CN109856309A - 反相高效液相色谱检测制剂中维生素k2（mk-7）的含量 - Google Patents
反相高效液相色谱检测制剂中维生素k2（mk-7）的含量 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种维生素K2(MK‑7)含量的测定方法，主要涉及维生素K2(MK‑7)的样品提取技术和色谱分离技术。该含量测定方法包括以下步骤：Ⅰ样品前处理；Ⅱ对照品溶液的制备；Ⅲ含量测定。利用高效液相色谱法和外标一点法测得样品溶液中维生素K2(MK‑7)的浓度，并结合取样量计算样品中维生素K2(MK‑7)的含量。本发明提供的方法样品前处理方法简便，转移率高；色谱条件采用40℃柱温，能很好的保护色谱柱，降低测量成本。
Description
技术领域
本发明属于维生素K2(MK-7)功效成分测定领域，具体地说，涉及一种保健食品、药品、普通食品 制剂中维生素K2(MK-7)的含量的测定方法。
背景技术
维生素K2是一种脂溶性维生素，具有叶绿醌生物活性的萘醌基团的衍生物，是人体中不可缺少的重 要维生素之一，维生素K2是维生素K唯一具有生物活性的形式，多用于加速凝血、维持凝血时间、治疗 维生素K缺乏引起的出血症。
维生素K2是一系列含有2-甲基-1，4-萘醒母核及C3位带有数目不等的异戊二烯结构单元的萜烯侧链 化合物的统称，根据萜烯侧链上碳元素的数目，可分为K2(10)、K2(20)、K2(35)、K2(40)等。维 生素K2(MK-7)则为萜烯侧链上有35个碳元素的维生素K2；维生素K2(MK-7)亦称为甲萘醒-7(MK-7)， 这是根据其萜烯侧链上有7个异戊二烯侧链命名的。其化学结构式为：
MK-7是维生素K2中功能最广泛、活性最强大、作用最持久、最安全、价格也最昂贵的成分。MK-7 具有广泛的抗癌功效，能抑制多种肿瘤细胞增殖，预防和逆转血管钙化，提高骨质密度，改善骨质增生等。 MK-7生产主要为微生物发酵、提取、化工合成等方法。MK-7国内检测检测方法报道较少，主要为高效液 相色谱法。
董跃伟在《反相高效液相色谱法测定纳豆提取物中维生素K2(MK-7)含量》中提出的MK-7的含量 测定方法中，样品前处理的方法较为繁琐，需要水浴加热使MK-7溶于溶剂中，且需要滤纸、微孔滤膜等 滤过，前处理过程中容易造成样品的损失。
王德伟等在《反相高效液相色谱法测定维生素K2中七烯甲萘醌的含量》中提出的含量测定方法中， 流动相为50％甲醇/水(含0.1％乙酸)(95:5＝V:V)，50％异丙烷。其流动相配置过程繁琐，且其中的乙酸 如果不经后处理，将会对色谱柱的寿命会造成一定的影响。
在食品安全标准与监测评估司在2016年第8号公告《关于海藻酸钙等食品添加剂新品种的公告》的 方法用于粉剂中维生素K2的测定，且色谱过程中，柱温高达50℃，该色谱条件对色谱柱的损害过大，大 大的缩短了色谱柱的使用寿命。
发明内容
本发明针对上述检验方法的不足，提供了一种具有高准确度、操作简便、检验成本低的维生素K2 (MK-7)的含量测定方法，适用于含有维生素K2(MK-7)制剂的含量测定。
为实现上述效果，本发明采用异丙醇作为样品前处理的溶剂，处理方法简单且能保证维生素K2(MK-7) 的转移率；色谱条件中柱温为40℃，能够降低对色谱柱的损害；适用于食品、药品、保健品中的各种剂型 中的维生素K2(MK-7)快速含量测定。
具体的，本发明采用下述的方法：
一种维生素K2(MK-7)的含量测定方法，包括以下步骤：
Ⅰ样品前处理：精密称取试样适量于棕色容量瓶中，加入异丙醇超声30min，用异丙醇定容至刻度， 摇匀，过0.45μm滤膜，得样品溶液(浓度C2)。
Ⅱ对照品溶液的制备：精密称取维生素K2(MK-7)(七烯甲萘醌)标准品适量，置棕色容量瓶中， 用异丙醇溶解并定容，配制成浓度为100μg/mL的对照品溶液(浓度C1)。
Ⅲ色谱条件：
色谱柱：C18 ODS柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒径5μm
柱温：40～50℃
流动相：色谱甲醇或色谱乙腈
流速：1.0ml/min
检测波长：254nm
进样量：10～20μL
Ⅳ含量测定方法：
①取对照品溶液，连续进样三次，计算平均值，得到对照品溶液的峰面积A1。
②取样品溶液，连续进样三次，计算平均值，得样品溶液的峰面积A2。
③计算：按以下公式计算样品溶液的浓度：
根据计算得到的样品浓度结合取样量，计算样品中维生素K2(MK-7)的浓度。
优选的，上述含量测定方法的色谱条件为：
色谱柱：C18 ODS柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒径5μm
柱温：40℃
流动相：色谱甲醇
流速：1.0ml/min
检测波长：254nm
进样量：10μL
优选的，上述含量测定方法中，对照品溶液和样品溶液经0.45μm滤膜滤过后，进样测定；
所述含量测定方法中的样品可以是食品、药品、保健品中的片剂、胶囊剂、软胶囊、滴剂、丸剂、粉 剂等。
上述含量测定方法的方法学研究：
①标准曲线和线性范围：
分别精密量取维生素K2(MK-7)(七烯甲萘醌)对照品溶液0mL、2.5mL、5mL、12.5mL、25mL、 37.5mL，置50mL棕色容量瓶中，配制成浓度为0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、 150μg/mL的对照品溶液，备用。
标准曲线的制备：取对照品溶液，经0.45μm滤膜滤过后，进样后测定，得到各对照品溶液的峰面积， 以峰面积为纵坐标，对应的各对照品溶液的浓度为横坐标，作图，得标准曲线，并计算回归方程：
②精密度试验：
取对照品溶液，重复进样6次，得维生素K2(MK-7)(七烯甲萘醌)峰面积，计算相对标准偏差RSD。
③稳定性考察：
取同一样品溶液，依法分别于0、2、4、6、8h测定，分别得维生素K2(MK-7)(七烯甲萘醌)的峰 面积，计算相对标准偏差RSD。
④重复性试验：
取样品5份，分别按样品前处理方法制备得样品溶液5份，并分别按上述含量测定方法测定维生素 K2(MK-7)(七烯甲萘醌)的含量，计算RSD。
⑤加样回收试验：
精密称取已知含量的样品9份，分为三组，分别精密加入适量含有维生素K2(MK-7)(七烯甲萘醌) 的异丙醇溶液，以样品前处理方法制备供试溶液。按上述色谱条件测定维生素K2(MK-7)(七烯甲萘醌) 的含量，计算平均回收率和RSD。
有益效果：
1.样品前处理步骤简便，使用异丙醇作为溶剂超声30min，同时能够保证维生素K2(MK-7)(七烯 甲萘醌)的转移率；
2.本检测方法的色谱条件柱温控制为35～40℃，该色谱方法在确保了样品检测的准确性的情况下，对 色谱柱没有造成损害，能够降低检测成本。
本发明的含量测定方法具有准确度高、仪器试剂简单，整个过程检测成本较低；本发明可以用于含有 维生素K2(MK-7)(七烯甲萘醌)食品、药品、保健品的含量快速测定，对含维生素K2(MK-7)(七烯 甲萘醌)的食品、药品、保健品质量进行评价，具有灵敏度高、准确度好、操作简便、快速、应用范围广 等特点。
附图说明
图1为实施例1中的对照品溶液的含量测定图谱；
图2为实施例1中的样品溶液的含量测定图谱；
图3为实施例2中的对照品溶液的含量测定图谱；
图4为实施例2中的样品溶液的含量测定图谱；
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步解释说明，但本领域相关技术人员理应知晓，此所述实施例仅 用于例证之目的，并不以任何方式限制本发明的保护范围。
下述实施例中，所用的样品包括微生物K2原料药、维生素K软胶囊、复合维生素片、纳豆提取物的 来源分别为：
下述实施例中，所用高效液相色谱仪为岛津LC-20AT，所用色谱柱IntersustainC18柱，所用化学试剂 包括流动相、溶剂等均为市售产品，均可自市场获得。
实施例1：维生素K2(MK-7)(七烯甲萘醌)的含量测定方法
1.样品前处理：取维生素K片数片，研细后，精密称取5.0g于100ml棕色容量瓶中，加入异丙醇超 声30min，用异丙醇定容至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，得样品溶液(浓度C2)。
2.对照品溶液的制备：精密称取维生素K2(MK-7)(七烯甲萘醌)标准品适量，置棕色容量瓶中， 用异丙醇溶解并定容，配制成浓度为100μg/mL的对照品溶液(浓度C1)。
3.色谱条件：
色谱柱：C18 ODS柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒径5μm
柱温：40℃
流动相：色谱甲醇
流速：1.0ml/min
检测波长：254nm
进样量：10μL
4.含量测定方法：
①取对照品溶液，经0.45μm滤膜滤过后，连续进样三次，计算平均值，得到对照品溶液的峰面积 A1。
②取样品溶液，连续进样三次，计算平均值，得样品溶液的峰面积A2。
③计算：按以下公式计算样品溶液的浓度：
根据计算得到的样品浓度结合取样量，计算样品中维生素K2(MK-7)的含量。
实施例2：维生素K2(MK-7)(七烯甲萘醌)的含量测定方法
1.样品前处理：取维生素K片数片，研细后，精密称取5.0g于100ml棕色容量瓶中，加入异丙醇超 声30min，用异丙醇定容至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，得样品溶液(浓度C2)。
2.对照品溶液的制备：精密称取维生素K2(MK-7)(七烯甲萘醌)标准品适量，置棕色容量瓶中， 用异丙醇溶解并定容，配制成浓度为100μg/mL的对照品溶液(浓度C1)。
3.色谱条件：
色谱柱：C18 ODS柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒径5μm
柱温：40℃
流动相：色谱甲醇
流速：1.0ml/min
检测波长：254nm
进样量：20μL
4.含量测定方法：
①取对照品溶液，经0.45μm滤膜滤过后，连续进样三次，计算平均值，得到对照品溶液的峰面积 A1。
②取样品溶液，连续进样三次，计算平均值，得样品溶液的峰面积A2。
③计算：按以下公式计算样品溶液的浓度：
根据计算得到的样品浓度结合取样量，计算样品中维生素K2(MK-7)的含量。
实验例3含量测定方法学
本方法学针对实施例1中的含量测定方法，包括以下内容：
①精密度试验
分别精密量取维生素K2(MK-7)(七烯甲萘醌)对照品溶液0mL、2.5mL、5mL、12.5mL、25mL、 37.5mL，置50mL棕色容量瓶中，配制成浓度为0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL的对照品溶液，备用。
标准曲线的制备：取对照品溶液，经0.45μm滤膜滤过后，进样后测定，得到各对照品溶液的峰面积， 以峰面积为纵坐标，对应的各对照品溶液的浓度为横坐标，作图，得标准曲线，并计算回归方程： Y＝2068.8X-1.001，线性范围为0～150μg/mL。
②精密度试验：
取对照品溶液，重复进样6次，得维生素K2(MK-7)(七烯甲萘醌)峰面积，计算相对标准偏差RSD 为0.21％。表明本方法的精密度高。
③稳定性考察：
取同一样品溶液，依法分别于0、2、4、6、8h测定，分别得维生素K2(MK-7)(七烯甲萘醌)的峰 面积，计算相对标准偏差RSD为0.19％。可见该方法能够保证样品再8h内保持稳定。
④重复性试验：
取维生素K2(MK-7)原料5份，分别按实施例1中样品前处理方法制备得样品溶液5份，并分别按 上述含量测定方法测定维生素K2(MK-7)(七烯甲萘醌)的含量，计算RSD为0.23％。表明本方法具有 较高的重复性。
⑤加样回收试验：
精密称取已知含量的样品9份，分为三组，分别精密加入维生素K2(MK-7)(七烯甲萘醌)对照品 溶液适量，以样品前处理方法制备供试溶液。按上述色谱条件测定维生素K2(MK-7)(七烯甲萘醌)的 含量，计算平均回收率，结果见表1。
表1加样回收试验结果
由上述方法学试验可看出，上述含量测定方法精密度好，稳定度高，重现性好，且方法简便、可靠， 能够用于维生素K2(MK-7)(七烯甲萘醌)的含量测定和质量控制。
Claims (4)
1.一种制剂中维生素K2(MK-7)的含量的方法，包括以下步骤：
Ⅰ样品前处理：精密称取试样适量于棕色容量瓶中，加入异丙醇超声30min，用异丙醇定容至刻度，摇匀后，得样品溶液(浓度C2)。
Ⅱ对照品溶液的制备：精密称取维生素K2(MK-7)(七烯甲萘醌)标准品适量，置棕色容量瓶中，用异丙醇溶解并定容，配制成浓度为100μg/mL的对照品溶液(浓度C1)。
Ⅲ色谱条件：
色谱柱：C18ODS柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒径5μm
柱温：40～50℃
流动相：色谱甲醇或色谱乙腈
流速：1.0ml/min
检测波长：254nm
进样量：10～20μL
Ⅳ含量测定方法：
①取对照品溶液，连续进样三次，计算平均值，得到对照品溶液的峰面积A1。
②取样品溶液，连续进样三次，计算平均值，得样品溶液的峰面积A2。
③计算：按以下公式计算样品溶液的浓度：
根据计算得到的样品浓度结合取样量，计算样品中维生素K2(MK-7)的浓度。
2.如权利要求1所述的含量测定方法，所述色谱条件为：
色谱柱：C18ODS柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒径5μm
柱温：40℃
流动相：色谱甲醇
流速：1.0ml/min
检测波长：254nm
进样量：10μL。
3.如权利要求1所述的含量测定方法，所述对照品溶液和样品溶液经0.45μm滤膜滤过后，进样测定。
4.如权利要求1所述的含量测定方法，所述样品可以是食品、药品、保健品中的片剂、胶囊剂、软胶囊、滴剂、丸剂、粉剂等。
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