KR20110001290A - 발모를 위한 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 발모를 위한 약학 조성물에 관한 것으로, β-sitosterol, 하수오 및 상백피의 추출물 중 어느 하나 이상을 포함하는 발모를 위한 약학 조성물을 제공하여, 기존에 시판되고 있는 발모, 양모들에 비하여 천연물로부터 추출하여 양모를 위한 약학조성물을 제공하기 때문에 천연물을 이용한 양모제 제품의 질적인 수준을 향상시키는 효과가 있으며, 또한, 본 발명의 DCS-HT는 부작용이 없기 때문에 안전하게 사용할 수 있다는 효과가 있다.

양모, 탈모, 약학 조성물, β-sitosterol, 하수오, 상백피

Description

발모를 위한 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING THE HAIR FROM FALLING OUT}

본 발명은 발모를 위한 약학 조성물에 관한 것이다.

모발(毛髮)은 생명유지에 중요한 기관은 아니지만, 건강의 상태를 나타내는 척도이자 외모를 결정짓는 신체의 중요한 일부분이다. 그렇기 때문에 모발이 많은 일반인에게는 일상적인 탈모(脫毛)가 당연한 신체적 활동으로 여기지만, 탈모가 진행 중인 사람들은 우울, 수치심, 사회적 고립 등으로 인해 정신적 안녕과 삶의 질에 심각한 영향을 받을 수 있다.

게다가 현대사회에 들어서면서, 탈모가 유전 또는 노화에서 발생하는 것 이외에도 사회활동 증가, 입시, 직장에서의 스트레스 증가 및 서구화된 식사습관에서 오는 영양 불균형 등이 탈모에 직간접적으로 영향을 미치는 것으로 생각되고 있다.

예로부터, 발모(發毛), 양모(養毛) 및 탈모예방에 대한 연구는 인류의 역사만큼이나 유구하지만, 아직까지 발모 및 탈모 기전에 대해서는 정확하게 밝혀져 있 지 않은 상황이다. 그러나 최근에 전 세계적으로 많은 대학 및 기업 연구소 등에서 모발 성장과 탈모에 대한 세포학적, 생화학적 또는 분자생물학적 연구가 활발히 진행되고 있으며, 탈모 치료 및 모발 성장을 촉진시킬 수 있는 약물의 개발에도 많은 노력을 기울이고 있다.

현재 모발성장을 촉진하는 약물로 미국 Food and Drug Administration (FDA) 에서 공인 받은 것은 Minoxidil과 Finasteride 그리고 Propecia 등이 있다. Pharmacia & Upjohn社의 Minoxidil은 최초에는 고혈압 치료를 위한 혈관확장제로 개발되었으나 부작용으로 다모증이 보고되면서 발모제로 개발 되었다. 그리하여 Minoxidil의 발모효과에 대한 작용기전은 현재까지 명확히 밝혀지지 않았지만, 혈관확장을 통한 영양공급 증가 및 Potassium Channel Opening 효과 등이 모발 성장을 유도하는 것으로 생각되고 있다.

또한, 최근 Merck社에서 개발된 Finasteride와 MSD社에서 개발된 Propecia는 남성호르몬 대사에 작용하는 효소인 5 α-reductase의 활성을 억제시키는 물질이다.

한편, 발모, 양모 및 탈모예방 연구에 이용되는 실험법으로는 실험동물을 이용한 in vivo 평가와 모낭세포 및 조직배양을 이용한 in vitro 평가 등이 주로 이용되고 있는데, 1980년대는 모낭을 구성하고 있는 핵심 세포인 모유두 세포(Dermal Papilla Cell)와 외모근 초세포(Outer Root Sheath Cell)의 배양법이 개발되면서, 모낭에서의 분화기전에 대한 연구가 활기를 띠게 되었고, 이후 모낭조직 배양법이 개발되면서 발모, 양모 및 탈모 방지 등의 연구에 유용한 평가모델로 활용될 수 있 는 가능성을 보여주었다.

그리고 최근에는 생화학적, 분자생물학적 실험 방법을 이용하여 모발 성장과 관련된 각종 성장인자나 유전자의 동정, 작용기전 연구 및 약물탐색연구가 활발히 진행되고 있다.

그러나 이러한 in vitro 배양기법을 이용한 평가는 모낭조직 내에서의 세포간의 상호작용과 모낭조직과 주위를 둘러싼 진피 조직과의 상호작용 및 혈액순환이 배제되는 등 모발성장에 직간접적으로 영향을 미칠 수 있는 많은 요소들이 배제되어 있어 한계성을 지니고 있다. 따라서 각종 생화학적 평가를 통해 탐색 되는 많은 약물들의 실제 효과를 검증하기 위해서는 아직까지 실험동물을 이용한 효과 평가와 임상실험 등이 주로 이용되고 있다.

또한, 최근에는 남성대머리 환자 증가뿐만 아니라 여성 탈모환자도 증가 추세에 있다. 그리고 대머리 환자의 분포가 중장년층에서 20~30 대의 젊은 층에서도 증가되어, 이들에 대한 취업문제, 결혼문제, 치료비용에 따른 경제적 부담, 정신적으로 대인 기피증 및 우울증 등이 증가하고 있는 추세이다.

그러므로 발모제품의 개발은 환자의 취업, 결혼 등에 대한 문제를 해결할 수 있을 뿐 아니라, 적극적인 사회참여를 유도하고 미용 및 정신적인 안정에 기여할 것이다. 그렇지만, 현재 시판되고 있는 발모 관련제품들은 탈모 및 발모에 대한 유전적, 생화학적, 병리학적 기작에 대한 이해가 부족하고, 대부분이 검증되지 않은 제품이 유통되고 있다.

또한, 기존제품의 조성을 변형한 형태로, 새로운 성분의 제품을 도출하지 못 하고 있는 실정이기 때문에 상대적으로 기술경쟁이 덜 하다. 그렇기 때문에 발모관련 제품들은 타 질환의 관련제품에 비해 개발기간이 짧고, 소요 비용이 적으며, 개발 성공 확률이 높은 장점을 가지고 있다. 게다가 발모에 효과적인 제품은 타 피부질환에 응용이 가능한 효과도 있다. 예를 들면, 5α-reductase type 2억제제에 관련된 발모제품들은 Dehydrotestosteron 분비 억제를 통해 여드름(acne)개선제로 활용될 수 있으며, 세포증식관련 발모제품은 상처치료제 등의 전환 가능하며, 임상적응증 확대가 가능하다.

한편, 국내에서 개인의 신체적 혹은 정신적 생활양식의 개선을 도모하는 QOL(Quality of Life)향상제품 시장이 확대되는 추세이다. 이러한 제품류에 큰 비중을 차지하는 발모관련제품 시장은 약 5000억에서 1조 시장을 예측하고 있으며, 점점 확대되고 있다. 그리고 발모관련 제품들은 타 질환의 관련제품에 비해 개발기간이 짧고, 소요 비용이 적으며, 개발 성공 확률이 높은 장점을 가지고 있으므로 적은 비용으로도 고부가 가치의 경제적 이윤을 창출 할 수 있다. 더욱이, 발모제품은 의약품뿐만 아니라 의약부외품, 샴푸, 비누 같은 다른 형태의 제품으로 전환이 가능하기 때문에 최종산업화 까지 성공률이 매우 높다. 이는 전체적인 개발비용 부담을 줄일 뿐만 아니라 다양한 마케팅에 의해서 시장 선점 효과가 크다고 하겠다.

또한, 한국사회도 고령화 사회, 소득증가로 인한 경제수준의 향상, 생활 패턴의 변화로 생명에는 직결되지 않지만, 생활의 질을 높이기 위한 QOL 향상 의약품 또는 제품의 증가하고 있는 추세에 있다. 그리하여 국내에서 발모제, 양모제 개발 연구는 제약회사보다는 화장품관련업체 및 몇몇 대학에서 연구가 이루어져 왔다. 탈모 방지 및 발모제품은 생약과 해초 등의 천연물 제품이 주로 사용되고 있다.

기타 양모 및 육모 효과를 주장하는 건강보조 식품, 발모비누, 영양샴푸, 에어토닉 등의 여러 형태로 판매되고 있으며 약 40여개의 업체가 제품을 출시하고 있다. 그렇지만, 일부 대기업을 제외한 대부분의 경우, 기존제품의 조성을 변형한 형태로, 유효성분의 작용기전 연구나 제품효과에 대한 객관적 검증 없이 탈모방지, 양모 또는 발모효과를 주장하는 제품을 생산하거나 수입하여 소비자를 현혹 시키고 있다. 식약청으로부터 허가 받은 탈모 관련 의약품은 minoxidil 성분의 바르는 치료제와 finasteride의 먹는 경구탈모 치료제로 구분된다.

minoxidil 성분의 제품은 가느다란 모발이 보이는 초기에는 효과가 좋지만, 완전히 탈모가 진행된 사람에게는 만족할만한 결과를 얻기다 어렵다는 단점이 있고, 경구탈모치료제의 제품은 발모 및 탈모방지 효과가 뛰어나지만 성욕감퇴, 남성의 발기력 저하, 임신여성의 위험성 등의 부작용이 있는 것으로 지적되고 있다.

국내외의 연구현황으로는 산수유추출물, 초산토코페롤, 가용성시스틴, 인삼엑기스 등을 주성분으로 하고 있는 제품과 PDG(펜타데칸산글리세리드)를 주요성분으로 하고 있는 제품이 있다. 또한, 살구씨, 진주가루, 토코페롤 등을 주성분으로 한 제품을 탈모예방 및 발모제로 시판하고 있는가 하면, 니코틴산벤질, 고삼추출물, 의이인추출물, 히노키티올을 주성분으로 하는 제품도 판매되고 있으며, 초산토코페롤과 살리실산, 니코산아미드 및 인삼, 감초 당귀, 천궁, 도인유 추출물 등의 생약 추출물을 주성분으로 하는 제품, 검은콩, 검은깨, 호도, 미역, 다시마의 추출물을 이용한 경구용 제품도 판매되고 있다. 그 외에 샴푸형태의 제품도 시판되고 있다. 그리고 최근에는 천연약재를 활용한 발모, 양모제 연구도 양적, 질적 증가 추세를 보이고 있다.

본 발명은 천연약재를 활용하여 발모를 위한 약학 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

이러한 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 태양으로 발모(發毛)를 위한 약학 조성물은 β-sitosterol, 하수오 및 상백피(桑白皮, Mori radicis Cortex)의 추출물 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 한다.

이때, 상기 β-sitosterol, 하수오 및 상백피의 추출물의 중량비(w/w)가 3:1:1인 것을 특징으로 한다.

이상에서 설명한 바와 같이 본 발명에 의하면, 기존에 시판되고 있는 발모, 양모들에 비하여 천연물로부터 추출하여 양모를 위한 약학조성물을 제공하기 때문에 천연물을 이용한 양모제 제품의 질적인 수준을 향상시키는 효과가 있으며, 또한, 본 발명의 DCS-HT는 부작용이 없기 때문에 안전하게 사용할 수 있다는 효과가 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 첨부된 도면을 참조하여 더 구체적으로 설명하되, 이미 주지되어진 기술적 부분에 대해서는 설명의 간결함을 위해 생략하거나 압축하기로 한다.

수컷의 탈모 패턴의 형태학적, 조직학적, 생화학적 측면은 짧은 원숭이를 가지고 연구한 끝에 알려졌다. 대표적인 수컷의 탈모패턴은 Telogen 기가 길어지고 Anagen 기가 짧아진다. 탈모의 한 가지 조직학적 특징은 Anagen 모낭이 충분이 길어지지 않는다는 것이다. 자라나는 모발의 두터움은 모낭의 크기로 결정되므로, 초기 Anagen에서 중기 Anagen에서 자라나는 모낭의 길이가 정상 모발 주기에서 매우 중요하다. 본 발명에서 C57BL/6 마우스를 실험동물 모델로 사용하였는데, C57BL6 마우스는 6주령부터 모발주기가 Telogen 기로 들어간다고 알려졌다.

본 발명에서는 5주령 된 실험동물을 이용하여 1주일간 순화기간을 거친 후 6주령 된 마우스를 가지고 실험을 하였다. Telogen기에 들어간 마우스는 털을 깎았을 때 체표면의 색이 분홍색을 띄었고, 시험을 진행함에 따라 체표면 색은 검정색으로 변해갔다. 이는 모발주기가 telogen기에서 Anagen기로 돌아감을 뜻 한다.

따라서 본 발명에서는 Hair Tonic 형태로 콩에서 추출한 β-sitosterol을 함유하는 조성물(이하, DCS-HT이라 함)을 포함하는 발모를 위한 약학 조성물을 제공한다.

β-sitosterol은 검은콩에서부터 추출된 것으로, 혈관형성을 유도하고 세포이동을 촉진하여 상처치유 효과가 있다는 것이 보고되어 있으며, 옥수수 불검화 추 출물이 잇몸치료제와 화상치료제 등으로 판매되고 있다. 또한, 항안드로젠, 세포 증식 효과를 가지고 있어, 안전성, 세포투과성, 원료 확보성 등의 천연물 발모제 개발에 필요한 충분한 조건들을 가지고 있다.

하수오는 마디풀과의 덩굴성 다년초로, 중국 원산이며 약용식물로 가꾸어진다. 뿌리줄기가 땅속으로 벋으면서 군데군데 고구마같이 굵은 덩이뿌리가 생기고, 원줄기는 가지가 갈라지면서 길게 벋어간다. 꽃은 8∼9월에 백색으로 피어 원추꽃차례로 달리는데, 방추형 또는 덩어리이며 길이 5~15cm, 지름 3~10cm이다. 바깥면은 적갈색~흑갈색이며 굵은 가로주름과 세로주름이 있다. 가로로 자른면은 엷은 유황색 내지 엷은 갈색이며 원형의 이상유관속이 특이한 무늬를 이루고 있다. 냄새가 없고 맛은 조금 쓰고 떫은 특징이 있다.

상백피는 뽕나무(Morus alba L.) 및 동속 근속식물 근피의 코르크층을 제거한 것으로, 겨울에 뿌리를 캐내 깨끗이 씻어 신선할 때 코르크층을 벗겨내고 세로로 갈라서 나무망치로 두드려 목부와 피부를 분리시켜 백피만 취한 것이다.

상백피의 맛은 달고, 성질은 차다. 주요 생리활성성분으로는 움벨리페론(Umbelliferone), 스코폴레틴(Scopoletin), 플라보노이드(Flavonoid) 성분의 모루신(Morusin), 멀베린(Mulberrin), 멀베로크로멘(Mulberrochromene), 시클로멀베린(Cyclomulberrin), 시클로멀베로크로멘(Cyclomulberrochromene) 등이 함유되어 있으며, 아세틸콜린(Acetyl Choline)과 작용이 유사한 항염성분이 함유되어 있다고 알려져 있다.

그리고 항암제인 시타라빈(Cytarabine)에 의해 유도한 탈모에 있어서도 모낭 수를 증가시키고 육모를 촉진시키는 효과가 있는 것으로 확인되었는데, 이는 상백피 중 플라보놀계 화합물에 의한 효과임이 입증되었다. 또한, Lymphoblastoma ATCC HTB 176 암종세포에 대해서도 현저한 세포증식 억제효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.

한편, 본 발명의 β-sitosterol, 하수오 및 상백피의 추출물이 포함된 약학조성물에 반묘(斑猫, Cantharides)가 포함되는 것도 가능한데, β-sitosterol 및 하수오만 포함된 추출물에 반묘를 첨가하는 것도 가능하고, β-sitosterol, 하수오 및 상백피의 추출물이 모두 포함된 추출물에 반묘를 첨가하는 것도 가능하다.

반묘는 가래과 길나잡이의 건사체로, 성질이 차고 맛이 매우며, 큰 독이 있다. 7~8월에 잡아서 그늘에 말리고 쓸 때에는 날개와 발을 떼어 버리고 찹쌀과 같이 볶되, 찹쌀이 노랗게 되는 것을 한도로 하여 쓰되 생으로 쓰면 토사를 한다. 그런데, 반묘는 피부자극약으로 내복 시에는 이뇨작용이 있고, 과량투여 시에는 혈뇨를 일으키지만, 외용으로는 피부자극약으로 피부를 발적시키며 생모작용을 하는 것으로 알려져 있다. 그리고 피부나 점막에 대하여 발적시키지만, 조직 침투력은 작아서 보통 피부 심층까지 미치지 않고, 그로 인해 생기 수포도 매우 빠르게 나아 상흔도 남지 않는다.

본 발명의 일실시예에서는 β-sitosterol, 하수오 및 상백피의 추출물이 포함된 발모를 위한 약학 조성물(DCS-HT)을 β-sitosterol, 하수오 및 상백피의 추출물을 중량비(w/w) 3:1:1로 조성하였다. 그리고 본 발명의 DCS-HT의 주요성분은 표1 에 나타낸 바와 같다.

	Component	(kg/100 kg)
Major component	β-sitosterol	0.500
	Moriradicis cortex extract	0.300
	Pleuropterus multflorus extract	0.200
Emolients	Gardenia seeds extract	0.500
	Sweet flag extract	0.300
	Aloe extract	0.300
	Propylene glycol	2.000
Flavoring agents	Rosemary extract	0.500
	Lavender extract	0.200
Moisteurizer	Collagen	2.000
Preservatives	Methylparaoxy benzoate	0.100
Solvent	Ethanol	48.000
	Deionized water	40.600
		95.5

그리고 본 발명의 일실시예에서는 β-sitosterol, 하수오 및 상백피의 추출물을 포함하는 약학 조성물에 대해서 실험이 이루어졌으나, 상기에서 언급한 반묘를 포함하여 발모를 위한 약학 조성물을 구성하는 것도 가능하다.

다음으로 β-sitosterol, 하수오 및 상백피의 추출물이 포함된 발모를 위한 약학 조성물(DCS-HT)의 효능을 알아보기 위해 하기와 같이, 실험된 결과에 대해서 설명한다.

1. 시험물질 및 실험동물

시험물질은 상기에서 설명한 β-sitosterol, 하수오 및 상백피의 추출물이 포함된 발모를 위한 약학 조성물(DCS-HT)을 이용하였으며, 실험동물로는 생후 5주된 C57BL6 마우스를 1주일간 사육실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 동물사육실의 온도는 23±3℃, 상대습도 50±10%, 12시간 간격으로 밤과 낮을 유지하였다. 실험동물은 격리용 사육상자(three shine)에서 사육하였고, 실험동물용 사료를 자유로이 급여하였다. 실험군은 총 4개의 군으로 정상대조군(Normall), 50% EtOH, 양성대조 약물군으로는 3% Minoxidil 처리군 및 본 발명의 시험물질 투여군(DCS-HT)으로 나누고, 각 군당 20마리로 총 80마리를 실험하였다.

2. 실험방법

2-1. 발모제의 도포 및 육안적 관찰

양모의 효과를 살펴보기 위해, 등쪽 피부의 색이 Pink Color를 보이는 휴지기 체모의 6주령을 사용하였다. 제모는 Electrical Animal Clipper를 이용하여 조심스럽게 마우스의 등판의 털을 깎아 내고 제거한 후, 그 부위에 붓을 이용하여 150 ㎕의 시료를 각 군별로 도포하였다. 시료의 처리는 매일 오전 10시에 일정한 시간을 정하여 3주간 실시하였다.

시료로는 DCS-HT과 3% Minoxidil 처리군을 실험시작 후 피부(제모부위)에 매일 도포하였고, 음성대조군으로는 saline과 용매대조군으로서는 50% 에탄올 (50% EtOH)을 도포하였다. 실험시작 후 1일, 6일, 12일, 16일 그리고 21일에 털이 자라는 상태를 육안으로 관찰하기 위하여 ether로 가볍게 마취한 후 사진촬영을 실시하였다. 털이 자란 상태의 정도는 육안으로 판단하여 0-20%(-), 20-40%(±), 40-60%(+), 60-80%(++), 80-100%(+++)로 기준을 정하였다.

2-2. 효소시료의 조제

피부조직은 Cold Chamber에서 미세 절편으로 만들었고, 그 중 일정량을 청량한 후, 4배량의 0.1 M 인산완충용액(pH 7.4)을 가하여 Bio Homogenizer를 이용하여 20% (w/v) 마쇄하여 균질액을 만들었다. 이 균질액을 12,000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 그 상층액에서 PMF(post-mitochondrial fraction)을 분리하였다.

2-3. 효소 활성도 측정

γ-GT 활성 -γ-glutamyl-3-carboxy-4-hydroxyanilide(γ-GT: γ-glutamyl transpeptidase)를 기질로 하여 생성된 5-aminosalicylic Acid를 다시 -ρ-xyleno와 Sodium Metaperiodate로 반응시켜 생성된 Kenoid 색소를 635nm에서 측정하는 kit 시약에 의하였다. 활성도 단위는 단백질 1mg 당 unit로 표시하였다.

ALP(Alkaline Phosphatase)활성은 ρ-nitrophenolphosphate를 기질로 하여 37℃에서 30분간 반응 시킨 후 유리된 ρ-nitrophenol에 Alkali를 가하여 비색 정량하는 Bessey-Lowry-Brock 방법에 의하였다. 활성도 단위는 단백질 1mg 당 Bessey-Lovry unit로 하였고, 단백질의 정량은 Lowry 등의 방법에 준하여 bovine albumin을 표준품으로 하여 측정하였다.

2-4. 분자생물학적 분석

RNA 추출 - 마우스를 부검하여 적출한 피부를 잘게 잘라 Deep freezer(-70℃)에 보관해 두었다가 피부조직 50~100 mg에 Trizol 1 ml를 넣어 homogenizer로 분쇄하였다. 분쇄된 조직은 실온에서 5분간 incubation 시킨 후 0.2 ml의 chloroform을 첨가하고 섞어 2~3분간 실온에서 다시 incubation 시킨 다음 4℃에서 12,000~15,000ㅧg로 10분 동안 원심 분리하여 상층액을 얻었다. 상층액에 0.5 mlR의 isoprophenol alcohol을 넣고 vortex한 후 실온에서 10분간 incubation하고 4℃에서 12,000ㅧg로 10분 동안 원심 분리하여 RNA pellet을 얻었다. 이 RNA pellet을 70% EtOH로 washing 한 뒤 건조시켰다. 그 후 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 수용액 50 μl에 pellet을 다시 용해시켰다, 그 용액을 DEPC 수용액에 1/100로 희석한 후 260nm에서 OD값을 측정하고 Absorbance ratio(A260/A280)가 1.8~2.0 사이인지 확인하였다.

2-5. cDNA 합성

power cDNA kit에서 제공되는 protocol에 따라 total RNA가 5μl이 되도록 RNA sample을 넣고 DEPC water를 9.5μl까지 채운 후 oligo(dT) primer 1μl를 넣어 65℃에서 10분간 가열하였다. RNase inhibitor 1.0μl, 5×RT buffer 4.0μl, dNTP 2.0μl, DTT 2.0μl, AMV RT buffer 0.5μl을 넣고 혼합하여 42℃에서 60분간 incubation 하였다. 그 후 70℃에서 5분간 가열하여 반응을 종결하였다.

2-6. PCR과 전기영동

i-taq DNA Polymerase를 이용하였으며, 10ㅧ PCR buffer 2.5μl, dNTP 2.0μl, template 1.25μl, forward primer 및 reverse primer 각각 1.25μl, iTaq 0.31μl, autoclaved deionized water 16.44μl를 섞고 PCR을 실시하였다. Primer 대조군으로 GAPD(58℃, 30 cycles), 실험군으로 IGF-1(60℃, 35cycles), TGF-β(58℃, 35 cycles)를 사용하였다. 그리고 TEB buffer를 이용하여 1.5% agarose gel에 전기영동 시켜 Ethidium bromide에 염색한 후 수세하였다. UV를 조사하여 DNA band를 확인하였고 그 확인된 band는 AlphaEasy v5.5 analyzer system을 이용하여 발현량을 수치화하였다.

2-7. 통계학적 분석

체중 및 장기무게 측정치의 통계적 분석은 SAS program을 사용하여 one-way ANOVA에서 유의한 F값의 항목을 Dunnett's test를 이용하여 p<0.05 수준에서 유의성을 검정하였다. 또한, 처치군에서 IGF-1 및 TGF-β의 발현에 대한 유의성은 Student's test를 사용하여 p<0.05 수준에서 대조군에 대해 검정하였다.

3. 결과

3-1. 육안적인 소견에 미치는 영향

표2 및 도1,2에 나타난 바와 같이, 실험동물을 이용한 양모실험에서 제모를 한 후 16일 뒤대조군이 털이 자란 부위를 측정하면, 전체 면적 중 36.1±9.8 %로 나타났으며, 이에 비해 β-sitosterol 처리군의 털이 자란 부위는 66.5±15.1 %로 털이 자라는 속도가 약 2배가량 빠른 것으로 나타났으며, 현재 시판되고 있는 3% Minoxidil을 처리한 군과 비슷한 효과를 보이고 있다.

Hair-regrowth/shaved area (%)
	1 Day	6 Day	12 Day	16 Day	21 Day
Normal	0.0±0.0	1.3±0.1	6.8±0.4	13.5±3.9	35.4±7.4
50% EtOH	0.0±0.0	1.6±0.1	9.4±1.7	21.4±6.5	36.3±8.4
3% Minoxidil	0.0±0.0	3.4±0.2*	25.6±3.5***	48.5±12.6***	68.1±14.2*
DCS-HT	0.0±0.0	1.4±0.3	15.4±4.6	44.6±12.5***	66.9±8.4*

3-2. γ-GT(γ-Glutamyl transpeptidase) 활성

γ-GT(γ-Glutamyl transpeptidase)는 생체 내 산화적 스트레스와 glutathione 대사, 그리고 세포막을 통한 아미노산 펩티드의 흡수 및 분비에 관여하는 효소로, glutamate, cysteine, glycine으로 구성된 glutathion의 체내 대사에 관여하여 세포내 hair의 케라틴화에 주성분인 cysteine을 공급하는데, 발모 주기에서 생장기(anagen)가 유도될 때 γ-GT의 더 많은 발현으로 발모의 표지 성분중 하나로 γ-GT가 제시되었다.

표3 및 도3에 나타난 바와 같이, 8주령 C3H 생쥐 등 부위를 제모하여 anagen 유도 후 날짜 경과에 따라 적출된 피부 조직의 γ-GT 측정 결과로, 제모 시 면도에 의한 피부자극으로 올수 있는 초기 효소 활성의 영향을 배제하고자 제모 1일 후부터 효소 활성을 측정하여 base-line을 정하였고, 초기에 3% minoxidil 도포군이 다른 군에 비해 효소 활성이 높게 나타났으나, 피부색이 핑크색에서 청색으로 변하는 8일에서 12일경에는 DCS-HT 도포군인 시험물질 도포군과 유사한 값을 나타내었다.

그리고 Hair re-growth가 급격히 일어나는 제모 후 15일에서 20일 경에는 DCS-HT 도포군이 3% MXD 도포군과 같이 유의한 효소 활성 증가를 나타내었는데(p<0.05), 이는 형태 관찰과 같은 결과를 보여주었다. 즉, 3% MXD 도포군은 생장기가 일어나는 시기에는 다른 군에 비하여 효소 활성이 높았고, 후기 생장기 시기인 15일에서 21일 사이에는 다른 군에 비해 활성이 떨어져 전반적으로 완만한 곡선의 변화를 보였다.

양성대조군인 3% Minoxidil의 경우에는 제모 후 11일에서 15일 사이에 효소 활성이 급격히 증가하는 반면, DCS-HT 도포군의 경우에는 약 10일째부터 효소 활성의 증가를 보여주었다. 이는 50% EtOH을 도포한 대조군에 비해 3일정도 생장기가 먼저 유도되었음을 나타낸 것이다. 또한 DCS-HT 도포군의 경우 도3에서 관찰된 바와 같이, 제모 후 15일에서 21일 사이에 급격한 hair re-growth가 일어남과 동시에 γ-GT 또한 유의하게 증가(p<0.01, p<0.001)하고 있음을 관찰할 수 있었다.

그리고 Richards 등은 표피에서 진피로 hair follicle의 함몰 시에 γ-GT의 발현이 보이지 않으나, 초기 생장기 단계에서 케라틴화와 관련하여 γ-GT 활성이 나타나고 있음을 보고하였다. 즉 제모 후 생장기가 유도되는 8일에서 11일경에 γ-GT 활성이 증가하는 양상은 초기 생장기의 케라틴화에 필요한 cysteine으로 분해하는데 γ-GT가 관여하여 나타난 결과로 생각된다. 특히 은행잎이 glutathione 대사에 관여하는 것으로 보고되어 있어 γ-GT 활성 증가에 영향을 준 것으로 사료 된다고 하겠다.

Group	1 Day	6 Days	12 Days	16 Days	21 Days
Normal	75.6±8.4	135.9±16.7	195.4±19.4	269.3±15.0	385.1±29.1
50% EtOH	73.4±6.9	154.6±12.5	202.4±13.6	280.1±24.6	405.2±25.1
3% Minoxidil	80.1±5.4	198.2±16.4*	236.4±10.7	342.1±17.4*	564.2±30.5**
DCS-HT	72.4±9.7	168.5±15.6	230.1±20.3	359.4±30.7*	697.4±23.4***

3-3. ALP(Alkaline phosphatase) 활성

ALP는 주로 혈관 신생에 관여하며, 진피 유두에 밀집되어 있는 모세혈관으로 영양을 공급함으로써 발모 작용을 원활하게 해 주는 것으로 알려져 있다. 따라서 ALP 측정은 발모 작용을 간접적으로 추측 가능한 것으로 보고되어 있고, non-growth 부위에 비해 re-growth 부위에서 alkaline phosphatase 활성이 현저히 증가함이 보고되었다.

표4와 도4는 날짜 경과에 따른 ALP 활성을 측정한 것으로, 3% Minoxidil 도포군의 경우 제모 후 5일에서 8일 사이의 ALP는 γ-GT와 유사한 양상으로 다른 군에 비해 유의한 차이를 보였다(p<0.05). 그리고 효소 활성은 생장기가 일어나는 시기인 8일에서 11일경에 세 군 모두 비슷한 양상으로 증가하는데, 3% minoxidil 도포군이 가장 높은 증가를 보였고, DCS-HT 도포군은 γ-GT 활성도와 유사하게 12일에서 16일 사이에 대조군에 비해 높은 활성 증가를 보여주었다.

여기서, 3% Minoxidil 도포군이 시간에 따라 ALP 활성도가 다른 군에 비해 증가하는 것은 혈관 확장에 의한 혈액순환의 증가로 모발 생장에 필요한 영양분을 공급함으로써 발모 작용이 나타나는 것과 관련된 결과로 추측되며, β-sitosterol, 하수오 및 상백피의 추출물을 포함하는 조성물 즉 DCS-toic 도포군도 대조군보다 높은 ALP 활성을 나타내어 천연물 추출 혼합물이 혈관 확장에 영향을 주었을 것으로 사료된다.

Group	1 Day	6 Days	12 Days	16 Days	21 Days
Normal	0.673 ±0.023	1.026 ±0.134	3.687 ±0.254	4.876 ±0.641	6.528 ±0.462
50% EtOH	0.552 ±0.015	1.262 ±0.026	4.627 ±0.341	5.016 ±0.732	6.832 ±0.726
3% Minoxidil	0.584 ±0.034	1.436 ±0.062	5.826 ±0.534*	6.427 ±0.426**	7.658 ±0.473*
DCS-HT	0.634 ±0.023	1.265 ±0.068	5.962 ±0.634*	6.852 ±0.721**	8.024 ±0.543**

3-4. 발모효과의 분자생물학적 특징

21일 투여 후 피부에서 IGF-1 및 TGF-β의 발현을 조사하였는데, IGF-1의 경우 saline과 50% EtOH에서 거의 유사한 발현 량을 나타냈었다. 3% Minoxidil군과 DCS-HT군에서 IGF-1의 발현량이 saline군보다 유의성(p<0.01~0.001) 있게 증가하여, 3% Minoxidil군은 약 1.5배, DCS-HT군은 약 2배 정도 많이 발현되었다. TGF-β 발현은 대조군으로 쓰인 saline군에서 발현량의 수치가 매우 낮았으며 50% EtOH군에서 3배, 3% Minoxidil군에서 11배, DCS-HT군에서는 12배 정도 saline보다 많은 양의 TGF-β가 유의하게 발현되었다(표5, 도5 및 도6 참조).

본 발명에서 DCS-HT은 모발의 성장을 촉진하였으며, 이러한 효과는 이미 발모제로서 잘 알려진 Minoxidil보다 모발이 매우 빠르게 성장하는 것으로 나타났다.

그리고 Minoxidil 및 DCS-HT이 남성 생식에 어떤 영향을 주는지 알아보기 위해 실험동물을 부검 하여 체중 및 상대 장기 무게를 측정하였다. 절대 장기 및 상대 장기의 무게에 있어서 3% Minoxidil 및 DCS-HT군은 대조군과 비교하여 차이가 없었다(data not shown). 하지만, 이러한 결과를 통해 Minoxidil이나 DCS-HT이 생식독성에 영향을 미치는지 않는다고 정확히 말할 수는 없지만, 안전성 평가 즉, 단회투여와 4주 반복투여로 일반 독성을 확인한 결과 어떠한 유의한 소견도 발견되지 않아 동물실험에서는 안전한 것으로 평가되었다(data not shown).

본 발명에서는 좀 더 자세하고 객관적인 자료를 얻기 위하여 조직학적 검사를 실시하였다, 실험을 실시한지 2주일 후 실험동물을 부검하여 검사 시약을 투여한 등쪽 피부를 채취하여 조직절편을 제작한 후, H&E 염색으로 현미경 검사를 실시하였다. 조직 검사 시 DCS-HT이 대조군보다 모낭의 길이와 크기에서 특징적인 차이를 보였다. 대조군인 saline 군에서는 모낭속의 모근의 수가 적었고 또한 모낭의 크기가 작았으며, DCS-HT군과 3% Minoxidil군에서는 모낭의 수가 많고 길이가 길어져 피부로 표출되어 있는 현상을 나타냈으며, 이러한 현상은 두 물질의 발모효과와 연관 지어 지는 것으로 사료된다(data not shown).

Group	TGF-β
Normal	6.476±0.547
50% EtOH	16.426±4.516**
3% Minoxidil	68.457±8.642***
DCS-HT	70.854±7.654***

그리고 DCS-HT의 기전을 알아보기 위하여 DCS-HT을 피부에 도포하여 모발 성장에 영향을 미치는 내분비계 인자를 조사하였다. 먼저 피부에 존재하는 내분비계인자들 중에 시료를 피부에 도포할 시에 평소 피부에 존재하는 내분비계인자들의 양에 변화가 생긴다는 추측 하에 실험을 하였다. 실험은 각 군당 시료도포부위인 등쪽 피부를 채취하여 진행하였고 내분비계인자들의 양을 측정하기 위해 PCR를 이용하였으며, 반복 실험하여 통계처리 하였다.

결과는 IGF-1 발현량이 대조군인 saline 군보다 3% Minoxidil군과 DCS-HT군에서 각각 1.5배, 2배 정도 많게 측정되었다, 이는 3% Minoxidil군이나 DCS-HT을 피부에 도포함으로써 피부에 IGF-1의 양을 증가시킴으로서 모발의 성장을 촉진하였다고 추정할 수 있다. IGF-1은 invitro에서 배양된 hair follicle 뿐만 아니라 상피세포의 성장을 촉진한다고 알려져 있으며 IGF-1 transgenic animal에서 hair follicle의 elongation이 촉진된다. TGF-β의 경우는 대조군인 saline 군에서 매우 낮은 수치를 나타냈으며 3% Minoxidil군 및 DCS-HT군에서 각각 15 및 13배 정도로 대조군보다 유의성 있게 증가하였다.

그리고 TGF-β1은 hair follicle의 anagen-catagen transition을 촉진하는 것으로 알려졌다. 그러나 이러한 변화는 매우 복잡하며, 더욱이 3개의 isoforms(β1-3)의 역할이 매우 다양하다. 이들 중 TGF-β2 효과는 모발 주기 중 생리적으로 모발의 성장을 촉진하며 anagen phase를 증가시키는 것으로 알려졌다. 본 발명에서 Minoxidil 및 DCS-HT의 21일 투여 후에 TGF-β의 발현이 증가하였는데, 이에 대한 해석은 좀 더 많은 실험이 필요할 것으로 사료된다.

Minoxidil는 이전의 연구들에서 실험동물에서 모낭을 자극하여 모낭이 충분히 길어지고 모발 재성장에 도움을 준다고 알려졌다. 사실은 Minoxidil sulfate가 모낭에 가서 활성 대사물로 전환되고, 사람의 머리피부에서 혈액순환이 잘되도록 작용하기 때문이다. 이와 마찬가지로, DCS-HT도 C57BL6 마우스에서 모발 재성장에 도움이 된다. 하지만, DCS-HT은 아직 기전이 확실히 알려져 있지 않았으나, DCS-HT처리에서 모낭의 길이성장 가속화가 모낭이 anagen기로 돌아가도록 활성화시킨다고 할 수 있다.

그러므로 충분한 모발 재성장에 필요한 시간이 짧아진다. 뿐만 아니라 모발 성장을 촉진하는 인자인 IGF-1 혹은 TGF-β2의 양을 증가시켜 모발 재성장을 촉진시킨다.

위에서 설명한 바와 같이 본 발명에 대한 구체적인 설명은 첨부된 도면을 참조한 실시예에 의해서 이루어졌지만, 상술한 실시예는 본 발명의 바람직한 예를 들어 설명하였을 뿐이기 때문에, 본 발명이 상기의 실시예에만 국한되는 것으로 이해되어져서는 아니 되며, 본 발명의 권리범위는 후술하는 청구범위 및 그 등가개념으로 이해되어져야 할 것이다.

도1은 21일 동안 실험이 진행되는 동안의 모발이 자라는 정도에 대해서 도시한 그래프이다.

도2는 21일 동안 실험이 진행되는 동안의 모발이 자라는 정도를 촬영한 도면이다.

도3은 8주령 C3H 생쥐의 등 부위를 제모하여 anagen 유도 후 날짜 경과에 따라 적출된 피부 조직의 γ-GT 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도4는 ALP(Alkaline phosphatase) 활성의 변화를 나타낸 그래프이다.

도5는 21일 투여 후 피부에서 TGF-β의 발현을 나타낸 그래프이다.

도6은 21일 투여 후 피부에서 IGF-1의 발현을 나타낸 그래프이다.

Claims (2)

1. β-sitosterol, 하수오 및 상백피(桑白皮, Mori radicis Cortex)의 추출물 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는

   발모(發毛)를 위한 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서,

   상기 β-sitosterol, 하수오 및 상백피의 추출물의 중량비(w/w)가 3:1:1인 것을 특징으로 하는

   발모를 위한 약학 조성물.

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