CN109824735A - 一种萘酰亚胺-铂(ii)配合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及铂类活性配体配合物领域，具体公开了一种萘酰亚胺‑铂(II)配合物、其制备方法以及该配合物在制备抗肿瘤药物中的应用，旨在提供一种高效、低毒、靶向性的铂类抗肿瘤化疗药物。所述配合物的化学式为I，所述的制备方法包括以下步骤：(1)将萘酰亚胺衍生物配体c与二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)溶于极性溶剂中，进行配位反应；(2)将步骤(1)的反应液洗涤、干燥，得到萘酰亚胺‑铂(II)配合物I；所述的萘酰亚胺‑铂(II)配合物用于抗癌药物。

Description

一种萘酰亚胺-铂(II)配合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及铂类活性配体的配合物以及制备方法，特别涉及一种萘酰亚胺-铂(II)配合物及其制备方法和应用。

背景技术

肺癌严重影响人们的生命安全和生活质量，其发病率呈快速增长的趋势，位居男性恶性肿瘤发病率第1位，女性发病率第2位(Chen,W.,et al.Cancer statistics inChina,2015,65(1):5-29.)。其中，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占原发性肺癌的80％，大多数患者在确诊时已处于中晚期。铂类药物为基础的化疗和分子靶向治疗是治疗晚期NSCLC的主要方式。虽然顺铂类作为化疗效果最好抗癌药物之一并得到广泛应用，但是其肾毒性、胃肠毒性、神经毒性、骨髓毒性和耳毒性等毒副作用以及肿瘤细胞的耐药性限制了其进一步的应用(Mao,Z.-W.；et al.Inorg.Chem.Front.,2017,4:10-32.)。

因此，研发出新型高效、低毒、靶向性的铂类抗肿瘤化疗药物迫在眉睫。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种萘酰亚胺-铂(II)配合物。

为实现本发明的第一个目的，本发明提供了以下的技术方案：

一种萘酰亚胺-铂(II)配合物，具有下述化学结构式I：

本发明的第二个目的是提供一种萘酰亚胺-铂(II)配合物的制备方法。

为实现本发明的第二个目的，本发明提供了以下的技术方案：

一种萘酰亚胺-铂(II)配合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将萘酰亚胺衍生物配体c与二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)溶于极性溶剂中，进行配位反应；

(2)将步骤(1)的反应液洗涤、干燥，得到萘酰亚胺-铂(II)配合物。

萘酰亚胺衍生物配体c的结构式为：

进一步地，所述步骤(1)中，萘酰亚胺衍生物配体c与二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)的摩尔比为1:0.5～1.5。

进一步地，所述步骤(1)中配位反应的温度条件为45～120℃。

进一步地，所述步骤(1)中甲醇和二甲基亚砜的混合溶液的体积为2～20mL。

进一步地，所述步骤(2)中，所述步骤(1)中，每1.0mmol的萘酰亚胺衍生物配体c加入极性溶剂的体积为35～55mL。

进一步地，所述步骤(1)中，极性溶剂为甲醇、乙腈和乙醇中的任意一种与二甲基亚砜、丙酮或水中的任意一种或几种溶剂的组合。

本发明的第三个目的在于提供一种萘酰亚胺-铂(II)配合物I在制备抗肿瘤药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1.本发明提供了一种萘酰亚胺-铂(II)配合物，首次得到以萘酰亚胺衍生物配体c为活性配体的配合物。

2.本发明的萘酰亚胺-铂(II)配合物的制备方法，以萘酰亚胺衍生物c为活性配体，与二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)配位反应合成了配合物，合成路线简单、反应条件温和，在45～120℃的条件下即可完成反应，产率达到了80％～91％。

3.本发明的萘酰亚胺-铂(II)配合物，表现出靶向于抑制肺癌耐药细胞NCI-H460的生长，其IC50值分别为0.10±0.15μM，其体外抗肿瘤活性远远大于配体和经典的金属基抗癌药物顺铂。

4.本发明的萘酰亚胺-铂(II)配合物，对正常细胞HL-7702的毒性很小(IC50＝65.03±1.05μM)；具有良好的抑瘤效果，抑制率达40.7％，具有潜在的药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。

附图说明

下面结合附图中的具体实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

图1为本发明实施例1制得的配体c的核磁共振氢谱图；

图2为本发明实施例1制得的配体c的核磁共振碳谱图；

图3为本发明实施例1制得的配合物的红外谱图；

图4为本发明实施例1制得的配合物的核磁共振氢谱谱图；

图5为本发明实施例1制得的配合物的核磁共振碳谱谱图；

图6为本发明实施例1制得的配合物的电喷雾质谱图。

具体实施方式

本发明涉及的二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)可参考现有文献(Al-Allaf,T.A.K.；et al.Transit.Met.Chem.,1998,23:403-406.)进行制备，在本申请中简写为cis-PtCl2(DMSO)₂。

本发明实施例中涉及的配体c的合成参照现有技术进行合成(Jiang,H.；etal.New J.Chem.,2014,38,109-114.Fujita,K.et al.Tetrahedron.2008,64,1943-1954.)。

实施例1

1.1对合成的萘酰亚胺衍生物配体c进行鉴定

制得的配体c的核磁共振氢谱图如图1所示，¹H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.48(d，J＝4.9Hz，2H)，δ8.39(d，J＝7.2Hz，1H)，δ8.16(d，J＝2.5Hz，1H)，δ7.99(d，J＝8.2Hz，1H)，δ7.72-7.57(m，3H)，δ7.55-7.48(m，4H)，δ7.39(d，J＝2.4Hz，1H)，δ7.34-7.24(m，2H)，δ7.24-7.18(m，1H)，δ7.14-7.04(m，2H)，δ5.34(s，2H)，δ4.04-4.01(m，2H)，δ2.63(t，J＝7.0Hz，2H)，δ1.93-1.80(m,2H),δ1.78-1.70(m,2H)。

配体c的核磁共振碳谱谱图如图2所示，¹³C NMR(101MHz，CDCl3)δ164.3，δ163.9，δ157.5，δ137.3，δ133.2，δ132.7，δ129.0，δ128.9，δ128.5，δ127.5，δ127.5，δ124.1，δ123.7，δ122.8，δ122.5，δ113.9，δ100.0，δ67.6，δ43.6，δ33.3，δ32.6，δ31.0，δ29.3，δ27.7。

因此，可以确定所得黄色配体c，其结构式如下：

1.2配位反应

准确称量1.0mmol的配体c和1.0mmol二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，混合均匀后，将固体溶解于55mL的乙醇和DMSO的混合溶液中(体积比为100:1)，在80℃下反应24小时，冷却至室温，静置，析出黄色固体，抽滤，固体依次经用水、甲醇、乙醚进行洗涤，分离出固体，真空干燥后得到黄色的萘酰亚胺-铂(II)配合物，产率为91.5％。

1.3红外光谱鉴定

配合物的红外光谱IR的谱图如图3所示，所述配合物在3408cm^-1，2925cm^-1，1698cm^-1，1584cm^-1，1440cm^-1，1329cm^-1，1272cm^-1，1163cm^-1，978cm^-1，780cm^-1，731cm^-1，705cm^-1，525cm^-1和508cm^-1处均有吸收峰。

1.4核磁共振氢谱鉴定

配合物的核磁共振氢谱谱图，如图4所示:¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)，δ8.75(d,J＝5.6Hz,2H)，δ8.30(d,J＝7.2Hz,1H)，δ8.24(d,J＝8.6Hz,3H)，δ7.81(d,J＝9.1Hz,3H)，δ7.78(d,J＝7.8Hz,2H)，δ7.59(t,J＝6.6Hz,2H)，δ7.36(d,J＝7.7Hz,2H)，δ7.31(t,J＝7.4Hz,2H)，δ7.24(t,J＝7.2Hz,1H)，δ5.38(d,J＝15.8Hz,2H)，δ5.23(s,2H)，δ4.86(d,J＝15.8Hz,2H)，δ4.05(s,2H)，δ3.14(s,2H)，δ1.74(s,4H)。

1.5核磁共振碳谱鉴定

配合物的核磁共振碳谱谱图，如图5所示。¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ165.86，163.51，163.07，156.77，149.04，141.31，137.34，133.23，133.07，128.43，127.77，127.59，127.15，125.34，123.47，123.30，122.82，121.95，121.74，114.22，67.87，67.77，63.89，43.00，40.42，25.33，23.87。

1.6电喷雾质谱鉴定

配合物的电喷雾质谱谱图，如图6所示。

ESI-MS:m/z＝786.2[M-Cl]⁺，其中M为配合物I的分子量。

1.7元素分析

配合物和配体c的元素分析结果，如表1所示。

表1配体c和实施例中铂(II)配合物1的元素分析结果

通过以上测试，可以确定所得黄色的配合物，其结构式如下：

实施例2

为了充分说明本发明所述的萘酰亚胺-铂(II)配合物在制备抗肿瘤药物中的用途，对其进行了抗肿瘤活性实验和毒性实验研究。

1.细胞株与细胞培养

本实验选用人宫颈癌细胞HeLa、人肺癌细胞NCI-H460、人卵巢癌SK-OV-3、人胃癌细胞BEL-7402以及人正常肝细胞HL-7702五种人类细胞株。

所有人源细胞株均培养在含100U/mL青霉素、10wt％小牛血、100U/mL链霉素的RPMI-1640培养液内，置37℃含体积浓度5％CO₂的孵箱中培养。

2.待测化合物的配制

所用的配体c和萘酰亚胺-铂(II)配合物的纯度均需≥95％，将它们的DMSO储液用生理缓冲液稀释成20μmol/L的终溶液(DMSO的终浓度≤1％)，测试该浓度下配体配体c和萘酰亚胺-铂(II)配合物对正常细胞或所选的肿瘤细胞生长的抑制程度。

3.细胞生长抑制实验(MTT法)

(1)取对数生长期的正常细胞或肿瘤细胞，经胰蛋白酶消化后，用含10％小牛血清的培养液配制成浓度为5000个/mL的细胞悬液，以每孔190μL接种于96孔培养板中，使待测细胞密度至1000～10000孔，边缘孔用无菌PBS填充。

(2)置37℃含体积浓度5％CO₂的孵箱中培养24h，至细胞单层铺满孔底，每孔加入一定浓度梯度的药物10μL，每个浓度梯度设4个复孔。

(3)5％CO₂，37℃孵育48小时，倒置显微镜下观察。

(4)每孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mL PBS，即0.5％MTT)，继续培养4h。

(5)终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μL的DMSO充分溶解甲瓒沉淀，振荡器混匀后，在酶标仪用波长为570nm，参比波长为450nm测定各孔的光密度值。

(6)同时设置调零孔(培养基、MTT、DMSO)，对照孔(细胞、培养液、MTT、相同浓度的药物溶解介质、DMSO)。

(7)根据测得的光密度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。利用公式：

计算配体c和萘酰亚胺-铂(II)配合物对所选细胞生长的抑制率，再以Bliss法分别计算各受试化合物对所选的各个细胞株的IC₅₀值。其结果如以下表2所示。

表2.配体c和萘酰亚胺-铂(II)配合物对各种细胞株的IC₅₀值(μM)

从IC₅₀活性筛选结果来看，萘酰亚胺-铂(II)配合物对所选的癌细胞均表现出一定的增殖抑制活性，均高于相应的配体c活性。其中铂(II)配合物1靶向性抑制人肺癌耐药株NCI-H460的增殖，其IC₅₀值分别为0.10±0.15μM，其活性比顺铂药物的活性分别提高了153倍。另一方面，配合物对人正常肝细胞HL-7702细胞毒性很小，这是一个有积极意义的结果，表明配合物能够靶向抑制人卵巢癌耐药株NCI-H460的生长，同时还具有较低的肝脏毒性，即配合物配合物具有一定的细胞毒性选择性。

因此，本发明所述的一种新型的萘酰亚胺-铂(II)配合物，总体表现出了明显的体外抗肿瘤活性和毒性选择性，具有良好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。

实施例3

配合物抑制NCI-H460细胞的端粒酶活性实验

1.细胞培养和化合物配制

人卵巢癌耐药株NCI-H460为肿瘤细胞株，配合物10.0μM的作用时间为24小时，细胞培养和化合物配制的步骤与实施例2相同。

2.端粒酶提取和抑制实验

端粒酶提取盒购于北京中西远大公司，货号NKJ15DLM，-80℃长期保存。

2.1端粒酶提取

配合物(10.0μM)作用人肺癌耐药株NCI-H460细胞后(设有空白对照组)，进行如下实验：

(1)收集不少于1×10⁶个细胞(约为6孔板的1-2孔细胞量)，2000rpm的转速下离心5min，离心收集细胞，预冷的PBS洗涤后于冰浴上研磨匀浆；

(2)加入1.0mL冰冷的Wash buffer(使用前每毫升PBS中加入1μL的DTT(1mol/L))，重悬上述收集的细胞，置冰上5min，在4℃、3000rpm转速的条件下离心5min，弃上清；

(3)加入40μL冰冷的Lysis buffer(用前每1mL Lysis buffer中加入0.5μL PMSF和0.5μL的β-巯基乙醇)悬浮细胞，涡旋振荡10s，置冰上45min，在4℃、13,000rpm的转速下离心30min，取上清；

(4)上清转移至新的EP管中(必要时测定总蛋白浓度)，以Lysis buffer调浓度10μg/μL，于-20℃保存备用。

2.2PCR扩增

(1)在PCR管中分别加入5μL 10×TRAP buffer、1μL dNTPs，1μL Taq-DNApolymerase、1μL TS primer和2μL端粒酶提取物，然后加入39μL灭菌超纯水，于室温下保温30min；

(2)加入1μL CX primer混匀，在扩增仪上进行30个循环，94℃预热5min，设置循环参数如下：94℃变性30s；50℃退火30s；72℃延伸90s；最后72℃延伸5min，4℃保存产物并尽快电泳。

2.3聚丙烯酰胺凝胶电泳

(1)制备12％非变性聚丙烯酰胺凝胶(10mL)：4mL 30％Acr-Bis(29:1)、H₂O(4.92mL)、10×TBE(1mL)、10％APS(70μL)和10μL的TEMED混合均匀。

(2)取9μL PCR产物加上1μL 10×上样缓冲液，于电压180V，12％非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳预跑45min，在电压220V，12％非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳2h；

2.4硝酸银染色

(1)将凝胶置10％乙酸固定30min，去离子水漂洗3次，每次5min；

(2)将凝胶置于0.2g/L硫代硫酸钠浸泡1min，去离子水漂洗3次，每次30s；

(3)将凝胶置于硝酸银染液染色30min，去离子水漂洗30s；

(4)将凝胶置于显色液中显色10-15min左右直到条带显色完全为止；

(5)最后将凝胶置于10％乙酸浸泡5min终止反应。

2.5结果判断与数据处理：

PCR扩增产物以硝酸银染色，出现6bp或间隔6bp整数倍的梯形条带为阳性结果，以凝胶成像软件测定条带，得出各标本的相对吸光度IOD值代表端粒酶活性。阳性条带以Gelpro4.0版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD(integrated optical density)累积光密度，每次均设有空白对照组。计算公式如下：

实验结果如下表所示。

由上表可知，配合物对人肺癌NCI-H460细胞的裸鼠模型具有良好的抑瘤效果。综上所述，本发明所述的配合物表现出优异的体内外抗肿瘤活性和选择性抑制人肺癌耐药株NCI-H460，对肿瘤细胞的细胞毒性优于顺铂和配体c。

综合实施例2～3的实验结果，萘酰亚胺-铂(II)配合物表现出靶向于抑制肺癌耐药细胞NCI-H460的增殖，其IC50值分别为0.10±0.15μM，其体外抗肿瘤活性远远大于配体和经典的金属基抗癌药物顺铂；此外，配合物对正常细胞HL-7702的毒性很小(IC50＝65.03±1.05μM)。更为重要的是，在荷瘤裸鼠的体内抑瘤实验显示，配合物对人肺癌NCI-H460细胞的裸鼠模型具有良好的抑瘤效果，抑制率达40.7％。萘酰亚胺-铂(II)配合物1表现出优越的体外抗肿瘤活性，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。

以上所述为本发明的部分实施方式，并不限制于本发明。对本领域技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下做出的若干改进和变型，也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种萘酰亚胺-铂(II)配合物，具有下述化学结构式I：

2.权利要求1所述萘酰亚胺-铂(II)配合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将萘酰亚胺衍生物配体c与二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)溶于极性溶剂中，进行配位反应；

(2)将步骤(1)的反应液洗涤、干燥，得到萘酰亚胺-铂(II)配合物；

萘酰亚胺衍生物配体c的结构式为：

3.权利要求2所述萘酰亚胺-铂(II)配合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，萘酰亚胺衍生物配体c与二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)的摩尔比为1:0.5～1.5。

4.权利要求2或3所述萘酰亚胺-铂(II)配合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中配位反应的温度条件为45～120℃。

5.权利要求2所述萘酰亚胺-铂(II)配合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，每1.0mmol的萘酰亚胺衍生物配体c加入极性溶剂的体积为35～55mL。

6.权利要求2或5所述萘酰亚胺-铂(II)配合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，极性溶剂为甲醇、乙腈和乙醇中的任意一种与二甲基亚砜、丙酮或水中的任意一种或几种溶剂的组合。

7.权利要求1所述的萘酰亚胺-铂(II)配合物在制备抗肿瘤药物中的应用。