CN109897824A - 以tipe2基因为靶点的肿瘤mdsc在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了以TIPE2基因为靶点的肿瘤MDSC在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用，其中，以TIPE2基因为靶点包括采用基因敲除、基因敲减或者化学药物降低TIPE2基因的表达。本申请的应用中，TIPE2基因缺失的肿瘤MDSC，一方面，能够预防并抑制肿瘤发生和生长，并且，能够抑制已有的肿瘤的生长速度；另一方面，能够增强抗肿瘤的免疫反应；可以用于制备肿瘤预防或治疗的新靶向药物。

Description

以TIPE2基因为靶点的肿瘤MDSC在制备预防或治疗肿瘤的药 物中的应用

技术领域

本申请涉及肿瘤靶向治疗领域，特别是涉及一种以TIPE2基因为靶点的肿瘤MDSC在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用。

背景技术

TIPE2，即肿瘤坏死因子α诱导的蛋白8-2，是TNFAIP8家族的一员。据报道，TIPE2是一个免疫负调控因子，选择性地高表达于胸腺、脾脏、淋巴结等免疫器官及炎症组织，对抑制炎症发生、维持免疫稳态具有关键性作用。TIPE2负调NF-κB和MAPK信号通路，抑制TCR介导的T细胞激活和TLR介导巨噬细胞先天免疫，起到抗炎的作用。其表达水平下调往往伴随着乙型肝炎、系统性红斑狼疮、糖尿病肾炎、实验性中风、儿童免疫性哮喘、动脉粥样硬化等炎症性疾病的发生。

髓系来源的抑制性细胞(缩写MDSC)是肿瘤微环境的主要组成部分。这类细胞的主要特点是具有强大的免疫抑制活性。在荷瘤宿主中，MDSC在骨髓中产生，然后迁移到外周淋巴器官和肿瘤中，有助于形成肿瘤微环境。最近的研究表明MDSC在肿瘤和外周淋巴器官中具有不同的功能和命运。髓系细胞的分化和功能异常是癌症的一个标志。MDSC能加速肿瘤进程，主要通过提高肿瘤细胞的存活、促进血管再生、促进肿瘤细胞侵袭至健康组织和加速转移来实现。

MDSC由骨髓(缩写BM)中共同的髓系祖细胞分化而来。MDSC的发育受到两类复杂的信号网络的调控。一类信号促进聚集这类未成熟髓系细胞，而另一类则提供病理性激活这类细胞的信号。肿瘤环境下骨髓髓系细胞组成被证实已经发生改变，这是因为大量研究表明在荷瘤宿主的骨髓中聚集了MDSC。MDSC的病理性激活是髓系细胞受到持续较低强度的肿瘤信号刺激的结果，其特征是具有相对较低的吞噬活性，持续产生活性氧簇(ROS)、一氧化氮(NO)和大量抗炎细胞因子。这与在清除细菌和病毒情况下髓系细胞的激活截然不同，清除细菌和病毒情况下的特征是：迅速激活吞噬功能，引发呼吸爆发，释放促炎细胞因子。炎症消失后，恢复正常的髓系发生。

MDSC具有与中性粒细胞和单核细胞不同的生化和基因组特征。这些特征包括：表达大量的NADPH氧化酶(Nox2)，导致增加产生超氧阴离子(O₂ ^-)、过氧化氢(H₂O₂)和过氧硝酸盐(PNT、ONOO^-)形式的活性氧簇(ROS)；上调表达精氨酸酶1(arg1)和一氧化氮合成酶2(nos2)基因，分别使精氨酸酶1(Arg1)和一氧化氮(NO)的产生量增加；上调激活转录调控因子C/EBPβ和STAT3；下调转录因子IRF8活性以及增加产生S100A8/9蛋白质。另外最近的研究也表明miR-142-3p也对MDSC具有特异性的调控作用。由于这些不同特征减弱了MDSC分化为包括巨噬细胞、树突状细胞和成熟的中性粒细胞在内的成熟髓系细胞的能力。过量产生的ROS、NO、Arg1和抑制性细胞因子决定了MDSC的免疫抑制活性。

MDSC来源于骨髓造血祖细胞和不成熟髓细胞，正常生理情况下能够分化发育为成熟的中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞，因此促进MDSC的分化成熟是靶向MDSC肿瘤免疫治疗的一项策略。而合理剔除已扩增及活化的MDSC更是尤为重要的治疗策略。因MDSC至今尚未有区别于IMC和成熟中性粒细胞的特异性表面标志，给MDSC靶向剔除策略带来困难。如Gr-1也表达在成熟中性粒细胞表面，抗Gr-1抗体清除MDSC的同时，功能性中性粒细胞也相应被清除，导致机体抗感染等免疫防御功能降低。因此，寻找新的既能有效限制MDSC免疫抑制功能，又能最大程度地降低其副作用的治疗靶点是临床上靶向MDSC的肿瘤免疫治疗应用成败的关键。

发明内容

本申请的目的是提供一种新肿瘤预防或治疗的靶点，以及该靶点在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种以TIPE2基因为靶点的肿瘤MDSC在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用；其中，以TIPE2基因为靶点包括采用基因敲除、基因敲减或者化学药物降低TIPE2基因的表达。

需要说明的是，本申请经过研究发现，TIPE2基因缺失的肿瘤MDSC，能够抑制新种植的肿瘤细胞的生长，具有预防肿瘤的效果；并且能够治疗并抑制已经存在的肿瘤细胞；因此，TIPE2基因缺失的肿瘤MDSC能够用于制备预防或治疗肿瘤的药物。其中TIPE2基因缺失可以通过基因敲除、基因敲减或者化学药物降低TIPE2基因的表达实现。

还需要说明的是，本申请的一种实现方式中，制备了TIPE2基因缺失的小鼠肺癌的肿瘤MDSC，即TIPE2基因确实的肺癌肿瘤MDSC，证实其能够有效的抑制肺癌肿瘤生长，具有很好的抗肺癌效果。可以理解，以TIPE2基因为靶点的肿瘤MDSC在制备预防或治疗肿瘤的药物时，采用相应的肿瘤MDSC即可制备治疗或预防相应肿瘤的药物，在此不做具体限定。

优选的，本申请的应用特别指，基于肿瘤MDSC进行细胞免疫疗法预防或治疗肿瘤。

本申请的另一方面公开了一种以TIPE2基因为靶点在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用；其中，以TIPE2基因为靶点包括采用基因敲除、基因敲减或者化学药物降低TIPE2基因的表达。

需要说明的是，本申请经过研究发现，TIPE2基因缺失其本身对于肿瘤有抑制作用，因此，可以TIPE2基因为靶点制备预防或治疗肿瘤的药物。

本申请的另一方面公开了一种TIPE2基因敲除的肿瘤MDSC。

本申请的另一方面公开了本申请的TIPE2基因敲除的肿瘤MDSC的制备方法，包括以下步骤，

采用皮下注射方式给TIPE2基因缺失的小鼠进行肿瘤细胞种植；

待种植的肿瘤细胞生长为肿瘤组织块后，从小鼠身上取下肿瘤组织块，采用酶混合液对肿瘤组织块进行消化，酶混合液包括胶原酶I、胶原酶IV、透明质酸酶和脱氧核糖核酸酶；其中，肿瘤细胞生长为肿瘤组织块一般在2-3周内，即种植肿瘤细胞后2-3周内即可采取肿瘤组织块；

消化完成后采用完全培养基终止消化，将肿瘤组织块置于细胞筛网上研磨，收集通过细胞筛网的组织研磨液；其中，采用完全培养基终止消化就是直接用完全培养基加满离心管即可终止消化；本申请的一种实现方式中，细胞筛网为70μm筛网，经过研磨后肿瘤细胞全部通过细胞筛网悬浮于组织研磨液中；

对组织研磨液进行4℃低速离心，获取细胞上清液，弃沉淀杂质；对细胞上清液进行4℃高速离心，收集沉淀细胞；其中，4℃低速离心是指在4℃下进行较低速度的离心，该离心速度下，细胞仍然悬浮在溶液中，而较大的杂质则离心沉淀被去除，本申请的一种实现方式中低速离心的速度为60g；4℃高速离心是指在4℃下进行较高速度的离心，该离心速度下，细胞被离心沉淀，用于去除上清液，本申请的一种实现方式中高速离心的速度为1260g；

将收集的沉淀细胞用RPMI 1640完全培养基重悬，采用小鼠肿瘤组织淋巴、单核巨噬、粒细胞分离液试剂盒对收集的沉淀细胞进行分离，具体的，将细胞的RPMI 1640完全培养基重悬液加入按照试剂盒配制的分离液液面上，1260g、25℃离心后，用吸管吸取并收集离心管中出现的两层环状的乳白色细胞层；其中，小鼠肿瘤组织淋巴、单核巨噬、粒细胞分离液试剂盒，本申请的一种实现方式中，具体采用的是购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司的LDS1090Z试剂盒，分离液液面或者梯度界面按照其说明书披露的常规方法制备，在此不做具体限定，1260g、25℃离心主要是为了达到更好的分离效果，该参数条件可以在试验允许的误差范围内调整；

采用PBS溶液洗涤所收集的乳白色细胞层，1260g，4℃离心，弃上清，再采用PBS重悬，获得PBS细胞悬液；本申请中，1260g，4℃离心，其中1260g的离心速度是为了使细胞沉淀，而又不至于破裂；4℃的离心温度主要是使细胞处在一个较低温度下，减缓其生长代谢，使其能够更稳定的存在；

采用流式抗体CD45/CD11b/Gr-1在4℃下，对PBS细胞悬液进行染色，并采用流式细胞仪分选CD45⁺CD11b⁺Gr-1⁺细胞，即获得TIPE2基因敲除的肿瘤MDSC。本申请的一种实现方式中，采用PBS重悬分选获得的细胞。其中，PBS即实验室常规使用的磷酸缓冲液。

优选的，在采用酶混合液对肿瘤组织块进行消化之前，还包括将肿瘤组织块剪成小块，然后再进行消化。可以理解，将肿瘤组织块剪成小块可以更好的的进行消化，提高消化的质量和效率。

优选的，酶混合液中含有50mg/mL的胶原酶I、50mg/mL的胶原酶IV、5mg/mL的透明质酸酶和1U/mL的脱氧核糖核酸酶。

优选的，肿瘤细胞种植中，采用的肿瘤细胞为LLC小鼠肺癌细胞。

优选的，肿瘤细胞种植中，种植肿瘤细胞的量为每只小鼠2×10⁶个肿瘤细胞。

优选的，从小鼠身上取下肿瘤组织块，具体包括，将脱颈处死的小鼠浸泡于75％酒精中，随后将小鼠放置于无菌超净台上，用手术剪刀和镊子取下肿瘤组织块。

本申请的再一面公开了本申请的TIPE2基因敲除的肿瘤MDSC在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用。

可以理解，本申请的TIPE2基因敲除的肿瘤MDSC具有很好的肿瘤抑制效果，因此，完全可以制备成相应的药物，用于预防或治疗肿瘤。其中，药物中还可以包括其它药学上可以接受的辅助成份或活性成份，在此不做具体限定。

由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：

本申请以TIPE2基因为靶点的肿瘤MDSC在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用，其中，TIPE2基因缺失的肿瘤MDSC，一方面，能够预防并抑制肿瘤发生和生长，并且，能够抑制已有的肿瘤的生长速度；另一方面，能够增强抗肿瘤的免疫反应；为肿瘤的预防或治疗提供了一种新的靶向药物。

附图说明

图1是本申请实施例中TIPE2基因敲除的肿瘤MDSC对野生型小鼠的原发性肿瘤的预防测试结果图；

图2是本申请实施例中TIPE2基因敲除的肿瘤MDSC对Tipe2^-/-型小鼠的原发性肿瘤的预防测试结果图；

图3是本申请实施例中TIPE2基因敲除的肿瘤MDSC对已经存在的肿瘤的治疗结果图；

图4是本申请实施例中TIPE2基因敲除的肿瘤MDSC增强抗肿瘤免疫反应的结果图。

具体实施方式

本申请在对MDSC进行研究的过程中发现一个新的治疗靶点，即TIPE2基因，通过研究证实，对TIPE2基因进行敲除降低TIPE2基因的表达，可以有效的抑制肿瘤增长，并增强抗肿瘤免疫反应，起到预防或治疗肿瘤的效果。可以理解，只要能够降低TIPE2基因的表达就可以抑制肿瘤增长，达到预防或治疗肿瘤的效果；因此，除了基因敲除以外，基因敲减或者化学药物只要可以降低TIPE2基因的表达，同样可以起到抑制肿瘤增长，达到预防或治疗肿瘤的效果。

此外，经过本申请研究证实，TIPE2基因敲除的肿瘤MDSC同样可以抑制肿瘤增长，并增强抗肿瘤免疫反应，起到预防或治疗肿瘤的效果。

下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

本例通过基因敲除手段获得TIPE2基因缺失的小鼠，采用皮下注射方式种植LLC小鼠肺癌细胞，在2-3周内，取相同数目的野生型和TIPE2基因缺失型肿瘤MDSC分别与LLC肿瘤细胞按照1:1比例混合，然后再次采用皮下注射方式种植到野生型和TIPE2基因缺失型小鼠皮下，以单独皮下注射方式种植LLC小鼠肺癌细胞组作为对照组，观察TIPE2缺陷的MDSC预防或治疗肿瘤的效果。另外以相同数目的野生型和TIPE2基因缺失型肿瘤MDSC治疗已经种植LLC小鼠肺癌细胞3天和6天的野生型小鼠，观察TIPE2缺陷的MDSC对已有肿瘤的治疗效果。其中，TIPE2缺陷的MDSC即TIPE2基因敲除的MDSC。详细如下：

试验1TIPE2基因敲除的MDSC预防或治疗肿瘤

1.肿瘤细胞种植

将购自ATCC的LLC小鼠肺癌细胞培养于DMEM完全培养基中，待获得足够数目的LLC细胞，本例具体的需要的LLC细胞量为2×10⁶/只小鼠剂量，采用皮下注射方式分别种植于野生型小鼠(缩写WT)和TIPE2基因缺失型小鼠(Tipe2^-/-)，待肿瘤生长2-3周，取相同数目的WT和Tipe2^-/-的肿瘤组织块，用于提取肿瘤MDSC。

其中，DMEM完全培养基包括：高糖DMEM+10％胎牛血清+1％青霉素和链霉素，均购自Hyclone公司。

2.肿瘤MDSC提取

将脱颈处死的小鼠浸泡于75％酒精中5分钟，随后将小鼠放置于无菌超净台上，用手术剪刀和镊子取下肿瘤组织块，放置于10cm培养皿中。用剪刀将肿瘤组织剪成小块，加入酶混合液10mL重悬于50mL离心管中，于震荡培养箱200转/分震荡消化45-60分钟，用完全培养基加满离心管终止消化。

将组织块悬液放在70μm细胞筛网上，细胞筛网购自BD Falcon公司，用5mL注射器手柄反复研磨，使细胞全部通过筛网滴到新的50mL离心管中，得到组织研磨液。弃去筛网，组织研磨液经60g，4℃离心5min，弃沉淀。将细胞上清经1260g，4℃离心10min，弃上清，将细胞沉淀用RPMI 1640完全培养基重悬。取15mL离心管按照小鼠肿瘤组织淋巴、单核巨噬、粒细胞分离液试剂盒说明书依次小心加入3mL的分离液1、2mL的分离液2、1mL的分离液3，制成体积比为3:2:1，体积总量与RPMI 1640完全培养基重悬的单细胞悬液体积相等的梯度界面。小鼠肿瘤组织淋巴、单核巨噬、粒细胞分离液试剂盒购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，产品编号LDS1090Z。

用吸管小心吸取细胞悬液样本加于梯度界面的分离液液面上，1260g，25℃离心30分钟，此时离心管中出现两层环状乳白色细胞层。用吸管吸取两层环状目的细胞层到新的15mL离心管中，往所得离心管中加入10mL PBS，混匀细胞。经1260g，4℃离心10min，弃上清，将细胞沉淀用PBS重悬。用购自BioLegend公司的流式抗体CD45/CD11b/Gr-1于4℃染色30分钟，然后上流式细胞仪分选CD45⁺CD11b⁺Gr-1⁺细胞，即获得的肿瘤MDSC。本例采用PBS按照1×10⁷/mL浓度重悬获得的肿瘤MDSC，置于冰上待用。

本例的流式细胞仪购自BD Bioscience公司。RPMI 1640完全培养基包括RPMI1640+10％胎牛血清+1％青霉素和链霉素，均购自Hyclone公司。酶混合液包括50mg/mL胶原酶I、50mg/mL胶原酶IV、5mg/mL透明质酸酶和1U/mL脱氧核糖核酸酶，均购自Sigma公司。

3.肿瘤MDSC对原发性肿瘤的预防测试

取1×10⁶的WT肿瘤MDSC，即没有进行TIPE2基因敲除的小鼠种植LLC小鼠肺癌细胞的肿瘤组织块中提取的肿瘤MDSC；以及1×10⁶的Tipe2^-/-肿瘤MDSC，即TIPE2基因敲除的小鼠种植LLC小鼠肺癌细胞的肿瘤组织块中提取的肿瘤MDSC，也就是本例的TIPE2基因敲除的肿瘤MDSC。将1×10⁶的WT肿瘤MDSC和1×10⁶的Tipe2^-/-肿瘤MDSC分别与1×10⁶的LLC肿瘤细胞按照1:1比例混合。然后再次采用皮下注射方式种植到新一组的WT和Tipe2^-/-小鼠皮下，以单独皮下注射方式种植1×10⁶的LLC小鼠肺癌细胞组作为对照组，采用直尺测量记录的手段，每天记录小鼠肿瘤长直径和短直径，按照肿瘤体积公式计算肿瘤体积，并统计肿瘤体积变化，以GraphPad 6.0软件进行数据分析。

其中，肿瘤体积(mm³)＝短直径²×长直径×1/2。

本例分别测试并统计了各组试验小鼠种植0天、3天、6天、8天、11天、14天和16天的肿瘤体积；测试结果如图1和图2所示，其中图1是三组试验对WT小鼠的测试结果图，图2是三组试验对Tipe2^-/-小鼠的测试结果图；图1和图2中，横坐标是种植后培养天数，纵坐标是肿瘤体积。图1中，曲线是Tipe2^-/-肿瘤MDSC和LLC肿瘤细胞的混合细胞种植到WT小鼠后的肿瘤体积增长曲线，“■”曲线是WT肿瘤MDSC和LLC肿瘤细胞的混合细胞种植到WT小鼠后的肿瘤体积增长曲线，“●”曲线是单独的LLC肿瘤细胞种植到WT小鼠后的肿瘤体积增长曲线。图2中，曲线是Tipe2^-/-肿瘤MDSC和LLC肿瘤细胞的混合细胞种植到Tipe2^-/-小鼠后的肿瘤体积增长曲线，“□”曲线是WT肿瘤MDSC和LLC肿瘤细胞的混合细胞种植到Tipe2^-/-小鼠后的肿瘤体积增长曲线，“○”曲线是单独的LLC肿瘤细胞种植到Tipe2^-/-小鼠后的肿瘤体积增长曲线。图1的结果显示，对于野生型小鼠，共注射LLC+Tipe2^-/-肿瘤MDSC，较单独注射LLC具有明显的抑制肿瘤生长效果，而共注射LLC+WT肿瘤MDSC较单独注射LLC不具有抑制肿瘤生长效果。而对于TIPE2基因缺失型小鼠，如图2所示，共注射LLC+Tipe2^-/-肿瘤MDSC与单独注射LLC一样具有相同的抑制肿瘤生长效果，而共注射LLC+WT肿瘤MDSC较单独注射LLC反而具有促进肿瘤生长的作用。以上结果说明第一，TIPE2基因敲除的肿瘤MDSC具有抗肿瘤的效果，能有用于预防或治疗肿瘤；第二，通过TIPE2基因敲除，抑制TIPE2基因表达，除同时种植LLC+WT肿瘤MDSC的情况以外，能够抑制肿瘤生长，具有抗肿瘤的效果，能有用于预防或治疗肿瘤。

试验2 TIPE2基因敲除的MDSC对已有肿瘤的治疗试验

1.肿瘤MDSC提取

将LLC小鼠肺癌细胞培养于DMEM完全培养基，待获得足够数目的LLC细胞，即2×10⁶/只小鼠剂量，采用皮下注射方式分别种植于野生型小鼠(缩写WT)和TIPE2基因缺失型小鼠(缩写Tipe2^-/-)，待肿瘤生长2-3周时间，取相同数目的WT和Tipe2^-/-的肿瘤组织块进行肿瘤MDSC提取。

肿瘤MDSC提取的具体方法同试验1。

2.肿瘤MDSC对已有肿瘤的治疗试验

将新一组WT小鼠采用皮下注射方式种植2×10⁶/只小鼠剂量的LLC肿瘤，于第3天和第6天采用尾静脉注射方式，一组注射3×10⁶的WT肿瘤MDSC，另一组注射3×10⁶的Tipe2^-/-肿瘤MDSC，另外，设置单独荷载LLC肿瘤的WT小鼠组作为对照组，采用直尺测量记录的手段，每天记录小鼠肿瘤长直径和短直径，按照试验1相同的方法计算并统计肿瘤体积。

本例分别测试并统计了各组试验小鼠种植0天、3天、6天、8天、11天、14天和16天的肿瘤体积，其中一组分别在第3天和第6天注射有WT肿瘤MDSC，另一组分别在第3天和第6天注射有Tipe2^-/-肿瘤MDSC，另外，还有一组单独荷载LLC肿瘤作为对照；结果如图3所示。图3中，横坐标是种植后培养天数，纵坐标是肿瘤体积，曲线是在种植LLC的WT小鼠中注射Tipe2^-/-肿瘤MDSC后的肿瘤体积增长曲线，“■”曲线是在种植LLC的WT小鼠中注射WT肿瘤MDSC后的肿瘤体积增长曲线，“●”曲线是单独荷载LLC肿瘤的对照组WT小鼠的肿瘤体积增长曲线。图3的结果显示，注射TIPE2基因敲除的肿瘤MDSC较单独荷载LLC具有明显的抑制肿瘤生长的效果，而注射野生型肿瘤MDSCs较单独荷载LLC不具有抑制肿瘤生长作用。以上结果说明TIPE2基因敲除的肿瘤MDSC具有治疗已有肿瘤的效果。

试验3TIPE2基因敲除的MDSC增强抗肿瘤免疫反应的测试

1.肿瘤MDSC提取

将LLC小鼠肺癌细胞培养于DMEM完全培养基，待获得足够数目的LLC细胞，即2×10⁶/只小鼠剂量，采用皮下注射方式分别种植于野生型小鼠(缩写WT)和TIPE2基因缺失型小鼠(缩写Tipe2^-/-)，待肿瘤生长17天后，取相同数目的WT和Tipe2^-/-的肿瘤组织块进行肿瘤MDSC提取。

肿瘤MDSC提取的具体方法参考试验1，所不同的是，最后流式细胞仪分选获得的细胞采用RPMI 1640完全培养基按照1×10⁶/mL的浓度重悬后，置于冰上待用，试验1是采用PBS重悬；其余与试验1相同。

2.CD8⁺T细胞

将同种异体C57BL/6小鼠脾脏来源的CD8⁺T细胞加入1μM的CFSE，于37℃孵育10-15分钟，加入5倍体积的冷的RPMI 1640完全培养基，冰上放置5分钟终止染色，2500转/分钟离心5-10分钟。用RPMI 1640完全培养基洗涤两次，最后用RPMI 1640完全培养基调整细胞浓度达2×10⁵/孔，铺板于96孔板。

其中，CD8⁺T细胞是通过无菌流式分选CD45⁺CD3⁺CD8⁺细胞获得。CFSE即琥珀酰亚胺酯，购自Invitrogen公司，货号C34570。

3.增强抗肿瘤免疫反应的测试

采用抗CD3/CD28磁珠预刺激染色上CFSE的CD8⁺T细胞，然后按照如下比例，一组与Tipe2^-/-肿瘤MDSC混合共培养，一组与WT肿瘤MDSC混合共培养。

按照肿瘤MDSC：预刺激染色CD8⁺T细胞按照1：2的比例混合共培养，具体的，1×10⁵肿瘤MDSC：2×10⁵预刺激染色CD8⁺T细胞；

按照肿瘤MDSC：预刺激染色CD8⁺T细胞按照1：4的比例混合共培养，具体的，0.5×10⁵肿瘤MDSC：2×10⁵预刺激染色CD8⁺T细胞；

按照肿瘤MDSC：预刺激染色CD8⁺T细胞按照1：8的比例混合共培养，具体的，0.25×10⁵肿瘤MDSC：2×10⁵预刺激染色CD8⁺T细胞。

另外，以未刺激的CD8⁺T细胞作为阴性对照，以单独抗CD3/CD28磁珠预刺激的CD8⁺T细胞作为阳性对照。培养72小时后通过BD Biosciences公司的流式细胞术检测CD8⁺T细胞增殖情况，并用BD Biosciences公司的FlowJo7.6软件分析数据。

结果如图4所示，图4中，纵坐标是CD8⁺T细胞增殖量，横坐标依序阴性对照、阳性对照、肿瘤MDSC与预刺激染色CD8⁺T细胞1:2的组、1:4的组和1:8的组，其中，Unsti组为阴性对照，Sti组为阳性对照，WT组是WT肿瘤MDSC与预刺激染色CD8⁺T细胞不同比例共混后的培养结果，Tipe2^-/-组是Tipe2^-/-肿瘤MDSC与预刺激染色CD8⁺T细胞不同比例共混后的培养结果。图4的结果显示，相较于阳性对照组，WT肿瘤MDSC能够显著性的在1:2和1:4的比例共培养条件下抑制CD8⁺T细胞增殖，而在1:8比例共培养条件下不能抑制CD8⁺T细胞增殖；与此不同都是，TIPE2基因敲除的肿瘤MDSC在1:2、1:4和1:8比例共培养条件下均不会抑制CD8⁺T细胞增殖。另外，相较于WT肿瘤MDSC，TIPE2基因敲除的肿瘤MDSC在1:2、1:4共培养条件下具有更高水平的CD8⁺T细胞增殖。这说明TIPE2基因敲除的肿瘤MDSC具有促进CD8⁺T细胞增殖的能力，增强了抗肿瘤免疫反应。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (10)

1.以TIPE2基因为靶点的肿瘤MDSC在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用；所述以TIPE2基因为靶点包括采用基因敲除、基因敲减或者化学药物降低TIPE2基因的表达。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于；所述应用包括基于所述肿瘤MDSC进行细胞免疫疗法预防或治疗肿瘤。

3.以TIPE2基因为靶点在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用；所述以TIPE2基因为靶点包括采用基因敲除、基因敲减或者化学药物降低TIPE2基因的表达。

4.一种TIPE2基因敲除的肿瘤MDSC。

5.根据权利要求4所述的TIPE2基因敲除的肿瘤MDSC的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，

采用皮下注射方式给TIPE2基因缺失的小鼠进行肿瘤细胞种植；

待种植的肿瘤细胞生长为肿瘤组织块后，从小鼠身上取下肿瘤组织块，采用酶混合液对肿瘤组织块进行消化，所述酶混合液包括胶原酶I、胶原酶IV、透明质酸酶和脱氧核糖核酸酶；

消化完成后采用完全培养基终止消化，将肿瘤组织块置于细胞筛网上研磨，收集通过细胞筛网的组织研磨液；

对所述组织研磨液进行4℃低速离心，获取细胞上清液，弃沉淀杂质；对细胞上清液进行4℃高速离心，收集沉淀细胞；

将收集的沉淀细胞用RPMI 1640完全培养基重悬，采用小鼠肿瘤组织淋巴、单核巨噬、粒细胞分离液试剂盒对收集的沉淀细胞进行分离，具体的，将细胞的RPMI 1640完全培养基重悬液加入按照试剂盒配制的分离液液面上，1260g、25℃离心后，用吸管吸取并收集离心管中出现的两层环状的乳白色细胞层；

采用PBS溶液洗涤所收集的乳白色细胞层，1260g，4℃离心，弃上清，再采用PBS重悬，获得PBS细胞悬液；

采用流式抗体CD45/CD11b/Gr-1在4℃下，对PBS细胞悬液进行染色，并采用流式细胞仪分选CD45⁺CD11b⁺Gr-1⁺细胞，即获得TIPE2基因敲除的肿瘤MDSC。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述酶混合液中含有50mg/mL的胶原酶I、50mg/mL的胶原酶IV、5mg/mL的透明质酸酶和1U/mL的脱氧核糖核酸酶。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于：所述肿瘤细胞种植中，采用的肿瘤细胞为LLC小鼠肺癌细胞。

8.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于：所述肿瘤细胞种植中，种植肿瘤细胞的量为每只小鼠2×10⁶个肿瘤细胞。

9.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于：所述从小鼠身上取下肿瘤组织块，具体包括，将脱颈处死的小鼠浸泡于75％酒精中，随后将小鼠放置于无菌超净台上，用手术剪刀和镊子取下肿瘤组织块。

10.根据权利要求4所述的TIPE2基因敲除的肿瘤MDSC在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用。