CN109939228A - 一种新型水溶性免疫佐剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型水溶性免疫佐剂，包括PBS磷酸盐缓冲液、Poly I：C聚肌胞、多聚赖氨酸和香菇多糖，所述PBS磷酸盐缓冲液由磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钾和双蒸水组成，且每升所述PBS磷酸盐缓冲液是由0.20～0.27g磷酸二氢钾、1.30～1.80g磷酸二氢钠、5.0～15.0g氯化钠、0.1～0.3g氯化钾和定容至1L的双蒸水配制而成。通过上述方式，本发明能够不需要使用卡介苗，避免动物机体产生针对佐剂本身的抗体，从而有助于提高抗体的纯度；另外，与水性的抗原混匀即可免疫动物，无需繁琐的乳化过程，有效保护了抗原的空间构象，更容易获得针对空间构象表位的抗体，有效节省免疫周期和每针次的抗原用量，对动物无伤害，更符合动物福利。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型水溶性免疫佐剂及其制备方法。
背景技术
抗原是能够刺激动物机体产生免疫应答的外源性物质，免疫佐剂，本身不具备抗原性，但先于抗原或者与抗原同时应用，能够非特异性的增强或者改变机体针对抗原的特异性免疫应答能力增强相应抗原的免疫原性。
现有抗体制备技术中常用的佐剂为弗氏佐剂，弗氏佐剂是用矿物质(石蜡油)、乳化剂(羊毛脂)和卡介苗组成；对于弗氏不完全佐剂通常由石蜡油和羊毛脂混合而成，组分比例为1～5:1，通常选用2:1，弗氏完全佐剂是在不完全佐剂的基础上加入卡介苗，最终浓度为2～20mg/ml。
弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂作为经典的单克隆抗体制备和多克隆抗体制备用佐剂，是使用时间最久、效果最好的经典佐剂，为抗体制备的首选佐剂。但是，抗体制备使用的弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，存在以下几点弊端：
(1)卡介苗为弗氏完全佐剂的关键成分，但卡介苗为管制品，需要具有一定资质的情况下通过一定部门才能购买，而且卡介苗为强免疫原，动物机体会产生较多针对卡介苗的抗体；
(2)上述弗氏佐剂和弗氏不完全佐剂为油性佐剂，与水溶性抗原混匀，需要繁琐的乳化过程，伴随着水溶性蛋白疏水基团的外翻，会破坏抗原构象；
(3)全部免疫周期时间为8～12周，相对较长，抗原用量方面，小鼠抗原用量为50～100ug/针，兔子抗原用量为0.5～1.0mg/针，免疫次数较多，且对动物的伤害较大，引起动物炎症反应，不符合动物福利。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种新型水溶性免疫佐剂及其制备方法，本水溶性免疫佐剂的制备不需要使用卡介苗，避免动物机体产生针对佐剂本身的抗体，从而有助于提高抗体的纯度，并有效降低抗体纯化或者杂交瘤细胞株筛选的难度；另外，与水性的抗原混匀即可免疫动物，无需繁琐的乳化过程，有效保护了抗原的空间构象，更容易获得针对空间构象表位的抗体，有效节省免疫周期和每针次的抗原用量，对动物无伤害，更符合动物福利。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种新型水溶性免疫佐剂，包括PBS磷酸盐缓冲液、Poly I：C聚肌胞、多聚赖氨酸和香菇多糖，所述PBS磷酸盐缓冲液由磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钾和双蒸水组成，且每升所述PBS磷酸盐缓冲液是由0.20～0.27g磷酸二氢钾、1.30～1.80g磷酸二氢钠、5.0～15.0g氯化钠、0.1～0.3g氯化钾和定容至1L的双蒸水配制而成。
优选的，每升所述PBS磷酸盐缓冲液中添加的Poly I：C聚肌胞的质量为0.4～0.6g、多聚赖氨酸的质量为0.2～0.5g，香菇多糖的质量为0.3～0.7g。
优选的，所述PBS磷酸盐缓冲液的pH为7.2～7.4。
一种新型水溶性免疫佐剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)配制PBS磷酸盐缓冲液：将0.20～0.27g磷酸二氢钾、1.30～1.80g磷酸二氢钠、5.0～15.0g氯化钠和0.1～0.3g氯化钾溶于双蒸水，定容至1L，搅拌溶解；
(2)使用盐酸调pH值至7.2～7.4；
(3)向第(2)步获得的PBS磷酸盐缓冲液中依次加入Poly I：C聚肌胞、多聚赖氨酸和香菇多糖；
(4)通过磁力搅拌器搅拌至少10分钟，即制得本新型水溶性免疫佐剂
优选的，制得的所述新型水溶性免疫佐剂通过0.22um的过滤器过滤除菌。
优选的，制得的所述新型水溶性免疫佐剂的保存温度为2～8℃。
本发明的有益效果是：本发明提供的一种新型水溶性免疫佐剂及其制备方法，不需要使用卡介苗，避免动物机体产生针对佐剂本身的抗体，从而有助于提高抗体的纯度，并有效降低抗体纯化或者杂交瘤细胞株筛选的难度；另外，与水性的抗原混匀即可免疫动物，无需繁琐的乳化过程，有效保护了抗原的空间构象，更容易获得针对空间构象表位的抗体，有效节省免疫周期和每针次的抗原用量，对动物无伤害，更符合动物福利。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1：
一种新型水溶性免疫佐剂，按照以下步骤进行配制：
一、称取原料：分别称取0.20g磷酸二氢钾、1.30g磷酸二氢钠、5.0g氯化钠和0.1g氯化钾；
二、将称取后的磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、氯化钠和氯化钾溶于双蒸水中，定容至1L搅拌溶解，然后使用盐酸调pH值至7.2，获得PBS磷酸盐缓冲液；
三、取上一步获得的PBS磷酸盐缓冲液中依次加入0.4g Poly I：C聚肌胞、0.2g多聚赖氨酸和0.3g香菇多糖，通过磁力搅拌器搅拌至少10分钟，得到本新型水溶性免疫佐剂，然后通过0.22um的过滤器过滤除菌，最后放置于4℃冰箱保存。
使用常规的弗式佐剂作为对比，弗式佐剂分为不完全弗式佐剂和完全弗式佐剂，不完全弗式佐剂的配制过程：是将羊毛脂和液体石蜡按照1:2比例置于容器内，在不完全弗式佐剂中加入卡介苗(最终浓度为10mg/ml)，即为完全弗式佐剂，分别用超声波使之混匀，通过高温高压灭菌后，置4℃下保存备用。
针对本发明提供的水溶性免疫佐剂，采用BSA(牛血清白蛋白)作为抗原，每针次20ug，将上述抗原蛋白溶于生理盐水中，使得抗原的稀释浓度为每针次50ul用量，无菌条件下取出上述本发明制备的水溶性免疫佐剂，与抗原按照体积比1:1迅速混匀，然后免疫小鼠，通过对小鼠进行皮下多点注射，第21天按同样方式加强免疫一针，第35天采微量尾血进行ELISA测定，待免疫结束后进行检测对比；其中，本发明提供的新型水溶性免疫佐剂产生沉淀属正常现象，与抗原混合操作越快越好。
针对常规弗氏佐剂，同样采用BSA(牛血清白蛋白)作为抗原，每针次100ug，将上述抗原蛋白溶于生理盐水中，使得抗原的稀释浓度为每针次100ul用量，首先在无菌条件下取出上述制备的弗氏完全佐剂和抗原按照体积比1:1进行混合，制备成油包水乳状液，然后免疫小鼠，通过对小鼠进行皮下多点注射，第14天、第28天和第42天时，分别用等量抗原与不完全弗氏不完全佐剂同上述方法混匀后进行加强免疫，待免疫结束后进行检测对比。
实施例2：
一种新型水溶性免疫佐剂，按照以下步骤进行配制：
一、称取原料：分别称取0.27g磷酸二氢钾、1.80g磷酸二氢钠、15.0g氯化钠和0.3g氯化钾；
二、将称取后的磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、氯化钠和氯化钾溶于双蒸水中，定容至1L搅拌溶解，然后使用盐酸调pH值至7.4，获得PBS磷酸盐缓冲液；
三、取上一步获得的PBS磷酸盐缓冲液中依次加入0.6g Poly I：C聚肌胞、0.5g多聚赖氨酸和0.7g香菇多糖，通过磁力搅拌器搅拌至少10分钟，得到本新型水溶性免疫佐剂，然后通过0.22um的过滤器过滤除菌，最后放置于4℃冰箱保存。
使用常规的弗式佐剂作为对比，弗式佐剂分为不完全弗式佐剂和完全弗式佐剂，不完全弗式佐剂的配制过程：是将羊毛脂和液体石蜡按照1:2比例置于容器内，在不完全弗式佐剂中加入卡介苗(最终浓度为10mg/ml)，即为完全弗式佐剂，分别用超声波使之混匀，通过高温高压灭菌后，置4℃下保存备用。
针对本发明提供的水溶性免疫佐剂，采用BSA(牛血清白蛋白)作为抗原，每针次20ug，将上述抗原蛋白溶于生理盐水中，使得抗原的稀释浓度为每针次50ul用量，无菌条件下取出上述本发明制备的水溶性免疫佐剂，与抗原按照体积比1:1迅速混匀，然后免疫小鼠，通过对小鼠进行皮下多点注射，第21天按同样方式加强免疫一针，第35天采微量尾血进行ELISA测定，待免疫结束后进行检测对比；其中，本发明提供的新型水溶性免疫佐剂产生沉淀属正常现象，与抗原混合操作越快越好。
针对常规弗氏佐剂，同样采用BSA(牛血清白蛋白)作为抗原，每针次100ug，将上述抗原蛋白溶于生理盐水中，使得抗原的稀释浓度为每针次100ul用量，首先在无菌条件下取出上述制备的弗氏完全佐剂和抗原按照体积比1:1进行混合，制备成油包水乳状液，然后免疫小鼠，通过对小鼠进行皮下多点注射，第14天、第28天和第42天时，分别用等量抗原与不完全弗氏不完全佐剂同上述方法混匀后进行加强免疫，待免疫结束后进行检测对比。
实施例3：
一种新型水溶性免疫佐剂，按照以下步骤进行配制：
一、称取原料：分别称取0.24g磷酸二氢钾、1.50g磷酸二氢钠、10.0g氯化钠和0.2g氯化钾；
二、将称取后的磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、氯化钠和氯化钾溶于双蒸水中，定容至1L搅拌溶解，然后使用盐酸调pH值至7.3，获得PBS磷酸盐缓冲液；
三、取上一步获得的PBS磷酸盐缓冲液中依次加入0.5g Poly I：C聚肌胞、0.3g多聚赖氨酸和0.5g香菇多糖，通过磁力搅拌器搅拌至少10分钟，得到本新型水溶性免疫佐剂，然后通过0.22um的过滤器过滤除菌，最后放置于4℃冰箱保存。
使用常规的弗式佐剂作为对比，弗式佐剂分为不完全弗式佐剂和完全弗式佐剂，不完全弗式佐剂的配制过程：是将羊毛脂和液体石蜡按照1:2比例置于容器内，在不完全弗式佐剂中加入卡介苗(最终浓度为10mg/ml)，即为完全弗式佐剂，分别用超声波使之混匀，通过高温高压灭菌后，置4℃下保存备用。
针对本发明提供的水溶性免疫佐剂，采用BSA(牛血清白蛋白)作为抗原，每针次20ug，将上述抗原蛋白溶于生理盐水中，使得抗原的稀释浓度为每针次50ul用量，无菌条件下取出上述本发明制备的水溶性免疫佐剂，与抗原按照体积比1:1迅速混匀，然后免疫小鼠，通过对小鼠进行皮下多点注射，第21天按同样方式加强免疫一针，第35天采微量尾血进行ELISA测定，待免疫结束后进行检测对比；其中，本发明提供的新型水溶性免疫佐剂产生沉淀属正常现象，与抗原混合操作越快越好。
针对常规弗氏佐剂，同样采用BSA(牛血清白蛋白)作为抗原，每针次100ug，将上述抗原蛋白溶于生理盐水中，使得抗原的稀释浓度为每针次100ul用量，首先在无菌条件下取出上述制备的弗氏完全佐剂和抗原按照体积比1:1进行混合，制备成油包水乳状液，然后免疫小鼠，通过对小鼠进行皮下多点注射，第14天、第28天和第42天时，分别用等量抗原与不完全弗氏不完全佐剂同上述方法混匀后进行加强免疫，待免疫结束后进行检测对比。
测试数据如表1所示：
表中为上述三个实施例和常规弗式佐剂的检测结果，通过酶标仪测出来的不同稀释比对应的吸光值，通过吸光值来判断动物免疫的效果，数据中的最后一列1为空白对照，通过上述表述可看出，本发明提供的新型水溶性免疫佐剂免疫后的效果几乎等同于经典的常规弗氏佐剂的免疫效果，具有良好的价值和市场前景。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (6)
1.一种新型水溶性免疫佐剂，其特征在于：包括PBS磷酸盐缓冲液、Poly I：C聚肌胞、多聚赖氨酸和香菇多糖，所述PBS磷酸盐缓冲液由磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钾和双蒸水组成，且每升所述PBS磷酸盐缓冲液是由0.20～0.27g磷酸二氢钾、1.30～1.80g磷酸二氢钠、5.0～15.0g氯化钠、0.1～0.3g氯化钾和定容至1L的双蒸水配制而成。
2.根据权利要求1所述的一种新型水溶性免疫佐剂，其特征在于：每升所述PBS磷酸盐缓冲液中添加的Poly I：C聚肌胞的质量为0.4～0.6g、多聚赖氨酸的质量为0.2～0.5g，香菇多糖的质量为0.3～0.7g。
3.根据权利要求2所述的一种新型水溶性免疫佐剂，其特征在于：所述PBS磷酸盐缓冲液的pH为7.2～7.4。
4.一种新型水溶性免疫佐剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)配制PBS磷酸盐缓冲液：将0.20～0.27g磷酸二氢钾、1.30～1.80g磷酸二氢钠、5.0～15.0g氯化钠和0.1～0.3g氯化钾溶于双蒸水，定容至1L，搅拌溶解；
(2)使用盐酸调pH值至7.2～7.4；
(3)向第(2)步获得的PBS磷酸盐缓冲液中依次加入Poly I：C聚肌胞、多聚赖氨酸和香菇多糖；
(4)通过磁力搅拌器搅拌至少10分钟，即制得本新型水溶性免疫佐剂。
5.根据权利要求4所述的一种新型水溶性免疫佐剂的制备方法，其特征在于：制得的所述新型水溶性免疫佐剂通过0.22um的过滤器过滤除菌。
6.根据权利要求5所述的一种新型水溶性免疫佐剂的制备方法，其特征在于：制得的所述新型水溶性免疫佐剂的保存温度为2～8℃。
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