CN109942699A - 一种利用水华蓝藻制备减肥肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用水华蓝藻制备减肥肽的方法，包括先将水华蓝藻进行预处理，通过改性活性炭对水华蓝藻产生的藻毒素进行吸附，且制备的改性活性炭孔隙较大且具有磁性，具有较好的吸附性，用预处理的水华蓝藻通过冻融法制得水华蓝藻溶液，水华蓝藻溶液采用硫酸铵分段盐析制备藻蓝蛋白干粉，将藻蓝蛋白干粉制得酶解液，最后将酶解液用大孔树脂分离纯化，即可得到减肥肽，本发明变废为宝，充分利用水华蓝藻，防止水华蓝藻污染水体，且制备的减肥肽较安全。
Description
技术领域
本发明涉及功能食品技术领域，具体涉及一种利用水华蓝藻制备减肥肽的方法。
背景技术
日趋严重的富营养化现象使内陆水体水华蓝藻大量暴发，并在水体表面大量堆积，严重影响水体景观，而且其释放的藻毒素和异味物质严重损害水质，危及人类的健康和社会的可持续发展，但是水华蓝藻是丰富的蛋白质资源，其蛋白质含量高达38%~47%，是地球上所有已知生物中最高的，其中藻胆蛋白含量可达细胞干重的10%~20%，藻胆蛋白主要包括藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、藻红蛋白三类，藻胆蛋白具有重要的食品功能成分，因此收集水体的水华蓝藻并进行资源化利用，不仅利于减少水中的营养负荷、防止水质恶化，又能产生经济效益；
目前我国肥胖人群已达7000万，肥胖因常伴有高血压、血脂异常、缺血性心脏病等出现，危害极大。因此，人们已经把更多的目光放在各种各样的减肥产品上。减肥产品主要由保健食品、药品、茶、外用、仪器五大类构成，目前肥胖治疗的药物种类单一，价格昂贵，减肥作用不稳定，而且长期使用副作用不容忽视，而生物活性肽与传统药物相比，具有安全，易吸收，生理功能多，健康营养，口感好，活性强等优点，为了变废为宝，本发明以水华蓝藻为原料，采用生物方法，制备具有减肥效果的多肽产品，但是由于藻毒素的存在，影响水华蓝藻蛋白质的提取，从而影响最终制备的减肥肽的效果。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种利用水华蓝藻制备减肥肽的方法，充分利用水华蓝藻，防止水华蓝藻污染水体，且制备的减肥肽较安全。
本发明通过以下技术方案来实现：
一种利用水华蓝藻制备减肥肽的方法，包括以下步骤：
步骤一、将水华蓝藻低温烘干，进行粗粉粹，得到粗粉碎后的水华蓝藻；
步骤二、将粗粉碎后的水华蓝藻浸泡于添加有改性活性炭的蒸馏水中5~7h后，将水华蓝藻分离出来烘干，得到预处理的水华蓝藻；
步骤三、将预处理的水华蓝藻溶于1mmol/L的PBS缓冲液中，摇匀后置于-10~-15℃冷冻，2~3h后3~5℃解冻，反复冻融多次，得到水华蓝藻溶液，备用；
步骤四、将步骤三制得的水华蓝藻溶液制备得到藻蓝蛋白干粉；
步骤五、将藻蓝蛋白干粉加水溶解，调节其PH为6.9~7.2，得到藻蓝蛋白溶液，将藻蓝蛋白溶液预热至80~90℃，保温30~40min后，使其冷却，向其加入中性蛋白酶，在48~53℃、pH值为6.9~7.2的条件下酶解4~6h，灭活后冷却离心获得酶解液；
步骤六、将酶解液用大孔树脂分离纯化，即可得到减肥肽。
进一步的，所述步骤二中改性活性炭的制备方法为：
（1）将水华蓝藻低温干燥，采用高速粉碎机破碎，得到破碎的水华蓝藻；
（2）将破碎的水华蓝藻置于质量浓度为2mol/L的HCl中浸泡1~2h后，将其干燥，得到粗处理的水华蓝藻；
（3）将粗处理的水华蓝藻置于添加有氯化亚铁溶液的发酵罐中发酵5~7h，待发酵结束后，将其取出干燥，得到二次处理的水华蓝藻，备用，所述发酵的条件为：温度为35~38℃，转速为350~500r/min；
（4）将二次处理的水华蓝藻置于炭化炉中进行炭化， 得到炭化物；
（5）将炭化物浸泡于氢氧化钾溶液中，放置于恒温25℃的摇床中以160~180r/min的转速震荡11~13h；
（6）将浸泡过氢氧化钾溶液的炭化物用蒸馏水冲洗后，干燥得到改性活性炭。
进一步的，所述步骤三中PBS缓冲液的PH为7.0。
进一步的，所述步骤四中藻蓝蛋白干粉的制备方法为：
a、将步骤三得到的水华蓝藻溶液在冰浴条件下超声破碎处理20 ~30min后，离心收集上清液A，备用；
b、将上清液A加入(NH4)2SO4达到28%的饱和度，搅拌45~52min后，于3~5℃静置过夜后，离心收集上清液B，备用；
c、将上清液B再次加入(NH4)2SO4达到55%的饱和度，于3~5℃静置过夜后，离心收集沉淀，备用；
d、将步骤c得到的沉淀用0.01 mol/L PBS缓冲液溶解后装入透析袋去盐，离心，收集上清液C，将上清液C真空冷冻干燥，即可得到藻蓝蛋白干粉。
进一步的，所述步骤a中超声破碎处理的间隙时间为2~4s，超声时间4~6s。
进一步的，所述离心转速为9000~10050r/min，离心时间为55~65min。
进一步的，所述步骤五中离心转速为3500~4500r/min，离心时间为25~35min。
进一步的，所述步骤五中加酶量为123~127 U/m L。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明将粗粉碎后的水华蓝藻浸泡于添加有改性活性炭的蒸馏水中，通过改性活性炭吸附水华蓝藻溶液中的藻毒素，保证提取的蛋白质以及后续制备的减肥肽的质量；
（2）本发明所述改性活性炭也是由水华蓝藻制得，使得水华蓝藻充分利用，实现经济利益最大化，通过将破碎的水华蓝藻浸泡于HCl溶液中，对水华蓝藻进行造孔，且通过将水华蓝藻置于添加有氯化亚铁溶液的发酵罐中发酵，使得氯化亚铁能够在水华蓝藻上附着并且进入其孔隙中，增大其孔隙结构且使得制得的活性炭具有磁性，从而具有较好的吸附性；
（3）本发明的水华蓝藻溶液采用冻融法制得，可以高效的提取藻蓝蛋白，使蛋白质充分释放出来，同时避免其他细胞碎片的干扰，且藻蓝蛋白干粉的制备中采用硫酸铵分段盐析，不易引起蛋白质的变形，本发明将上清液C真空冷冻干燥，采用真空冷冻干燥，使得制得的藻蓝蛋白干粉具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例中的技术方案对本发明进行清楚、完整地描述。
实施例1
一种利用水华蓝藻制备减肥肽的方法，包括以下步骤：
步骤一、将水华蓝藻低温烘干，进行粗粉粹，得到粗粉碎后的水华蓝藻；
步骤二、将粗粉碎后的水华蓝藻浸泡于添加有改性活性炭的蒸馏水中5h后，将水华蓝藻分离出来烘干，得到预处理的水华蓝藻，使用BENCKMAN高效液相色谱检测藻毒素的含量，直至藻毒素含量＜0.1μg/L；
其中改性活性炭的制备方法为：
（1）将水华蓝藻低温干燥，采用高速粉碎机破碎，得到破碎的水华蓝藻；
（2）将破碎的水华蓝藻置于质量浓度为2mol/L的HCl中浸泡1~2h后，将其干燥，得到粗处理的水华蓝藻；
（3）将粗处理的水华蓝藻置于添加有氯化亚铁溶液的发酵罐中发酵5h，待发酵结束后，将其取出干燥，得到二次处理的水华蓝藻，备用，所述发酵的条件为：温度为35℃，转速为350r/min；
（4）将二次处理的水华蓝藻置于炭化炉中进行炭化， 得到炭化物；
（5）将炭化物浸泡于氢氧化钾溶液中，放置于恒温25℃的摇床中以160r/min的转速震荡11h；
（6）将浸泡过氢氧化钾溶液的炭化物用蒸馏水冲洗后，干燥得到改性活性炭。
步骤三、将预处理的水华蓝藻溶于1mmol/L的PBS缓冲液中，PBS缓冲液的PH为7.0，摇匀后置于-10℃冷冻，2h后3℃解冻，反复冻融多次，得到水华蓝藻溶液，备用；
步骤四、将步骤三制得的水华蓝藻溶液制备得到藻蓝蛋白干粉，所述藻蓝蛋白干粉的制备方法为：
a、将步骤三得到的水华蓝藻溶液在冰浴条件下超声破碎处理20 min后，离心收集上清液A，备用，所述步骤a中超声破碎处理的间隙时间为2s，超声时间4s；
b、将上清液A加入(NH4)2SO4达到28%的饱和度，搅拌45min后，于3℃静置过夜后，离心收集上清液B，备用；
c、将上清液B再次加入(NH4)2SO4达到55%的饱和度，于3℃静置过夜后，离心收集沉淀，备用；
d、将步骤c得到的沉淀用0.01 mol/L PBS缓冲液溶解后装入透析袋去盐，离心，收集上清液C，将上清液C真空冷冻干燥，即可得到藻蓝蛋白干粉，所述离心转速为9000r/min，离心时间为55min。
步骤五、将藻蓝蛋白干粉加水溶解，调节其PH为6.9，得到藻蓝蛋白溶液，将藻蓝蛋白溶液预热至80℃，保温30min后，使其冷却，向其加入中性蛋白酶，加酶量为123U/mL，在48℃、pH值为6.9的条件下酶解4h，灭活后冷却离心获得酶解液，离心转速为3500r/min，离心时间为25min；
步骤六、将酶解液用大孔树脂分离纯化，即可得到减肥肽，所得到的减肥肽的胰脂肪酶抑制率为56.69%。
实施例2
一种利用水华蓝藻制备减肥肽的方法，包括以下步骤：
步骤一、将水华蓝藻低温烘干，进行粗粉粹，得到粗粉碎后的水华蓝藻；
步骤二、将粗粉碎后的水华蓝藻浸泡于添加有改性活性炭的蒸馏水中6h后，将水华蓝藻分离出来烘干，得到预处理的水华蓝藻；
其中改性活性炭的制备方法为：
（1）将水华蓝藻低温干燥，采用高速粉碎机破碎，得到破碎的水华蓝藻；
（2）将破碎的水华蓝藻置于质量浓度为2mol/L的HCl中浸泡1h后，将其干燥，得到粗处理的水华蓝藻；
（3）将粗处理的水华蓝藻置于添加有氯化亚铁溶液的发酵罐中发酵6h，待发酵结束后，将其取出干燥，得到二次处理的水华蓝藻，备用，所述发酵的条件为：温度为36℃，转速为400r/min；
（4）将二次处理的水华蓝藻置于炭化炉中进行炭化， 得到炭化物；
（5）将炭化物浸泡于氢氧化钾溶液中，放置于恒温25℃的摇床中以170r/min的转速震荡12h；
（6）将浸泡过氢氧化钾溶液的炭化物用蒸馏水冲洗后，干燥得到改性活性炭。
步骤三、将预处理的水华蓝藻溶于1mmol/L的PBS缓冲液中，PBS缓冲液的PH为7.0，摇匀后置于-10℃冷冻，2h后4℃解冻，反复冻融5次，得到水华蓝藻溶液，备用；
步骤四、将步骤三制得的水华蓝藻溶液制备得到藻蓝蛋白干粉，所述藻蓝蛋白干粉的制备方法为：
a、将步骤三得到的水华蓝藻溶液在冰浴条件下超声破碎处理20 min后，离心收集上清液A，备用，所述步骤a中超声破碎处理的间隙时间为2s，超声时间5s；
b、将上清液A加入(NH4)2SO4达到28%的饱和度，搅拌50min后，于4℃静置过夜后，离心收集上清液B，备用；
c、将上清液B再次加入(NH4)2SO4达到55%的饱和度，于4℃静置过夜后，离心收集沉淀，备用；
d、将步骤c得到的沉淀用0.01 mol/L PBS缓冲液溶解（PH=7）后装入透析袋去盐，离心，收集上清液C，将上清液C真空冷冻干燥，即可得到藻蓝蛋白干粉，所述离心转速为10000r/min，离心时间为60min。
步骤五、将藻蓝蛋白干粉加水溶解，调节其PH为7.0，得到藻蓝蛋白溶液，将藻蓝蛋白溶液预热至85℃，保温35min后，使其冷却，向其加入中性蛋白酶，加酶量为125U/mL，在50℃、pH值为7.0的条件下酶解5h，灭活后冷却离心获得酶解液，离心转速为4000r/min，离心时间为30min；
步骤六、将酶解液用大孔树脂分离纯化，即可得到减肥肽，所得到的减肥肽的胰脂肪酶抑制率为61.88%。
实施例3
一种利用水华蓝藻制备减肥肽的方法，包括以下步骤：
步骤一、将水华蓝藻低温烘干，进行粗粉粹，得到粗粉碎后的水华蓝藻；
步骤二、将粗粉碎后的水华蓝藻浸泡于添加有改性活性炭的蒸馏水中7h后，将水华蓝藻分离出来烘干，得到预处理的水华蓝藻；
其中改性活性炭的制备方法为：
（1）将水华蓝藻低温干燥，采用高速粉碎机破碎，得到破碎的水华蓝藻；
（2）将破碎的水华蓝藻置于质量浓度为2mol/L的HCl中浸泡2h后，将其干燥，得到粗处理的水华蓝藻；
（3）将粗处理的水华蓝藻置于添加有氯化亚铁溶液的发酵罐中发酵7h，待发酵结束后，将其取出干燥，得到二次处理的水华蓝藻，备用，所述发酵的条件为：温度为38℃，转速为500r/min；
（4）将二次处理的水华蓝藻置于炭化炉中进行炭化， 得到炭化物；
（5）将炭化物浸泡于氢氧化钾溶液中，放置于恒温25℃的摇床中以180r/min的转速震荡13h；
（6）将浸泡过氢氧化钾溶液的炭化物用蒸馏水冲洗后，干燥得到改性活性炭。
步骤三、将预处理的水华蓝藻溶于1mmol/L的PBS缓冲液中，PBS缓冲液的PH为7.0，摇匀后置于-15℃冷冻，3h后5℃解冻，反复冻融多次，得到水华蓝藻溶液，备用；
步骤四、将步骤三制得的水华蓝藻溶液制备得到藻蓝蛋白干粉，所述藻蓝蛋白干粉的制备方法为：
a、将步骤三得到的水华蓝藻溶液在冰浴条件下超声破碎处理30min后，离心收集上清液A，备用，所述步骤a中超声破碎处理的间隙时间为4s，超声时间6s；
b、将上清液A加入(NH4)2SO4达到28%的饱和度，搅拌52min后，于5℃静置过夜后，离心收集上清液B，备用；
c、将上清液B再次加入(NH4)2SO4达到55%的饱和度，于5℃静置过夜后，离心收集沉淀，备用；
d、将步骤c得到的沉淀用0.01 mol/L PBS缓冲液溶解后装入透析袋去盐，离心，收集上清液C，将上清液C真空冷冻干燥，即可得到藻蓝蛋白干粉，所述离心转速为10050r/min，离心时间为65min。
步骤五、将藻蓝蛋白干粉加水溶解，调节其PH为7.2，得到藻蓝蛋白溶液，将藻蓝蛋白溶液预热至90℃，保温40min后，使其冷却，向其加入中性蛋白酶，加酶量为127 U/mL，在53℃、pH值为7.2的条件下酶解6h，灭活后冷却离心获得酶解液，离心转速为4500r/min，离心时间为35min；
步骤六、将酶解液用大孔树脂分离纯化，即可得到减肥肽，所得到的减肥肽的胰脂肪酶抑制率为59.65%。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (8)
1.一种利用水华蓝藻制备减肥肽的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、将水华蓝藻低温烘干，进行粗粉粹，得到粗粉碎后的水华蓝藻；
步骤二、将粗粉碎后的水华蓝藻浸泡于添加有改性活性炭的蒸馏水中5~7h后，将水华蓝藻分离出来烘干，得到预处理的水华蓝藻；
步骤三、将预处理的水华蓝藻溶于1mmol/L的PBS缓冲液中，摇匀后置于-10~-15℃冷冻，2~3h后3~5℃解冻，反复冻融多次，得到水华蓝藻溶液，备用；
步骤四、将步骤三制得的水华蓝藻溶液制备得到藻蓝蛋白干粉；
步骤五、将藻蓝蛋白干粉加水溶解，调节其PH为6.9~7.2，得到藻蓝蛋白溶液，将藻蓝蛋白溶液预热至80~90℃，保温30~40min后，使其冷却，向其加入中性蛋白酶，在48~53℃、pH值为6.9~7.2的条件下酶解4~6h，灭活后冷却离心获得酶解液；
步骤六、将酶解液用大孔树脂分离纯化，即可得到减肥肽。
2.根据权利要求1所述的一种利用水华蓝藻制备减肥肽的方法，其特征在于：所述步骤二中改性活性炭的制备方法为：
（1）将水华蓝藻低温干燥，采用高速粉碎机破碎，得到破碎的水华蓝藻；
（2）将破碎的水华蓝藻置于质量浓度为2mol/L的HCl中浸泡1~2h后，将其干燥，得到粗处理的水华蓝藻；
（3）将粗处理的水华蓝藻置于添加有氯化亚铁溶液的发酵罐中发酵5~7h，待发酵结束后，将其取出干燥，得到二次处理的水华蓝藻，备用，所述发酵的条件为：温度为35~38℃，转速为350~500r/min；
（4）将二次处理的水华蓝藻置于炭化炉中进行炭化， 得到炭化物；
（5）将炭化物浸泡于氢氧化钾溶液中，放置于恒温25℃的摇床中以160~180r/min的转速震荡11~13h；
（6）将浸泡过氢氧化钾溶液的炭化物用蒸馏水冲洗后，干燥得到改性活性炭。
3.根据权利要求1所述的一种利用水华蓝藻制备减肥肽的方法，其特征在于：所述步骤三中PBS缓冲液的PH为7.0。
4.根据权利要求1所述的一种利用水华蓝藻制备减肥肽的方法，其特征在于：所述步骤四中藻蓝蛋白干粉的制备方法为：
a、将步骤三得到的水华蓝藻溶液在冰浴条件下超声破碎处理20 ~30min后，离心收集上清液A，备用；
b、将上清液A加入(NH4)2SO4达到28%的饱和度，搅拌45~52min后，于3~5℃静置过夜后，离心收集上清液B，备用；
c、将上清液B再次加入(NH4)2SO4达到55%的饱和度，于3~5℃静置过夜后，离心收集沉淀，备用；
d、将步骤c得到的沉淀用0.01 mol/L PBS缓冲液溶解后装入透析袋去盐，离心，收集上清液C，将上清液C真空冷冻干燥，即可得到藻蓝蛋白干粉。
5.根据权利要求4所述的一种利用水华蓝藻制备减肥肽的方法，其特征在于：所述步骤a中超声破碎处理的间隙时间为2~4s，超声时间4~6s。
6.根据权利要求4所述的一种利用水华蓝藻制备减肥肽的方法，其特征在于：所述离心转速为9000~10050r/min，离心时间为55~65min。
7.根据权利要求1所述的一种利用水华蓝藻制备减肥肽的方法，其特征在于：所述步骤五中离心转速为3500~4500r/min，离心时间为25~35min。
8.根据权利要求1所述的一种利用水华蓝藻制备减肥肽的方法，其特征在于：所述步骤五中加酶量为123~127 U/m L。
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