CN109929871A

CN109929871A - 一种介导双链rna进入中华紫胶虫体内的方法

Info

Publication number: CN109929871A
Application number: CN201910181801.5A
Authority: CN
Inventors: 陈航; 王伟伟; 凌晓霏; 陆沁; 柳鹏飞; 张金稳
Original assignee: Research Institute of Resource Insects of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Research Institute of Resource Insects of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2019-03-11
Filing date: 2019-03-11
Publication date: 2019-06-25
Anticipated expiration: 2039-03-11
Also published as: CN109929871B; AU2020100222A4

Abstract

本发明涉及一种介导双链RNA进入中华紫胶虫体内的方法，属于基因工程技术领域。该方法首先提取中华紫胶虫总RNA并反转录为cDNA后进行PCR扩增，扩增产物和L4440载体经SacI和SalI双酶切，酶切产物利用T4连接酶连接过夜，得到的FAD‑L4440重组质粒转入到HT115感受态细胞中，扩大培养至菌液OD₆₀₀为0.1~0.7，加入IPTG诱导2~5h，得到FAD‑L4440‑HT115菌体，将菌体稀释后直接涂抹在中华紫胶虫幼虫期虫体上。本发明方法能将dsRNA转染到紫胶虫体内，有效干扰FAD基因表达量，从而引起个体泌胶量降低，为RNAi转染过程中不适用注射法、喂食等转染方法的昆虫提供参考。

Description

一种介导双链RNA进入中华紫胶虫体内的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种介导双链RNA进入中华紫胶虫体内的方法。

背景技术

中华紫胶虫（Kerria chinensis）隶属于半翅目（Hemiptera）、胶蚧科（Tachardiidae）、胶蚧属（Kerria），是一种具有重要经济价值的资源昆虫，主要寄生于交趾黄檀（Dalbergia cocrinchinensis）、光叶合欢（Aibizia lucida）等植物上，通过吸取植物韧皮部的汁液生长繁殖。紫胶是雌虫通过腺体分泌出的一种纯天然的树脂，主要成分由紫胶树脂、紫胶蜡、紫胶色酸等组成。紫胶具有粘接性强、绝缘性好、防潮、涂膜光滑等优良特征，而且无毒、无味等优良的物化性能而被广泛应用于军工、日用化工、电子等行业，具有重要的经济价值。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指在真核生物中，由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发同源mRNA降解，使靶基因表达沉默的现象。dsRNA转染有注射、喂食、浸泡、病毒感染和转基因等方法，较常用的是注射法和喂食法。在RNA干扰研究的初期，注射最初主要应用于线虫，并随着在果蝇中运用的开展，目前已在小菜蛾（Plutella xyllostella）、褐飞虱、（Nilaparvata lugens）、赤拟谷盗（Tribolium castaneum）等研究对象中建立了注射dsRNA诱导RNAi的体系。但当研究对象个体过小时，注射难度增大且成活率降低这一问题仍无法得到有效解决。喂食法诱导RNAi因其操作简单方便，对研究对象危害性小等特点已在马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）、麦长管蚜（Sitobion avenae）等昆虫中得到应用。但喂食法存在作用较慢、效率较低的缺点。由于注射法和喂食法各自存在缺点，在研究对象个体过小且不能喂食时，使用哪种转染方法将dsRNA转染到昆虫体内显得至关重要。

本研究的虫种中华紫胶虫个体较小，且是刺吸式口器，口针刺入寄主植物后便终身不动，通过吸取植物的汁液生长繁殖。因而紫胶虫选择哪种转染方式对使用RNAi验证相关基因功能至关重要。因此如何克服现有技术的不足是目前基因工程技术领域急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种介导双链RNA进入中华紫胶虫体内的方法，该方法能将dsRNA转染到紫胶虫体内，为RNAi转染过程中不适用注射法、喂食等转染方法的昆虫提供参考。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种介导双链RNA进入中华紫胶虫体内的方法，包括如下步骤：

步骤（1），提取中华紫胶虫总RNA并反转录为cDNA后进行PCR扩增，扩增产物和L4440载体经SacI和SalI双酶切，酶切产物利用T4连接酶连接过夜，得到FAD-L4440重组质粒；

步骤（2），将步骤（1）得到的FAD-L4440重组质粒转入到HT115感受态细胞中，扩大培养至菌液OD₆₀₀为0.1~0.7，加入IPTG诱导2~5h，得到FAD-L4440-HT115菌体；

步骤（3），将步骤（2）得到的FAD-L4440-HT115菌体稀释至浓度为6.2ng•mL^-1~620ng•mL^-1，然将采用稀释后的菌液直接涂抹在中华紫胶虫幼虫期虫体上。

进一步，优选的是，所述的中华紫胶虫总RNA包含中华紫胶虫FAD基因的总RNA。

进一步，优选的是，步骤（1）中，所述的PCR扩增采用的引物为ds-F和ds-R，其中，

ds-F：atgagctcgcaatgatacaacgaacca；

ds-R：atgtcgacgaacgatgtgaccataagc。

进一步，优选的是，步骤（1）中，所述的PCR扩增体系为

Taq PCR Master Mix(2X, with Red Dye) 12.5μl，

cDNA 1.0μl，

ds-F 10μM 1.0μl，

ds-R 10μM 1.0μl，

dH2O 9.5μl，

总计 25.0μl。

进一步，优选的是，步骤（1）中，所述的PCR反应条件：95℃预变性2min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，35次循环；72℃延伸10min，4℃保存。

进一步，优选的是，步骤（1）中，酶切的时间为10min，温度为37℃。

进一步，优选的是，步骤（1）中，酶切的体系为：

SacⅠ 1.0 μl，

SalⅠ 1.0 μl，

Buffer 5.0 μl，

FAD或L4440 5.0 μl，

dH2O 38.0 μl，

总计 50.0 μl。

进一步，优选的是，步骤（2）中，所述的扩大培养具体方法是：将构建好的FAD-L4440重组质粒转化到HT115感受态菌株中，涂布于含有氨苄青霉素和四环素的SOC固体培养基上，培养12 h，挑取单菌落转入含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL四环素的SOC液体培养基37℃过夜培养，然后将过夜培养液加入含有75μg/mL氨苄青霉素和12.5μg/mL四环素的2×YT液体培养基中培养至OD₆₀₀=0.1~0.7。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明首次在中华紫胶虫基因功能验证中引入了细菌表达dsRNA的RNAi系统，通过涂干、喷施两种处理方法的比较，发现涂干法能够有效干扰FAD基因表达量，从而引起个体泌胶量降低，但喷施法干扰效果不明显。现有的dsRNA转染方法主要用注射法和喂食法，但当研究对象个体过小时，注射难度增大且成活率降低这一问题仍无法得到有效解决，喂食法也存在作用较慢、效率较低的缺点，在研究对象个体过小且不能喂食时，本研究所采用的涂干法可为RNAi转染过程中不适用注射法、喂食等转染方法的昆虫提供参考，将为在分子水平上验证紫胶合成相关基因功能提供行之有效的技术方法。

本发明采用涂干法，发现低浓度和中浓度菌液转染对中华紫胶虫FAD基因的干扰效果较明显，分别降低了90.79%和85.46%，个体泌胶量也相对于ck组有显著性差异，分别较低14.89%和12.73%。从而验证了涂干法能够有效干扰FAD基因表达量，从而引起个体泌胶量降低。

附图说明

图1为重组载体的构建及dsRNA诱导表达流程图；

图2为干扰载体构建和dsRNA诱导表达电泳图；其中，M，DNA Marker；1，FAD基因片段PCR产物；2，FAD-L4440质粒经过ds-F和ds-R扩增的PCR产物；3，FAD-L4440经过T7单引物扩增的PCR产物；4，FAD-L4440-HT115菌液诱导前RNA电泳；5，FAD-L4440-HT115菌液诱导后RNA电泳。

图3为不同浓度菌液涂干对中华紫胶FAD基因的影响图；A为低浓度菌液处理后的基因表达量；B为中浓度菌液处理后的基因表达量；C为高浓度菌液处理后的基因表达量。大写字母表示同一时间段两种菌液处理的基因表达量差异分析（P＜0.05）；小写字母表示同一处理下不同时间段的基因表达量差异分析（P＜0.05）。

图4为不同浓度菌液喷施对中华紫胶FAD基因的影响图；A为低浓度菌液处理后的基因表达量；B为中浓度菌液处理后的基因表达量；C为高浓度菌液处理后的基因表达量。大写字母表示同一时间段两种菌液处理的基因表达量差异分析（P＜0.05）；小写字母表示同一处理下不同时间段的基因表达量差异分析（P＜0.05）。

图5为RNA干扰后个体泌胶量测定结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1

步骤（2），将步骤（1）得到的FAD-L4440重组质粒转入到HT115感受态细胞中，扩大培养至菌液OD₆₀₀为0.1，加入IPTG诱导2h，得到FAD-L4440-HT115菌体；

步骤（3），将步骤（2）得到的FAD-L4440-HT115菌体稀释至浓度为6.2ng•mL^-1，然将采用稀释后的菌液直接涂抹在中华紫胶虫幼虫期虫体上。

实施例2

步骤（2），将步骤（1）得到的FAD-L4440重组质粒转入到HT115感受态细胞中，扩大培养至菌液OD₆₀₀为0.7，加入IPTG诱导5h，得到FAD-L4440-HT115菌体；

步骤（3），将步骤（2）得到的FAD-L4440-HT115菌体稀释至浓度为620ng•mL^-1，然将采用稀释后的菌液直接涂抹在中华紫胶虫幼虫期虫体上。

步骤（1）中，所述的中华紫胶虫总RNA包含中华紫胶虫FAD基因的总RNA。

所述的PCR扩增采用的引物为ds-F和ds-R，其中，

ds-F：atgagctcgcaatgatacaacgaacca；

ds-R：atgtcgacgaacgatgtgaccataagc。

所述的PCR扩增体系为

Taq PCR Master Mix(2X, with Red Dye) 12.5μl，

cDNA 1.0μl，

ds-F 10μM 1.0μl，

ds-R 10μM 1.0μl，

dH2O 9.5μl，

总计 25.0μl。

所述的PCR反应条件：95℃预变性2min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，35次循环；72℃延伸10min，4℃保存。

酶切的时间为10min，温度为37℃。

酶切的体系为：

SacⅠ 1.0 μl，

SalⅠ 1.0 μl，

Buffer 5.0 μl，

FAD或L4440 5.0 μl，

dH2O 38.0 μl，

总计 50.0 μl。

步骤（2）中，所述的扩大培养具体方法是：将构建好的FAD-L4440重组质粒转化到HT115感受态菌株中，涂布于含有氨苄青霉素和四环素的SOC固体培养基上，培养12 h，挑取单菌落转入含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL四环素的SOC液体培养基37℃过夜培养，然后将过夜培养液加入含有75μg/mL氨苄青霉素和12.5μg/mL四环素的2×YT液体培养基中培养至OD₆₀₀=0.7。

实施例3

步骤（2），将步骤（1）得到的FAD-L4440重组质粒转入到HT115感受态细胞中，扩大培养至菌液OD₆₀₀为0.5，加入IPTG诱导3h，得到FAD-L4440-HT115菌体；

步骤（3），将步骤（2）得到的FAD-L4440-HT115菌体稀释至浓度为300ng•mL^-1，然将采用稀释后的菌液直接涂抹在中华紫胶虫幼虫期虫体上。

所述的PCR扩增采用的引物为ds-F和ds-R，其中，

ds-F：atgagctcgcaatgatacaacgaacca；

ds-R：atgtcgacgaacgatgtgaccataagc。

所述的PCR扩增体系为

Taq PCR Master Mix(2X, with Red Dye) 12.5μl，

cDNA 1.0μl，

ds-F 10μM 1.0μl，

ds-R 10μM 1.0μl，

dH2O 9.5μl，

总计 25.0μl。

酶切的时间为10min，温度为37℃。

酶切的体系为：

SacⅠ 1.0 μl，

SalⅠ 1.0 μl，

Buffer 5.0 μl，

FAD或L4440 5.0 μl，

dH2O 38.0 μl，

总计 50.0 μl。

步骤（2）中，所述的扩大培养具体方法是：将构建好的FAD-L4440重组质粒转化到HT115感受态菌株中，涂布于含有氨苄青霉素和四环素的SOC固体培养基上，培养12 h，挑取单菌落转入含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL四环素的SOC液体培养基37℃过夜培养，然后将过夜培养液加入含有75μg/mL氨苄青霉素和12.5μg/mL四环素的2×YT液体培养基中培养至OD₆₀₀=0.5。

应用实例

实验涉及的所有培养基购买于生工生物工程(上海)股份有限公司，其中：

SOC培养基组分：蛋白胨20.0g；酵母粉5.0g；氯化钠0.5g；七水硫酸镁5.0g；D-葡萄糖3.6g。

SOC固体培养基组分：SOC培养基：34g，琼脂粉：12g，蒸馏水：1L

SOC液体培养基组分：SOC培养基：34g，蒸馏水：1L

含有氨苄青霉素的SOC固/液体培养基中：每毫升培养基中含有100μg的氨苄青霉素。

含有氨苄青霉素和四环素的SOC固/液体培养基中：每毫升培养基中含有100μg的氨苄青霉素，含有50μg的四环素。

2×YT培养基组分：酵母粉10.0g；蛋白胨16.0g；氯化钠5.0g。

含有氨苄青霉素和四环素的2×YT液体培养基中：每毫升培养基中含有75μg的氨苄青霉素，含有12.5μg的四环素。

注：文中“/”代表“或”的意思。

本发明是中华紫胶虫基因功能验证中采用涂干法有效转染双链RNA到昆虫体内引起泌胶量下降的方法，主要涉及紫胶虫基因功能验证中双链RNA转染的方法。本发明主要目的：1）探索一种将双链RNA介导到昆虫体内的高效、便捷的转染方法；2）比较涂干和喷施法，明确哪种方法为有效转染方法；3）采用高、中、低三种dsRNA菌液浓度方式，哪种浓度能达到最好的沉默效果；从这三个目的出发探讨采用将双链RNA有效转染到紫胶虫体内，引起相关基因表达沉默，为在分子水平上验证紫胶合成相关基因功能提供行之有效的技术方法。

1 重组载体的构建

利用RNA提取试剂盒（EZ-10 Tatal RNA Minin-presps kit，生工生物工程（上海）股份有限公司）提取中华紫胶虫总RNA，其提取过程参照试剂盒说明书，并用反转录试剂盒（PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser，Takara）反转录为cDNA。根据FAD基因序列（序列上传于NCBI数据库，PRJNA489372）设计引物ds-F：atgagctcgcaatgatacaacgaacca（SEQ ID NO.1）和ds-R：atgtcgacgaacgatgtgaccataagc（SEQ ID NO.2），预期扩增片段大小为266bp，以cDNA为模板进行PCR扩增[Taq PCR MasterMix (2X, with Red Dye) ，生工生物工程（上海）股份有限公司]，PCR反应体系如表1所示。反应条件：95℃预变性2min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，35次循环；72℃延伸10min，4℃保存。

表1

扩增片段的电泳检测结果显示介于250-500bp之间（图2A），与预期相符。根据图1载体构建的流程，FAD基因胶回收产物和L4440载体经SacI和SalI（NEB（北京）有限公司）在37℃水浴中酶切10min，其反应体系如表2所示，分别回收酶切产物，酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳检测之后利用T4连接酶连接过夜，得到FAD-L4440重组质粒。

表2

将FAD-L4440重组质粒连接好后转入到50μL DH5α感受态细胞中，涂布于含有氨苄青霉素的SOC固体培养基上，培养12h，挑取单菌落于SOC液体培养基中培养。经T7单引物菌液PCR扩增，反应体系如表3所示， PCR反应条件：95℃预变性2min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，35次循环；72℃延伸10min，4℃保存；获得预期的目的条带（图2B），并送公司测序，结果显示与目的片段吻合，验证FAD-L4440重组质粒已成功构建。所述的T7单引物序列为taatacgactcactatagg（SEQ ID NO.3）。

表3

2 dsRNA的诱导表达

将FAD-L4440重组质粒转入到HT115感受态细胞中，扩大培养至菌液OD₆₀₀为0.4，加入IPTG诱导4h，收集菌体（图1）。诱导后的菌液提总RNA检测，结果如图2C所示。凝胶电泳结果显示，诱导后FAD-L4440-HT115菌液提取的RNA含有一条目的基因的RNA条带，而诱导前FAD-L4440-HT115菌液提取的RNA不含此条带，据此可以判定诱导后的FAD-L4440-HT115特异条带为FAD的dsRNA条带，证明FAD基因dsRNA的诱导表达成功。

其中，所述的扩大培养具体是：将构建好的FAD-L4440重组质粒转化到HT115感受态菌株中，涂布于含有氨苄青霉素和四环素的SOC固体培养基上，培养12 h，挑取单菌落转入含有氨苄青霉素和四环素的SOC液体培养基37℃过夜培养，然后将过夜培养液加入含有氨苄青霉素和四环素的2×YT液体培养基中培养至OD₆₀₀=0.4。

3 转染效果检测

用无菌水稀释菌体，配制成高、中、低三种不同浓度的测试菌液（620 ng•mL^-1、62 ng•mL^-1、6.2 ng•mL^-1）作为实验组，并以不做任何处理作为自然组（ck），以L4440-HT115菌液（其制备过程与FAD-L4440-HT115菌液相同，区别在于：重组的质粒不含FAD基因片段）作为对照组。紫胶虫幼虫期泌胶量较少，成虫期大量分泌紫胶逐渐形成胶壳将虫体和寄主植物枝条覆盖起来，涂干和喷施dsRNA菌液很难被虫体吸收，所以本发明选择在紫胶虫幼虫期对其进行转染。

（1）涂干：将FAD-L4440-HT115菌体用无菌水稀释成不同浓度后，用软毛刷直接涂抹在虫体上。

（2）喷施：将FAD-L4440-HT115菌体用无菌水稀释成不同浓度后，用小喷壶直接喷施在虫体上。

每天处理2次，在连续处理3天后的12 h、24 h、48 h和72 h收集的实验样品。根据FAD基因片段设计荧光定量引物，上游引物：catcgttcttacaaggctaa（SEQ ID NO.4）和下游引物：tatgtggatcggcattcg（SEQ ID NO.5），并选择β-actin为内参基因，其上游引物：atcgtgctgagtgaggaa（SEQ ID NO.6）和下游引物：cgcttcgctgattatcgta（SEQ ID NO.7）。利用荧光定量（RT-qPCR）试剂盒（SYBR Primix Ex TaqTM，Takara公司）进行检测，其反应体系如表4所示，反应条件：95℃预变性2min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，35次循环，采用2^-∆∆CT法计算相对表达量。

表4

结果表明，使用涂干FAD-L4440-HT115菌液处理组的FAD基因表达量明显降低，其中低浓度和中浓度在12 h时相对于对照组有显著差异，分别降低了90.79%和85.46%，中浓度在72 h时干扰效率高于其他两个组（图3）。使用喷施FAD-L4440-HT115菌液处理的FAD基因表达量在低浓度12h和48h、中浓度24h和48h有所降低，其中只有在中浓度48h相对于对照组有显著差异（图4）。

在一个月后采集不同处理的紫胶虫，剥取新鲜胶块称重，用95%酒精浸泡胶块，待胶完全溶解后，过滤取虫体统计个体数并称重，然后计算其个体泌胶量。结果表明，涂干法的低浓度和中浓度处理组相比ck组个体泌胶量有显著性差异（P＜0.05），分别降低了14.89%和12.73%，喷施法3个不同浓度处理的实验组相比ck组个体泌胶量都有所增高（图5）。

通过涂干、喷施两种处理方法的比较，发现涂干法能够有效干扰FAD基因表达量，从而引起个体泌胶量降低，但喷施法干扰效果不明显。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 中国林业科学研究院资源昆虫研究所

<120> 一种介导双链RNA进入中华紫胶虫体内的方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

atgagctcgc aatgatacaa cgaacca 27

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

atgtcgacga acgatgtgac cataagc 27

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

taatacgact cactatagg 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

catcgttctt acaaggctaa 20

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

tatgtggatc ggcattcg 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

atcgtgctga gtgaggaa 18

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

cgcttcgctg attatcgta 19

Claims

1.一种介导双链RNA进入中华紫胶虫体内的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的介导双链RNA进入中华紫胶虫体内的方法，其特征在于，所述的中华紫胶虫总RNA包含中华紫胶虫FAD基因的总RNA。

3.根据权利要求1所述的介导双链RNA进入中华紫胶虫体内的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的PCR扩增采用的引物为ds-F和ds-R，其中，

ds-F：atgagctcgcaatgatacaacgaacca；

ds-R：atgtcgacgaacgatgtgaccataagc。

4.根据权利要求1或3所述的介导双链RNA进入中华紫胶虫体内的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的PCR扩增体系为

Taq PCR Master Mix(2X, with Red Dye) 12.5μl，

cDNA 1.0μl，

ds-F 10μM 1.0μl，

ds-R 10μM 1.0μl，

dH2O 9.5μl，

总计 25.0μl。

5.根据权利要求4所述的介导双链RNA进入中华紫胶虫体内的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的PCR反应条件：95℃预变性2min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，35次循环；72℃延伸10min，4℃保存。

6.根据权利要求1所述的介导双链RNA进入中华紫胶虫体内的方法，其特征在于，步骤（1）中，酶切的时间为10min，温度为37℃。

7.根据权利要求1所述的介导双链RNA进入中华紫胶虫体内的方法，其特征在于，步骤（1）中，酶切的体系为：

SacⅠ 1.0 μl，

SalⅠ 1.0 μl，

Buffer 5.0 μl，

FAD或L4440 5.0 μl，

dH2O 38.0 μl，

总计 50.0 μl。

8.根据权利要求1所述的介导双链RNA进入中华紫胶虫体内的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的扩大培养具体方法是：将构建好的FAD-L4440重组质粒转化到HT115感受态菌株中，涂布于含有氨苄青霉素和四环素的SOC固体培养基上，培养12 h，挑取单菌落转入含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL四环素的SOC液体培养基37℃过夜培养，然后将过夜培养液加入含有75μg/mL氨苄青霉素和12.5μg/mL四环素的2×YT液体培养基中培养至OD₆₀₀=0.1~0.7。