊中睾酮代谢的酶的5-α-还原酶的活性的材料。然而，该材料会引起例如性功能障碍、抑郁症和自杀意念等副作用。此外，该材料可能增加出生缺陷的概率。因此，不可向生育年龄的女人或孕妇施用该材料。一旦停止施用这两种药物，脱发再次发展。丙戊酸是另一种治疗脱发的药物。然而，怀孕期间摄入；儿童的认知发展能力显著降低。同样，目前使用的所有药物具有副作用。因此，必需开发一种具有较少副作用的安全脱发治疗药剂。
参与头发发育的诱导物包括β-连环蛋白、ALP(碱性磷酸酶)和IGF-1(胰岛素样生长因子1)。具体地，β-连环蛋白是决定毛囊中干细胞命运的蛋白质。干细胞在β-连环蛋白的存在下分化成毛细胞并且在β-连环蛋白的缺失下分化成皮肤细胞。ALP参与血管生成并且向集中诱导真皮的毛细血管提供营养，从而促进毛发生长。IGF-1诱导毛发从休眠状态转化至生长状态，而毛发休眠状态是脱发的主要原因。同时，TGF-β(转化生长因子β)是攻击并破坏周围的滤泡细胞而导致脱发的毛发生长抑制因子。
假俭草是一种生长迟缓的暖季草坪草。这种草是多年生的，种植在大块的草皮中。假俭草属于禾本科，其学名是Eremochloa ophiuroides(Munro)Hack。其主要分布在中国、东亚、中南半岛、美国东北部、中部美洲和加勒比地区。其耐受多种类型的土壤，但特别优选潮湿的酸性土壤和低肥力的沙质土壤。叶长15～30mm、宽2～4mm且平坦，具有白色中脉。除叶环部(collar part)外没有毛且叶尖是圆的。茎具有压扁的鞘并且根是具有细分支的匍匐枝。其花具有3～5英寸的总状花序。该总状花序为紫色且略微扁平状，并具有两排小穗状花。
假俭草主要用作草坪或草皮草，由于其高叶率和好口感用作草料。韩国专利No.10-1350826描述了假俭草提取物或其分离物作为组合物用于预防和治疗糖尿病的用途。韩国专利No.10-1398546描述了假俭草提取物或其分离物作为组合物用于改善皮肤疾病的用途。
因此，本发明人尝试开发无毒、安全的脱发治疗药剂。在我们的研究过程中，本发明人确证，假俭草提取物可以增加小鼠模型中毛发生长相关因子的表达并且促进毛发生长，导致本发明的完成。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的一个目的是提供一种包括假俭草提取物或其分离物作为活性成分的用于预防或治疗脱发的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供一种包括假俭草提取物或其分离物作为活性成分的用于改善脱发的健康功能食品。
本发明同样的一个目的是提供一种包括假俭草提取物或其分离物作为活性成分的毛发生长组合物。
用于解决问题的方案
为了达到上述目的，本发明提供一种包括假俭草提取物作为活性成分的用于预防或治疗脱发的药物组合物。
本发明还提供一种包括假俭草提取物作为活性成分的用于改善脱发的健康功能食品。
本发明还提供一种包括假俭草提取物作为活性成分的毛发生长组合物。
本发明还提供一种包括假俭草提取物的分离物作为活性成分的用于预防或治疗脱发的药物组合物，所述假俭草提取物的分离物通过使用有机溶剂对所述提取物进行附加提取来制备。
本发明还提供一种包括假俭草提取物的分离物作为活性成分的用于改善脱发的健康功能食品，所述假俭草提取物的分离物通过使用有机溶剂对所述提取物进行附加提取来制备。
本发明还提供一种包括假俭草提取物的分离物作为活性成分的毛发生长组合物，所述假俭草提取物的分离物通过使用有机溶剂对所述提取物进行附加提取来制备。
本发明还提供一种用于预防或治疗脱发的方法，其包含向受试者给予药物有效剂量的假俭草提取物的步骤。
本发明还提供一种用于预防或治疗脱发的方法，其包含向受试者给予药物有效剂量的假俭草提取物的分离物的步骤，所述假俭草提取物的分离物通过使用有机溶剂对所述提取物进行附加提取来制备。
本发明还提供包括假俭草提取物作为活性成分的药物组合物用于预防或治疗脱发的用途。
本发明还提供包括假俭草提取物作为活性成分的健康功能食品用于预防或改善脱发的用途。
本发明还提供包括假俭草提取物作为活性成分的毛发生长组合物用于预防或治疗脱发的用途。
本发明还提供包括假俭草提取物的分离物作为活性成分的药物组合物用于预防或治疗脱发的用途，所述假俭草提取物的分离物通过使用有机溶剂对假俭草提取物进行附加提取来制备。
本发明还提供包括假俭草提取物的分离物作为活性成分的健康功能食品用于预防或改善脱发的用途，所述假俭草提取物的分离物通过使用有机溶剂对假俭草提取物进行附加提取来制备。
本发明还提供包括假俭草提取物的分离物作为活性成分的毛发生长组合物用于预防或改善脱发的用途，所述假俭草提取物的分离物通过使用有机溶剂对假俭草提取物进行附加提取来制备。
发明的效果
本发明的假俭草提取物或其分离物增加毛发生长相关因子的表达并因此促进毛发生长，从而可有效用于预防或治疗脱发。
附图说明
参考附图可以更好理解本发明优选实施方案的应用，其中：
图1是说明假俭草提取物的乙酸乙酯分离物(A)或丁醇分离物(B)的皮肤细胞增殖活性的图。
图2是说明β-连环蛋白和ALP根据假俭草提取物的乙酸乙酯分离物(A)或丁醇分离物(B)表达的模式的图。
图3是在小鼠去毛皮肤上分布假俭草提取物的乙酸乙酯分离物(A)或丁醇分离物(B)后拍摄的照片。
图4是说明分布假俭草提取物的乙酸乙酯分离物(A)或丁醇分离物(B)后，小鼠去毛皮肤上毛发生长效果的照片。
图5是说明小鼠皮肤组织中ALP酶活性根据假俭草提取物的乙酸乙酯分离物(A)或丁醇分离物(B)变化的图。
图6是说明小鼠皮肤组织中由假俭草提取物的乙酸乙酯分离物(A)或丁醇分离物(B)诱导的IGF-1mRNA表达的图。
图7是说明小鼠皮肤组织中由假俭草提取物的乙酸乙酯分离物(A)或丁醇分离物(B)诱导的TGF-βmRNA表达的图。
图8是说明染色后观察的分布有假俭草提取物的乙酸乙酯分离物(A)或丁醇分离物(B)的小鼠皮肤组织中的毛囊生长的照片。
图9是说明其上分布假俭草提取物的乙酸乙酯分离物(A)或丁醇分离物(B)后的小鼠皮肤上毛发生长的荧光显微镜照片。
图10是说明分布假俭草提取物(B)后裸鼠皮肤上的毛发生长效果的照片。
图11是说明染色后观察的分布假俭草提取物(B)后裸鼠皮肤上的毛囊生长的照片。
图12是说明其上分布假俭草提取物(B)后裸鼠皮肤上毛发生长的荧光显微镜照片。
具体实施方式
实施本发明的最佳方式
下文详细描述本发明。
本发明提供一种包括假俭草提取物作为活性成分的用于预防或治疗脱发的药物组合物。
本发明还提供一种包含向受试者给予药物有效剂量的假俭草提取物的步骤的用于预防或治疗脱发的方法。
本发明还提供一种包括假俭草提取物作为活性成分的药物组合物用于预防或治疗脱发的用途。
上述假俭草是购买或者栽培的。可以使用假俭草所有的叶、茎或根。在本发明的一个实施方案中，使用假俭草叶。
可以通过使用水、醇或其混合物作为溶剂提取所述提取物。所述醇优选是C1～C4低级醇。低级醇在此优选是乙醇或甲醇。在本发明的一个实施方案中，醇是80％甲醇。
提取方法可以是本领域技术人员已知的任何常规方法，例如减压提取、沸水提取、过滤、热水提取、浸提、回流提取、冷提取、抽汽、室温提取或超声波提取。在本发明的一个实施方案中，提取方法是室温提取。
提取溶剂以假俭草总体积的20～50倍体积添加至干燥的假俭草中，优选25～40倍，更优选30～35倍。在本发明的一个实施方案中，提取溶剂以假俭草总体积的32倍体积添加至干燥假俭草。
可以在10～50℃下进行提取，优选在10～40℃，更优选在10～30℃。在本发明的一个实施方案中，在15～25℃下进行提取。提取可以进行2～5天，优选2～4天。在本发明的一个实施方案中，提取进行3天。可以重复提取1～5次，优选2～4次。在本发明的一个实施方案中，重复提取3次。
在本发明的一个优选实施方案中，将甲醇添加至假俭草叶样品中以获得假俭草提取物。然后，从假俭草提取物获得乙酸乙酯分离物和丁醇分离物。本发明人确证上述分离物可以增加皮肤细胞中β-连环蛋白和ALP的表达并可以增加小鼠皮肤组织中ALP酶的活性和IGF-1的表达，但是减少TGF-β的表达，因此确证毛发生长诱导效果(参见图1～12)。因此，确证假俭草提取物包括其分离物可有效用于治疗脱发。
药物组合物优选包含作为活性成分的、组合物总重量的10～95重量％的本发明的假俭草提取物。本发明的药物组合物可包含除活性成分外的一种或多种具有与活性成分相同或相似功能的有效成分。
本发明的药物组合物可以包含任何普遍使用的载体、稀释液、赋形剂或至少其中两种的组合。药学上可接受的载体可以是可在人体内运送本发明的组合物的任何载体而没有限制，例如Merck Index，13版,Merck&Co.Inc.中描述的化合物，例如生理盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲生理盐水、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体和包括一种或多种这些组分的混合物。如果需要，可附加添加例如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂等一般添加剂。
本发明的组合物可通过与例如填料、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂等通用稀释剂或赋形剂混合来制备。
本发明的组合物可口服或肠胃外给药并且可以药物制剂的一般形式使用。用于口服的固体制剂是片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂和锭剂。通过混合一种或多种合适的赋形剂，例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等，制备这些固体制剂。除简单赋形剂外，可以使用例如硬脂酸镁、滑石等的润滑剂。用于口服的液体制剂是悬浮液、溶液、乳剂和糖浆剂，并且上述制剂可以包含例如润湿剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂等多种赋形剂。
用于肠胃外给药的制剂是无菌水溶液、水不溶性赋形剂、悬浮液、乳剂、冻干制剂和注射剂。
除一种或多种活性化合物外，水不溶性赋形剂和悬浮液可以包含丙二醇、聚乙二醇、例如橄榄油等植物油、例如油酸乙酯等可注射的酯等。
本发明的组合物可以口服或肠胃外给药，肠胃外给药在此例举为皮肤外用、腹膜内注射、直肠内注射、皮下注射、静脉内注射、肌内注射或胸内注射。
本发明的组合物以药学有效剂量给药。药物有效剂量可以根据疾病种类、疾病严重程度、药物活性、药物敏感性、给药时间、给药途径、排泄、治疗期和其他共同治疗药剂等进行调整。本发明的组合物可以单独给药或与其他治疗药剂组合给药。当本发明的组合物与其他治疗药剂共同给药时，给药可以是顺序的或同时的。
为了达到预期效果，本发明的药物组合物中包含的活性成分的量可为0.001～10,000mg/㎏，优选为0.1～5g/kg。本发明所述药物组合物可一天一次或者以分剂量(divideddose)一天多次给药。
本发明还提供一种包括假俭草提取物作为活性成分的用于改善脱发的健康功能食品。
本发明还提供一种包括假俭草提取物作为活性成分的健康功能食品用于预防或改善脱发的用途。
提取物可以具有如上所述的特征。例如，上述假俭草是购买或者栽培的。可以使用假俭草所有的叶、茎或根。在本发明的一个实施方案中，使用假俭草叶。
可以通过使用水、醇或其混合物作为溶剂提取所述提取物。所述醇优选是C1～C4低级醇。低级醇在此优选是乙醇或甲醇。在本发明的一个实施方案中，醇是80％甲醇。
在本发明的一个优选实施方案中，将甲醇添加至假俭草叶样品以获得假俭草提取物。然后，从假俭草提取物获得乙酸乙酯分离物和丁醇分离物。本发明人确证上述分离物可以增加皮肤细胞中β-连环蛋白和ALP的表达并可以增加小鼠皮肤组织中ALP酶的活性和IGF-1的表达，但是减少TGF-β的表达，因此确证毛发生长诱导效果(参见图1～12)。因此，确证假俭草提取物包括其分离物可有效用于改善脱发。
可以根据目的确定作为活性成分添加至健康功能食品中的假俭草提取物的含量。通常，健康功能食品优选包含相对于健康功能食品总重量为0.01～90重量份的假俭草提取物。
此外，对于健康功能食品的形式和种类没有特别限制。添加有本发明提取物的健康功能食品的形式可以是片剂、胶囊、散剂、颗粒、溶液或丸剂。
本发明的健康功能食品可以像其他健康食品一样附加包含各种调味剂或天然碳水化合物等。上述天然碳水化合物可以是例如葡萄糖和果糖等单糖、例如麦芽糖和蔗糖等二糖、例如糊精和环糊精等多糖、和例如木聚糖、山梨醇和赤藓糖醇等葡萄糖醇的天然碳水化合物。此外，可以包含例如奇异果甜蛋白和甜叶菊提取物等天然甜味剂、和例如糖精和天冬甜素等人工甜味剂作为甜味剂。
除上述成分外，本发明的健康功能食品可以包含多种营养素、维生素、矿物质、调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增粘剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油或醇。所有所述成分可以单独或一起添加。这些成分的混合比率实际上并不重要，但通常，每一种可相对于每100重量份的本发明提取物添加0.01～0.1重量份。
本发明还提供包括假俭草提取物作为活性成分的毛发生长组合物。
本发明还提供包括假俭草提取物作为活性成分的毛发生长组合物用于预防或治疗脱发的用途。
提取物可以具有如上所述的特征。例如，上述假俭草是购买或者栽培的。可以使用假俭草所有的叶、茎或根。本发明的一个实施方案中，使用假俭草叶。
可以通过使用水、醇或其混合物作为溶剂提取所述提取物。所述醇优选是C1～C4低级醇。低级醇在此优选是乙醇或甲醇。在本发明的一个实施方案中，醇是80％甲醇。
在本发明的一个优选实施方案中，将甲醇添加至假俭草叶样品以获得假俭草提取物。然后，从假俭草提取物获得乙酸乙酯分离物和丁醇分离物。本发明人确证上述分离物可以增加皮肤细胞中β-连环蛋白和ALP的表达并可以增加小鼠皮肤组织中ALP酶的活性和IGF-1的表达，但是减少TGF-β的表达，因此确证毛发生长诱导效果(参见图1～12)。因此，确证假俭草提取物包括其分离物可有效用作毛发生长组合物。
本发明的毛发生长组合物可包含浓度为组合物总重量的0.001～99.99重量％、优选0.1～50重量％的假俭草提取物。然而，只要对人体不引起毒性，上述比率可以根据使用目的或脱发严重程度进行调整。
本发明的毛发生长组合物可以以适当浓度包含除假俭草提取物外的通用化妆品材料或药物材料。可以包含例如纯净水、矿泉水、乙醇、甘油、角鲨烯、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇、蓖麻油、椿油(tsubaki oil)、石蜡油、表面活性剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、抗氧化剂、芳香剂或载体。
本发明的组合物除上述组成外可以包含运送营养至毛囊的组分和促进毛发生长的其它补充组分，其例举为例如维生素A、维生素B1、维生素B2、烟酸、维生素C、维生素E、泛酸钠、泛酸钾或生物素H(维生素H)等维生素；例如多巴等氨基酸；和例如大麻籽油、蛋油、橄榄油、山茶油、菜籽油、芝麻油和胚芽油等动/植油。这样的补充材料的优选浓度为组合物总体积的0.0001～10重量％，更优选为0.01～1重量％。
本发明的组合物可以直接施用或分散在毛发或头皮上。因此，组合物可以以生发油、洗发液、发乳、喷发胶、发用摩丝、发用啫喱、护发素、洗发香波、染发剂、发膜、护发精华素(hair treatment)、眉毛生长剂、睫毛生长剂或睫毛营养素、宠物香波或宠物染发剂的形式制备。
本发明的组合物可以配制成本领域可常规制备的任何形式，例如乳霜、洗剂、补剂、喷雾、气溶胶、油、溶液、悬浮液、凝胶、软膏、乳剂或糊剂。
在将本发明的组合物配制成糊剂、乳霜或凝胶的情况下，合适的载体可以选自由动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅、皂土、二氧化硅、滑石和氧化锌组成的组。
在将本发明的组合物配制成喷雾剂的情况下，合适的载体可以选自由乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末组成的组，并且特别地可以附加包含例如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚等喷射剂。
在将本发明的组合物配制成液体的情况下，合适的载体可以选自由溶剂、增溶剂和乳化剂组成的组，其例举为水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯。
在将本发明的组合物配制成悬浮液的情况下，合适的载体可以选自由例如水、乙醇或丙二醇的液体稀释剂；例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯等悬浮剂；微晶纤维素；甲基氢氧化铝；皂土；琼脂；和黄芪胶组成的组。
本发明还提供一种包括假俭草提取物的分离物作为活性成分的用于预防或治疗脱发的药物组合物，所述假俭草提取物的分离物通过使用有机溶剂对提取物进行附加提取来制备。
本发明还提供一种用于预防或治疗脱发的方法，其包含向受试者给予药物有效剂量的假俭草提取物的分离物的步骤，所述假俭草提取物的分离物通过使用有机溶剂对假俭草提取物进行附加提取来制备。
本发明还提供包含假俭草提取物的分离物作为活性成分的药物组合物用于预防或治疗脱发的用途，所述假俭草提取物的分离物通过使用有机溶剂对假俭草提取物进行附加提取来制备。
提取物可以具有如上所述的特征。例如，上述假俭草是购买或者栽培的。可以使用假俭草所有的叶、茎或根。本发明的一个实施方案中，使用假俭草叶。
可以通过使用水、醇或其混合物作为溶剂提取所述提取物。所述醇优选是C1～C4低级醇。低级醇在此优选是乙醇或甲醇。在本发明的一个实施方案中，醇是80％甲醇。
有机溶剂在此可以是正己烷、乙酸乙酯或丁醇，特别是乙酸乙酯或丁醇。
分离物可以具有如上所述的特征。例如，分离物可以是乙酸乙酯分离物或丁醇分离物。可以通过使用正己烷提取假俭草甲醇提取物，去除可溶层，并用乙酸乙酯对剩余水层进行提取来获得乙酸乙酯分离物。丁醇分离物可以通过用丁醇提取假俭草的乙酸乙酯分离物获得。
在本发明的一个优选实施方案中，将甲醇添加至假俭草叶样品来获得假俭草提取物。然后，从假俭草提取物获得乙酸乙酯分离物和丁醇分离物。本发明人确证上述分离物可以增加皮肤细胞中β-连环蛋白和ALP的表达并可以增加小鼠皮肤组织中ALP酶的活性和IGF-1的表达，但是减少TGF-β的表达，因此确证毛发生长诱导效果(参见图1～12)。
本发明还提供一种包括假俭草提取物的分离物作为活性成分的用于改善脱发的健康功能食品，所述假俭草提取物的分离物通过使用有机溶剂对提取物进行附加提取来制备。
本发明还提供包括假俭草提取物的分离物作为活性成分的健康功能食品用于预防或改善脱发的用途，所述假俭草提取物的分离物通过使用有机溶剂对假俭草提取物进行附加提取来制备。
提取物可以具有如上所述的特征。例如，上述假俭草是购买或者栽培的。可以使用假俭草所有的叶、茎或根。本发明的一个实施方案中，使用假俭草叶。
可以通过使用水、醇或其混合物作为溶剂提取所述提取物。所述醇优选是C1～C4低级醇。低级醇在此优选是乙醇或甲醇。在本发明的一个实施方案中，醇是80％甲醇。
有机溶剂在此可以是正己烷、乙酸乙酯或丁醇，特别是乙酸乙酯或丁醇。
分离物可以具有如上所述的特征。例如，分离物可以是乙酸乙酯分离物或丁醇分离物。可以通过使用正己烷提取假俭草甲醇提取物，去除可溶层，并用乙酸乙酯对剩余水层进行提取来获得乙酸乙酯分离物。丁醇分离物可以通过用丁醇提取假俭草的乙酸乙酯分离物获得。
健康功能食品可以具有如上所述的特征。
在本发明的一个优选实施方案中，将甲醇添加至假俭草叶样品以获得假俭草提取物。然后，从假俭草提取物获得乙酸乙酯分离物和丁醇分离物。本发明人确证上述分离物可以增加皮肤细胞中β-连环蛋白和ALP的表达并可以增加小鼠皮肤组织中ALP酶的活性和IGF-1的表达，但是减少TGF-β的表达，因此确证毛发生长诱导效果(参见图1～12)。
本发明还提供一种包括假俭草提取物的分离物作为活性成分的毛发生长组合物，所述假俭草提取物的分离物通过使用有机溶剂对提取物进行附加提取来制备。
此外，本发明提供包括假俭草提取物的分离物作为活性成分的毛发生长组合物用于预防或改善脱发的用途，所述假俭草提取物的分离物通过使用有机溶剂对假俭草提取物进行附加提取来制备。
提取物可以具有如上所述的特征。例如，上述假俭草是购买或者栽培的。可以使用假俭草所有的叶、茎或根。本发明的一个实施方案中，使用假俭草叶。
可以通过使用水、醇或其混合物作为溶剂提取所述提取物。所述醇优选是C1～C4低级醇。低级醇在此优选是乙醇或甲醇。在本发明的一个实施方案中，醇是80％甲醇。
有机溶剂在此可以是正己烷、乙酸乙酯或丁醇，特别是乙酸乙酯或丁醇。
分离物可以具有如上所述的特征。例如，分离物可以是乙酸乙酯分离物或丁醇分离物。可以通过使用正己烷提取假俭草甲醇提取物，去除可溶层，并用乙酸乙酯对剩余水层进行提取来获得乙酸乙酯分离物。丁醇分离物可以通过用丁醇提取假俭草的乙酸乙酯分离物获得。
毛发生长组合物可以具有如上所述的特征。
在本发明的一个优选实施方案中，将甲醇添加至假俭草叶样品以获得假俭草提取物。然后，从假俭草提取物获得乙酸乙酯分离物和丁醇分离物。本发明人确证上述分离物可以增加皮肤细胞中β-连环蛋白和ALP的表达并可以增加小鼠皮肤组织中ALP酶的活性和IGF-1的表达，但是减少TGF-β的表达，因此确证毛发生长诱导效果(参见图1～12)。
本发明的方式
如下述实施例所示，本发明实际和目前优选的实施方案是说明性的。
然而，将理解的是本领域技术人员在考虑本公开时可在本发明的精神和范围内做出修改和改进。
实施例1：假俭草提取物的制备
从日本的Fukukaen Nursery and Blub Co.Ltd购买假俭草种子，种植在韩国井邑市韩国原子能研究所(Korea Atomic Energy Research Institute)的先进放射技术研究所(Advanced Radiation Technology)的田地里。从生长的假俭草收集叶子。在-80℃下储存所得叶子。将7kg假俭草叶与225L的80％甲醇混合，向其中添加3次，并将混合物在混合器中研磨。在室温下诱导沉淀3天。在50℃下减压浓缩所得提取物。结果，制备出502.5g假俭草甲醇提取物。
实施例2：假俭草分离物的制备
根据极性使用有机溶剂分离实施例1中获得的假俭草甲醇提取物。减压浓缩的甲醇提取物悬浮在添加有10％甲醇的3L水中。首先，向其中添加5次3L的低极性溶剂己烷(正己烷)。减压浓缩分离物并干燥。结果，获得44.0311g己烷分离物。然后，向水层添加5次3L的乙酸乙酯，接着分离。减压浓缩分离物并干燥。结果，获得28.1328g乙酸乙酯分离物。然后，向水层添加5次3L的丁醇，接着分离。减压浓缩分离物并干燥。结果，获得111.1267g丁醇分离物和213.371g水溶性分离物。
实验实施例1：皮肤细胞增殖活性的确定
通过MTT法研究假俭草提取物的乙酸乙酯和甲醇分离物对皮肤细胞(HaCaT)增殖的影响。
具体地，在补充有10％FBS的培养基中稀释HaCaT细胞，以50,000细胞/孔的密度分布在24孔板中，接着培养24小时。培养完成后，用补充有1％FBS的培养基替换培养基以最小化包含在血清中的其他成分的作用，接着培养24小时。此后，向培养基中添加或不添加浓度为100ng/mL、1μg/mL或10μg/mL的假俭草分离物，进一步培养细胞。用补充有0.5mg/mL的MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物](Amersco，美国)替换细胞培养的培养基，接着在37℃培养细胞。3小时后，用PBS彻底洗去MTT试剂，向其中添加200mL的DMSO(二甲基亚砜，Amresco)从而完全溶解甲臜。将溶解的甲臜转移至96孔板。通过使用Infinite M200(TECAN，瑞士)测量OD540。
结果，如图1所示，与蒸馏水处理的对照(Con)相比，假俭草乙酸乙酯分离物(A)或丁醇分离物(B)处理的组的细胞增殖活性增加(图1)。
实验实施例2：毛发生长诱导因子表达的确证
进行免疫印迹法确证假俭草乙酸乙酯和丁醇分离物对毛发生长诱导因子β-连环蛋白和ALP的表达的影响。
具体地，HaCaT细胞以2×106细胞(3mL)/皿的密度分布在60mm培养皿中，接着在37℃、5％CO2的恒温箱中培养12小时使得细胞附着在培养皿上。用浓度为50μg/mL的假俭草乙酸乙酯分离物或丁醇分离物处理细胞。收集细胞并悬浮在包含蛋白酶抑制剂(1mM PMSF，0.1mM冈田酸(okadaic acid)、抑肽酶、亮抑肽酶和胃酶抑素)的裂解缓冲液(150mM NaCl，10mM Tris-HCl，1mM EGTA，1mM EDTA，0.2mM钒酸钠，0.5％诺乃清洁剂P-40)中。将混合物置于冰上30分钟，然后进行超声处理。细胞裂解物在2×SDS终止液(2％SDS，5mM EGTA，5mMEDTA，25mM二硫苏糖醇，10％甘油，0.01％溴酚蓝，0.25M Tris-Cl(pH 6.8))中稀释，接着在100℃煮沸5分钟。通过10％SDS-PAGE从各细胞裂解物中分离出等量蛋白质，并且将分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。为防止硝酸纤维素膜上非特异性抗体结合，进行1小时的封闭。然后，使用PBS清洗膜两次。通过在室温下搅拌2小时使得膜与β-连环蛋白和ALP一抗反应。使用PBS清洗膜2～3次。使膜与以上述相同比率稀释的HRP-缀合的二抗反应，接着在室温下反应2小时。通过显影X射线胶片研究各蛋白质的表达量。
结果，如图2所示，与蒸馏水处理的对照(Con)相比，假俭草乙酸乙酯分离物(A)或丁醇分离物(B)处理的皮肤细胞中的β-连环蛋白和ALP的表达增加(图2)。
实验实施例3：脱毛诱导小鼠中毛发生长诱导效果的确证
<3-1>毛发生长的确证
进行下述实验研究分布在脱毛小鼠皮肤上的假俭草乙酸乙酯和丁醇分离物的毛发生长诱导效果。
具体地，使43日龄的C57BL/6CrN小鼠(Central Lab.Animal Inc.，首尔)适应实验室6天。因此，49日龄的小鼠用于该实验。在恒温23±3℃、湿度55±3％的动物房中饲养小鼠。每个鼠笼包含3只小鼠。小鼠被随机分组成为实验组。在实验期间，提供小鼠不限量的水和饲料。
为了应用毛发生长周期的休眠阶段，首先通过使用电动剃刀在不损伤皮肤的情况下小心地去除小鼠背部毛发。其次，为去除皮肤中的毛囊和微小毛发，在皮肤上分布含巯基乙酸的Niclean脱毛膏(Ildong Pharmaceutical Co.,Ltd.，韩国)，然后发明人等待2分钟以便皮肤良好吸收。此后，用温水去除脱毛膏，并在实验前给予小鼠24小时用于恢复。持续观察小鼠并确证不具有炎症。0.2mL样品每天在下午2点一日一次地喷洒在毛发去除区域持续21天。此时，使用刷子均匀铺展样品。使用蒸馏水处理阴性对照(DW)，用3％米诺地尔(Dongsung Bio Pharm.Co.,Ltd.,韩国)处理阳性对照(3％MXD)。用假俭草乙酸乙酯分离物(A)和丁醇分离物(B)处理实验组(图3)。
结果，如图4所示，在施用10天后，阴性对照观察到深蓝色肤色。施用18天后，毛发去除区域观察到部分毛发生长。同时，在阳性对照组应用10天后，脱毛区域扩大，其中肤色转为深蓝色。在施用21天后，毛发去除中心区域观察到一般的毛发生长。在假俭草乙酸乙酯分离物(A)或丁醇分离物(B)处理的小鼠中，施用10天后，脱毛区域的部分外边界观察到深蓝色肤色，施用18天后，在整个脱毛区域的约90％明显观察到毛发生长(图4)。
<3-2>皮肤组织中ALP酶活性的确证
进行下述实验研究假俭草乙酸乙酯和丁醇分离物对小鼠皮肤组织中ALP酶活性的影响。
具体地，通过与实验实施例<3-1>所述相同的方式从使用样品处理21天的小鼠背部取出皮肤，在液氮中快速冷冻。将1g皮肤放入4倍皮肤重量的、0.1M的磷酸盐缓冲液中，接着均质化(homogenization)。将匀浆(homogenate)在4℃下以12,000rpm离心20分钟。获得的上清液用于ALP酶活性测量。通过使用自动生化分析仪(Hitachi-747)以常规方法分析ALP酶活性。
结果，如图5所示，假俭草乙酸乙酯分离物(A)或丁醇分离物(B)处理的组比阴性对照组(DW)具有更高的ALP活性(图5)。
<3-3>皮肤组织中IGF-1表达水平的确证
进行下述实验研究假俭草乙酸乙酯和丁醇分离物对小鼠皮肤组织中IGF-1mRNA表达的影响。
具体地，通过与实验实施例<3-1>所述相同的方式从使用样品处理20天的小鼠背部取出皮肤，以获得皮肤组织。通过常规方法提取皮肤组织mRNA。通过常规方法对样品进行qPCR(定量实时PCR)，并且通过数控化信号量化IGF-1mRNA的表达。IGF-1的相对水平标准化为β-肌动蛋白。
结果，如图6所示，与阴性对照(DW)相比，IGF-1mRNA的表达在阳性对照(3％MXD)中增加55％，在假俭草乙酸乙酯分离物(A)处理的实验组中增加33％，并且在假俭草丁醇分离物(B)处理的实验组中增加42％(P<0.05)。即，IGF-1mRNA表达水平的顺序为阳性对照>分离物B>分离物A>阴性对照，并且IGF-1mRNA的表达量随毛发生长而增加(图6)。
<3-4>皮肤组织中TGF-β的表达水平的确证
通过与实验实施例<3-3>所述相同的方式进行qPCR研究假俭草乙酸乙酯和丁醇分离物对小鼠皮肤组织中TGF-βmRNA表达的影响。
结果，如图7所示，与阴性对照(DW)相比，TGF-βmRNA的表达在阳性对照(3％MXD)中减少28％，在假俭草乙酸乙酯分离物(A)处理的实验组中减少25％，并且在假俭草丁醇分离物(B)处理的实验组中减少19％(P<0.05)。即，TGF-βmRNA表达水平的顺序为分离物A<阳性对照<分离物B<阴性对照，并且TGF-βmRNA的表达量随毛发生长而减少(图7)。
<3-5>皮肤组织中的毛囊生长的确证
在毛发生长的过程中，黑色素合成开始，因此真皮层变厚并且毛囊的尺寸深入生长至真皮和皮下脂肪。进行下述实验研究假俭草乙酸乙酯和丁醇分离物对毛囊生长的影响。
具体地，与实验实施例<3-1>所述相同的方式从使用样品处理21天的小鼠背部取出皮肤，从而获得皮肤组织。在4％多聚甲醇的中性缓冲液中固定所得皮肤组织48～72小时。清洗固定组织以清除固定剂，并且在70％乙醇中反应1小时，在80％乙醇中反应1小时，在90％乙醇中反应1小时，在95％乙醇中反应1小时，在100％乙醇中反应2小时，和在二甲苯中反应2小时用于脱水和净化(clarification)，接着通过使用包埋设备(Leica，德国)包埋入石蜡中。将包埋的石蜡块切成5μm厚的切片。将切片在二甲苯中反应15分钟两次，在100％乙醇中反应3分钟，在95％乙醇中反应3分钟，在90％乙醇中反应3分钟，在80％乙醇中反应3分钟，并且在70％乙醇中反应3分钟用于去石蜡化(deparaffinization)和脱水。将组织用苏木精染色5分钟然后用曙红染色1分钟。通过使用中性树胶封片剂(permount)将组织封片并在光学显微镜下观察染色组织。
结果，如图8所示，与阴性对照(DW)相比，毛囊的数量和其深度(真皮厚度)在阳性对照(3％MXD)和假俭草乙酸乙酯分离物(A)或丁醇分离物(B)处理的实验组中显著增加。与阴性对照相比，毛囊的数量按照分离物A<分离物B<阳性对照的顺序增加。真皮的厚度同样增加(图8)。
<3-6>毛发生长数量的对比
通过常规方法在光学显微镜下计数实验实施例<3-1>中小鼠的毛发生长数量用于比较。
结果，如图9所示，与阴性对照组(DW)小鼠相比，毛发生长数量在阳性对照组(3％MXD)小鼠和假俭草乙酸乙酯分离物(A)或丁醇分离物(B)处理的实验组小鼠中显著增加(图9)。
实验实施例4：遗传无毛裸鼠中毛发生长诱导效果的确证
<4-1>毛发生长的确证
进行下述实验研究分布在遗传无毛裸鼠上的假俭草提取物的毛发生长诱导效果。
具体地，35日龄的裸鼠(CAnN.Cg-Foxn1nu,Orientibio,首尔)适应实验室6天。因此，41日龄小鼠用于此实验。在恒温23±3℃、湿度55±3％的动物房中饲养小鼠。每个鼠笼包含3只小鼠。小鼠被随机分组成为实验组。在实验期间，提供小鼠不限量的水和饲料。0.2mL样品每天在下午2点一日一次地喷洒在毛发去除区域持续30天。同时，使用刷子均匀分散样本。用蒸馏水处理阴性对照(A)，并用假俭草提取物处理实验组(B)。
结果，如图10所示，在施用20天后，实验组观察到一般的毛发生长。在施用30天后，观察到在整个背部区域显著发生的毛发生长。阴性对照组无变化(图10)。
<4-2>皮肤组织中毛囊生长的确证
与实验实施例<4-1>所述相同的方式从使用样品处理21天的小鼠背部取出皮肤，从而获得皮肤组织。在4％多聚甲醇的中性缓冲液中固定所得皮肤组织48～72小时。清洗固定组织以清除固定剂，并且在70％乙醇中反应1小时，在80％乙醇中反应1小时，在90％乙醇中反应1小时，在95％乙醇中反应1小时，在100％乙醇中反应2小时，和在二甲苯中反应2小时用于脱水和净化，接着通过使用包埋设备(Leica，德国)包埋入石蜡中。将包埋的石蜡块切成5μm厚的切片。将切片在二甲苯中反应15分钟两次，在100％乙醇中反应3分钟，在95％乙醇中反应3分钟，在90％乙醇中反应3分钟，在80％乙醇中反应3分钟，并且在70％乙醇中反应3分钟用于去石蜡化和脱水。将组织用苏木精染色5分钟然后用曙红染色1分钟。通过使用中性树胶封片剂将组织封片并在光学显微镜下观察染色组织。
结果，如图11所示，与阴性对照(A)相比，毛囊的数量和其深度(真皮厚度)在假俭草提取物处理的实验组(B)中显著增加。与阴性对照相比，毛囊的数量在实验组中增加。真皮的厚度同样增加(图11)。
<4-3>毛发生长数量的比较
通过常规方法在光学显微镜下计数实验实施例<4-1>中小鼠的毛发生长数量用于比较。
结果，如图12所示，与阴性对照组(A)小鼠相比，假俭草提取物处理的实验组(B)小鼠中生长的毛发数量显著增加(图12)。
本领域技术人员将理解的是，以上说明书中公开的构思和具体实施方案可容易地用作改造或设计用于实现与本发明同样目的的其他实施方案的基础。本领域技术人员还将理解的是，这些等同的实施方案不背离如所附权利要求书中所述的本发明的精神与范围。

Claims (20)

1.一种用于预防或治疗脱发的药物组合物，其包括假俭草提取物作为活性成分。
2.根据权利要求1所述的用于预防或治疗脱发的药物组合物，其中所述假俭草提取物通过使用水、C1～C4醇或其混合物作为溶剂来提取。
3.根据权利要求2所述的用于预防或治疗脱发的药物组合物，其中所述C1～C4醇是甲醇或乙醇。
4.一种用于改善脱发的健康功能食品，其包括假俭草提取物作为活性成分。
5.一种毛发生长组合物，其包括假俭草提取物作为活性成分。
6.一种用于预防或治疗脱发的药物组合物，其包括假俭草提取物的分离物作为活性成分，所述假俭草提取物的分离物通过使用有机溶剂对所述提取物进行附加提取来制备。
7.根据权利要求6所述的用于预防或治疗脱发的药物组合物，其中所述有机溶剂为正己烷、乙酸乙酯或丁醇。
8.根据权利要求6所述的用于预防或治疗脱发的药物组合物，其中所述有机溶剂为乙酸乙酯或丁醇。
9.一种用于改善脱发的健康功能食品，其包括假俭草提取物的分离物作为活性成分，所述假俭草提取物的分离物通过使用有机溶剂对所述提取物进行附加提取来制备。
10.根据权利要求9所述的用于改善脱发的健康功能食品，其中所述有机溶剂为正己烷、乙酸乙酯或丁醇。
11.一种毛发生长组合物，其包括假俭草提取物的分离物作为活性成分，所述假俭草提取物的分离物通过使用有机溶剂对所述提取物进行附加提取来制备。
12.根据权利要求11所述的毛发生长组合物，其中所述有机溶剂为正己烷、乙酸乙酯或丁醇。
13.一种用于预防或治疗脱发的方法，其包含向受试者给予药物有效剂量的假俭草提取物的步骤。
14.包括假俭草提取物作为活性成分的药物组合物用于预防或治疗脱发的用途。
15.包括假俭草提取物作为活性成分的健康功能食品用于预防或改善脱发的用途。
16.包括假俭草提取物作为活性成分的毛发生长组合物用于预防或治疗脱发的用途。
17.一种预防或治疗脱发的方法，其包含向受试者给予药物有效剂量的假俭草提取物的分离物的步骤，所述假俭草提取物的分离物通过使用有机溶剂对所述假俭草提取物进行附加提取来制备。
18.包括假俭草提取物的分离物作为活性成分的药物组合物用于预防或治疗脱发的用途，所述假俭草提取物的分离物通过使用有机溶剂对所述假俭草提取物进行附加提取来制备。
19.包括假俭草提取物的分离物作为活性成分的健康功能食品用于预防或改善脱发的用途，所述假俭草提取物的分离物通过使用有机溶剂对所述假俭草提取物进行附加提取来制备。
20.包括假俭草提取物的分离物作为活性成分的毛发生长组合物用于预防或改善脱发的用途，所述假俭草提取物的分离物通过使用有机溶剂对所述假俭草提取物进行附加提取来制备。
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