CN105535964A - 一种具有免疫调节作用的双链聚核苷酸—ε-聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物及其制备使用方法 - Google Patents

一种具有免疫调节作用的双链聚核苷酸—ε-聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物及其制备使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种具有免疫调节作用的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物及其制备使用方法。本发明亦提供一种具有引发增强免疫反应与改变免疫反应类型作用的免疫原组合物及其制备使用方法，包含该双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物和抗原。其所述的复合物含有双链聚核苷酸和阴离子硫酸聚糖与阳离子ε‐聚赖氨酸及金属阳离子相互复合而成的复合物；该复合物具有免疫调节的药理活性；该复合物的制备工艺简单；本发明的复合物具有良好的水溶性及抗生物酶降解作用。其所述的免疫原组合物可引发增强免疫反应与改变免疫反应类型。

Description

一种具有免疫调节作用的双链聚核苷酸—ε-聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物及其制备使用方法
技术领域
本发明涉及医药领域，具体的说本发明提供一种具有免疫调节作用的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物及其制备方法、使用方法。本发明亦提供一种具有引发增强免疫反应与改变免疫反应类型作用的免疫原组合物及其制备使用方法。
背景技术
一、双链聚核苷酸：双链聚核苷酸或其衍生物具有多种药理活性，来源是天然提取或人工合成。人工合成的双链聚核苷酸如聚肌胞(polyI:C)可诱导体内产生干扰素，保护细胞免受病毒感染，具有防治病毒性疾病等疗效；天然提取的双链聚核苷酸如呼肠孤病毒科提取的病毒双链RNA具有抗病毒、抗肿瘤等活性。
聚肌胞(PolyIC，PIC)是人工合成的聚次黄嘌呤核苷酸(PolyI)和聚胞嘧啶核苷酸(PolyC)配对后的双链产物，是一种高效干扰素诱生剂。但由于PIC易于被人及灵长目动物血清中的核酸酶水解，限制了临床使用。
聚肌胞主要用于预防和治疗病毒性感染，如流感、病毒性肝炎、疱疹性结膜炎。也试用于肿瘤的辅助性治疗。少数病人有一过性低热，偶见乏力、口干、恶心等。
二、硫酸聚糖：硫酸聚糖包括多糖和低聚糖。
多糖由许多单糖分子(10个以上)缩合而成的长链结构，一般分子量较大，10个以下单糖分子缩合而成的称为低聚糖：又称寡糖。
常见的多糖按其来源可分为四类：动物多糖、植物多糖、海洋生物多糖或微生物多糖等。
植物多糖是从植物，尤其是从中药材中提取的水溶性多糖。如当归多糖、人参多糖、艾叶多糖、柴胡多糖、紫根多糖等。这类多糖没有细胞毒性，而且质量容易通过化学手段控制，已成为当今新药研究的发展方向之一。
动物多糖是从动物组织、器官及体液中分享纯化得到的多糖。如肝素、硫酸软骨素、透明质酸、猪胎盘脂多糖等。
微生物多糖包括香菇多糖、茯苓多糖、银耳多糖、云芝多糖等。这类多糖主要对肿瘤治疗及免疫调节效果显著。
海洋生物多糖是从海洋、湖沼生物体内分离、纯化得到的多糖。这类多糖具有广泛的生物学效应，如海带多糖等。
多糖的糖链能控制细胞的分裂与分化，调节细胞的生长与衰老。特别是多糖作为广谱免疫调节剂可用于免疫性疾病的治疗以及抗肿瘤、抗病毒治疗等。
常见的低聚糖有卡拉胶寡糖、艾蒿叶寡糖、大豆低聚糖、低分子肝素等。低聚糖通常聚有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等药理作用。
硫酸基的引入会引起聚糖的理化性质、特别是立体构像的变化，而构象变化是活性变化的决定因素。研究发现有的聚糖本来无抗病毒活性，经硫酸化后表现出抗病毒活性；而有抗病毒活性的硫酸聚糖被脱去硫酸根后，即失去抗病毒活性。例如卡拉胶和肝素等具有抑制疱疹病毒复制作用，但如果将这些聚糖的硫酸根去掉，上述活性则随之消失。
聚糖可以通过硫酸酯化等方式转化为硫酸聚糖，诸如香菇多糖、右旋糖酐、牛膝多糖的硫酸化衍生物的毒性更低活性更高，是多种胞膜病毒的强大抑制剂。
三、ε‐聚赖氨酸
1977年日本学者S.Shima和H.Sakai在从微生物中筛选的过程中，发现一株放线菌No.346能产生大量而稳定的Dragendo～Positive(简写为DP)物质，通过对酸水解产物的分析及结构分析，证实该DP物质是一种含有25‐30个赖氨酸残基的同型单体聚合物，称为ε‐多聚赖氨酸(ε‐PL)。
ε‐聚赖氨酸具有很好的杀菌能力和热稳定性。ε‐聚赖氨酸的作用机理主要表现在如下3个方面:
(1)作用于细胞壁和细胞膜系统；
(2)作用于遗传物质或遗传微粒结构；
(3)作用于酶或功能蛋白。
ε‐聚赖氨酸富含阳离子，与带有阴离子的物质有强的静电作用力并且对生物膜有良好的穿透力，基于这一特性多聚赖氨酸可用于某些药物的载体，因此在医疗和制药方面得到广泛应用。ε‐聚赖氨酸与氨甲嘌呤(治疗白血病、肿瘤的药物)聚合，能提高药物的疗效。
四、特异性免疫的类型
特异性免疫(specificimmunity)又称获得性免疫或适应性免疫，这种免疫只针对一种病原。是获得免疫经后天感染(病愈或无症状的感染)或人工预防接种(菌苗、疫苗、类毒素、免疫球蛋白等)而使机体获得抵抗感染能力。一般是在微生物等抗原物质刺激后才形成的(免疫球蛋白、免疫淋巴细胞)，并能与该抗原起特异性反应。
特异性免疫类型‐‐细胞免疫：
T细胞是参与细胞免疫的淋巴细胞，受到抗原刺激后，转化为致敏淋巴细胞，并表现出特异性免疫应答，免疫应答只能通过致敏淋巴细胞传递，故称细胞免疫。免疫过程通过感应、反应、效应三个阶段，在反应阶段致敏淋巴细胞再次与抗原接触时，便释放出多种淋巴因子(转移因子、移动抑制因子，激活因子，皮肤反应因子，淋巴毒，干扰素)，与巨噬细胞，杀伤性T细胞协同发挥免疫功能。细胞免疫主要通过抗感染；免疫监视；移植排斥；参与迟发型变态反应起作用。其次辅助性T细胞与抑制性T细胞还参与体液免疫的调节。
特异性免疫类型—体液免疫：
B细胞是参与体液免疫的致敏B细胞。在抗原刺激下转化为浆细胞，合成免疫球蛋白，能与靶抗原结合的免疫球蛋白即为抗体。免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)分为五类。
①IgG是血清中含量最多的免疫球蛋白，唯一能通过胎盘的抗体，具有抗菌、抗病毒、抗毒素等特性，对毒性产物起中和、沉淀、补体结合作用，临床上所用丙种球蛋白即为IgG。
②IgM是分子量最大的免疫球蛋白，是个体发育中最先合成的抗体，因为它是一种巨球蛋白，故不能通过胎盘。血清中检出特异性IgM，作为传染病早期诊断的标志，揭示新近感染或持续感染，具有调理、杀菌、凝集作用。
③IgA有两型即分泌与血清型。分泌型IgA存在于鼻、支气管分泌物、唾液、胃肠液及初乳中。其作用是将病原体粘附于粘膜表面，阻止扩散。血清型IgA，免疫功能尚不完全清楚。④IgE是出现最晚的免疫球蛋白，可致敏肥大细胞及嗜碱性粒细胞，使之脱颗粒，释放组织胺。寄生虫感染，血清IgE含量增高。
⑤IgD其免疫功能不清。
还有一类无T与B淋巴细胞标志的细胞，具有抗体依赖细胞介导的细胞毒作用能杀伤特异性抗体结合的靶细胞，又称杀伤细胞(Killercell)，简称K细胞，参与ADCC效应，在抗病毒，抗寄生虫感染中起杀作用。再一类具有自然杀伤作用的细胞，称为自然杀伤细胞(naturalkillercell)即NK细胞。在杀伤靶细胞时，不需要抗体与补体参与。
特异性免疫形成过程
在抗原刺激下，机体的特异性免疫应答一般可分为感应、反应和效应3个阶段。分为三个阶段：1感应阶段是抗原处理、呈递和识别的阶段；
2.反应阶段是B细胞、T细胞增殖分化，以及记忆细胞形成的阶段；
3.效应阶段是效应T细胞、抗体和淋巴因子发挥免疫效应的阶段。
如果某些病原体突破了第一道和第二道防线，即进入人体并生长繁殖，引起感染。有的有症状，就是患病；有的没有症状，称作隐性感染。不论是哪一种情况，机体都经历了一次与病原体斗争的过程，这种专门针对某一种病原体(抗原)的识别和杀灭作用称为特异性免疫。譬如得过伤寒病的人对伤寒杆菌有持久的免疫力，那是因为伤寒杆菌刺激机体产生免疫应答，增加了巨噬细胞的吞噬功能，同时在体内还产生抗伤寒杆菌的抗体。人体的免疫系统又能把伤寒杆菌这个“敌人”的特征长期“记忆”下来，如果再有伤寒杆菌进入，就会很快被识别、被消灭。
能进行免疫应答的免疫细胞有很多种，最重要的是淋巴细胞。它又分成两种。两种细胞的发育成熟过程不一样，一种是在胸腺内发育成熟，称作T淋巴细胞，是在骨髓内发育成熟的为B淋巴细胞。
具有吞食异物的巨噬细胞也是一种重要的免疫细胞，它具有“加工厂”的作用，即巨噬细胞吞噬异物(如细菌、肿瘤细胞等)后，对异物进行加工处理。处理后的异物(抗原)就与T淋巴细胞和B淋巴细胞发生免疫反应，它本身也能直接杀灭异物或者产生细胞因子参与免疫反应。
B淋巴细胞受病原体刺激后，引起一系列变化，最终转化成为能产生抗体的浆细胞，所产生的抗体通过各种方式来消灭病原体，如溶解病原体，中和病原体产生的毒素，凝集病原体使之成为较大颗粒让吞噬细胞吞食消灭。浆细胞产生的抗体存在于机体的血液和体液中，这种免疫反应就称为体液免疫。
经处理后的病原体刺激T淋巴细胞后，也同样引起一系列变化，最终转化成能释放出淋巴因子的致敏淋巴细胞。淋巴因子种类很多，作用也并不相同，它们积极地参与到免疫反应中，这种免疫反应通常称为细胞免疫。体液免疫和细胞免疫二者之间不是孤立的，它们相辅相成，互相协作，共同发挥免疫作用。
特异性免疫引发与增强—免疫佐剂
又称非特异性免疫增生剂。本身不具抗原性，但同抗原一起或预先注射到机体内能增强免疫原性(见抗原)或改变免疫反应类型。
种类很多，目前尚无统一的分类方法，常用的佐剂可分为4类：无机佐剂，如氢氧化铝，明矾等；有机佐剂，微生物及其产物如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、百日咳杆菌、内毒素、细菌提取物(胞壁酰二肽)等；合成佐剂，如人工合成的双链多聚核苷酸(双链多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、异丙肌苷等；油剂，如费氏佐剂、花生油乳化佐剂、矿物油、植物油等。弗氏佐剂目前在实验动物中最常用，又可分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种。不完全佐剂是油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或吐温(Tween)80)相混合而成，当其再与抗原混合，即成油包水乳剂，可用于免疫注射。在不完全佐剂中加入死的分枝杆菌，即成为弗氏完全佐剂。完全佐剂的免疫强度大于不完全佐剂。该佐剂主要用于动物实验，不适宜于人类使用。而且动物多次注射后也常会发生佐剂病。
免疫佐剂的生物作用包括：
(1)抗原物质混合佐剂注入机体后，改变了抗原的物理性状，可使抗原物质缓慢地释放，延长了抗原的作用时间；
(2)佐剂吸附了抗原后，增加了抗原的表面积，使抗原易于被巨噬细胞吞噬；
(3)佐剂能刺激吞噬细胞对抗原的处理；
(4)佐剂可促进淋巴细胞之间的接触，增强辅助T细胞的作用；
(5)可刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞产生抗体。故免疫佐剂的作用可使无免疫原性物质变成有效的免疫原；
(6)可提高机体初次和再次免疫应答的抗体滴变；
(7)改变抗体的产生类型以及产生迟发型变态反应，并使其增强。
公开号为CN101166559B的专利发明申请文件公开了一种包含基于聚肌苷酸‐聚胞苷酸的佐剂的免疫原物质；公开号为CN101124014B的专利发明申请文件公开了一种含基于聚肌苷酸‐聚胞苷酸的佐剂的粘膜免疫物质。该两项专利所使用的佐剂组合物包含聚肌胞、抗生素及金属阳离子。其所采用的氨基糖苷类抗生素分子量远小于ε‐聚赖氨酸，因此所组成的双链聚核苷酸复合物抗生物酶水分解的能力低于双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物；同时由于疫苗主要用于健康人群，其所存在的卡那霉素具有潜在损伤听觉神经，致聋风险，而且卡那霉素的使用容易造成抗生素滥用，产生耐药细菌等问题。
阴离子的双链聚核苷酸或双链聚核苷酸衍生物在体内容易被人及灵长目动物血清中的核酸酶水解，作用时间短，限制了临床使用。目前，多聚核酸类药物聚肌胞注射液中含有卡那霉素作为阳离子稳定剂，而卡那霉素的使用容易造成抗生素残留等问题。
1975年，Levy等研究制出PICLC，即PIC与聚赖氨酸和羧甲基纤维素的化合物，该化合物可以抵抗酶水解，在人和灵长目动物中诱生出较PIC高得多的干扰素。但PICLC毒副作用严重，在人体上，用PICLC治疗9例淋巴细胞性白血病，发烧100％，肌痛50％，低血压50％；又治疗了7名多发性骨髓瘤和5例喉乳头瘤病，副作用为中度发烧，中度低血压，白细胞明显下降及肌痛等。
文献报导中所用的聚赖氨酸是化学合成的大分子量的α型聚赖氨酸，其赖氨酸残基之间的酰胺键是由α-氨基与α-羧基缩合而成，研究也证明了α‐聚赖氨酸比ε‐聚赖氨酸抑菌活性差且有毒性。
1969年，中国科学院与有关单位协作创造性地使用了新的制剂配方，研制出新的聚肌胞络合物制剂，即在PIC基础上加入含多胺基正离子的硫酸卡那霉素，以保护双链结构不被核酸酶快速水解，保持较好的稳定性，使其能够发挥应有的作用，由于硫酸卡那霉素分子量比多达几万或几十万分子量的聚赖氨酸小得多，所以副反应要低得多，但卡那霉素的使用容易造成抗生素残留等问题。
为了克服上述缺陷，特决定立题研究出一种具有免疫调节作用的聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物及其制备使用方法。本项目亦提供一种具有引发增强免疫反应与改变免疫反应类型作用的免疫原组合物及其制备使用方法。
发明内容
本发明提供一种具有免疫调节作用的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物及其制备使用方法。本发明亦提供一种具有引发增强免疫反应与改变免疫反应类型作用的免疫原组合物及其制备使用方法，包含该双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物和抗原(例如此二种成份位于一疫苗内)。其所述的具有免疫调节作用的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物含有双链聚核苷酸和硫酸聚糖与阳离子ε‐聚赖氨酸及金属阳离子相互复合而成的复合物。本发明的目的具有免疫调节作用的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物具有良好的水溶性及抗生物酶降解作用；具有引发增强免疫反应与改变免疫反应类型作用的免疫原组合物可引发增强免疫反应与改变免疫反应类型。
本发明的优点和效果在于该复合物的制备工艺简单；引入阴离子硫酸聚糖、ε‐聚赖氨酸形成双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物有良好的亲水性；双链聚核苷酸、阴离子硫酸聚糖和阳离子ε‐聚赖氨酸及金属阳离子相互复合的形式使其双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸复合物比单纯双链聚核苷酸具有更强的抗生物酶降解作用；引入的硫酸聚糖比单纯双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸复合物具有更强的抗病毒效果；引入的ε‐聚赖氨酸含有25‐30个赖氨酸残基，分子量适中，且避免了α‐聚赖氨酸有毒且活性低的缺点，适用于硫酸聚糖与双链聚核苷酸的复合；引入金属阳离子进一步提高了复合物免疫调节活性。该类复合物药物具有的免疫调节的药理活性，可用于人用药品及兽用药品领域；该类复合物与抗原物组成的免疫原组合物可用于预防、治疗微生物感染、抗肿瘤等用途。本发明亦对该双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物的理化性质进行限定，包括复合物组分配比、pH值、浓度。
阴离子硫酸聚糖主要来源于我国的中药或中药提取物及其衍生物，因此该双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物为我国中药的广泛应用提供了新思路。
本发明的目的提供一种具有免疫调节作用的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物及其制备方使用方法。本发明亦提供一种具有引发增强免疫反应与改变免疫反应类型作用的免疫原组合物及其制备使用方法，其特征在于，
1.一种具有免疫调节作用的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物，其特征是含有双链聚核苷酸、阴离子硫酸聚糖与阳离子ε‐聚赖氨酸及金属阳离子相互复合而成的复合物。
2.如1所述的具有免疫调节作用的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物，其中双链聚核苷酸指阴离子的双链聚核苷酸或其衍生物，来源是天然提取或人工合成。天然提取双链聚核苷酸来源于呼肠孤病毒科病毒的核酸提取物，包含鸡传染性法氏囊病毒RNA、轮状病毒RNA、羊蓝舌病病毒RNA、非洲马瘟病毒RNA；人工合成的双链聚核苷酸是聚肌胞；双链聚核苷酸终浓度为1.0g—10g/L。
3.如1所述的具有免疫调节作用的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物，其中阴离子硫酸聚糖是指含硫酸基的亲水性阴离子聚糖或其衍生物，并可与双链聚核苷酸、ε‐聚赖氨酸及金属阳离子相互复合成水溶性复合物溶液，包括多糖和低聚糖。阴离子硫酸聚糖包含肝素、硫酸软骨素A、香菇多糖硫酸酯、牛膝多糖硫酸酯；阴离子硫酸聚糖终浓度为1.0g—10g/L。
4.如1所述的具有免疫调节作用的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物，其中阳离子ε‐聚赖氨酸是指阳离子的含有25‐30个赖氨酸残基的ε‐氨基同型单体聚合物；双链聚核苷酸、硫酸聚糖与ε‐聚赖氨酸的优选比例是双链聚核苷酸的磷酸根所具有的阴离子电荷数与硫酸聚糖的硫酸基所具有的阴离子电荷数总和与ε‐聚赖氨酸的氨基所具有的阳离子电荷数比为1：1；其金属阳离子是Ca2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+，且其金属离子呈可溶性金属盐的形式，终浓度为0.2mmol—4mmol/L；其复合物溶液优选pH范围是7.0‐8.0。
5.如4所述的双链聚核苷酸，其特征是优选终浓度为1.0g/L；肝素终或硫酸软骨素A浓度为1.0g/L；对应加入ε‐聚赖氨酸；对应金属阳离子是CaCl2，终浓度为0.4mmol/L；药物制剂所用溶剂为0.01mol/L，pH＝7.6的PBS缓冲液。
6.如1所述的具有免疫调节作用的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物的制备方法，是将阴离子的双链聚核苷酸或其衍生物、阴离子硫酸聚糖或其衍生物和阳离子ε‐聚赖氨酸及金属阳离子相互复合，而制成复合物，其操作步骤如下：
a.阴离子的双链聚核苷酸或其衍生物母液配制：
将阴离子的双链聚核苷酸或其衍生物用PBS缓冲液配制成浓度1‐20mg/ml的溶液，并经0.2‐0.45μm孔径的滤膜过滤除菌。
b.阴离子硫酸聚糖或其衍生物母液配制：
将阴离子的聚糖或其衍生物用PBS缓冲液配制成浓度2‐60mg/ml的溶液，并经0.2‐0.45μm孔径的滤膜过滤除菌。
c.阳离子ε‐聚赖氨酸母液配制：
将阳离子ε‐聚赖氨酸用PBS缓冲液配制成浓度1‐30mg/ml的溶液，并经0.2‐0.45μm孔径的滤膜过滤除菌。
d.金属阳离子溶液母液配制：
将金属阳离子可溶性盐用注射用水配制成浓度为0.1mol/L的溶液，并经0.2‐0.45μm孔径的滤膜过滤除菌。
e.双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物制备：双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物制备一般原则：在4℃下，首先向阴离子的双链聚核苷酸或其衍生物母液中滴加配方量的阴离子的硫酸聚糖或其衍生物母液，边滴加，边搅拌。接下来按配方量，再缓慢滴加阳离子ε‐聚赖氨酸母液，边滴加，边搅拌，最后滴加配方量的金属阳离子溶液母液，边滴加，边搅拌形成最终双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物。补加PBS缓冲液，同时调节pH值至7.0‐8.0，并在4℃下连续搅拌12小时后将复合物溶液分装于密封容器中，沸水浴30分钟，然后在水流中迅速降至室温，经0.2‐0.45μm孔径的滤膜过滤除菌制成无菌的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物。
7.如1所述的具有免疫调节作用的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物可以通过下列给药途径中的一种途径给药于人类或动物，该给药途径包括肌肉注射、腹腔注射、静脉注射、皮下注射、经呼吸道吸入、直肠给药、阴道给药、经口给药、经鼻给药、经眼给药、透皮或皮内给药。
8.一种具有引发增强免疫反应与改变免疫反应类型作用的免疫原组合物，其包含1所述的具有免疫调节作用的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物和抗原物。其中抗原物是人造抗原、动物抗原、植物抗原、微生物抗原或是肿瘤抗原。
9.如8所述的具有引发增强免疫反应与改变免疫反应类型作用的免疫原组合物，其中抗原物是灭活狂犬病毒抗原。其中抗原物是灭活狂犬病毒抗原，每毫升该组合物中灭活狂犬病毒抗原效价不低于1个国际单位；其每毫升该组合物中双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物以所含有的双链聚核苷酸计，不低于0.7mg。
10.如8所述的具有引发增强免疫反应与改变免疫反应类型作用的免疫原组合物的制备方法，是将双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物与抗原物相互混合，而制成组合物。
11.如8所述的具有引发增强免疫反应与改变免疫反应类型作用的免疫原组合物可以通过下列给药途径中的一种途径给药于人类或动物，该给药途径包括肌肉注射、腹腔注射、静脉注射、皮下注射、经呼吸道吸入、直肠给药、阴道给药、经口给药、经鼻给药、经眼给药、透皮或皮内给药。以下通过方案设计和测试方法说明本发明。
复合物：指由两种或两种以上不同物质所形成的结合体。当复合物表现与其中各单一组分所具有的性质迥异的化学、机械和物理方面的特性时，这些组分仍保持着各自的原始性质。本发明所指双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物是含有阴离子的双链聚核苷酸或其衍生物、阴离子硫酸聚糖或其衍生物和阳离子ε‐聚赖氨酸及金属阳离子相互复合，而制成复合物。所指免疫原组合物包含该双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物和抗原(例如此二种成份位于一疫苗内)。
我们尝试制备一种具有免疫调节作用的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物，希望该类复合物即保留及增强免疫调节的药理活性，又通过复合物的所具有的特性，使其有良好的水溶性，并具有一定的抗生物酶水解作用。
双链聚核苷酸的筛选条件是阴离子的双链聚核苷酸或双链聚核苷酸衍生物，即带有负电荷的双链聚核苷酸。
阴离子硫酸聚糖的筛选条件是为可溶性阴离子的硫酸聚糖或其衍生物，并可与核酸、ε‐聚赖氨酸相互复合成水溶性复合物溶液，包括多糖和低聚糖，也就是亲水性阴离子的硫酸聚糖或其衍生物，阴离子硫酸聚糖主要来源于我国的中药或中药提取物及衍生物，例如肝素、香菇多糖硫酸酯、硫酸软骨素等。
为增加双链聚核苷酸的紧密度，在双链聚核苷酸‐ε‐聚赖氨酸复合物中添加金属阳离子可溶性盐，如CaCl2，其终浓度为0.2mmol—4mmol/L。Zn2+、Mg2+、Mn2+二价金属离子与Ca2+有类似的作用。
该复合物的复合主要是利用物质所带电荷性质相反而进行复合。双链聚核苷酸、硫酸聚糖与ε‐聚赖氨酸的优选比例是双链聚核苷酸的磷酸根所具有的阴离子电荷数与硫酸聚糖所具有的硫酸基的阴离子电荷数总和与ε‐聚赖氨酸的氨基所具有的阳离子电荷数比为1：1。
根据人或动物体所能广泛接受的pH值范围，该复合物优选pH范围是7.0‐8.0。
我们尝试将符合筛选条件的上述双链聚核苷酸、阴离子硫酸聚糖、阳离子ε‐聚赖氨酸及金属阳离子制成复合物。
为达到此目的，本发明的所涉及的双链聚核苷酸、阴离子硫酸聚糖和阳离子ε‐聚赖氨酸可以是先以固体形态充分混合，再添加溶剂进行复合反应，也可以用固－液形态、液－液形态进行复合，反应物添加量、添加顺序、反应条件可适当进行调整。
因此，我们收集了双链聚核苷酸：人工合成的典型代表物：polyI:C(沉降系数≥4S)、天然提取的典型代表物：鸡传染性法氏囊病毒RNA；阴离子硫酸聚糖典型代表物：肝素、硫酸软骨素A；阳离子ε‐聚赖氨酸；CaCl2。然后按本发明内容所述制备方法进行复合物制备(每种复合物具体制备方法详见各实施例)。
各实施例所制具有免疫调节作用的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物将按以下全部或部分质量检测方法进行检测。
1、双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物性状检查：澄清透明溶液。
2、双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物异常毒性检测：按《中国药典》方法检查，小鼠应健存。
3、双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物抗核酸酶降解能力检测：
向单独双链聚核苷酸、市售聚肌胞对照组以及其对应的不完全复合物(即复合物中未加入硫酸聚糖，对应的ε‐聚赖氨酸按比例减少)、双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物中分别加入RNase(其反应体系中每毫升含双链聚核苷酸40μg、RNase10μg)，于室温消化。根据RNase可使双螺旋结构核酸双链水解，而产生增色效应，且水解程度越大，增色效应越甚的原理，每15min检测在A248nm处的吸光度值，复合物组以对应的无双链聚核苷酸的ε‐聚赖氨酸溶液作空白。
4、双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物干扰素诱导效果检测：
取15只21日龄小鸡随机分为两组，每组10只(双链聚核苷酸为法氏囊病毒RNA的复合物组用小鸡2只)，一组注射各实施例制备的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物制剂、第二组注射市售聚肌胞、第三组注射0.01mol/L的PBS溶液作为对照组。每只鸡按0.01ml/Kg体重注射，间隔三天再注射一次，在最后一次注射12小时、36小时后采血，用ELISA方法测定血液中的α干扰素含量。
5、双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物抗病毒效果检测：
取用9‐11gKM系小白鼠120只，分为五组，用乙型脑炎病毒(P3株，6.5logLD50/ml)腹腔攻击小白鼠，0.3ml/只，于感染后12小时，第一组小白鼠用0.05ml/只的PBS、第二组小白鼠用0.05ml/只的无硫酸聚糖复合物(即复合物中未加入硫酸聚糖，对应的ε‐聚赖氨酸按比例减少)、第三组小白鼠用0.05ml/只的无硫酸聚糖复合物+0.05ml/只的单独硫酸聚糖(即用第二组无硫酸聚糖复合物和对应含量的单独硫酸聚糖同注射小白鼠，不能在小白鼠同一部位注射)、第四组小白鼠用0.05ml/只的市售聚肌胞、第五组小白鼠用0.05ml/只的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物皮下注射治疗小白鼠，每日1次，连续3次。自攻毒日起，连续观察21天，记录小鼠死亡率。
6、双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物与抗原物制成的免疫原组合物使用效果检测：
将制备的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物与灭活狂犬病毒抗原按7:3的比例充分混合，然后按狂犬病疫苗效价测定法(NIH法)进行效价检测，以市售聚肌胞+疫苗及无硫酸聚糖复合物+疫苗组(即复合物中未加入硫酸聚糖，对应的ε‐聚赖氨酸按比例减少，与灭活狂犬病毒抗原同样按7:3的比例充分混合)为对照组、以0.3ml/剂的灭活狂犬病毒抗原作为单纯疫苗对照组。
各双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物的具体制备及双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物、免疫原组合物有关质量检测结果详见具体实施方式。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但应理解本发明的范围非限于这些实施例的范围。
实施例1
a、0.1mol/L的氯化钙溶液制备：
称取无水氯化钙1.110g用100ml注射用水溶解，并经0.2μm孔径的滤膜过滤除菌制成0.1mol/L的氯化钙溶液。
b、0.01mol/L的PBS溶液(pH＝7.6)制备：
分别称取磷酸氢二钠0.124g、一水合磷酸二氢钠0.018g、氯化钠0.808g，混合后用100ml注射用水溶解，并经0.2μm孔径的滤膜过滤除菌制成0.01mol/L的PBS溶液(pH＝7.6)。
c、2mg/ml的PolyIC中间体溶液制备：
称取1.0088g的PolyI、0.9912g的PolyC分别加400ml的PBS溶液进行溶解，合并两液，混合摇匀，补加PBS溶液至1000ml，置45℃水浴60分钟后，经0.45μm孔径的滤膜过滤除菌制成2mg/ml的PolyIC中间体溶液备用。
d、10mg/ml的硫酸肝素钠溶液制备：
称取无水硫酸肝素钠1.000g用100ml的PBS溶液进行溶解，并经0.45μm孔径的滤膜过滤除菌制成10mg/ml的硫酸肝素溶液。e、10mg/ml的ε‐聚赖氨酸溶液制备：
称取ε‐聚赖氨酸1.000g用100ml的PBS溶液进行溶解，并经0.45μm孔径的滤膜过滤除菌制成10mg/ml的ε‐聚赖氨酸溶液。f、pH值调节液制备：
称取氢氧化钠4.0g用100ml注射用水溶解，并经0.2μm孔径的滤膜过滤制成pH值调节液。
g、PolyIC‐ε‐聚赖氨酸‐硫酸肝素钠复合物制备：
在4℃下进行操作，首先向50ml的PolyIC中间体溶液中边搅拌，边滴加10ml的硫酸肝素钠溶液，接下来边搅拌，边滴加8.02ml的ε‐聚赖氨酸溶液，之后向上述混合液中边搅拌，边滴加0.4ml的氯化钙溶液。补加PBS缓冲液至100ml，同时用pH值调节液调节pH至7.6，并在4℃下连续搅拌12小时后将复合物溶液分装于密封容器中，沸水浴30分钟，然后将密封容器置水流中迅速降至室温，最后经0.45μm孔径的滤膜过滤除菌制成无菌的PolyIC‐ε‐聚赖氨酸‐硫酸肝素钠复合物。
实施例2
a、0.1mol/L的氯化钙溶液制备：
称取无水氯化钙1.110g用100ml注射用水溶解，并经0.2μm孔径的滤膜过滤除菌制成0.1mol/L的氯化钙溶液。
b、0.01mol/L的PBS溶液(pH＝7.6)制备：
分别称取磷酸氢二钠0.124g、一水合磷酸二氢钠0.018g、氯化钠0.808g，混合后用100ml注射用水溶解，并经0.2μm孔径的滤膜过滤除菌制成0.01mol/L的PBS溶液(pH＝7.6)。
c、2mg/ml的PolyIC中间体溶液制备：
称取1.0088g的PolyI、0.9912g的PolyC分别加400ml的PBS溶液进行溶解，合并两液，混合摇匀，补加PBS溶液至1000ml，置45℃水浴60分钟后，经0.45μm孔径的滤膜过滤除菌制成2mg/ml的PolyIC中间体溶液备用。
d、10mg/ml的硫酸软骨素A溶液制备：
称取硫酸软骨素A1.000g用100ml的PBS溶液进行溶解，并经0.45μm孔径的滤膜过滤除菌制成10mg/ml的硫酸软骨素A溶液。
e、10mg/ml的ε‐聚赖氨酸溶液制备：
称取ε‐聚赖氨酸1.000g用100ml的PBS溶液进行溶解，并经0.45μm孔径的滤膜过滤除菌制成10mg/ml的ε‐聚赖氨酸溶液。
f、pH值调节液制备：
称取氢氧化钠4.0g用100ml注射用水溶解，并经0.2μm孔径的滤膜过滤制成pH值调节液。
g、PolyIC‐ε‐聚赖氨酸‐硫酸软骨素A复合物制备：
在4℃下进行操作，首先向50ml的PolyIC中间体溶液中边搅拌，边滴加10ml的硫酸软骨素A溶液，接下来边搅拌，边滴加5.22ml的ε‐聚赖氨酸溶液，之后向上述混合液中边搅拌，边滴加0.4ml的氯化钙溶液。补加PBS缓冲液至100ml，同时用pH值调节液调节pH至7.6，并在4℃下连续搅拌12小时后将复合物溶液分装于密封容器中，沸水浴30分钟，然后将密封容器置水流中迅速降至室温，最后经0.45μm孔径的滤膜过滤除菌制成无菌的PolyIC‐ε‐聚赖氨酸‐硫酸软骨素A复合物。
实施例3
a、0.1mol/L的氯化钙溶液制备：
称取无水氯化钙1.110g用100ml注射用水溶解，并经0.2μm孔径的滤膜过滤除菌制成0.1mol/L的氯化钙溶液。
b、0.01mol/L的PBS溶液(pH＝7.6)制备：
分别称取磷酸氢二钠0.124g、一水合磷酸二氢钠0.018g、氯化钠0.808g，混合后用100ml注射用水溶解，并经0.2μm孔径的滤膜过滤除菌制成0.01mol/L的PBS溶液(pH＝7.6)。
c、2mg/ml的法氏囊病毒RNA溶液制备：
将法氏囊病毒RNA用PBS缓冲液溶解，经0.45μm孔径的滤膜过滤除菌制成2mg/ml的溶液备用。
d、10mg/ml的硫酸肝素钠溶液制备：
称取无水硫酸肝素钠1.000g用100ml的PBS溶液进行溶解，并经0.45μm孔径的滤膜过滤除菌制成10mg/ml的硫酸肝素溶液。
e、10mg/ml的ε‐聚赖氨酸溶液制备：
称取ε‐聚赖氨酸1.000g用100ml的PBS溶液进行溶解，并经0.45μm孔径的滤膜过滤除菌制成10mg/ml的ε‐聚赖氨酸溶液。
f、pH值调节液制备：
称取氢氧化钠4.0g用100ml注射用水溶解，并经0.2μm孔径的滤膜过滤制成pH值调节液。
g、法氏囊病毒RNA‐ε‐聚赖氨酸‐硫酸肝素钠复合物制备：
在4℃下进行操作，首先向0.5ml的法氏囊病毒RNA溶液中边搅拌，边滴加0.1ml的硫酸肝素钠溶液，接下来边搅拌，边滴加80μl的ε‐聚赖氨酸溶液，之后向上述混合液中边搅拌，边滴加4μl的氯化钙溶液。补加PBS缓冲液至1.0ml，同时用pH值调节液调节pH至7.6，并在4℃下连续搅拌12小时后将复合物溶液分装于密封容器中，沸水浴30分钟，然后将密封容器置水流中迅速降至室温，最后经0.45μm孔径的滤膜过滤除菌制成无菌的法氏囊病毒RNA‐ε‐聚赖氨酸‐硫酸肝素钠复合物。
各实施例双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物质量检测结果。
1、双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物性状检查：
试验结果表明，三种双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物性状检查均合格。
2、双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物异常毒性检测：
组别 检查结果
实施例1复合物制剂 小鼠均应健存。
实施例2复合物制剂 小鼠均应健存。
试验结果表明，实施例1、2制备的两种核酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物异常毒性检测合格。
3、核酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物制剂抗核酸酶降解能力检测
试验结果表明，三种双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物均比单纯双链聚核苷酸、市售聚肌胞、未加硫酸聚糖的不完全复合物抗核酸酶降解能力强。
4、双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物干扰素诱导效果检测
试验结果表明，三种双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物均有良好的干扰素诱导效果。
5、双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物抗病毒效果检测
试验结果表明，二种双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物组的治疗效果优于市售聚肌胞组、无硫酸聚糖复合物组和PBS对照组。
6、双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物与抗原物制成的免疫原组合物使用效果检测
疫苗批号 疫苗效价(IU/ml)
实施例1复合物+疫苗 8.3
实施例1无硫酸聚糖复合物+疫苗 6.6
实施例2复合物+疫苗 9.1
市售聚肌胞+疫苗 5.6
单纯疫苗 1.3
试验结果表明，二种双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物与灭活狂犬病毒抗原制成的免疫原组合物，在节约70％疫苗抗原量的基础上，疫苗效价高于市售聚肌胞+疫苗、无硫酸聚糖复合物+疫苗、单纯疫苗。
以上所述仅为本发明优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改，等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种具有免疫调节作用的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物，其特征是含有双链聚核苷酸、阴离子硫酸聚糖与阳离子ε‐聚赖氨酸及金属阳离子相互复合而成的复合物。
2.如权利要求1所述的具有免疫调节作用的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物，其中双链聚核苷酸指阴离子的双链聚核苷酸或其衍生物，来源是天然提取或人工合成；天然提取双链聚核苷酸来源于呼肠孤病毒科病毒的核酸提取物，包含鸡传染性法氏囊病毒RNA、轮状病毒RNA、羊蓝舌病病毒RNA、非洲马瘟病毒RNA；人工合成的双链聚核苷酸是聚肌胞；双链聚核苷酸终浓度为1.0g—10g/L。
3.如权利要求1所述的具有免疫调节作用的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物，其中阴离子硫酸聚糖是指含硫酸基的亲水性阴离子聚糖或其衍生物，并可与双链聚核苷酸、ε‐聚赖氨酸及金属阳离子相互复合成水溶性复合物溶液，包括多糖和低聚糖。阴离子硫酸聚糖包含肝素、硫酸软骨素A、香菇多糖硫酸酯、牛膝多糖硫酸酯；阴离子硫酸聚糖终浓度为1.0g—10g/L。
4.如权利要求1所述的具有免疫调节作用的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物，其中阳离子ε‐聚赖氨酸是指阳离子的含有25‐30个赖氨酸残基的ε‐氨基同型单体聚合物；双链聚核苷酸、硫酸聚糖与ε‐聚赖氨酸的优选比例是双链聚核苷酸的磷酸根所具有的阴离子电荷数与硫酸聚糖的硫酸基所具有的阴离子电荷数总和与ε‐聚赖氨酸的氨基所具有的阳离子电荷数比为1：1；其金属阳离子是Ca2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+中的一种或一种以上，且其金属离子呈可溶性金属盐的形式，终浓度为0.2mmol—4mmol/L；其复合物溶液优选pH范围是7.0‐8.0。
5.如权利要求4所述的具有免疫调节作用的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物，其特征是优选终浓度为1.0g/L；肝素终或硫酸软骨素A浓度为1.0g/L；对应加入ε‐聚赖氨酸；对应金属阳离子是CaCl2，终浓度为0.4mmol/L；药物制剂所用溶剂为0.01mol/L，pH＝7.6的PBS缓冲液。
6.如权利要求1所述的具有免疫调节作用的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物的制备方法，是将阴离子的双链聚核苷酸或其衍生物、阴离子硫酸聚糖或其衍生物和阳离子ε‐聚赖氨酸及金属阳离子相互复合，而制成复合物，其操作步骤如下：
a.阴离子的双链聚核苷酸或其衍生物母液配制：
将阴离子的双链聚核苷酸或其衍生物用PBS缓冲液配制成浓度1‐20mg/ml的溶液，并经0.2‐0.45μm孔径的滤膜过滤除菌；
b.阴离子硫酸聚糖或其衍生物母液配制：
将阴离子的聚糖或其衍生物用PBS缓冲液配制成浓度2‐60mg/ml的溶液，并经0.2‐0.45μm孔径的滤膜过滤除菌；
c.阳离子ε‐聚赖氨酸母液配制：
将阳离子ε‐聚赖氨酸用PBS缓冲液配制成浓度1‐30mg/ml的溶液，并经0.2‐0.45μm孔径的滤膜过滤除菌；
d.金属阳离子溶液母液配制：
将金属阳离子可溶性盐用注射用水配制成浓度为0.1mol/L的溶液，并经0.2‐0.45μm孔径的滤膜过滤除菌；
e.双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物制备：双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物制备一般原则：在4℃下，首先向阴离子的双链聚核苷酸或其衍生物母液中滴加配方量的阴离子的硫酸聚糖或其衍生物母液，边滴加，边搅拌。接下来按配方量，再缓慢滴加阳离子ε‐聚赖氨酸母液，边滴加，边搅拌，最后滴加配方量的金属阳离子溶液母液，边滴加，边搅拌形成最终双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物。补加PBS缓冲液，同时调节pH值至7.0‐8.0，并在4℃下连续搅拌12小时后将复合物溶液分装于密封容器中，沸水浴30分钟，然后在水流中迅速降至室温，经0.2‐0.45μm孔径的滤膜过滤除菌制成无菌的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物。
7.如权利要求6所述的具有免疫调节作用的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物的制备方法，其特征是：通过下列给药途径中的一种途径给药于人类或动物，该给药途径包括肌肉注射、腹腔注射、静脉注射、皮下注射、经呼吸道吸入、直肠给药、阴道给药、经口给药、经鼻给药、经眼给药、透皮或皮内给药。
8.一种具有引发增强免疫反应与改变免疫反应类型作用的免疫原组合物，其包含权利要求1所述的具有免疫调节作用的双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物和抗原物，其中抗原物是人造抗原、动物抗原、植物抗原、微生物抗原或是肿瘤抗原。
9.如权利要求8所述的具有引发增强免疫反应与改变免疫反应类型作用的免疫原组合物，其中抗原物是灭活狂犬病毒抗原。其中抗原物是灭活狂犬病毒抗原，每毫升该组合物中灭活狂犬病毒抗原效价不低于1个国际单位；其每毫升该组合物中双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物以所含有的双链聚核苷酸计，不低于0.7mg。
10.如权利要求8所述的具有引发增强免疫反应与改变免疫反应类型作用的免疫原组合物的制备方法，是将双链聚核苷酸—ε‐聚赖氨酸—硫酸聚糖复合物与抗原物相互混合，而制成组合物。
11.如权利要求8所述的具有引发增强免疫反应与改变免疫反应类型作用的免疫原组合物可以通过下列给药途径中的一种途径给药于人类或动物，该给药途径包括肌肉注射、腹腔注射、静脉注射、皮下注射、经呼吸道吸入、直肠给药、阴道给药、经口给药、经鼻给药、经眼给药、透皮或皮内给药。
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