CN116789808A - 一种鼠抗非洲猪瘟病毒抗血清的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于免疫血清领域，具体涉及一种鼠抗非洲猪瘟病毒抗血清的制备方法。包括以下步骤，S1，取非洲猪瘟病毒蛋白和大豆蛋白抗原进行混合，得到免疫试剂；S2，使用S1中所述免疫试剂对鼠先后进行第一阶段免疫；S3，所述第一阶段免疫后对S2中所述鼠进行第二阶段免疫；S4，所述第二阶段免疫后对所述鼠取血，从所述血中分离出抗血清。缩短了制备时间，同时提高了鼠产生抗体的特异性及产量，为畜禽类体外诊断试剂上游原材料，及非洲猪瘟病毒相关免疫检测提供了方便。
Description
技术领域
本发明属于免疫血清领域，具体涉及一种鼠抗非洲猪瘟病毒抗血清的制备方法。
背景技术
非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染家猪和各种野猪而引起的一种急性、出血性、烈性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情，每年对世界范围内的猪养殖行业造成巨大的经济损失，危害巨大。
自2018年8月3日，中国确诊首例非洲猪瘟疫情。世界各国的研究人员一直都在努力开发各种能对非洲猪瘟病毒产生效果的新型非洲猪瘟病毒疫苗，经过世界各国科研人员的不懈努力，目前已有很多种类的疫苗处于临床验证的阶段，这些疫苗主要包括了减毒活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗和重组腺病毒等各类疫苗。目前在制备鼠源多克隆抗体时，其耗费时间较长，获得的抗体效价较低等都是相关研发人员所面临的主要问题，因此找到一种既可减少鼠多抗制备时间，又能提高获得的抗体效价的方法成为研发人员关注的焦点。
发明内容
本发明提供一种鼠抗非洲猪瘟病毒抗血清的制备方法，应用本发明的方法制备抗血清耗时时间短，抗血清特异性强且效价高，能够为体外诊断试剂上游提供质量较高的鼠源抗体原材料，以应用于非洲猪瘟病毒检测相关领域，可以产生较高的应用价值和社会效益。
本发明提供一种技术方案，一种鼠抗非洲猪瘟病毒抗血清的制备方法，包括以下步骤，S1，取非洲猪瘟病毒蛋白和大豆蛋白抗原进行混合，得到免疫试剂；S2，使用S1中所述免疫试剂对鼠先后进行第一阶段免疫；S3，所述第一阶段免疫后对S2中所述鼠进行第二阶段免疫；S4，所述第二阶段免疫后对所述鼠取血，从所述血中分离出抗血清。大豆蛋白抗原及非洲猪瘟病毒的抗原，不断刺激鼠机体的免疫系统，产生针对非洲猪瘟病毒抗原的抗体，缩短了制备时间，同时提高了鼠产生抗体的特异性及产量。优选的技术方案中，所述鼠为BALB/C小鼠。
本发明提供一种技术方案，所述非洲猪瘟病毒蛋白选自非洲猪瘟病毒的p72蛋白、p30蛋白、p54蛋白、pE183R蛋白、pB438L蛋白、pE120R蛋白、p150蛋白、p37蛋白和p15中的一种。优选地，所述非洲猪瘟病毒蛋白为p30蛋白。根据非洲猪瘟病毒在不同时期的存在状态，体外诊断时可以选择不同的蛋白作为检测标准，p30蛋白由ASFV的ORF CP204L基因编码，蛋白大小约为23.6ku。p30蛋白在ASFV感染早期表达，通常于感染后2～4h产生，12h后合成减少，在整个感染期间均能检测到，与病毒入侵细胞密切相关，p30蛋白被广泛应用于ASFV的血清学检测。对于本领域技术人员而言，非洲猪瘟病毒蛋白可根据现有技术自行制备亦可从市场购买获得。
本发明提供一种技术方案，所述S1中所述免疫试剂还包括弗氏佐剂；所述步骤S2中，进行所述第一阶段免疫时，所述弗氏佐剂为弗氏完全佐剂；所述步骤S3中，进行所述第二阶段免疫时，所述弗氏佐剂为弗氏不完全佐剂。弗氏佐剂的存在可以增加抗原的表面面积易为巨噬细胞所吞噬，延长抗原在体内的存留期，增加与免疫细胞接触的机遇，增强免疫原性，减少非洲猪瘟病毒蛋白的使用量。
本发明提供一种技术方案，所述第一阶段免疫与所述第二阶段免疫间隔时间为14天，步骤S4中，所述第二阶段免疫7天后对所述鼠取血。
本发明提供一种技术方案，所述免疫试剂中各组分的组成与含量为：所述非洲猪瘟病毒蛋白的溶液0.2mL～1mL且所述溶液含所述非洲猪瘟病毒蛋白20μg～200μg，所述大豆蛋白抗原溶液0.2mL～1mL且所述溶液中所述大豆蛋白抗原的浓度为1mg/mL～2mg/mL。
本发明提供一种技术方案，所述非洲猪瘟病毒蛋白的溶液0.2mL～1mL且所述溶液含所述非洲猪瘟病毒蛋白20μg～200μg，所述大豆蛋白抗原溶液0.2mL～1mL且所述溶液中所述大豆蛋白抗原的浓度为1mg/mL～2mg/mL，所述弗氏佐剂0.4mL～2mL。
本发明提供一种技术方案，所述S4中，从所述鼠的眼眶后血管丛取血，置于37℃水浴锅中1小时，之后置于4℃环境中过夜，使血清完全充分析出，通过离心分离出抗血清。
本发明提供一种技术方案，所述第一阶段免疫的操作过程，将所述鼠的颈部和背部分为6个区域，每个区域免疫注射2个点位，共免疫注射12个点位；所述所述第二阶段免疫的操作过程，将所述鼠的颈部和背部分为6个区域，每个区域免疫注射2个点位，共免疫注射12个点位。选取大面积的颈部和背部分为六个区域，每个区域免疫注射2个点位，使免疫试剂进入鼠的体内在体内分布均匀，在体内各个区域引起免疫反应。
本发明的有益效果为：
本发明通过对BALB/C小鼠多次免疫添加了佐剂、大豆蛋白抗原及非洲猪瘟P30蛋白抗原，不断刺激BALB/C小鼠机体的免疫系统，产生针对非洲猪瘟P30蛋白抗原的抗体，缩短了制备时间，同时提高了BALB/C小鼠产生抗体的特异性及产量，使其产生的非洲猪瘟P30蛋白抗体效价最高可达1:25000，为畜禽类体外诊断试剂上游原材料，及非洲猪瘟病毒相关免疫检测提供了方便。
具体实施方式
实施例1，一种鼠抗非洲猪瘟病毒抗血清的制备方法，包括步骤S1-S4：
S1，第一阶段免疫的免疫试剂制备，将含有60μg非洲猪瘟病毒P30蛋白抗原的0.5mL蛋白液体，与1mL弗氏完全佐剂和0.5mL大豆蛋白抗原进行混合并乳化完全，得到的免疫试剂为首次免疫使用的量；第二阶段免疫的免疫试剂与第一阶段免疫的免疫试剂不同之处在于，非洲猪瘟病毒P30蛋白抗原量降低至30μg，1mL弗氏完全佐剂替换为1mL弗氏不完全佐剂，其余操作相同，第一阶段免疫和第二阶段免疫大豆蛋白抗原使用的浓度均为1mg/mL。
S2，使用S1中所述免疫试剂对鼠先后进行第一阶段免疫，对BALB/C小鼠进行第一阶段免疫，在BALB/C小鼠的颈部和背部分成6个区域，每个区域免疫注射2个点位，共免疫注射12个点位，皮下注射。
S3，第一阶段免疫14天后进行第二阶段免疫，在BALB/C小鼠的颈部和背部分成6个区域，每个区域免疫注射2个点位，共免疫注射12个点位，皮下注射。
S4，第二阶段免疫7天后，对免疫的BALB/C小鼠进行眼眶后血管丛取血法，将收集的血液放置于37℃水浴锅中一小时，之后置于4℃冰箱中过夜，使血清完全充分析出，最后通过离心沉淀分离出抗血清，保存于-80℃冰箱中。
实施例2，实施例2与实施例1的不同之处在于S1中，第一阶段免疫将含有100μg非洲猪瘟病毒P30蛋白抗原的0.7mL蛋白液体，与1.4mL弗氏完全佐剂和0.7mL大豆蛋白抗原进行混合并乳化完全，得到的免疫试剂为首次免疫使用的量；第二阶段免疫将非洲猪瘟病毒P30蛋白抗原量降低至50μg，1mL弗氏完全佐剂替换为1mL弗氏不完全佐剂，其余操作相同，第一阶段免疫和第二阶段免疫大豆蛋白抗原使用的浓度均为1.5mg/mL。其余均相同。
实施例3，实施例3与实施例1的不同之处在于S1中，第一阶段免疫将含有150μg非洲猪瘟病毒P30蛋白抗原的1mL蛋白液体，与2mL弗氏完全佐剂和1mL大豆蛋白抗原进行混合并乳化完全，得到的免疫试剂为首次免疫使用的量；第二阶段免疫将非洲猪瘟病毒P30蛋白抗原量降低至75μg，1mL弗氏完全佐剂替换为1mL弗氏不完全佐剂，其余操作相同，第一阶段免疫和第二阶段免疫大豆蛋白抗原使用的浓度均为2mg/mL。其余均相同。
对比例1，对比例1与实施例1的区别在于，对比例1中的免疫试剂中不包含大豆蛋白抗原。其余均相同。
实验对象，实施例1-3每个实施例和对比例1选用10只大小均一、精神状态较好的雌性BALB/C小鼠，3～4周龄，BALB/C小鼠在实验动物饲养车间中的专用鼠房中进行饲养，免疫之前每只BALB/C小鼠在尾部进行标记，平时饲喂保持BALB/C小鼠的正常体况，避免出现过瘦或过肥的个体，从而降低对免疫效果的影响，提高免疫系统响应水平，每天鼠粮供给，结合自动饮水系统进行饲养。
实验分析，对实施例1-3和对比例1所得抗血清进行效价测定。具体步骤如下：
1、用PBS缓冲液将抗原浓度稀释到2μg/mL，96孔酶标板每孔加入200μL，4℃包被过夜；
2、弃去包被液，PBST洗涤3次，每次5min，每孔加入300μL 3％BSA-PBST封闭液，37℃封闭1.5h；
3、弃去封闭液，PBST洗涤3次，每次5min，将BALB/C小鼠血清进行倍比稀释，以正常组BALB/C小鼠血清作为对照，每孔加入200μL，37℃孵育2h；
4、弃去稀释血清，PBST洗涤3次，每次5min，每孔加入100μL二抗工作液(按照1:8000比例稀释HRP标记IgG抗体)，37℃孵育1h；
5、弃去二抗工作液，用PBST洗涤3次，每次5min，每孔加入100μL TMB底物显色液，室温反应20min；
6、每孔加入50μL浓度为3mol/L的H2SO4终止反应，通过酶标仪读取每孔450nm处的吸光值并记录，计算样品血清效价。
实验结果如表1-表4所示。
表1：实施例1在不同血清效价水平下BALB/C小鼠的数量占比及蛋白浓度比较
表2：实施例2在不同血清效价水平下BALB/C小鼠的数量占比及蛋白浓度比较
表3：实施例3在不同血清效价水平下BALB/C小鼠的数量占比及蛋白浓度比较
表4：对比例在不同血清效价水平下BALB/C小鼠的数量占比及蛋白浓度比较
实验结果显示，本发明通过免疫BALB/C小鼠获得BALB/C小鼠血清，对比例结果显示鼠抗非洲猪瘟病毒P30蛋白血清效价范围为：1:5000～1:10000(表4)，实施例1、实施例2及实施例3结果显示鼠抗非洲猪瘟病毒P30蛋白血清效价范围为：1:10000～1:25000(表1、表2和表3)。
根据上述效价测定结果可以看出，在免疫抗原的时候，添加一定量的大豆蛋白抗原，相比只添加佐剂混匀抗原免疫的组(抗体效价：1:5000～1:10000)，在免疫相同次数的条件下，获得的抗体效价会更高，可以达到1:10000～1:25000。这充分证明一定量的大豆蛋白抗原与抗原蛋白混合后，可有效缩短鼠源抗体制备时间，一定范围内提高抗体效价水平，可以为体外诊断试剂上游提供质量较高的鼠源抗体原材料，以应用于非洲猪瘟病毒检测相关领域，可以产生较高的应用价值和社会效益。
Claims (10)
1.一种鼠抗非洲猪瘟病毒抗血清的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，
S1，取非洲猪瘟病毒蛋白和大豆蛋白抗原进行混合，得到免疫试剂；
S2，使用S1中所述免疫试剂对鼠先后进行第一阶段免疫；
S3，所述第一阶段免疫后对S2中所述鼠进行第二阶段免疫；
S4，所述第二阶段免疫后对所述鼠取血，从所述血中分离出抗血清。
2.根据权利要求1所述的一种鼠抗非洲猪瘟病毒抗血清的制备方法，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒蛋白选自非洲猪瘟病毒的p72蛋白、p30蛋白、p54蛋白、pE183R蛋白、pB438L蛋白、pE120R蛋白、p150蛋白、p37蛋白和p15中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种鼠抗非洲猪瘟病毒抗血清的制备方法，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒蛋白为p30蛋白。
4.根据权利要求1所述的一种鼠抗非洲猪瘟病毒抗血清的制备方法，其特征在于，所述S1中所述免疫试剂还包括弗氏佐剂；所述步骤S2中，进行所述第一阶段免疫时，所述弗氏佐剂为弗氏完全佐剂；所述步骤S3中，进行所述第二阶段免疫时，所述弗氏佐剂为弗氏不完全佐剂。
5.根据权利要求4所述的一种鼠抗非洲猪瘟病毒抗血清的制备方法，其特征在于，所述第一阶段免疫与所述第二阶段免疫间隔时间为14天，步骤S4中，所述第二阶段免疫7天后对所述鼠取血。
6.根据权利要求3所述的一种鼠抗非洲猪瘟病毒抗血清的制备方法，其特征在于，所述免疫试剂中各组分的组成与含量为：所述非洲猪瘟病毒蛋白的溶液0.2mL～1mL且所述溶液含所述非洲猪瘟病毒蛋白20μg～200μg，所述大豆蛋白抗原溶液0.2mL～1mL且所述溶液中所述大豆蛋白抗原的浓度为1mg/mL～2mg/mL。
7.根据权利要求4所述的一种鼠抗非洲猪瘟病毒抗血清的制备方法，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒蛋白的溶液0.2mL～1mL且所述溶液含所述非洲猪瘟病毒蛋白20μg～200μg，所述大豆蛋白抗原溶液0.2mL～1mL且所述溶液中所述大豆蛋白抗原的浓度为1mg/mL～2mg/mL，所述弗氏佐剂0.4mL～2mL。
8.根据权利要求1所述的一种鼠抗非洲猪瘟病毒抗血清的制备方法，其特征在于，所述鼠为BALB/C小鼠。
9.根据权利要求1所述的一种鼠抗非洲猪瘟病毒抗血清的制备方法，其特征在于，所述S4中，从所述鼠的眼眶后血管丛取血，置于37℃水浴锅中1小时，之后置于4℃环境中过夜，使血清完全充分析出，通过离心分离出抗血清。
10.根据权利要求1所述的一种鼠抗非洲猪瘟病毒抗血清的制备方法，其特征在于，所述第一阶段免疫的操作过程，将所述鼠的颈部和背部分为6个区域，每个区域免疫注射2个点位，共免疫注射12个点位；所述所述第二阶段免疫的操作过程，将所述鼠的颈部和背部分为6个区域，每个区域免疫注射2个点位，共免疫注射12个点位。
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