CN109876144A - Emc8基因抑制剂在制备治疗胃癌药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及EMC8基因抑制剂在制备治疗胃癌药物中的用途。本发明发现EMC8基因可作为胃癌治疗作用靶点；EMC8基因抑制剂可抑制胃癌细胞的增殖速率、改变胃癌细胞周期分布、促进胃癌细胞凋亡，抑制胃癌细胞克隆形成。本发明将EMC8基因抑制剂应用于治疗胃癌药物的制备，从基因水平上抑制EMC8基因的活性，或者抑制EMC8基因的转录或表达，制备的治疗胃癌药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质，EMC8基因抑制剂是唯一的有效成分或者有效成分之一，药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

Description

EMC8基因抑制剂在制备治疗胃癌药物中的用途

技术领域

本发明涉及EMC8基因抑制剂在制备治疗胃癌药物中的用途，属于生物医药研究领域。

背景技术

癌症是严重危害人类健康的重大疾病之一，其中胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤，其发病率占全球每年新发肿瘤的前五位，死亡率同样高居前五位。胃癌主要起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，在我国各种恶性肿瘤中发病率位居前列，胃癌发病有明显的地域性差别。在全球范围内，我国发病率要高于欧美，在我国境内，西北与东部沿海地区胃癌发病率明显高于南方地区。胃癌的发生与多种因素有关，近年来由于饮食结构的改变、生活习惯的改变、工作压力增大以及幽门螺杆菌的感染等原因，使得胃癌发病率高居不下，且胃癌呈现年轻化倾向。胃癌可发生于胃的任何部位，其中大约半数以上发生于胃窦部，胃小弯、胃大弯及前后壁均可受累。绝大多数胃癌属于腺癌。胃癌发病率高，生存时间短，且具体发病机制目前尚不清楚，导致胃癌存在治疗困难、传统药物疗效差及靶向药物缺乏的特点。因此，进一步阐明胃癌的分子基础，以寻找新的治疗靶点，及开发新的药物，是提高胃癌防治有效率的关键。

目前，EMC8基因(ER membrane protein complex subunit 8)在胃癌及其他恶性肿瘤中的作用还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了EMC8基因抑制剂在制备治疗胃癌药物中的用途。

本发明的技术方案如下：

本发明的第一方面，提供了EMC8基因抑制剂在制备治疗胃癌药物中的用途。

根据本发明，所述EMC8基因来源于人，其Genbank登录号为NM_006067。

根据本发明优选的，所述EMC8基因抑制剂是指以EMC8基因为作用靶标制备或筛选得到的对EMC8基因具有抑制效果的分子或制剂。所述抑制效果包括但不限于：抑制EMC8基因活性，或者抑制EMC8基因转录或表达。

根据本发明优选的，所述EMC8基因抑制剂为核酸分子、核酸构建体、慢病毒、抗体或小分子化合物。

进一步优选的，所述核酸分子为双链RNA或shRNA。

进一步优选的，所述核酸分子作用的EMC8基因靶序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3任一序列所示；最优选的，所述核酸分子作用的EMC8基因靶序列如SEQ IDNO：3所示。

进一步优选的，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10任一序列所示；最优选的，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示。

根据本发明，所述治疗胃癌药物具有以下功用之一种或多种：抑制胃癌细胞的增殖速率，改变胃癌细胞周期分布，促进胃癌细胞凋亡，抑制胃癌细胞克隆形成。

根据本发明优选的，所述治疗胃癌药物必然包括EMC8基因抑制剂，并以EMC8基因抑制剂作为前述功用的唯一有效成分或者有效成分之一。

根据本发明，所述胃癌为胃腺癌。

本发明第二方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子为EMC8基因抑制剂，可以降低胃癌细胞中EMC8基因的表达，包含：

a)双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与EMC8基因杂交的核苷酸序列；或者

b)shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与EMC8基因杂交的核苷酸序列。

根据本发明，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与EMC8基因靶序列相同；所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与EMC8基因靶序列相同。

进一步，所述茎环结构的序列可选自以下任意一种：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU和CCACACC。

更进一步的，所述EMC8基因靶序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3任一序列所示；最优选的，所述EMC8基因靶序列如SEQ ID NO：3所示。

根据本发明优选的，所述双链RNA为小干扰RNA(siRNA)。

根据本发明优选的，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10任一序列所示；最优选的，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示。

根据本发明，所述shRNA经酶切加工后可成为siRNA，进而起到特异性沉默胃癌细胞中EMC8基因表达的作用。

本发明的第三方面，提供一种核酸构建体，所述核酸构建体为EMC8基因抑制剂，含有编码前述核酸分子中shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。

根据本发明优选的，所述核酸构建体是将编码前述核酸分子中shRNA的基因片段克隆入载体获得的。

根据本发明优选的，所述载体为慢病毒载体GV493。

根据本发明优选的，所述核酸构建体还含有启动子序列和/或编码肿瘤细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列；进一步优选的，所述可被检测的标记物为绿色荧光蛋白(GFP)。

所述EMC8基因干扰核酸构建体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞，进而转录出本发明所述的shRNA，通过酶切加工等步骤，最终获得siRNA，用于特异性沉默EMC8基因的表达。

本发明第四方面，提供一种慢病毒，所述慢病毒为EMC8基因抑制剂，由前述核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。

本发明第五方面，提供一种治疗胃癌药物，包括上述EMC8基因抑制剂的一种或多种。

根据本发明优选的，所述EMC8基因抑制剂为治疗胃癌药物的唯一有效成分或有效成分之一。

所述治疗胃癌药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质或气雾的物质形式。其中，所述药物的剂型为临床上或药学上可接受的任一剂型。例如，但不限于，所述药物的剂型为粉剂、注射液、胶囊、口服液、片剂、滴丸、喷剂。

所述治疗胃癌药物根据不同剂型的需要，还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料，所述药学上可接受的载体或辅料是糖类，如乳糖、蔗糖和葡萄糖；淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、甲基纤维素和乙基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；固体润滑剂，如硬脂酸镁和硬脂酸；硫酸钙；植物油，如棉籽油、花生油、芝麻油、菜籽油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醉、山梨糖醇、甘油、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；压片剂、稳定剂；调味剂；防腐剂；抗氧化剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。

本发明第六方面，提供一种胃癌联合治疗药物组合，包括上述一种或几种EMC8基因抑制剂和至少一种其他治疗胃癌药物。

根据本发明优选的，所述胃癌联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

i)将EMC8基因抑制剂和其他治疗胃癌药物分别制成独立的制剂；

ii)将EMC8基因抑制剂和其他治疗胃癌药物配置成复方制剂。

当EMC8基因抑制剂和其他治疗胃癌药物为独立制剂时，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同，当其他治疗胃癌药物为抗体时，一般采用胃肠外给药型；当其他治疗胃癌药物为化学药物时，给药形式可以比较丰富，可以是胃肠道给药亦可以是非胃肠道给药，一般推荐针对各化学药物的已知给药途径给药。当EMC8基因抑制剂和其他治疗胃癌药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，EMC8基因可作为胃癌治疗作用靶点。EMC8基因抑制剂可抑制胃癌细胞的增殖速率、改变胃癌细胞周期分布、促进胃癌细胞凋亡，抑制胃癌细胞克隆形成，为治疗胃癌药物开辟新的方向。

本发明将EMC8基因抑制剂应用于治疗胃癌药物的制备，从基因水平上抑制EMC8基因的活性，或者抑制EMC8基因的转录或表达，制备的治疗胃癌药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质，EMC8基因抑制剂是唯一的有效成分或者有效成分之一，药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

附图说明

图1：胃腺癌细胞增殖数量的增殖曲线；

图2：胃腺癌细胞增殖倍数的增殖曲线；

图3：Celigo连续5天记录胃腺癌细胞增殖图片；

图4：GV493慢病毒载体图谱；

图5：EMC8基因表达的敲减效率检测柱状图；

图6：MMT法检测EMC8基因干扰慢病毒对胃腺癌细胞增殖数量的影响；

图7：MMT法检测EMC8基因干扰慢病毒对胃腺癌细胞增殖倍数的影响；

图8：流式细胞凋亡检测EMC8基因干扰慢病毒对胃腺癌细胞凋亡率的影响；

图9：细胞克隆形成法检测EMC8基因干扰慢病毒对细胞克隆形成能力的影响，其中左边为KD组；右边为NC组；

图10：细胞克隆形成法检测EMC8基因干扰慢病毒感染后细胞克隆柱状图；

图11：EMC8基因干扰慢病毒对胃腺癌细胞的细胞周期的影响。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

本发明对GEO和TCGA等数据库中胃癌基因相关信息进行开发，并进一步查阅大量文献，同时结合表达谱差异分析、高通量细胞筛选技术等功能基因筛选方法，最终，成功筛选出可能的促进胃癌转化的特异性癌基因EMC8基因，且该基因迄今为止尚未在胃癌领域得到进一步研究及开发。

依据上述研究结果，进一步探索，开发针对该基因的相应技术及新方法，能给胃癌患者的诊断治疗提供更多选择。

实验材料

表1主要试剂及来源

表2主要仪器及来源

实施例1 EMC8基因对胃癌细胞增殖的影响

1.1目的细胞

实施例1选择的目的细胞如表3所示，为AGS细胞(属于人胃腺癌细胞)，培养基为完全培养基，即添加10％胎牛血清的F12培养基。

表3实施例1目的细胞及其培养基

目的细胞	完全培养基	96孔板细胞数
			AGS细胞(胃腺癌细胞)	F12+10％FBS	1500～2000个/孔

1.2目的病毒

为保证基因干扰效率，实施例1针对EMC8基因设计3个RNA干扰靶序列，3个RNA干扰靶序列如表4所示，并将携带不同靶序列的3个质粒载体等比例混合进行慢病毒包装，从而确保病毒感染细胞后EMC8基因的敲减效率，同时将绿色荧光蛋白(GFP)基因包装进慢病毒中。

其中，质粒载体为GV493(该载体为吉凯基因公司提供)，对照组插入序列：TTCTCCGAACGTGTCACGT(SEQ ID NO：4)。

表4 EMC8基因的靶序列

分组标记	靶点	靶序列	编号
				KD1	靶点1	GAGTAAAGGATGCCAGTCCAA	SEQ ID NO：1
KD2	靶点2	GCTCGTGGATTTCGATAACCA	SEQ ID NO：2
				KD3	靶点3	GTGGCTCTCACCCTGATTGAT	SEQ ID NO：3

包装成的慢病毒如表5所示，Ctrl为阴性对照组，其病毒不含靶序列，含有SEQ IDNO：4所示的对照序列，EMC8为实验组，其病毒含有如表4所示的3个EMC8基因靶序列。

表5实施例1包装的慢病毒

1.3实验方法

培养生长状态良好的目的细胞，病毒感染前一天将细胞分入96孔板培养，感染当天按组别加入不同慢病毒颗粒进行目的细胞的感染实验。感染2～3d，荧光显微镜下观察细胞GFP表达情况(荧光率需达到70～90％)，待孔内细胞密度达到70～90％时收集细胞，通过全视野细胞自动分析仪(Celigo)识别带绿色荧光的细胞并拍照(即读板)。然后通过软件对拍照的图像进行分析处理，计算孔板中不同组别含有的细胞数目。连续读板5天后，即可绘制出细胞生长曲线图，从而呈现出细胞增殖状况。

1.4实验步骤

1.4.1准备目的细胞

1.4.1.1细胞复苏

(1)从液氮罐中取出细胞冻存管；

(2)迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻；

(3)完全解冻后，1300rpm，离心约3min；

(4)75％(v/v)酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜；

(5)吸去冻存液上清，然后加入1mL新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3mL完全培养基的规格为6cm的培养皿中，轻轻晃匀后置于37℃、5％CO₂培养箱培养；

(6)次日更换一次完全培养基后再继续培养。

1.4.1.2细胞传代

(1)将上述继续培养生长约90％汇合度的细胞进行传代；

(2)弃去旧培养液，加入2mL灭菌的D-Hanks溶液，洗涤细胞，然后弃去该溶液；

(3)加入0.5mL胰酶消化液，37℃消化约1-2min，直到细胞完全消化下来；

(4)加入1mL完全培养基，吹打数次，将壁上的细胞冲洗下来；

(5)混匀细胞后分至两个新的规格为6cm的培养皿中，补足完全培养基至4mL，继续培养至对数生长期。

1.4.2.目的细胞慢病毒感染

(1)将处于对数生长期的目的细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液；

(2)将细胞悬液接种于96孔板中，细胞数约为1500～2000个/孔，37℃、5％CO₂培养箱培养待细胞融合度达到约20～30％；

(3)根据目的细胞的MOI值，加入上述包装成的慢病毒；

(4)12h后观察细胞状态，并更换培养基；

(5)感染2～3天后观察慢病毒上报告基因GFP的表达情况，荧光率一般应当达到70～90％，将细胞继续培养至细胞融合度达到70～90％时，收集细胞继续后续实验。

1.4.3 Celigo细胞计数检测细胞增殖

(1)将上述收集到的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数；

(2)将细胞悬液接种于96孔板中，细胞数为1500～2000个/孔，每组接种3复孔，培养体系为100μL/孔，应当注意接种过程中确保每孔加入细胞数目一致，37℃、5％CO₂培养箱培养；

(3)从接种后第二天开始，每天Celigo检测读板一次，连续检测读板5天；

(4)通过调整输入参数，准确计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞数量；然后对数据进行统计绘图，绘出5天的细胞增殖曲线。

1.5实验结果

1.5.1细胞生长情况

根据细胞被感染后所表达的绿色荧光蛋白信号，可对细胞拍照并进行计数，然后根据细胞数量绘制曲线观察其增殖情况。细胞增殖曲线如图1和图2所示，结果表明，阴性对照组(Ctrl)表现出正常的细胞增殖趋势，实验组(EMC8)的细胞增殖被显著抑制，说明实验组慢病毒携带的EMC8基因靶序列可以与AGS细胞中的EMC8基因靶序列互补结合，降低胃癌细胞中的EMC8基因的表达水平，显著抑制胃癌细胞的增殖(P<0.05)。

Celigo连续5天在同一时间点对目标96孔板进行扫描读板，获得的扫描结果如图3所示，结果表明，在第5天时，实验组(EMC8)的AGS细胞数量明显少于对照组(Ctrl)。

1.5.2增殖倍数变化(Ctrl/EMC8组)

表6细胞相对于第一天的增殖倍数

如表6所示，Ctrl组细胞增殖正常，第五天相比第一天的增殖倍数达到7.69倍；EMC8组(实验组)细胞增殖显著减缓，第五天相比第一天的增殖倍数仅1.88倍。

表7实验组与阴性对照组(Ctrl组)的第五天增殖倍数的比值

基因	组别	增殖倍数	P值(Ctrl vs实验组)
				—	Ctrl	1	-
EMC8	EMC8	4.08	1.32719×10-<sup>5</sup>

以增殖检测第五天Ctrl组(阴性对照组)细胞计数倍数值比实验组细胞计数倍数值的增殖倍数值为判断依据。当增殖倍数值≥2时，即该实验组细胞相比Ctrl组细胞，细胞增殖显著减缓，从而推断该实验组慢病毒针对的目的基因为增殖相关的阳性基因。如表7所示，Ctrl组细胞增殖正常，EMC8组细胞增殖显著减缓，Ctrl组与EMC8组相比第五天增殖倍数的比值为4.08，统计学结果表明P<0.001，说明抑制EMC8基因具有显著抑制AGS细胞增殖的作用。

由以上可知，降低胃腺癌细胞中EMC8基因的转录水平，可抑制胃腺癌细胞增殖。

实施例2 EMC8基因抑制剂shRNA的筛选及干扰慢病毒的构建

2.1针对EMC8基因干扰慢病毒的制备：

2.1.1EMC8基因靶序列：

EMC8基因的靶序列如表4所示。

2.1.2干扰慢病毒载体

载体名称：GV493(该载体为吉凯基因公司提供)

元件顺序：hU6-MCS-CBh-gcGFP-IRES-puromycin

对照编号：CON313

对照组插入序列：TTCTCCGAACGTGTCACGT(SEQ ID NO：4)

载体图谱如图4所示。

2.1.3根据EMC8基因靶序列设计shRNA干扰序列，合成寡核苷酸链

设计的shRNA干扰序列如表8所示，根据该序列合成shRNA寡核苷酸链，其中，EMC8-RNAi(70235-11)-a和EMC8-RNAi(70235-11)-b合成寡核苷酸链EMC8-RNAi(70235-11)，EMC8-RNAi(70236-13)-a和EMC8-RNAi(70236-13)-b合成寡核苷酸链EMC8-RNAi(70236-13)，EMC8-RNAi(70237-1)-a和EMC8-RNAi(70237-1)-b合成寡核苷酸链EMC8-RNAi(70237-1)。

表8 shRNA的核苷酸序列

分别将寡核苷酸链EMC8-RNAi(70235-11)、EMC8-RNAi(70236-13)、EMC8-RNAi(70237-1)构建至GV493载体中，与包装辅助载体质粒pHelper 1.0和pHelper 2.0(辅助载体质粒可购自商业公司，本次研究购自吉凯基因公司)，共转染293T细胞，在转染48-72h获得未纯化的细胞上清，并对上清进行纯化浓缩获得高滴度的慢病毒，获得的慢病毒分别为LV-EMC8-RNAi(70235-11)、LV-EMC8-RNAi(70236-13)、LV-EMC8-RNAi(70237-1)，慢病毒滴度如表9所示。同时，将SEQ ID NO：4所述的序列构建至GV493载体中，按照上述方法转染293T细胞后获得对照组慢病毒。

表9构建的慢病毒滴度

病毒名称	滴度(TU/mL)
		LV-EMC8-RNAi(70235-11)	8×10<sup>8</sup>
LV-EMC8-RNAi(70236-13)	8×10<sup>8</sup>
		LV-EMC8-RNAi(70237-1)	6×10<sup>8</sup>

病毒滴度采用实时定量PCR方法(q-PCR)检测得到。

2.2 q-PCR检测目的基因敲减效率

针对EMC8基因进行引物设计。抽提对照组以及干扰慢病毒感染组细胞，分别抽提RNA，反转录获得cDNA，以GAPDH为内参，通过q-PCR检测EMC8基因的mRNA表达情况。

2.2.1实验步骤

2.2.1.1总RNA抽提

(1)按照实施例1中1.4.1～1.4.2进行目的细胞的培养与慢病毒感染，所述慢病毒为上述制备的LV-EMC8-RNAi(70235-11)、LV-EMC8-RNAi(70236-13)、LV-EMC8-RNAi(70237-1)和插入目的序列为SEQ ID NO：4的对照组慢病毒，分别记为KD1组、KD2组、KD3组、NC组，收集细胞，2000rpm离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1mL Trizol，充分混匀后室温静置5min，然后转移至新的1.5mL EP管中；

(2)每管加入200μL氯仿，上下颠倒EP管15s，室温静置10min；

(3)4℃、12800rpm，离心15min；

(4)吸取上层液体移至新的1.5mL EP管，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后4℃静置10min；

(5)4℃、12800rpm离心12min后，弃上清；

(6)加入1mL、75％(v/v)乙醇(用DEPC水新鲜配制)，洗涤沉淀；

(7)4℃、11800rpm离心5min，弃去大部分上清；

(8)4℃、11800rpm再次离心5min，弃去上清，室温干燥；

(9)待RNAQ沉淀基本透明时，加入RNase-free水至完全溶解，Nanodrop 2000/2000C分光光度计分析测定所抽提RNA的浓度及质量。

2.2.1.2反转录获得cDNA

(1)将1μL Oligo dT(0.5μg/μL)和2.0μg上述抽提的RNA加入到PCR小管中，补充RNase-Free H₂O至10μL；混匀后离心，70℃温浴10min；之后立即置于冰水混合物中冰浴，使Oligo dT和模板退火；

(2)在上述混合物中，按表10的比例配制反转录反应体系(冰上进行)，混匀，短暂离心；

表10 RNA反转录反应体系

注：dNTPs是dATP,dCTP,dGTP,dTTP的混合，浓度为10mM

(3)上述体系在42℃水浴反应1h，然后在70℃水浴10min使反转录酶失活，将得到的反转录产物cDNA置于-20℃保存备用。

2.2.1.3q-PCR检测

(1)按表11配置q-PCR反应体系(12μL体系)：

表11 q-PCR反应体系

试剂	每管加入量
		SYBR premix ex taq	6.0μL
引物mix(5μM)	0.3μL
		模板(反转录产物)	0.6μL
RNase-Free H<sub>2</sub>O	5.1μL

引物信息如表12和表13：：

表12内参基因引物信息

内参基因	上游引物序列	下游引物序列
			GAPDH	TGACTTCAACAGCGACACCCA	CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA

表13目的基因引物信息

目的基因	上游引物序列	下游引物序列
			EMC8	CAGAAGCCGCGTAAGGAG	CCATGAATCAATCAGGGTGAG

(2)q-PCR检测，并进行数据分析。

2.3实验结果

q-PCR检测结果如表14和图5所示，EMC8基因干扰慢病毒(KD1组、KD2组、KD3组)显著抑制细胞中EMC8基因在mRNA水平的表达量(P<0.001)，针对分组标记为KD3的EMC8基因靶序列(SEQ ID NO：3)设计的shRNA具有最高的EMC8基因表达的敲减效率，其shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示。

表14 q-PCR检测结果

分组标记	表达丰度	标准偏差	p value	敲减效率
					NC	1.000	0.030	-	-
KD1	0.251	0.043	0.000(NC vs KD1)	0.749
					KD2	0.181	0.015	0.000(NC vs KD2)	0.819
KD3	0.166	0.023	0.000(NC vs KD3)	0.834

实施例3 EMC8基因抑制剂对胃癌细胞的影响

进行MTT实验、细胞凋亡检测实验、细胞克隆形成实验、细胞周期检测实验阐述EMC8基因抑制剂对胃癌细胞的影响，同时证明实施例2中构建的干扰慢病毒对胃癌细胞的作用。具体的，若无特别说明，实施例3中所述实验均采用表15的设计进行实验。

表15基本实验设计

3.1MTT实验检测细胞活力

3.1.1实验步骤

(1)按照实施例1中1.4.1～1.4.2进行目的细胞的培养与慢病毒感染，所述慢病毒为含有对照基因(SEQ ID NO：4)慢病毒(NC组)和实施例2制备的EMC8基因干扰慢病毒LV-EMC8-RNAi(70237-1)(KD组)，收集处于对数生长期的各实验组细胞，胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，并计数；

(2)将细胞悬液接种于96孔板中，细胞数为1500个/孔，培养体系为100μL/孔，每组设置3-5组重复(检测5天，则设置5组重复，使用5个96孔板)；

(3)待细胞完全沉淀下来后，在显微镜下观察各实验组的细胞密度，如果发现密度不均匀，则固定一组，微调其他组细胞的量使其密度保持一致，37℃、5％CO₂培养箱中进行培养；

(4)每天培养终止前4h，加入20μL 5mg/mL的MTT溶液，无需换液；

(5)MTT溶液处理4h后完全吸去培养液，应当注意不要吸掉孔板底部的甲瓒颗粒，加100μL DMSO溶解甲瓒颗粒；

(6)振荡器振荡2-5min，酶标仪检测490nm处OD值，然后进行数据的统计分析。

3.2Annnexin V-APC流式细胞凋亡检测(单染法)

3.2.1实验步骤：

(1)按照实施例1中1.4.1～1.4.2进行目的细胞的培养与慢病毒感染，所述慢病毒为含有对照基因(SEQ ID NO：4)慢病毒(NC组)和实施例2制备的EMC8基因干扰慢病毒LV-EMC8-RNAi(70237-1)(KD组)，对目的细胞进行慢病毒感染4天后，于6孔板中进行传代培养，培养体系为2mL/孔，待细胞融合度达85％后诱导凋亡；

(2)消化与收集细胞，1300rmp离心5min，弃上清，4℃预冷的D-Hanks溶液(pH＝7.2～7.4)洗涤细胞沉淀；

(3)1×binding buffer洗涤细胞沉淀一次，1300rmp离心3min，收集细胞；

(4)200μL 1×binding buffer重悬细胞沉淀；

(5)加入10μL Annexin V-APC染色，室温避光处理10-15min；

(6)根据细胞量，补加400-800μL 1×binding buffer，流式细胞仪检测；

(7)结果分析，使用流式细胞仪分析软件guava InCyte进行分析。

3.3细胞克隆实验

3.3.1实验步骤

(1)按照实施例1中1.4.1～1.4.2进行目的细胞的培养与慢病毒感染，所述慢病毒为含有对照基因(SEQ ID NO：4)慢病毒(NC组)和实施例2制备的EMC8基因干扰慢病毒LV-EMC8-RNAi(70237-1)(KD组)，对目的细胞进行慢病毒感染3天后，收集各实验组细胞胰酶消化，完全培养基重悬，制成细胞悬液，计数；

(2)将细胞悬液接种于6孔板中，各实验组细胞接种量为400-1500个/孔，培养体系为2mL/孔，每个实验组设3个复孔；

(3)将接种好的细胞于37℃、5％CO₂培养箱中继续培养到14-15天，中途每隔3-4天进行换液并观察细胞状态；

(4)实验终止前荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照，PBS洗涤细胞1次；

(5)每孔加入1mL 4％多聚甲醛，固定细胞30-60min，PBS洗涤细胞1次；

(6)每孔加入洁净、无杂质结晶紫染液500-1000μL，细胞染色10-20min；

(7)ddH₂O洗涤细胞3～5次，晾干，数码相机拍照，克隆计数。

3.4PI-FACS细胞周期检测实验

3.4.1实验步骤

(1)按照实施例1中1.4.1～1.4.2进行目的细胞的培养与慢病毒感染，所述慢病毒为含有对照基因(SEQ ID NO：4)慢病毒(NC组)和实施例2制备的EMC8基因干扰慢病毒LV-EMC8-RNAi(70237-1)(KD组)。将感染后的目的细胞接种于规格为6cm的培养皿中，培养体系为4mL/皿，37℃、5％CO₂培养箱培养，待各实验组目的细胞融合度约为80％时(细胞未进入生长平台期)，胰酶消化，完全培养基重悬成细胞悬液，收集细胞于5mL离心管中，每组设三个平行，每管细胞数目≥10⁶；

(2)1300rmp离心5min，弃上清，4℃预冷的D-Hanks(pH＝7.2～7.4)洗涤细胞沉淀1次；

(3)1300rmp离心5min，4℃预冷的75％乙醇固定细胞至少1h；

(4)1300rmp离心5min去固定液，D-Hanks洗涤细胞沉淀一次，同步骤(2)；

(5)细胞染色液配制：将40×PI(碘化丙啶)母液(2mg/mL)、100×RNase母液(10mg/mL)、1×D-Hanks按照体积比25：10：1000混合均匀配置成细胞染色液；

(6)细胞染色：根据细胞量，加入0.6-1mL的细胞染色液重悬，使上机时细胞通过率为300～800个/s；

(7)流式细胞仪检测，数据分析(使用ModFit软件进行分析)。

3.5实验结果

3.5.1细胞活力检测结果

MTT实验检测结果如图6和图7所示。图6和图7，分别反映了shRNA慢病毒感染AGS细胞，培养5天后，经MTT处理4小时，实验组(KD组)与对照组(NC组)的细胞在波长490nm的光的吸收率(OD₄₉₀)随时间变化的对比，和在波长490nm的光的吸收率变化倍数(OD₄₉₀/fold)随时间变化的对比，P<0.05。OD₄₉₀在这里反映了具有活力的细胞的数量。结果表明：相比NC组，KD组细胞增殖速度显著减缓，KD组细胞增殖经T-Test分析P<0.05，EMC8基因干扰慢病毒具有显著抑制胃腺癌细胞增殖的作用，说明抑制EMC8基因能抑制胃腺癌细胞的增殖。

3.5.2细胞凋亡检测结果

如图8所示，KD组细胞凋亡率显著高于对照组，相比对照组(NC组)，KD组细胞凋亡率经T-Test分析P<0.05，EMC8基因干扰慢病毒具有显著促进胃腺癌细胞凋亡的作用，说明抑制EMC8基因能促进胃腺癌细胞的凋亡。

3.5.3细胞克隆形成实验结果

如图9和图10所示，KD组细胞感染病毒后的细胞克隆数显著低于对照组，相比对照组(NC组)，KD组细胞克隆数经T-Test分析P<0.05，EMC8基因干扰慢病毒具有显著抑制胃腺癌细胞克隆形成的作用，说明抑制EMC8基因能抑制胃腺癌细胞克隆的形成。

3.5.4细胞周期检测实验结果

如图11所示，KD组细胞被停滞在G1期(DNA合成前期)，进入S期(DNA合成期)的胃腺癌细胞明显少于对照组(NC组)，相比对照组(NC组)，KD组处于S期的细胞经T-Test分析P<0.05，处于G1期的细胞经T-Test分析P<0.05，处于G2/M期的细胞经T-Test分析P>0.05，说明了抑制EMC8基因能够改变胃腺癌细胞周期分布。从细胞周期的角度解释了EMC8基因干扰慢病毒可以抑制肿瘤细胞的增殖，说明了抑制EMC8基因可以抑制胃癌细胞的增殖。

综上所述，本发明成功筛选出可能的促进胃癌细胞转化的特异性癌基因EMC8基因，并已通过细胞功能学实验证实其功能。本发明发现，EMC8基因可作为胃癌治疗靶点。EMC8基因抑制剂可抑制胃癌细胞的增殖速率、改变胃癌细胞周期分布、促进胃癌细胞凋亡，抑制胃癌细胞克隆形成，为治疗胃癌药物开辟新的方向。

本发明从细胞功能学角度出发证实EMC8基因在胃癌发生中的作用，通过构建目的基因shRNA慢病毒，慢病毒转染胃癌细胞，与转染对照慢病毒做对比，检测两组胃癌细胞系内mRNA水平目的基因的表达情况；随后通过细胞功能学实验进行细胞增殖、凋亡、细胞周期、细胞克隆形成检测，结果显示shRNA组与对照组对比，shRNA组胃癌细胞增殖抑制程度明显高于对照组，细胞凋亡率增加程度较对照组高，与对照组相比能明显抑制胃癌细胞克隆形成。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> EMC8基因抑制剂在制备治疗胃癌药物中的用途

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gagtaaagga tgccagtcca a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctcgtggat ttcgataacc a 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtggctctca ccctgattga t 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttctccgaac gtgtcacgt 19

<210> 5

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccgggagtaa aggatgccag tccaactcga gttggactgg catcctttac tcttttttg 59

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aattcaaaaa agagtaaagg atgccagtcc aactcgagtt ggactggcat cctttactc 59

<210> 7

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccgggctcgt ggatttcgat aaccactcga gtggttatcg aaatccacga gctttttg 58

<210> 8

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aattcaaaaa gctcgtggat ttcgataacc actcgagtgg ttatcgaaat ccacgagc 58

<210> 9

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccgggtggct ctcaccctga ttgatctcga gatcaatcag ggtgagagcc actttttg 58

<210> 10

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aattcaaaaa gtggctctca ccctgattga tctcgagatc aatcagggtg agagccac 58

Claims (10)

1.EMC8基因抑制剂在制备治疗胃癌药物中的用途。

2.如权利要求1所述的EMC8基因抑制剂在制备治疗胃癌药物中的用途，其特征在于，所述EMC8基因抑制剂是指以EMC8基因为作用靶标制备或筛选得到的对EMC8基因具有抑制效果的分子或制剂。

3.如权利要求1所述的EMC8基因抑制剂在制备治疗胃癌药物中的用途，其特征在于，所述EMC8基因抑制剂为核酸分子、核酸构建体、慢病毒、抗体或小分子化合物。

4.如权利要求3所述的EMC8基因抑制剂在制备治疗胃癌药物中的用途，其特征在于，所述核酸分子为双链RNA或shRNA；优选的，所述核酸分子作用的EMC8基因靶序列如SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3任一序列所示；所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10任一序列所示。

5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为EMC8基因抑制剂，可以降低胃癌细胞中EMC8基因的表达，包含：

a)双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与EMC8基因杂交的核苷酸序列；所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与EMC8基因靶序列相同；或者

b)shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与EMC8基因杂交的核苷酸序列；所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与EMC8基因靶序列相同。

6.如权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，所述茎环结构的序列可选自以下任意一种：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU和CCACACC；所述EMC8基因靶序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3任一序列所示；所述shRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10任一序列所示。

7.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体为EMC8基因抑制剂，含有编码权利要求5所述的核酸分子中shRNA的基因片段，能表达权利要求5所述的shRNA；

优选的，所述核酸构建体是将编码权利要求5所述的核酸分子中shRNA的基因片段克隆入载体获得的；所述载体为慢病毒载体GV493。

8.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒为EMC8基因抑制剂，由权利要求7所述的核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。

9.一种治疗胃癌药物，其特征在于，包括权利要求3所述的EMC8基因抑制剂的一种或多种。

10.一种胃癌联合治疗药物组合，其特征在于，包括权利要求3所述的一种或几种EMC8基因抑制剂和至少一种其他治疗胃癌药物；

优选的，所述胃癌联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

i)将EMC8基因抑制剂和其他治疗胃癌药物分别制成独立的制剂；

ii)将EMC8基因抑制剂和其他治疗胃癌药物配置成复方制剂。