CN109928949B - 一种荧光探针的制备及其长期稳定成像溶酶体的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种全新结构的荧光分子探针(I)的制备方法和应用。所述分子结构具有如(I)所示的结构式，该类化合物可以用作溶酶体的长时间稳定成像，其本身在510nm处没有荧光，当其进入细胞溶酶体之后被溶酶体水解酶水解后产生荧光，且荧光强度不随溶酶体的酸度变化而变化，有效荧光分子不会流出溶酶体。可以用于生理或病理条件下溶酶体酸度升高或降低过程时溶酶体的长期稳定成像。

Description

一种荧光探针的制备及其长期稳定成像溶酶体的应用
技术领域
本发明涉及一种新型荧光探针的制备方法及其在溶酶体成像领域的应用。
背景技术
溶酶体是一种存在于所有真核生物细胞的由单层膜包封的酸性细胞器，内含多种水解酶用以消化各种细胞外源和内源物质，是细胞的消化器官。溶酶体正常功能的维持依赖于其pH的调控。溶酶体pH在各种生命过程中呈现动态变化的特点。如在细胞凋亡、癌细胞的转移、细胞成熟等过程中溶酶体pH会降低,而在衰老及溶酶体贮积症等过程中pH则会上升，溶酶体pH的动态变化与细胞自噬、死亡、致病菌吞噬、神经性疾病等密切相关。随着研究的深入，人们还发现溶酶体在细胞代谢、免疫、激素分泌调节等生命活动中发挥着重要的功能。在这些生理病理过程中，尤其是当溶酶体酸度发生变化的情况下，可靠的溶酶体标记和成像分析方法显得尤为重要。
利用化学小分子荧光探针进行溶酶体荧光成像具有简单易操作的特点而成为细胞生物学常用的分析方法，以LysoTracker green为代表的商业化溶酶体探针通常含有一个荧光基团和弱碱性的胺基官能团，其中弱碱性基团通过分子内光引发的电子转移(photoinduced electron transfer,PET)抑制探针的荧光，在溶酶体酸性条件下胺基被质子化，抑制了PET，从而导致探针的荧光增强。但该类探针的缺点也十分明显，抑制PET不充分导致荧光信号弱；易发生光漂白，从而丧失荧光性能；在溶酶体保留时间短，难用于长时间跟踪、分析溶酶体。因此开发稳定、易制备，又可以长期聚集于溶酶体而不受pH变化影响的溶酶体荧光探针具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种具较大斯托克斯位移的全新结构荧光分子的制备方法及其在溶酶体长时间稳定成像方面的应用，发明所述荧光分子式为：C18H12O4，分子量为：292.0736。
Figure SMS_1
1.上述荧光分子探针的制备方法包括如下步骤：
1)中间体(II)的合成：在空气氛围25℃下，将间苯二酚、(E)-3-(2-formylphenyl)acrylic acid和磷酸混合后加热至120℃磁力搅拌反应12小时。反应完成后将反应液冷却后过滤得到灰白色固体中间体(II)；中间体(II)的结构如下所示：
Figure SMS_2
优选的反应物的摩尔比为1：1；
优选的反应浓度为0.2mol/L。
2)探针(I)的合成：将底物加入二氯甲烷中冷却至0℃后依次加入乙酰氯和氢氧化钠。然后将反应温度升高至室温25℃反应2小时。用水淬灭反应后用二氯甲烷萃取三次，将有机相合并后加入无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂后采用硅胶色谱柱分离纯化得到探针(I)。
优选的原料和乙酰氯及氢氧化钠摩尔比为1:2:2；
优选的原料反应浓度为0.1moL/L；
图1-3分别是探针(I)的核磁共振氢谱、碳谱及高分辨率质谱。
2.上述探针(I)用于稳定的不依赖于酸性pH的溶酶体成像：
本发明所述的荧光探针(I)本身没有荧光，当乙酰基被细胞中的水解酶水解后得到化合物(II)后在340nm激发下会发出波长510nm蓝色的荧光。经过共定位实验(图4)证明本发明的探针经过水解后发出的荧光只定位于细胞的溶酶体中，因此本探针(I)可以用于细胞内溶酶体的定位成像。
图4A所示的红色荧光信号(商业化溶酶体探针信号)和蓝色荧光信号能够很好的重叠，说明探针(I)定位于溶酶体中。
图4B为划线处红蓝色像素点重合的的软件分析，结果更进一步证明上述的探针(I)定位于细胞的溶酶体中。
利用本探针(I)进行溶酶体定位成像检测时具有如下特征：该探针不会由于溶酶体酸度的上升而流出溶酶体。
所述荧光分子探针(I)用于多种细胞的溶酶体成像的有益效果是：探针(I)自身不具备荧光发光性能，其扩散进入细胞内部后被细胞溶酶体内的乙酰水解酶水解后无法扩散溢出溶酶体，从而聚集在溶酶体内，同时发出蓝色的荧光。上述探针不同于传统的溶酶体探针的酸性pH依赖性，从而可以长期稳定的成像观测溶酶体，实现一些溶酶体pH升高的生理病理过程溶酶体的成像。
附图说明
图1.荧光分子探针(I)的核磁共振氢谱。
图2.荧光分子探针(I)的核磁共振碳谱。
图3.荧光分子探针(I)的高分辨率质谱。
图4.激光共聚焦荧光显微镜分析荧光分子探针(I)的细胞器定位。(标尺：10μm)
图5.激光共聚焦荧光显微镜分析荧光分子探针(I)用于多种细胞的溶酶体成像。(标尺：10μm)
实施例：
1.激光共聚焦荧光显微分析荧光分子探针(I)的细胞器定位
将HeLa细胞传代到35mm玻璃底(NEST)的共聚焦专用培养皿中，加入含10％FBS的DMEM进行培养24h。在这些细胞中加入荧光分子探针(I)(2μmol/L)和商业化的溶酶体探针Lysotracker Red(2μM)，孵育30分钟，用PBS清洗2次后用激光共聚焦荧光显微镜观察荧光分子探针(I)在细胞内的分布情况得图4。
2.激光共聚焦荧光显微分析荧光分子探针(I)的细胞器定位
将HeLa、MCF-7、HT1080细胞分别传代到35mm玻璃底(NEST)的共聚焦专用培养皿中，加入含10％FBS的DMEM进行培养24h。在这些细胞中加入荧光分子探针(I)(2μmol/L)，孵育30分钟，用PBS清洗2次后用激光共聚焦荧光显微镜观察各种细胞的溶酶体得图5。

Claims (3)

1.一种荧光分子探针(I)，其特征在于，所述荧光分子探针(I)的分子式为：C18H12O4，分子量为：292.0736，化学结构如式(I)所示：
Figure QLYQS_1
2.如权利要求1所述荧光分子探针(I)的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)具有荧光的中间体(II)的合成：在室温空气氛围下，将间苯二酚、(E)-3-
(2-甲酰基苯基)丙烯酸和磷酸混合后在磁力搅拌器搅拌下加热至100℃反应，反应12小时后将反应物过滤得到中间体(II)，所述的中间体(II)的结构如式(II)所示；
Figure QLYQS_2
2)荧光分子探针(I)合成：在室温氮气氛围下，将中间体(II)溶解于吡啶中，然后向反应体系中加入醋酸酐，在磁力搅拌器搅拌下升温至25℃反应，TLC追踪反应终点，将反应液真空浓缩去除溶剂，经硅胶色谱柱纯化得到目标产物(I)。
3.权利要求1所述的式(I)化合物在制备生理或病理条件下、溶酶体酸度变化过程中对溶酶体成像检测的荧光分子探针的应用。
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