CN109824623A - 一种单去甲氧基姜黄素吡咯衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供具有结构式I所示的单去甲氧基姜黄素吡咯衍生物，该化合物具有较好的脂水分配系数，具有良好的透过血脑屏障靶向脑部组织的能力，同时具有良好的抗胶质瘤活性及安全性，对人胶质瘤U87具有良好的抑制作用，对裸鼠U87胶质瘤的抑瘤率达到了90％以上，能够用于制备抗胶质瘤的药物。

Description

一种单去甲氧基姜黄素吡咯衍生物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及药物化学中的新药研发技术领域，具体涉及一类新型的单去甲氧基姜黄素吡咯衍生物及其制备方法和在抗肿瘤中的应用。

背景技术

姜黄素(Curcumin)是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种化学成分，为一种二酮类色素，它具有广泛的药理活性，主要包括抗炎，抗氧化，抗衰老，抗感染，降血脂，抗动脉粥样硬化及抗肿瘤等多种药理活性。同时存在于姜黄根中的还有姜黄素的两个类似物：单去甲氧基姜黄素及双去甲氧基姜黄素，它们与姜黄素一样有着广泛而显著的生物活性，但由于来源问题一直没有得到充分的研究。特别是单去甲氧基姜黄素因其在姜黄素根中的含量远低于姜黄素，目前研究得很少。

我们致力于单去甲氧基姜黄素的研究，前期研究表明单去甲氧基姜黄素及其衍生物对胶质瘤具有一定的作用(申请号：201410671697.5，201510180690.8)。但进一步的研究表明这些化合物，或者是文献报道的单去甲氧基姜黄素衍生物虽然在体外细胞实验上表现出较好的抗胶质瘤活性，但体内效果，特别是针对裸鼠颅内接种模型的效果较差。我们分析原因，认为单去甲氧基姜黄素的脂水分配系数较差，不易透过血脑屏障，从而对脑部的肿瘤治疗效果较差，因此调节单去甲氧基姜黄素的脂水分配系数，增加其跨过血脑屏障的能力，是增加其抗胶质瘤的有效途径之一。

人体细胞的组成含有80％的水，因此药物要转运扩散到血液或体液，需要溶解在水相，要求药物有较高的水溶性。而药物吸收转运必须要跨越无数的细胞层，生物膜是由磷脂所组成的，因此又要求药物有一定的脂溶性。由此可见，药物亲水性或亲脂性的过高或过低，都对药效产生不良的影响。而作用于脑内中枢系统的药物，需通过血脑屏障，血脑屏障是指脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血浆与脑细胞之间的屏障和由脉络丛形成的血浆和脑脊液之间的屏障，本身较为致密，药物要透过血脑屏障，应具有较大的脂溶性。但需要注意的是脂水分配系数应有一定的范围，只有在一定范围内才能显示最好的药效。因此，通过对药物脂水分配系数的调节，来改善药物，特别是针对脑内中枢系统的药物的药效是一项复杂的工作。

而本发明主要是针对单去甲氧基姜黄素进行脂水分配系数进行调节，以改善其透过血脑屏障的能力，从而增加其对胶质瘤的抗肿瘤活性。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种具有抗胶质瘤活性的含吡咯基团的单去甲氧基姜黄素衍生物，本发明的另一个目的是提供一种合成上述具有抗胶质瘤作用的单去甲氧基吡咯衍生物。本发明的再一个目的是给出其在抗胶质瘤活性方面的应用。

本发明的上述目的是通过以下的技术方案来实现的：

具有抗肿瘤作用的单去甲氧基姜黄素吡各衍生物，具有如下结构：

本发明还提供上述的衍生物的合成路线，本发明的反应合成流程如下：

本发明所述的单去甲氧基吡咯衍生物采用如下方法合成：

对羟基苯甲醛与等摩尔的吡咯及甲醛水溶液经Mannich反应经柱层析得中间体1；将乙酰丙酮与硼酐溶于乙酸乙酯中，加热至回流半小时，再加入1个当量中间体1和催化量正丁胺，回流过夜，柱层析得关键中间体2；

将中间体2与硼酐溶于乙酸乙酯中回流半小时，之后再加入1个当量3-甲氧基-4羟基苯甲醛与正丁胺，回流24小时，加入1N盐酸回流半小时，反应液用乙酸乙酯萃取，柱层析得目标产物。

本发明所述单去甲氧基姜黄素吡咯衍生物还可以与人体可接受的药用辅料组合制成各种制剂，包括溶液剂、注射剂、片剂、胶囊剂、软膏剂、凝胶剂、气雾剂或喷雾剂等。

本发明单去甲氧基姜黄素吡咯衍生物的药物用途是，该衍生物用于抗肿瘤，特别是对人胶质瘤显示出突出的体外与体内抑制活性。

本发明的有益效果：本发明提供了一种新的单去甲氧基姜黄素吡咯衍生物，且该衍生物可用于制备抗肿瘤的药物，对于胶质瘤细胞体内和体外增殖均具有突出的抑制作用，对裸鼠U87胶质瘤的抑瘤率达到了90％以上。此外，用HPLC法测定该化合物的平衡溶解度及表观脂水分配系数，表明其具有良好的平衡理化性质，易于透过血脑屏障，脑部药物浓度达到血液中浓度的3倍多，但化合物本身的毒副作用较小。上述药效学与成药性测试结果表明本发明所披露的单去甲氧基姜黄素吡咯衍生物具有抗胶质瘤的潜在疗效。

具体实施方式

以下通过实施例形式展示具体的实施方式，对本发明内容进行进一步的详细说明，但不该当将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡是基于本发明上述内容在本领域内所能实现的技术均应属于本发明的内容。

实施例1. 4-羟基-3-(吡咯烷基-1-甲基)苯甲醛的制备

将5g对羟基苯甲醛溶于50mL水中，然后加入3.07g含40％的甲醛水溶液，2.9g吡咯回流5小时，冷却，柱层析得淡黄色晶体5.1g，产率60.1％。¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ：9.87(s，1H)，7，63(m，1H)，7.34(dd，1H)，7.31(dd，1H)，3.81(s，2H)，2.56(m，4H)，1.76(m，4H)；ESI-MSm/z 203.1[M+H]⁺.

实施例2. 6-(4-羟基-3-(吡咯烷基-1-甲基)苯基)己烷-5烯-2，4-二酮的制备

将975mg乙酰丙酮与1g硼酐溶于乙酸乙酯中，加热至回流半小时，再加入1个当量2g的中间体1和催化量正丁胺，回流过夜，柱层析得淡黄色产物2.1g，产率75％。¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ：9.89(s，1H)，7.62，6.63(dd，each 1H)，7.43(dd，1H)，7.31(dd，1H)，7.11(s，1H)，6.53(s，1H)，3.81(s，2H)，2.55(m，4H)，2.26(s，3H)，1.85(m，4H)；ESI-MS m/z288.2[M+H]⁺.

实施例3.吡咯单去甲氧基姜黄素衍生物

将1g中间体2与242mg硼酐溶于乙酸乙酯中回流半小时，之后再加入1个当量530mg3-甲氧基-4羟基苯甲醛与催化量正丁胺，回流24小时，加入1N盐酸30mL回流半小时，反应液用乙酸乙酯萃取，柱层析得淡黄色目标产物0.9g，产率61.3％。¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ：9.5-8.0(br，1H)，7.52(m，3H)，7.29(s，1H)，7.19(dd，1H)，6.75(m，4H)，6.01(s，1H)，3.80(s，3H)，3.71(s，2H)，2.36(m，4H)，1.68(m，4H)；ESI-MS m/z 422.4[M+H]⁺.

实施例4.片剂的制备

按上述配方，用常规方法制备成片剂。

实施例5.单去甲氧基姜黄素吡咯衍生物的体外药理活性

通过药理试验证明，本发明的单去甲氧基姜黄素衍生物具有更好的体外抗肿瘤作用，可以用于进一步制备抗肿瘤药物。选择的肿瘤细胞包括胶质瘤U87细胞、胶质瘤U251细胞、胶质瘤SHG44细胞和MCF-7人乳腺癌细胞。

实验方法：

细胞消化、计数、制成浓度为5×10⁴个/mL的细胞悬液，96孔板中每孔加入100μl细胞悬液(每孔5×10³个细胞)；96孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时；用完全培养基稀释药物至所需浓度，每孔加入100μL相应的含药培养基；96孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养72小时。

MTT法：

1)将96孔板进行MTT染色，λ＝490nm，测定OD值。

2)每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，在培养箱继续培养4小时；

3)弃去培养基，每孔加入150μL DMSO溶解，摇床10分钟轻轻混匀；λ＝490nm，酶标仪读出每孔的OD值。

采用如下公式计算抑制率：

实验结果：

表1单去甲氧基姜黄素吡咯衍生物对4种人类癌细胞株抗增殖活性的IC₅₀值(μM)

根据表1的实验结果所示，本发明的单去甲氧基吡咯衍生物的IC₅₀要显著优于单去甲氧基姜黄素和姜黄素。

实施例6.单去甲氧基姜黄素吡咯衍生物的体内抗胶质瘤活性

胰酶消化单层培养的U87细胞并计数，以不含小牛血清的DMEM培养基清洗2次，弃上清，用不含小牛血清的DMEM培养基稀释至2*10⁵/ml，混匀，台盼蓝染色活细胞数＞95％。采用瘤细胞悬液接种方法制作动物模型。裸鼠予乙醚麻醉后固定于鼠脑立体定位仪，消毒头部皮肤，选择裸鼠头部顶枕区(人字缝前3mm，中线右侧旁开2mm)，用无菌注射器针头钻孔，将吸有5ul瘤细胞悬液的微量进样器垂直硬脑膜表面插入，旋转缓慢进针2mm，回抽有阻力、无脑脊液吸出，10min内缓慢注入，注射完毕留针5min，待细胞沉积。缓慢拔针，透过透明的颅骨观察是否有颅内出血，如有出血，可去少许颅骨减压。接种次日静脉给药，单去甲氧基姜黄素及其吡咯衍生物(10mg/Kg)，每组10只裸鼠，雌雄各半。对照组给予等体积生理盐水静脉注射。给药4，9，14，18天后micro-CT扫描颅内肿瘤体积，计算各组药物抑瘤率。

实验结果见附图1，与对照组相比，单去甲氧基姜黄素(DMC)能显著抑制颅内肿瘤的生长，但本发明的化合物单去甲氧基姜黄素吡咯衍生物(DMC-BH)给药18天时能几乎完全抑制颅内胶质瘤的生长，抑瘤率高达91.4％，具有突出的效果，显著优于单去甲氧基姜黄素。

实施例7单去甲氧基姜黄素吡咯衍生物的毒性考察

体内给药的裸鼠分别在给药1，5，10，15，18天称取体重。给药结束后，处死小鼠，剥取心脏、肝脏、脾脏，用10％福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片厚4～5μm，HE染色，评价小鼠靶器官受损情况。石蜡切片与HE染色步骤如下：

石蜡切片：按常规方法进行脱蜡，水合，将切片用二甲苯浸泡5min，更换二甲苯后再浸泡5min；分别用无水乙醇中浸泡5min；95％乙醇中浸泡5min；85％乙醇中浸泡5min；70％乙醇中浸泡5min，PBS浸洗3min×3次。

HE染色：浸入试剂盒中试剂一核染液染缸内染色3-5min，水洗约30-60s；浸入试剂盒中试剂二分色液I中约20s，水洗约30-60s；浸入试剂盒中试剂三分色液II中约40s，水洗约30-60s；至于试剂盒中试剂死浆染液中染色2min，再用试剂五增色液洗去多余染液，洗两次，滤纸吸干封片镜检。

实验结果如图2所示，从图中可以看出，单去甲氧基姜黄素吡咯衍生物(DMC-BH)的毒副作用较小，对体重影响与模型组相比没有明显变化。且长期给药后对靶器官未造成可观测到的损伤，说明单去甲氧基姜黄素吡咯衍生物安全性较高。

实施例8单去甲氧基姜黄素吡咯衍生物的脂水分配系数测定

采用HPLC法测定化合物的脂水分配系数，色谱条件如下：反相C18色谱柱，流动相为甲醇-1％乙酸水溶液(50∶50)，流速1.0mL/min，检测波长428nm。精密量取一定量的单去甲氧基姜黄素及其吡咯衍生物，制得一定浓度的标准溶液，在上述色谱条件下分别测定峰面积，然后以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得到标准方程。

然后精密称取1mg单去甲氧基姜黄素及其吡咯衍生物于10mL试管中，分别加入5mL正辛醇饱和的水溶液，涡旋5min，静置30min，过膜，过膜之后的溶液于10mL容量瓶中，用纯甲醇定容，在上述色谱条件下测定，记录峰面积，带入标准曲线中计算质量浓度ρ₀。

取2mL过膜之后的溶液于10mL试管中，再加入2mL用水饱和的正辛醇，涡旋5min，用恒温水浴振荡器于37度下振摇24小时。精确量取下层水相0.5mL于10mL容量瓶中，用纯甲醇定容，在上述色谱条件下测定，记录峰面积，带入标准曲线计算质量浓度ρ_equ。按公式Papp＝(ρ₀-ρ_equ)/ρ_equ，计算脂水分配系数。

表2.单去甲氧基姜黄素吡咯衍生物的脂水分配系数

根据表2的实验结果所示，本发明的单去甲氧基吡咯衍生物的脂水分配系数要显著优于单去甲氧基姜黄素，说明其拥有更好的脂溶性，易于透过血脑屏障，从而具有更好的抗脑内胶质瘤活性。

实施例9单去甲氧基姜黄素吡咯衍生物的透过血脑屏障能力检测

取18只SD大鼠，i.g.给药单去甲氧基姜黄素及其吡咯衍生物，剂量均为5.0mg/kg，分别于15min，1h，4h 3个时间点(N＝3)，放血处死，收集全血，并采集脑组织。采血后，血样置于肝素化的EP管中，在4℃，8000rpm下离心5min，分离血浆，转移血浆于-20℃保存待测。采集脑组织后剥离表面附着血管后转移至-20℃保存待测，分析前称重，加入4倍20％MeOH匀浆后待LC-MS/MS检测。

取待测血浆(或脑匀浆)100μL(需稀释的样品用空白血浆/脑匀浆按比例进行稀释)→加入300μL含有内标(安定：125ng/mL)的乙腈沉淀→涡旋5min→4000rpm 4℃离心10min→取50μL上清→加入150μL 5mM NH₄FA with 0.1％FA water溶液→混匀→10.0μL进样测定。

检测结果如表3所示：

表3单去甲氧基姜黄素吡咯衍生物透脑结果

由检测结果可知，本发明的单去甲氧基姜黄素吡咯衍生物具有良好的透过血脑屏障的能力，在脑中的药物浓度较高，因而针对发生在脑部的胶质瘤具有独特的疗效。

Claims (6)

1.单去甲氧基姜黄素吡咯衍生物，其结构如式I所示：

2.权利要求1所述的单去甲氧基姜黄素吡咯衍生物的制备方法如下：

苯甲醛与等摩尔的吡咯及甲醛水溶液经Mannich反应得到中间体1；将乙酰丙酮与硼酐溶于乙酸乙酯中，加热至回流，再加入中间体1和正丁胺，回流过夜，柱层析得关键中间体2；

将中间体2与硼酐溶于乙酸乙酯中回流半小时，之后再加入3-甲氧基-4羟基苯甲醛与正丁胺，回流24小时，加入1N盐酸回流半小时，反应液用乙酸乙酯萃取，柱层析得目标产物。

3.权利要求2所述的制备方法，其特征在于中间体1的制备方法采用Mannich反应将苯甲醛与等摩尔的吡咯及甲醛水溶液回流反应5小时得到。

4.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的单去甲氧基姜黄素吡咯衍生物。

5.权利要求1所述的单去甲氧基姜黄素吡咯衍生物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

6.权利要求5所述的应用，其特征在于所述肿瘤选自胶质瘤。