CN101270146A - 一种黄曲霉毒素g1人工抗原的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种黄曲霉毒素G1与蛋白质载体大分子偶联制备人工抗原的方法。用间氯过氧苯甲酸氧化黄曲霉毒素G1分子二呋喃环的双键，使其形成活性极强的黄曲霉毒素G1环氧化物，然后在室温下使黄曲霉毒素G1环氧化物在两相体系中与载体蛋白质上的氨基相连，最后通过透析、冷冻干燥即得到黄曲霉毒素G1人工抗原。本发明有益效果是：1.能够有效地制备出黄曲霉毒素G1人工抗原，从而生产出识别黄曲霉毒素G1的抗体，这对于采用免疫分析技术快速检测黄曲霉毒素G1具有重要的实际意义；2.整个制备过程简便可行，无需特别的仪器设备，成本低廉，容于规模化生产和推广应用；3.本发明制备合成的黄曲霉毒素G1人工抗原具有较好的稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及一种黄曲霉毒素G1与蛋白质载体大分子偶联制备人工抗原的方法。
背景技术
真菌毒素是产毒真菌分泌产生的次生代谢产物，是能引起人畜各种损害的天然有毒化合物。在已经发现的真菌毒素中黄曲霉毒素(aflatoxin，简称AFT)是毒性最强的真菌毒素，其毒性、致癌性和污染频率均居生物毒素的首位。黄曲霉毒素G1是已发现的黄曲霉毒素主要种类之一，它污染食品及饲料后，直接或间接进入人类食品链，威胁人类的健康和生命安全，危害程度与黄曲霉毒素的摄入量成正相关。黄曲霉毒素广泛存在于大米、玉米、花生、芝麻、大豆、菜籽等农产品和鱼肉等食品中，其污染食品及饲料的环节多，为此世界各国都规定了黄曲霉毒素食品及饲料中的最大允许含量并作为强制性标准。我国属于黄曲霉毒素污染较重的地区，加强对食品及饲料中黄曲霉毒素的检测是增强食品安全性的一个重要环节。
目前黄曲霉毒素G1的检测方法主要有薄层层析法(TLC)和液相色谱法，这些分析方法或灵敏度达不到限量检测的要求，且前处理复杂、检测费用高、费时费力。因此，研究开发新兴的黄曲霉毒素G1快速检测技术是我国检测市场的迫切需求，对保障我国食品消费安全具有重要意义。
近些年发展起来的免疫分析技术具有灵敏度高、检测时间短、操作简单等优点，并逐渐成为黄曲霉毒素等污染物快速检测技术研究的热点。抗原和抗体是免疫分析技术的核心试剂和技术源头。黄曲霉毒素G1分子量为328，属小分子化合物(≤1000)，不能直接刺激动物产生抗体，只有和牛血清蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、多聚赖氨酸等载体蛋白质共价偶联后，才能转化为既具有反应原性又具有免疫原性的完全抗原，刺激动物产生抗体。目前，黄曲霉毒素B1等的人工抗原国外均有成功报道，而黄曲霉毒素G1人工抗原则至今未见报道，根本原因在于缺少黄曲霉毒素G1人工抗原制备方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术存在的不足而提供一种工艺简单、实用性强的黄曲霉毒素G1(aflatoxin G1)人工抗原制备方法。
本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：首先用间氯过氧苯甲酸氧化黄曲霉毒素G1分子二呋喃环的双键，使其形成活性极强的黄曲霉毒素G1环氧化物，然后在室温下使黄曲霉毒素G1环氧化物在两相体系中与载体蛋白质上的氨基相连，最后通过透析、冷冻干燥即得到黄曲霉毒素G1人工抗原。
按上述方案，所述的间氯过氧苯甲酸氧化黄曲霉毒素G1分子二呋喃环双键的过程为：取间氯过氧苯甲酸6～10毫克溶于1毫升二氯甲烷中，配成浓度为6～10毫克每毫升的间氯过氧苯甲酸溶液，并用1～2毫升0.1～0.3摩尔每升pH7.0～7.5的磷酸盐缓冲液洗涤2～5遍；取黄曲霉毒素G11～5毫克溶于1～5毫升二氯甲烷中，配成浓度为8～10毫克每毫升的黄曲霉毒素G1溶液，并加入1～5毫升0.1～0.3摩尔每升pH7.0～7.5的磷酸盐缓冲液；将上述间氯过氧苯甲酸溶液和黄曲霉毒素G1溶液混合，并在15～25℃条件下搅拌80～100分钟；将反应终溶液室温静置，待分层后弃去上层水相，保留有机相，该有机相即为黄曲霉毒素G1环氧化物的二氯甲烷溶液。
按上述方案，所述的黄曲霉毒素G1环氧化物在两相体系中与载体蛋白质上的氨基相连过程为：取黄曲霉毒素G1环氧化物的二氯甲烷溶液(上述氧化步骤最终保留的有机相)1～3毫升，加到4.0～6.0毫升载体蛋白质溶液中，所形成的两相体系于室温下磁力搅拌2-6小时；反应终溶液用1000～3000转每分钟离心分离10～30分钟，取上层水相，并用二氯甲烷洗涤2～5次，保留水相溶液，黄曲霉毒素G1与载体蛋白质的偶联物即存在于最终保留的水相溶液中。
按上述方案，所述的透析、冷冻干燥过程为：将最终保留的黄曲霉毒素G1与载体蛋白质的偶联物水相溶液密闭于透析袋中，以0.1～0.2摩尔每升pH7.4的磷酸盐缓冲液作为透析液，共透析2～3天，每间隔4～12小时更换1次透析液；最后1次透析结束后，将透析袋中的溶液分装，经冷冻干燥，即得到黄曲霉毒素G1人工抗原。
上述方案所述的载体蛋白质可用牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白、多聚赖氨酸等生物蛋白质或人造多肽，溶于pH6.8～7.5的磷酸盐缓冲液中，配成浓度为0.5～10毫克每毫升的载体蛋白质溶液。
上述方案所述的偶联反应条件为在室温下于两相体系中自发反应实现偶联，无需其它双功能交联剂。
本发明有益效果在于：1.能够有效地制备出黄曲霉毒素G1人工抗原，从而生产出识别黄曲霉毒素G1的抗体，这对于采用免疫分析技术快速检测黄曲霉毒素G1具有重要的实际意义；2.本发明的整个制备过程简便可行，无需特别的仪器设备，成本低廉，容于规模化生产和推广应用；3.本发明制备合成的黄曲霉毒素G1人工抗原具有较好的稳定性。
附图说明
图1为本发明一个实施例的紫外可见光谱连续扫描图谱，图谱中：AFG1为黄曲霉毒素G1紫外-可见光谱连续扫描图谱曲线；OVA为卵清白蛋白紫外可见光谱连续扫描图谱曲线；AFG1-OVA为黄曲霉毒素G1人工抗原紫外-可见光谱连续扫描图谱曲线。
具体实施方式
实施例1
1)取市售的纯度(以重量计)为85％的间氯过氧苯甲酸9.86毫克溶于1毫升二氯甲烷中，并用1毫升的0.1摩尔每升pH7.0的磷酸盐缓冲液于分液漏斗中洗涤4遍；称取2毫克黄曲霉毒素G1溶于1毫升二氯甲烷中，并加入1毫升的0.1摩尔每升pH7.2的磷酸盐缓冲液；将上述间氯过氧苯甲酸溶液和黄曲霉毒素G1溶液混合，并在22℃条件下磁力搅拌80分钟；将反应终溶液室温静置，待分层后弃去上层水相，保留有机相，该有机相即为黄曲霉毒素G1环氧化物的二氯甲烷溶液。
2)上述步骤1)最终保留的有机相2毫升加到4.0毫升含有牛血清清白蛋白13.6毫克的pH7.2的磷酸盐缓冲溶液中，所形成的两相体系于室温下磁力搅拌4小时；反应终溶液2000转每分钟离心分离20分钟，取上层水相，并用2毫升二氯甲烷洗涤，重复3次，保留水相溶液，黄曲霉毒素G1与牛血清白蛋白的偶联物即存在于最终保留的水相溶液中。
3)将上述步骤2)最终保留的水相溶液密闭于透析袋中，以0.15摩尔每升pH7.4的磷酸盐缓冲液作为透析液，共透析3天，每间隔12小时更换1次透析液；最后1次透析结束后，将透析袋中的溶液分装于离心管中，经冷冻干燥，即得到黄曲霉毒素G1人工抗原的免疫原黄曲霉毒素G1-牛血清白蛋白。
实施例2
1)取市售的纯度(以重量计)为85％的间氯过氧苯甲酸9.39毫克溶于1毫升二氯甲烷中，并用等体积的0.1摩尔每升pH7.0的磷酸盐缓冲液于分液漏斗中洗涤3遍；称取2mg黄曲霉毒素G1溶于1毫升二氯甲烷中，并加入1毫升的0.1摩尔每升pH7.2的磷酸盐缓冲液；将上述间氯过氧苯甲酸溶液和黄曲霉毒素G1溶液混合，并在22℃条件下磁力搅拌100分钟；将反应终溶液室温静置，待分层后弃去上层水相，保留有机相，该有机相即为黄曲霉毒素G1环氧化物的二氯甲烷溶液。
2)上述步骤1)最终保留的有机相2毫升加到6.0毫升含有卵清白蛋白13.1毫克的pH7.2的磷酸盐缓冲溶液中，所形成的两相体系于室温下磁力搅拌4小时；反应终溶液2000转每分钟离心分离20分钟，取上层水相，并用2毫升二氯甲烷洗涤，重复3次，保留水相溶液，黄曲霉毒素G1与卵清白蛋白的偶联物即存在于最终保留的水相溶液中。
3)将上述步骤2)最终保留的水相溶液密闭于透析袋中，以0.15摩尔每升pH7.4的磷酸盐缓冲液作为透析液，共透析3天，每间隔12小时更换1次透析液；最后1次透析结束后，将透析袋中的溶液分装于离心管中，经冷冻干燥，即得到黄曲霉毒素G1人工抗原的包被抗原：黄曲霉毒素G1-卵清白蛋白。
实施例3
1)取市售的纯度(以重量计)为85％的间氯过氧苯甲酸8.62毫克溶于1毫升二氯甲烷中，并用1毫升的0.1摩尔每升pH7.0的磷酸盐缓冲液于分液漏斗中洗涤4遍；称取2毫克黄曲霉毒素G1溶于1毫升二氯甲烷中，并加入1毫升的0.1摩尔每升pH7.2的磷酸盐缓冲液；将上述间氯过氧苯甲酸溶液和黄曲霉毒素G1溶液混合，并在22℃条件下磁力搅拌80分钟；将反应终溶液室温静置，待分层后弃去上层水相，保留有机相，该有机相即为黄曲霉毒素G1环氧化物的二氯甲烷溶液。
2)上述步骤1)最终保留的有机相2毫升加到4.0毫升含有牛血清清白蛋白12.5毫克的pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液中，所形成的两相体系于室温下磁力搅拌4小时；反应终溶液2000转每分钟离心分离20分钟，取上层水相，并用2毫升二氯甲烷洗涤，重复3次，保留水相溶液，黄曲霉毒素G1与牛血清白蛋白的偶联物即存在于最终保留的水相溶液中。
3)将上述步骤2)最终保留的水相溶液密闭于透析袋中，以0.15摩尔每升pH7.4的磷酸盐缓冲液作为透析液，共透析3天，每间隔12小时更换1次透析液；最后1次透析结束后，将透析袋中的溶液分装于离心管中，经冷冻干燥，即得到黄曲霉毒素G1人工抗原的免疫原黄曲霉毒素G1-牛血清白蛋白。
本发明人工抗原的鉴定：
1)通过紫外-可见光谱扫描图谱鉴定偶联物，从图1中可以看出黄曲霉毒素G1与载体卵清白蛋白偶联成功。由偶联物在特征紫外吸收波长346nm处的吸光度值及消光系数可以算出黄曲霉毒素G1-牛血清白蛋白的偶联率为6.13，黄曲霉毒素G1-卵清白蛋白的偶联率为4.57。
2)免疫动物证明产生了抗黄曲霉毒素G1的抗体：(1)小鼠免疫试验：用0.75％的生理盐水将上述合成的黄曲霉毒素G1-牛血清白蛋白配成0.67毫克每毫升的溶液，第一次免疫用0.45毫升完全弗氏佐剂与上述配好的黄曲霉毒素G1-牛血清白蛋白等体积混合，充分乳化后，每只6-8周龄的Balb/c小鼠皮下注射0.3毫升，相当于100微克蛋白质。每隔2周加强免疫1次，加强免疫中将佐剂换用不完全弗氏佐剂，其他方法与第一次免疫方法相同。第5次加强免疫后的第10天从小鼠尾部取血，制备抗血清。(2)非竞争ELISA检测抗体效价试验：以pH9.6的碳酸盐缓冲液将包被抗原黄曲霉毒素G1卵清白蛋白稀释成10微克每毫升，酶标板每孔加入100微升，4℃过夜，倾去包被液，用常规磷酸盐-吐温洗涤液每孔洗涤三次，扣干；每孔加入200微升5％脱脂奶粉，37℃封闭2小时，倾去封闭液，每孔洗涤三次，扣干；从500倍开始倍比稀释抗血清，每孔加入100微升，并平行设置对照孔，以阴性血清为阴性对照，以0.15摩尔每升pH7.4的磷酸盐缓冲液作空白对照，37℃保温保湿2小时，洗涤三次，扣干；每孔加入100微升用0.15摩尔每升pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释2000倍的羊抗鼠IgG:HRP酶标二抗，37℃保温保湿2小时，每孔洗涤五次，扣干；每孔加反应底物液100微升，37℃避光反应15分钟后，每孔加入50微升2摩尔每升硫酸溶液终止反应，5分钟后以空白对照孔调零，450nm测吸光值；以两倍于阴性血清吸光值的抗血清测定值对应的抗血清稀释倍数为抗血清效价，结果如表1
表1黄曲霉毒素G1抗血清效价测定结果
从表1的数据可以证明本发明方法制备的黄曲霉毒素G1人工抗原通过免疫后可以得到效价在12000以上抗血清。(3)ELISA竞争抑制试验：ELISA操作步骤同上，不同的是将倍比稀释的抗血清换为含有不同浓度黄曲霉毒素G1标准品的抗血清溶液；若随着黄曲霉毒素G1浓度的增加吸光值下降，则证明抗血清中的抗体能够与黄曲霉毒素G1发生结合反应；竞争性ELISA试验所得结果如下表2
表2黄曲霉毒素G1参与的ELISA竞争抑制试验结果
表2竞争性ELISA抑制试验结果表明小鼠产生了抗黄曲霉毒素G1的抗体，从而证明本发明方法制备的抗黄曲霉毒素G1人工抗原是成功的。
Claims (5)
1.一种黄曲霉毒素G1人工抗原的制备方法，其特征在于首先用间氯过氧苯甲酸氧化黄曲霉毒素G1分子二呋喃环的双键，使其形成活性极强的黄曲霉毒素G1环氧化物，然后在室温下使黄曲霉毒素G1环氧化物在两相体系中与载体蛋白质上的氨基相连，最后通过透析、冷冻干燥即得到黄曲霉毒素G1人工抗原。
2.按权利要求1所述的黄曲霉毒素G1人工抗原的制备方法，其特征在于所述的间氯过氧苯甲酸氧化黄曲霉毒素G1分子二呋喃环双键的过程为：取间氯过氧苯甲酸6～10毫克溶于1毫升二氯甲烷中，配成浓度为6～10毫克/每毫升的间氯过氧苯甲酸溶液，并用1～2毫升0.1～0.3摩尔每升pH7.0～7.5的磷酸盐缓冲液洗涤2～5遍；取黄曲霉毒素G11～5毫克溶于1～5毫升二氯甲烷中，配成浓度为8～10毫克每毫升的黄曲霉毒素G1溶液，并加入1～5毫升0.1～0.3摩尔每升pH7.0～7.5的磷酸盐缓冲液；将上述间氯过氧苯甲酸溶液和黄曲霉毒素G1溶液混合，并在15～25℃条件下搅拌80～100分钟；将反应终溶液室温静置，待分层后弃去上层水相，保留有机相，该有机相即为黄曲霉毒素G1环氧化物的二氯甲烷溶液。
3.按权利要求1或2所述的黄曲霉毒素G1人工抗原的制备方法，其特征在于所述的黄曲霉毒素G1环氧化物在两相体系中与载体蛋白质上的氨基相连过程为：取黄曲霉毒素G1环氧化物的二氯甲烷溶液(上述氧化步骤最终保留的有机相)1～3毫升，加到4.0～6.0毫升载体蛋白质溶液中，所形成的两相体系于室温下搅拌2-6小时；反应终溶液用1000～3000转每分钟离心分离10～30分钟，取上层水相，并用二氯甲烷洗涤2～5次，保留水相溶液，黄曲霉毒素G1与载体蛋白质的偶联物即存在于最终保留的水相溶液中。
4.按权利要求1或2所述的黄曲霉毒素G1人工抗原的制备方法，其特征在于所述的透析、冷冻干燥过程为：将最终保留的黄曲霉毒素G1与载体蛋白质的偶联物水相溶液密闭于透析袋中，以0.1～0.2摩尔每升pH7.4的磷酸盐缓冲液作为透析液，共透析2～3天，每间隔4～12小时更换1次透析液；最后1次透析结束后，将透析袋中的溶液分装，经冷冻干燥，即得到黄曲霉毒素G1人工抗原。
5.按权利要求3所述的黄曲霉毒素G1人工抗原的制备方法，其特征在于
1)取市售的纯度(以重量计)为85％的间氯过氧苯甲酸9.86毫克溶于1毫升二氯甲烷中，并用1毫升的0.1摩尔每升pH7.0的磷酸盐缓冲液于分液漏斗中洗涤4遍；称取2毫克黄曲霉毒素G1溶于1毫升二氯甲烷中，并加入1毫升的0.1摩尔每升pH7.2的磷酸盐缓冲液；将上述间氯过氧苯甲酸溶液和黄曲霉毒素G1溶液混合，并在22℃条件下磁力搅拌80分钟；将反应终溶液室温静置，待分层后弃去上层水相，保留有机相，该有机相即为黄曲霉毒素G1环氧化物的二氯甲烷溶液；
2)上述步骤1)最终保留的有机相2毫升加到4.0毫升含有牛血清清白蛋白13.6毫克的pH7.2的磷酸盐缓冲溶液中，所形成的两相体系于室温下磁力搅拌4小时；反应终溶液2000转每分钟离心分离20分钟，取上层水相，并用2毫升二氯甲烷洗涤，重复3次，保留水相溶液，黄曲霉毒素G1与牛血清白蛋白的偶联物即存在于最终保留的水相溶液中；
3)将上述步骤2)最终保留的水相溶液密闭于透析袋中，以0.15摩尔每升pH7.4的磷酸盐缓冲液作为透析液，共透析3天，每间隔12小时更换1次透析液；最后1次透析结束后，将透析袋中的溶液分装于离心管中，经冷冻干燥，即得到黄曲霉毒素G1人工抗原的免疫原黄曲霉毒素G1-牛血清白蛋白。
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