CN109913498A - 低表达gfpt1的du145稳定细胞株及构建与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种新发现的可以对前列腺癌增殖产生影响的通路‑GFPT1调控AMPK磷酸化的通路。具体采用shRNA干扰技术在DU145细胞中干涉GFPT1，以达到激活AMPK的活性，抑制细胞增殖的目的，经过结晶紫染色和蛋白免疫印迹实验检测证实，GFPT1的抑制能够激活AMPK通路抑制细胞增殖，从而达到有效治疗前列腺癌的目的。

Description

低表达GFPT1的DU145稳定细胞株及构建与应用

技术领域

本发明涉及到细胞生物学与生物化学与分子生物学技术，具体涉及检测细胞增殖及 AMPK磷酸化的方法。

背景技术

肿瘤的发生发展常常与一系列能量产生机制的失衡相关。从正常细胞到肿瘤细胞的进化过程中,细胞必须面对各种各样的胁迫,例如癌基因的激活、低氧条件、营养物质的缺乏及化学和放射治疗。在压力的刺激下肿瘤细胞通过调节细胞代谢以提供支持肿瘤生存和成长的营养。将细胞代谢和肿瘤联系在一起最有代表性的分子之一是AMP活化的蛋白质激酶 AMPK(AMP-activated protein kinase,AMPK)。

肿瘤代谢紊乱是肿瘤发生发展的重要特征，肿瘤的生长常常与一系列的能量产生机制的失衡相关，这种现象被称为Warburg现象。即肿瘤细胞主要使用糖酵解及乳酸发酵产生能量，而不是通过三羧酸循环中丙酮酸的氧化磷酸化。葡萄糖是生物体内主要的营养物质,在被细胞摄入后就迅速的被磷酸化生成6-磷酸葡萄糖,进一步转换成6-磷酸果糖。大部分的6-磷酸果糖通过糖酵解作用产生ATP，2％-5％的葡萄糖进入己糖胺信号通路(HBP)。与正常细胞相比肿瘤细胞葡萄糖的吸收及糖酵解明显增加,导致了糖酵解中间途径HBP和磷酸戊糖途径(PPP) 的增加。

GFPT1作为己糖胺合成中的第一个及限速酶,在癌症中的作用这些年受到了越来越多的关注。通过数据库分析，GFPT1在乳腺癌、前列腺、肺癌、膀胱癌、胰腺癌等许多恶性肿瘤中异常表达，证明GFPT1在肿瘤发生发展中具有重要作用。同时研究证实GFPT1高表达的三阴性乳腺癌患者的存活期及总生存数明显下降。前列腺癌病人的组织中GFPT1表达量明显升高,研究者认为GFPT1可作为前列腺癌的标签蛋白。

发明内容

本发明涉及辅助治疗前列腺癌的新通路，目的一是阐明GFPT1通过调节AMPK的磷酸化抑制肿瘤发生发展，目的二,为GFPT1在癌症诊断、预后、治疗、肿瘤标志物筛选等临床转化应用提供基础。

实验结果表明，GFPT1抑制了肿瘤细胞的生物合成，同时在2-DG处理条件下，GFPT1抑制了AMPK的磷酸化。包括如下步骤：

包装细胞的转染

1)转染前一天将慢病毒包装细胞293T接种于60mm细胞培养皿以使第二天细胞密度达到60％～70％。

2)在293T细胞中以1:8:9的比例转染5μg包装质粒及病毒质粒分别为pVSVg:PSPAX2: shRNA(包含shControl及shGFPT1片段)。

3)转染8-12h后吸去培养基并加入3ml完全培养基。

4)转染后72h，将上清放入15ml离心管中，3000转离心10分钟，吸取上清并用0.45μm 的滤膜过滤，得到所需病毒(后续实验凡是接触过病毒液的吸管都要用84消毒液清洗)。

靶细胞感染与筛选

1)感染前24h将靶细胞DU145接种于35mm dish或六孔板中以使第二天细胞密度达到 50％左右。

2)取1ml病毒液加入5μg/ml polybrene后加入到预感染的DU145/VCAP细胞中，并于 37℃、5％CO2培养箱内培养。

3)感染的DU145细胞培养8h～24h后吸去培养基，换用完全培养基转至10cm dish中，继续培养。

4)24h后用含1.5μg/ml puromycin的培养基换液，等细胞长成后验证目标基因的表达。

本发明公开一种新发现的可以对前列腺癌增殖产生影响的通路-GFPT1调控AMPK磷酸化的通路。具体采用shRNA干扰技术在DU145细胞中干涉GFPT1，以达到激活AMPK 的活性，抑制细胞增殖的目的，经过结晶紫染色和蛋白免疫印迹实验检测证实，GFPT1的抑制能够激活AMPK通路抑制细胞增殖，从而达到有效治疗前列腺癌的目的。

附图说明

图1.DU145细胞中敲低表达GFPT1，用结晶紫染色检测细胞增殖变化。接种同样数量的细胞到6孔板后，在3、5、7、9天后分别用结晶紫染色测定DU145敲低GFPT1 表达的细胞增殖能力的变化(A)第9天染色结果(B)染色晾干后冰醋酸将结晶紫洗脱，测定590nm波长下的吸光值，绘制生长曲线，每个时间点每种样品3个生物学重复。

图2.DU145细胞敲低GFPT1表达，分别在2-DG处理4小时后，收取细胞裂解液，通过western blot实验，用AMPK磷酸化蛋白进行检测。通过Western Blot检测2-DG处理后，敲低GFPT1表达的DU145细胞中GFPT1、AMPK、P-AMPK、P-ACC的表达量。细胞经20mM 2-DG处理4h后收集蛋白进行检测，Vinculin作为内参。

具体实施方式

现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。慢病毒感染及细胞系筛选

1)转染前一天将慢病毒包装细胞293T接种于60mm细胞培养皿以使第二天细胞密度达到60％～70％。

2)在293T细胞中以1:8:9的比例转染5μg包装质粒及病毒质粒质粒分别为pVSVg:PSPAX2: shRNA(包含shControl及shGFPT1片段1及片段2)，序列如下。

shGFPT1片段1(sh1)的序列：GCTATGACTTCGAATCTGA

shGFPT1片段2(sh2)的序列：AGGCAAAGACAAGAAAGGA

3)转染8-12h后吸去培养基并加入3ml完全培养基。

4)转染后72h，将上清放入15ml离心管中，3000转离心10分钟，吸取上清并用0.45μm 的滤膜过滤，得到所需病毒(后续实验凡是接触过病毒液的吸管都要用84消毒液清洗)。

靶细胞感染与筛选

1)感染前24h将靶细胞DU145接种于35mm dish以使第二天细胞密度达到50％左右。取1ml病毒液加入5μg/ml polybrene后加入到预感染的DU145/VCAP细胞中，并于37℃、5％CO2培养箱内培养。

2)感染的DU145细胞培养8h～24h后吸去培养基，换用完全培养基转至10cm dish中，继续培养。

3)24h后用含1.5μg/ml puromycin的培养基换液，验证目标基因的表达。

通过Western Blot实验验证细胞系的建立

蛋白质样品的制备

1)配制RIPA蛋白裂解液(每个600mm的培养皿用100ul)加入蛋白酶抑制剂。

2)收集细胞，并用预冷的PBS清洗细胞，用配制好的蛋白裂解液将细胞吹散，将细胞移到离心管中，放入DNA混合仪中混匀，4℃30min。

3)将离心管放入离心机中，13000转4℃15min，将上清移至另一离心管中。

4)以BCA法测定蛋白浓度测浓度

空白对照：RIPA

混合不同浓度的BSA(0.125μg/μl,0.25μg/μl,0.5μg/μl,1μg/μl,2μg/μl)各20μl，制成标准品备用并稀释2μl的样品到18μl的RIPA。

BCA系统:A:B＝50:1比例配置测量的溶液，最终按照200μlBCA+20μl样品或者标准品，振荡后37℃孵育30min，用酶标仪测量蛋白浓度。

5)取所需质量的样品，加入5X SDS Loading buffer(含DTT 0.1M),并将混合物在95℃加热 10min使蛋白质变性。

免疫印迹技术(Western Blot)

1)将凝胶固定到电泳装置上后，加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液后，加样，在不加入样品的胶孔中加入等体积的1×SDS Loading buffer进行配平。

2)连接好电源后用80V电压跑胶，当样品经过浓缩胶到达分离胶时，将电压增大到120V 直至溴酚蓝接近凝胶末端然后结束电泳。

3)取出电泳好的凝胶，并切除外源及上层的积层胶。

4)转膜：将膜及4片滤纸剪成所需胶的大小。先将PVDF膜浸于甲醇中浸泡5分钟。按照顺序：正级-海绵+滤纸+膜+胶+滤纸+海绵-负极，将膜夹紧，每一层都要压平，防止产生气泡。

5)将组装好的夹子放入装有转膜缓冲液的电泳槽中，放入冰盒，转子后加盖，并将电泳槽外围加入冰水混合物后放在磁力搅拌器上接通电源。恒流400mA 2h。

6)将转好的膜放入TBST中洗涤5min，洗涤两次。

7)封闭：用TBST配置5％的脱脂牛奶并混匀，将PVDF膜浸泡在含5％脱脂牛奶的TBST 中，室温摇晃0.5-1h。

8)将膜放入TBST中洗涤5min，洗涤三次，将PVDF膜放在杂交袋中，再将用5％BSA稀释的一抗加入杂交袋中，轻轻赶走气泡，封口，4℃摇床过夜或者置于摇床上室温孵育 1-2h。

9)将PVDF膜取出，用TBST清洗3次，每次15min。

10)在膜上加上用TBST配置的5％脱脂牛奶稀释好的二抗，置于摇床上室温孵育2h。将膜用TBST清洗3次，每次15min。

11)将Thermo的发光液按1:1的比例将A、B液混合。用镊子夹起PVDF膜的边缘，用吸水纸吸去膜边缘多余水分，将其放在保鲜膜上，加入发光夜，避光孵育5分钟,曝光。

通过结晶紫染色检测细胞增殖

1)按3000细胞/孔的GFPT1低表达细胞数量接种到6孔板中

2)由接种后第3天开始，对一个时间点的细胞进行结晶紫染色(0.1％w/v结晶紫，溶剂为10％甲醇)，

3)每隔1-2天进行一次染色，待所有时间点进行完之后，用10％乙酸对结晶紫进行洗脱。

4)将洗脱液转移至96孔板中，用酶标仪测定每个样品洗脱液的590nm吸光值，对应时间点绘制生长曲线。GFPT1的低表达抑制肿瘤细胞的增殖(图1)

在AMPK激活剂处理条件下检测AMPK信号通路的变化

1)DU145背景下敲低表达和对照肿瘤细胞系按0.7X106细胞/皿的数量接种到6cm培养皿中，2)24小时细胞贴壁后，在培养基(gibco，DMEM，C11995500BT)中加入终浓度10mM的2-DG(2-deoxy-D-glucose，sigma，D8375)，与不加2-DG的对照组一起培养 4小时；

3)吸走培养基，加入1-2ml PBS(Hyclone，SH30256.01)洗去剩余培养基，吸走PBS，将细胞培养皿置于液氮中淬灭；

4)每个培养皿加入100-200μl的RIPA裂解液(CST，9806S)，用细胞刮铲将细胞刮下，

5)5)转移至1.5ml离心管中，4℃静止1小时，裂解细胞，4℃，12000rpm离心15min，吸取上清，获得细胞蛋白样品，按比例加入4X Loading Buffer(Takara，9173)，97℃变性10分钟；

6)对蛋白样品加入上样孔中进行SDS-PAGE电泳，

7)电泳结束后用湿转法将丙烯酰胺凝胶上的蛋白转印至0.45μm的PVDF膜上，

8)使用5％脱脂奶粉(BD，232100)孵育1-3小时进行封闭，

9)分别使用β-actin(Proteintech，20536-1-AP)，AMPKα(CST，5831)，p-AMPKαT72(CST，2535)，4℃孵育过夜，

10)用TBST buffer(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.1％Tween-20)洗PVDF膜三次，每次10min，加入溶于5％脱脂奶粉(BD，232100)的羊抗兔二抗(Millipore，AP-132-P)，室温反应1小时；

11)用TBST buffer(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.1％Tween-20)洗PVDF膜三次，每次10min，

12)使用ECL发光液(Tanon，180-501)进行化学发光反应，检测蛋白表达水平，证明GFPT1对于AMPK的磷酸化激活具有抑制作用(图2)；

图1：接种同样数量的细胞到6孔板后，在3、5、7、9天后分别用结晶紫染色测定DU145 敲低GFPT1表达的细胞增殖能力的变化(A)第9天染色结果(B)染色晾干后冰醋酸将结晶紫洗脱，测定590nm波长下的吸光值，绘制生长曲线，每个时间点每种样品3个生物学重复。

图2：通过Western Blot检测2-DG处理后，敲低GFPT1表达的DU145细胞中GFPT1、AMPK、P-AMPK、P-ACC的表达量。细胞经20mM 2-DG处理4h后收集蛋白进行检测，Vinculin作为内参。

实例1GFPT1促进肿瘤细胞增殖。

在DU145差异表达GFPT1的细胞中用结晶紫染色检测肿瘤细胞的增殖效率,十二孔板中接种3000个细胞,在第3、5、7、9天取出细胞进行结晶紫染色,拍照后用冰醋酸洗涤细胞,用酶标仪读取数值,绘制细胞的增殖曲线。如图1所示GFPT1低表达抑制细胞增殖。

实例2GFPT1调控AMPK磷酸化。

利用构建好的GFPT1差异表达的细胞系验证GFPT1对AMPK磷酸化的影响,将GFPT1差异表达及相应对照组的细胞，在AMPK活化的情况下(如加入2-DG处理),通过WesternBlot 利用AMPK抗体和AMPK Thr172位磷酸化抗体,及AMPK调控的ACC信号通路的抗体,观察细胞中AMPK蛋白、AMPK磷酸化及相应信号通路的变化趋势,证明GFPT1调控AMPK 信号通路如图2所示。

通过上述实验表明，GFPT1在肿瘤发生发展中具有重要的生物学功能并可以调节AMPK的磷酸化，因此GFPT1的低表达可以抑制前列腺癌的增长，有助于GFPT1的癌症诊断、预后、治疗、肿瘤标志物筛选等临床转化的应用。

Claims (6)

1.低表达GFPT1蛋白的DU145稳定细胞株的构建方法，其特征在于：以前列腺癌DU145细胞作为宿主细胞，通过慢病毒感染导致细胞中GFPT1蛋白的表达量下调来抑制肿瘤细胞的生长。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用于慢病毒包装的细胞293T接种于细胞培养皿60mm；

2)在293T细胞中以1:8:9的质量比例转染5μg包装质粒及病毒质粒质粒分别为pVSVg:PSPAX2:shRNA(包含shControl及shGFPT1片段)shGFPT1片段1(sh1)的序列：GCTATGACTTCGAATCTGA；shGFPT1片段2(sh2)的序列：AGGCAAAGACAAGAAAGGA；

3)转染8-12h后吸去培养基并加入完全培养基；

4)转染后48-72h，将上清放入离心管中，3000-4000转离心10-15分钟，吸取上清并用0.45μm的滤膜过滤，得到所需病毒；

5)感染前16-24h将靶细胞DU145/VCAP接种于细胞培养皿以使第二天细胞密度达到50％-60％，取1-2ml病毒液加入5-6μg/ml polybrene后加入到预感染的DU145/VCAP细胞中；

6)感染的DU145/VCAP细胞培养8h～24h后吸去培养基，换用完全培养基转至10cm dish中，继续培养；

7)用含1.5-2μg/ml puromycin的培养基换液对细胞进行筛选。

3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于：

8)通过免疫荧光及免疫共沉淀技术(Western)检测GFPT1的感染效率及表达量的变化；

9)十二孔板中接种3000个DU145低表达GFPT1细胞,在第3、5、7、9天取出细胞进行结晶紫染色,拍照后用冰醋酸洗涤细胞,用酶标仪读取数值,绘制细胞的增殖曲线。

4.一种权利要求1-3任一所述构建方法获得的DU145-shGFPT1稳转细胞系。

5.一种权利要求4所述的DU145-shGFPT1稳转细胞系的应用，其特征在于，将GFPT1的低表达调控AMPK的磷酸化；包括以下步骤：

1)将GFPT1低表达细胞0.5-1.5X106细胞/皿的数量接种到培养皿中，

2)12-24小时后，在培养基(gibco，DMEM，C11995500BT)中加入终浓度10-50mM的2-DG(2-deoxy-D-glucose)，继续培养1-24小时，

3)吸走培养基，加入1-2ml PBS(Hyclone，SH30256.01)洗去剩余培养基，吸走PBS，将细胞培养皿置于液氮中淬灭；

4)每个培养皿加入100-200μl的RIPA裂解液(CST，9806S)，破碎细胞，提取蛋白；

5)对蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，将凝胶上的蛋白转印至0.22μm的PVDF膜上；

6)利用β-actin，AMPKα，ACC，p-ACC S79特异抗体，通过Western Blot进行化学发光。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，通过干扰GFPT1来促进AMPK的磷酸化，能够抑制前列腺癌细胞的增殖。