KR20160105344A - 모발성장 촉진용 조성물 - Google Patents

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KR20160105344A
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Abstract

본 발명은 대황 추출물, 감송향 추출물 및 이들 각각의 유기용매 분획물로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 성분을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물을 사용함으로써 발모 촉진 효과를 얻을 수 있다.

Description

모발성장 촉진용 조성물{Composition for Promoting Growth of Hairs}
본 발명은 대황 추출물 및 감송향 추출물 중에서 선택되는 하나 이상의 성분을 유효성분으로 포함하는 탈모방지 또는 발모 촉진용 조성물에 관한 것이다.
탈모증의 원인이나 발생 기전에 대해서는 알려져 있지 않은 부분이 많은데, 주요 원인으로는 남성호르몬과 스테로이드 호르몬이 관련되어 있는 것으로 보고되어 있다. 예를 들어, 남성형 탈모증의 원인은 남성호르몬 밸런스 부전으로, 남성형 탈모증 유발의 주원인이 남성호르몬(androgen)에 있다는 것이 발표된 바 있다(J. Shapiro 등, Hair regrowth. Therapeutic agents, Dermatol. Clin. 16(2), 341-356, 1998). 또한, 탈모증의 원인으로서 스트레스가 크게 관여한다는 논문 발표도 있었다. 한편, 대머리 및 탈모의 원인을 규명하고자 하는 연구결과, 최근에는 신장 기능의 장해가 탈모의 직접적인 원인이라는 주장이 제시되고 있다.
탈모 방지 또는 육모 촉진을 할 수 있는 물질을 개발하려는 시도가 오랜 기간 동안 있었다. 그러나 이러한 노력은 거의 실패로 귀결되거나 혹은 부분적으로만 성공하는 미완성의 개발이었다. 미국 FDA (Food and Drug Administration)에서 인증된 몇 가지의 탈모방지 또는 발모촉진 의약이 있으나, 이러한 의약들도 탈모방지 또는 발모촉진을 만족할 수준으로 달성하고 있지는 않다.
한편, Wnt 단백질은 베타카테닌(β-catenin)이 모낭 형성에 중요한 역할을 하며, 모발의 발생과 성장에 관여하는 것으로 종래 알려져 있다. Wnt 단백질은 모발의 발생과 성장에 관여하는 신호전달 단백질로서, Wnt에 의한 신호전달이 베타카테닌으로 이어져 모낭을 형성하고, 탈모치료에 중요한 역할을 담당한다[1].
또한 5α-환원효소는 남성호르몬인 테스토스테론을 DHT(Dihydtotestosterone)로 전환시켜 주는 역할을 하는 효소로서, 5α-환원효소의 작용을 억제함으로써 탈모를 억제하고 발모를 촉진할 수 있음이 알려져 있다.
미국 공개특허공보 제2005-260152호는 물, 폴리솔베이트 및 보조성분들을 포함하는 액상의 담체에 용해된 마늘 성분이 발모 작용을 한다는 것을 개시하고 있다. 미국 공개특허공보 제2005-239697호는 액틴-결합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 육모 촉진용 조성물을 개시하고 있다.
WO 2005-063279는 IL (interleukin)-15와 발모 촉진 또는 탈모 방지가 관련 있음을 개시하고 있다. WO 2005-053763는 모유두 또는 배양된 모유두 세포를 피부에 이식하는 과정을 포함하는 발모 촉진 방법을 개시하고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 천연 추출물 성분을 포함하는 발모 촉진용 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 대황 추출물 및 감송향 추출물 중에서 선택되는 하나 이상의 성분을 이용하여 발모 촉진 효과를 얻을 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 탈모방지 또는 발모 촉진용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 대황 추출물, 감송향 추출물 및 이들 각각의 유기용매 분획물로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 유효 성분으로 포함하는 탈모방지 또는 발모 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 천연 추출물 성분을 포함하는 발모 촉진용 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 대황 추출물 및 감송향 추출물 중에서 선택되는 하나 이상의 성분을 이용하여 발모 촉진 효과를 얻을 수 있음을 규명하였다.
본 명세서 상의 용어 "탈모"는 성장기의 모발 비율이 적어지고, 퇴행기 또는 휴지기의 모발이 많아져, 정상적인 상태에서의 평균적 모발 탈락 개수에 비해 비정상적으로 모발이 탈락하는 숫자가 많아지는 상태를 의미한다.
본 발명의 유효성분으로 이용되는 "대황(Rhubarb)"은 마디풀과의 여러해살이 풀인 대황류의 뿌리로 만든 약재이다. 대황류의 식물인 장엽대황(Rheum palmatum L.), 당고특대황(Rheum tanguticum Maximowicz), 약용대황(Rheum officinale Baillon) 및 동속 식물의 뿌리줄기를 사용하여 만든다. 대황을 복용하면 설사를 하여 체내의 독(毒), 열(熱)을 없앤다는 '사하작용'이 일어난다. 장위를 세척하고 대사를 촉진하며 열성변비와 더부룩한 속을 치료한다. 또한 두통, 충혈, 인후통, 변비, 코피, 토혈, 종기에 효과가 있고 이뇨, 부종에도 사용한다. 약리작용으로 대장운동촉진, 해열, 체온강하, 담즙분비 촉진, 혈액응고 시간 단축, 항균, 이뇨, 간기능 보호 등이 알려져 있다.
또한 본 발명의 유효성분으로 이용되는 "감송향(Nardostachys)"은 감송(Nardostachys chinensis Batalin), 시엽감송(Nardostachys jatamansi DC.) 및 동속 식물의 뿌리줄기 및 뿌리를 사용하여 만든 약재이다. 복통 해소 효과가 있으며 검버섯, 기미, 영양장애를 동반한 부스럼, 충치, 치질에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 각기병과 무릎 부종에 사용되고 있다.
상기 대황 추출물 및 감송향 추출물은 다양한 추출 용매, 예를 들어 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 1,3-부틸렌글리콜, (h) 부틸 아세테이트를 추출 용매로 하여 얻을 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 추출물은 물을 추출 용매로 하여 얻어진 것이다. 한편, 본 발명의 추출물은 상기 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.
또한 본 발명은 상기 1차 추출물에 대한 유기용매 분획물을 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 명세서 상의 용어 "분획물"은 상술한 1차 추출물을 헥산, 에틸아세테이트, 디클로로메탄, n-부탄올, 석유에테르, 벤젠 및 클로로포름으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유기 용매에 의해 다시 추출한 2차 추출물을 의미한다. 더욱 구체적으로는 상기 1차 추출물을 감압 증류에 의해 분말 상태로 제조하고, 이를 물과 상기 헥산, 에틸아세테이트, 디클로로메탄, n-부탄올, 석유에테르, 벤젠 및 클로로포름으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 유기 용매를 함께 넣어 층 분리를 실시하여 상기 유기 용매층을 회수하는 방식으로 분획물을 얻을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 각 성분의 1차 추출물을 감압 증류하여 얻어진 분말에 대하여 (a) 동량의 물과 헥산을 이용하여 층 분리를 실시하고, 헥산 층을 회수하여 헥산 분획물을 얻었고, (b) 헥산 분획물 회수 후 남은 물 층에 동량의 에틸아세테이트를 넣어주어 층 분리를 실시하고, 에틸아세테이트 층을 회수하여 에틸아세테이트 분획물을 얻었으며, (c) 에틸아세테이트 분획물 회수 후 남은 물 층에 동량의 디클로로메탄을 넣어 층 분리를 실시하고, 디클로로메탄 층을 회수하여 디클로로메탄 분획물을 얻었으며, (d) 마지막으로 남은 물 층에 동량의 부탄올을 넣어 층 분리를 실시하고, 부탄올 층을 회수하여 부탄올 분획물을 얻었다. 본 발명의 분획물은 상술한 본 발명의 일 실시예에서와 같이, 헥산, 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 및 부탄올을 순차적으로 이용하여 얻을 수도 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 또는 부탄올 분획물의 경우에도 헥산 분획물과 마찬가지로 1차 추출물 분말에 대하여 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 또는 부탄올을 동량의 물과 함께 이용하여 최초 층 분리 수행 후 회수된 것을 이용할 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "1차 추출물"은 2차 추출물을 의미하는 "분획물"과 구분짓기 위한 용어로서, 대황 또는 감송향 원료를 상술한 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 1,3-부틸렌글리콜, (h) 부틸 아세테이트 등의 용매를 추출 용매로 이용하여 최초로 추출한 추출물을 나타낸다. 본 발명의 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조된 것을 포함한다.
본 발명의 유효 성분인 대황 추출물, 감송향 추출물 및 이들 각각의 유기용매 분획물로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상은 높은 윈트/베타-카테닌 신호 유도 촉진활성 및 5α-환원효소 억제 효과를 보인다(참조: 도 2-5).
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 유기용매 분획물은 대황 또는 감송향을 헥산, 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 부탄올, 물로 순차적으로 분획하여 얻은 대황의 에틸아세테이트 분획물, 디클로로메탄 분획물, 부탄올 분획물, 감송향의 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 분획물로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상이다. 본 발명의 대황의 에틸아세테이트 분획물, 디클로로메탄 분획물, 부탄올 분획물, 감송향의 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 분획물은 구체적으로 예를 들면 본 명세서 상의 제조예 1-2에 따라 제조할 수 있다. 대황의 에틸아세테이트 분획물, 디클로로메탄 분획물, 부탄올 분획물, 감송향의 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물및 물 분획물은 매우 우수한 윈트/베타카테닌 신호유도촉진 활성 및/또는 5α-환원효소 억제 효과를 보인다(참조: 도 5).
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 유효 성분은 대황 단일추출물, 감송향 단일추출물, 또는 대황 및 감송향 복합추출물이다. 대황 단일추출물, 감송향 단일추출물, 그리고 대황 및 감송향 복합추출물은 마우스를 이용한 발모효력시험에서 상업적으로 이용가능한 발모제인 마이녹실과 동등한 정도의 효능을 발휘한다는 결과를 도출하였다(참조: 도 6).
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명인 조성물은 식품 조성물이다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 대황 추출물, 감송향 추출물 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 대황, 감송향 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명인 조성물은 화장료 조성물이다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 대황 추출물, 감송향 추출물 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 피부 상태 개선용 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명인 조성물은 약제학적 조성물이다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국소 투여(topical application) 방식으로 적용되는 피부 외용 조성물일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-80 ㎎/kg 범위 내이다. 또한 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1회 내지 3회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 탈모방지 또는 발모 촉진용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 조성물을 이용하면 효과적으로 탈모를 방지하고, 발모를 촉진할 수 있다.
(c) 본 발명의 조성물의 유효 성분은 천연물 소재의 성분이어서, 식품, 화장료, 의약 등에 안전하게 적용할 수 있다.
도 1은 대황, 감송향의 메탄올 추출물 및 그 분획물의 제조 과정을 나타낸다.
도 2는 각각의 단일추출물에서의 윈트/베타카테닌 신호(Wnt/ Beta-catenin signaling)전달 유도 활성을 탐색한 결과를 나타낸다. 도 2에서의 용어 "DW"는 증류수, "VPN"은 발프론산(Valproic acid), "LiCl"은 리튬클로라이드를 나타낸다.
도 3은 제조예 1-2에서 제조된 대황, 감송향 각 용매층의 분획물들을 50 μg/ml의 농도로 처리하여 윈트/베타카테닌 신호(Wnt/ Beta-catenin signaling)전달 유도 활성을 탐색한 결과를 나타낸다. 도 3에서의 용어 "Hex"는 헥산 분획물, "EA"는 에틸아세테이트 분획물, "DCM"은 디클로로메탄 분획물, "BuOH"는 부탄올 분획물, "W"는 물 분획물을 나타낸다.
도 4는 제조예 1-1에서 제조한 대황, 감송향 추출물에서 40-50%의 5α-환원효소에 대한 억제효과를 확인한 결과를 나타낸다. 도 4에서의 용어 "EB"는 버퍼만 넣은 효소 블랭크(enzyme blank), "Liv"는 생쥐 간 추출물을 넣은 반응 결과물을 나타낸다.
도 5는 제조예 1-2에서 제조한 대황, 감송향 분획물을 최종 3.3 mg/ml 농도로 첨가하여 5α-환원효소에 대한 억제효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 제조예 1-1의 추출물이 마우스 발모효과에 미치는 효능을 평가한 결과를 나타낸다. 도 6에서의 용어 "대감"은 대황 및 감송향 혼합 추출물을 나타낸다.
도 7은 제조예 1-1에서 제조된 추출물의 발모효능을 평가하기 위하여 마우스의 제모 후, 하루 1회씩 14일 간 시험물질을 처리하며 제모 당일, 시험물질 투여 후 3, 7, 10, 13, 및 15일 발모 부위를 촬영한 사진을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
제조예 1-1: 대황, 감송향 및 그의 복합추출물 제조
대황(국산, 한약시장), 감송향(중국산, 한약시장)의 단일 또는 대황과 감송향 2종의 복합 혼합물 각 50 g에 증류수 500 ml 내지 600 ml를 가하여 100℃에서 6시간 동안 1회 환류 추출 하였으며, 냉각시킨 후 여과지(Whatman No 4. filter paper)에 여과시켜 고형분을 제거하였다. 이후 여과된 추출액을 감압농축기를 이용하여 완전히 건조한 후 적정농도로 증류수에 용해하여 세포실험을 실시하였으며, 동물실험용 샘플의 용해는 에탄올을 사용하였다.
제조예 1-2: 대황, 감송향의 메탄올 추출물 및 그 분획물의 제조
대황, 감송향 각 50 g을 분쇄 후, 500 내지 600 ml의 메탄올을 넣어 65℃ 중탕에서 4시간 동안 환류추출하였다. 상기에서 얻은 메탄올 총 추출액을 감압농축기(Rotavapor R-215, Buchi)로 용매를 완전히 제거한 후, 헥산(Hexane)과 증류수(DW)를 각각 200 ml 씩 넣고 층 분리를 실시하여 헥산층을 회수하였다. 상기의 잔류 물층에 대하여 에틸아세테이트(Ethyl acetate)를 200 ml 넣고 동일한 방법으로 층 분리를 실시하여 에틸아세테이트 층을 회수하였다. 상기의 잔류 물층에 대하여 디클로로메탄(Dichloromethane)을 200 ml 넣고 층분리를 실시하여 디클로로메탄 층을 회수하였다. 상기의 잔류 물층에 대하여 부탄올(n-Butanol)을 200 ml 넣고 층 분리를 실시하여 부탄올 층과 물 층을 회수하였다. 각 분획층은 감압농축하여 용매를 완전히 제거한 다음 적정 농도로 DMSO에 용해하여 실험에 사용하였으며, 전체적인 제조 과정은 도 1과 같다.
실시예 1: 대황, 감송향의 각 추출물에서 Wnt/beta-catenin 신호 유도 촉진활성 평가
모발 성장 및 발모와 관련하여 제조예 1-1에서 제조된 추출물의 윈트/베타카테닌 신호(Wnt/ Beta-catenin signaling)전달 유도 활성을 탐색하였다. 이를 위하여 배양 및 형질전환(transfection)이 용이한 HEK-293T(인간 배아신장세포)에 Wnt 리셉터 벡터(receptor vector)인 TOPFlash 또는 컨트롤 벡터(control vector)인 FOPFlash를 pCMV renilla 벡터와 함께 형질전환 하여 활성평가 시험에 사용하였다. 구체적으로는, HEK-293T 세포를 DMEM 배지에 10% 소태아혈청(Fetal bovine serum, FBS), 100 unit/ml의 페니실린 및 100 μg/ml의 스트렙토마이신이 첨가된 배양액에서 5% CO2, 37℃ 조건으로 인큐베이터(incubator)에서 배양하였으며, TOPFlash 플라스미드, FOPFlash 플라스미드, pCMV/renilla 플라스미드 등으로 형질전환 하였다. 12 시간 뒤 형질전환된 HEK-293T 세포를 조직배양용 96-웰 플레이트(96-well plate)에 도말(plating) 하였으며, 24시간 뒤 추출물을 200 ug/ml 농도로 처리 후, 48시간 동안 배양기 내에서 배양하였다. 세포들은 듀얼 루시퍼라아제 분석 시스템(Dual-luciferase Assay System, Promega, USA)의 표준방법대로 용해(lysis)시켜 활성도를 측정하였다. Renilla 루시퍼라아제의 활성도는 형질전환 효율(efficiency)을 표준화하기 위하여 사용되었으며, TOP/renilla 활성도 비를 FOP/renilla 활성도 비로 나눈 후 비교실험군인 증류수 대조군 값을 1로 변환하여 상대적인 TOP/FOP 활성도 비를 구하였다. 양성대조군으로는 Wnt 신호전달 체계를 활성화시킨다고 알려져 있는 리튬클로라이드(LiCl)와 발프론산(Valproic acid)을 각각 50 μM, 5 μM로 하여 사용하였다. 각각의 단일추출물에서의 윈트/베타카테닌 신호(Wnt/ Beta-catenin signaling)전달 유도 활성을 탐색한 결과, 도 2에서와 같이 대황 추출물에서 TOP/FOP의 값이 증류수 대조군 대비 1.5-2.0 으로 증가하였으며, 특히 감송향 추출물 군에서 TOP/FOP의 값이 2.0 이상으로 증가하여 윈트/베타카테닌 신호유도촉진 활성이 나타남을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 대황, 감송향의 각 분획물에서 Wnt/beta-catenin 신호 유도 촉진활성 평가
제조예 1-2에서 제조된 대황, 감송향 각 용매층의 분획물들을 50 μg/ml의 농도로 처리하여 윈트/베타카테닌 신호(Wnt/ Beta-catenin signaling)전달 유도 활성을 탐색한 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이, 대황의 디클로로메탄(DCM), 감송향의 부탄올(n-BuOH) 분획물에서 TOP/FOP의 비율이 DMSO 대조군 대비 1.5-2배 정도로 증가하여 윈트/베타카테닌 신호유도촉진 활성이 나타났다.
실시예 3: 대황, 감송향의 각 추출물에서 5α-환원효소 억제효과(5α-reductase inhibitor) 확인
5α-환원효소(5α-reductase)는 테스토스테론(testosterone)을 더 활성이 높은 DHT(Dihydrotestosterone)로 전환하는 효소인데, DHT의 과다로 인한 윈트/베타카테닌 신호전달 감소는 탈모기전과 밀접한 연관이 있다. 본 제조예 1-1에서 제조한 대황, 감송향의 증류수 추출물들의 5α-환원효소에 대한 억제효과를 확인하기 위하여, 추출물 처리에 의하여 생쥐의 간 마이크로좀(microsome)에서 얻어지는 5α-환원효소가 테스토스테론을 감소시키는 과정이 억제되는 정도를 측정하였다. 간 마이크로좀의 5α-환원효소를 얻기위하여 생후 10주령의 BL/6 수컷 생쥐의 간을 마취 후 절제하고, 라이시스 버퍼(lysis buffer)에 초음파처리(sonication)를 통해 간 내 5α-환원효소를 추출한 뒤, 원심분리하여 얻은 상층액을 실험에 사용하였으며, 나머지는 -80℃에 보관하였다. 실험을 위하여 5α-환원효소 반응에 필요한 포스파타아제 버퍼(phosphatase buffer), 테스토스테론, NaDPH를 모두 섞어주고, 5α-환원효소가 추출된 용해 버퍼(lysis buffer) 및 추출물을 최종 5 mg/ml의 농도로 첨가한 다음, 37℃에서 180분간 반응시켰으며, 얻어진 반응물에 디클로로메탄(Dichloromethane)을 첨가하여 반응을 종료시켰다. 내부대조군으로는 프로필-p-히드록시벤조에이트(propyl-p-hydroxybenzoate)를 첨가하여 테스토스테론의 양을 보정하였으며, 테스토스테론의 감소 및 내부대조군의 함량을 평가하기 위하여 고성능 액체크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)를 이용하였다. 분석을 위한 조건으로 고정상 컬럼(column)은 C18 역상컬럼을 이용하였으며, 이동상 용매(Mobile phase)로는 메탄올 및 초순수 증류수(Deionized water)의 비율을 65:35로 되도록 설정하였고, 시료주입량을 20 μl로 하여 UV 검출기(UV detector)를 이용 245 nm에서 평가하였다. 버퍼만 넣은 효소 블랭크(enzyme blank) 대조군으로부터 얻어진 값을 100%로 하였을 때 생쥐 간 추출물을 넣은(Liv) 반응 결과물의 상대적인 테스토스테론/내부대조군의 비를 구하고, 생약 추출물을 넣은 결과와 비교하여 저해 활성(inhibition activity)을 계산하였으며 구체적인 방법은 아래 계산식 1과 같다.
(계산식 1)
[{시료처리시(테스토스테론 면적/내부대조군 면적)} - {효소만 처리시(테스토스테론 면적/내부대조군 면적)}] / [{효소 무 첨가시(테스토스테론 면적/내부대조군 면적)} - {효소만 처리시(테스토스테론 면적/내부대조군 면적)}] * 100(%)
제조예 1-1에서 제조한 대황, 감송향 추출물을 처리시 40-50%의 5α-환원효소 반응 저해가 나타나 탈모예방 효능이 확인되었다(참조: 도 4).
실시예 4: 대황, 감송향의 각 분획물에서 5α-환원효소 억제효과(5α-reductase inhibitor) 확인
제조예 1-2에서 제조한 대황, 감송향 분획물을 최종 3.3 mg/ml의 농도로 첨가하여 5α-환원효소에 대한 억제효과를 확인한 결과(참조: 도 5), 대황 부탄올분획물 및 감송향 헥산분획물에서 5α-환원효소의 억제 효과가 뚜렷하게 나타났다.
실시예 5: 마우스 발모 효력시험
발모 효력시험을 위하여, 생후 6주된 수컷 C57BL/6 특정병원체 부재(specific pathogen free) 마우스(코아텍)를 구입한 후, 스테인레스망 사육상자[165 W x 240 L x 145 H (mm)]에서 사육하였으며 순화기간에는 3마리 이하/사육상자, 투여 및 관찰기간에는 1마리/사육상자로 수용하였다. 실험동물은 설치류용 사료(2918C, Harlan Co. Ltd., USA) 및 살균 여과된 음수를 자유롭게 공급받았으며, 동물 사육실은 온도 23±3℃, 습도 55±15%, 환기횟수 10-20회, 12시간 간격으로 자동점등되는 환경에서 관리되었다. 순화기간 동안 특이한 이상이 발견되지 않는 건강한 동물을 대상으로 순화종료 시점에 마취 후 소동물용 제모기(electric clipper)를 이용하여 마우스 등쪽을 1차적으로 제모하였으며, 제모제 비트(veet)를 도포하여 2차 제모를 실시하였다. 제모 후 등쪽 피부색이 균일한 선홍색을 보이는 개체만을 선별하여 실험에 이용하였으며, 체중을 기준으로 군을 분리하였다. 동물실험용 군설정은 부형제(에탄올)만을 도포한 부형제대조군, 제조예 1-1에서 제조된 각각의 대황, 감송향 단일추출물 군 및 대황, 감송향의 2개 복합추출물 군을 설정하였으며, 양성대조군으로 마이녹실 3%(현대약품) 군을 추가하였다. 제모 다음날부터 제모 부위에 하루 1회 총 14일 동안 부형제 및 추출물 등을 각각 200 μl 씩 도포하고 자연스럽게 스며들 수 있도록 일정하게 처리하였다. 마우스 등 부위는 0(제모당일), 시험물질 투여 후 3, 7, 10, 13, 15일(부검당일)등 총 6회를 사진촬영 하였으며, 촬영된 사진은 이미지분석 프로그램(Image pro. 6.3)을 이용하여 모발이 자라난 면적(%)을 측정하는데 사용되었다. 제조예 1-1에서 제조된 추출물의 발모효능을 평가하기 위하여, 샘플 도포 15일차 마우스 발모 면적(%)을 수치화한 결과를 도 6에 나타내었으며, 각 군의 발모도 사진을 도 7에 제시하였다. 제모 후 샘플 도포 15일차에 추출물에 따라 60-100%의 발모가 이루어졌는데, 대황, 감송향 각 단일추출물 및 대황과 감송향 복합추출물 등에서 발모효능이 나타났으며, 특히 대황과 감송향의 복합추출물 4% 농도에서는 양성대조군인 마이녹실 3%와 비교 시 동등 이상의 효능이 확인되었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
참고문헌
1. Ruth Schmidt-Ullrich et al., Molecular principles of hair follicle induction and morphogenesis, BioEssays 27:247-261(2005).

Claims (7)

  1. 대황 추출물, 감송향 추출물 및 이들 각각의 유기용매 분획물로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 유효 성분으로 포함하는 탈모방지 또는 발모 촉진용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 유기용매 분획물은 대황 또는 감송향을 헥산, 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 부탄올, 물로 순차적으로 분획하여 얻은 대황의 에틸아세테이트 분획물, 디클로로메탄 분획물, 부탄올 분획물, 감송향의 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 분획물로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 유효 성분은 대황 단일추출물, 감송향 단일추출물, 또는 대황 및 감송향 복합추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 조성물은 피부 외용 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
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