CN109810081B - 一种倍半萜并香叶基尿黑酸甲酯杂合物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种倍半萜并香叶基尿黑酸甲酯杂合物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，公开了一种乌药烷型倍半萜并香叶基尿黑酸甲酯杂合物，及其制备方法与应用。该化合物分离自樟科山胡椒属植物乌药(Linderaaggregata)的干燥块根，命名为Linderin A。该化合物的制备方法都采用了天然产物化学领域较为成熟的技术手段，在实际操作容易实现。经体外生物活性研究表明Linderin A具有显著的生长转化因子(Transforming growth factor,TGF)‑β抑制活性。该化合物可以进一步作为抗肝纤维化治疗的先导化合物。

Description

一种倍半萜并香叶基尿黑酸甲酯杂合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及从传统中药樟科山胡椒属植物乌药(Lindera aggregata)中分离得到的一种倍半萜并香叶基尿黑酸甲酯杂合物的制备方法及应用。
背景技术
肝纤维化是慢性肝病向肝硬化发展的中间过程，以胶原蛋白为主的细胞外基质合成与降解失衡，导致过多的胶原在肝内沉积，是多条细胞信号转导通路和一系列细胞信息分子网络共同控制的结果。转化生长因子(Transforming growth factor，TGF)-β是肝纤维化病变过程中最关键的细胞因子之一，其中TGF-β/smad信号转导通路是TGF-β信号转导调节肝星状细胞(HSC)活化促进细胞外基质生成的主要途径。随着对TGF-β研究的不断深入，越来越多的抗纤维化的潜在作用靶点被发现，Smads通路是TGF-β信号转导中的最重要通路，Smad 蛋白是TGF-β超家族的直接底物，是将配体与受体作用的信号由胞浆传导到胞核的中介分子。因此寻找具有TGF-β抑制活性的先导化合物是治疗肝纤维化的重要途径之一。
乌药(Lindera aggregata)为樟科山胡椒属植物，该植物为2015年版《中国药典》收录的乌药的唯一品种，有悠久的使用历史。本品辛、温。归肺、脾、肾、膀胱经，具有行气止痛，温肾散寒的功效，用于治疗寒凝气滞、胸腹胀痛、气逆喘急、膀胱虚冷，遗尿尿频，疝气疼痛，经寒腹痛等病症。
发明内容
本发明的目的在于提供一种倍半萜并香叶基尿黑酸甲酯杂合物，及其制备方法与在治疗肝纤维化方面的应用。
一种倍半萜并香叶基尿黑酸甲酯杂合物，命名为Linderin A，其化学结构式如下所示：
。
本发明还提供了这种杂合物的制备方法，包括如下步骤：
（1） 将乌药干燥块根(5.0 kg)粉碎，获得粗粉，所述粗粉的粒度小于等于10目，将乌药块根粗粉用乙醇加热回流提取，滤过，合并提取液，减压浓缩回收乙醇，得到总浸膏；
（2） 将步骤（1）的总浸膏分散于水中，然后用石油醚萃取，得到石油醚相提取物；
（3） 将将步骤（2）的提取物先经过硅胶柱层析，石油醚-丙酮梯度洗脱，薄层色谱检视后，得到A–G七个组分，组分E经过反相C-18柱层析甲醇-水梯度洗脱后，再分别经过反相C-8乙腈-水等度洗脱和反相C-18甲醇-水等度洗脱，得到1个倍半萜并香叶基尿黑酸甲酯杂合物(Linderin A)。
所述步骤（3）的石油醚-丙酮梯度洗脱过程中，石油醚和丙酮的体积比为100:0至0:100。
所述步骤（3）的甲醇-水梯度洗脱中，甲醇和水的体积比为30:70至100:0。
所述步骤（3）的乙腈-水等度洗脱的乙腈和水的体积比为65:35；甲醇-水等度洗脱的甲醇和水的体积比为75:25。
本发明还提供了上述杂合物在制备治疗肝纤维化的药物上的应用。
本发明的有益效果：
1. 新化合物
本发明从樟科山胡椒属植物乌药的干燥块根中分离得到了1个结构新颖的乌药烷型倍半萜并香叶基尿黑酸甲酯杂合物，该类化合物在天然界中极为罕见，本发明丰富了该类化合物的化学多样性，为化合物领域增加了1种新的化合物，也为乌药的化学分类学研究提供了新的证据。
2. 提取方法简单
该化合物的制备方法都采用了天然产物化学领域较为成熟的技术手段，在实际操作容易实现。
3. 治疗肝纤维化
Linderin A可以显著抑制TGF-β/smad2表达，其IC50为33.41 μM。体外生物活性实验表明该化合物具有较为显著的TGF-β抑制活性，可以作为抗肝纤维化药物的备用先导化合物，具有一定的应用潜力。
附图说明
图1 化合物Linderin A的高分辨质谱；
图2 化合物Linderin A的氢谱；
图3 化合物Linderin A的碳谱和DEPT135谱；
图4 化合物Linderin A的1H-1H COSY 谱；
图5 化合物Linderin A的HSQC谱；
图6 化合物Linderin A的HMBC谱；
图7 化合物Linderin A的NOESY谱；
图8 化合物Linderin A的紫外吸收图谱；
图9 化合物Linderin A的圆二色谱及计算的圆二色谱；
图10 化合物Linderin A的红外图谱；
图11 Linderin A对TGF-β的抑制活性。
具体实施方式
实施例1 Linderin A的制备
提取：将樟科山胡椒属植物乌药(产于浙江台州，5.0 kg)的干燥块根乌药的干燥块根粉碎，以80%乙醇回流提取4次，每次1至2小时，过滤合并提取液，提取液减压浓缩，提取浓缩液加水稀释后用等体积的石油醚萃取4次，减压回收溶剂分别得到石油醚相提取物。
分离：将上一步得到的石油醚相提取物(127.5 g)经硅胶柱层析，以体积比石油醚-丙酮(100:0至0:100)梯度洗脱，进一步经过反相C18硅胶柱层析甲醇-水(30:70至100:0)梯度洗脱，再经过半制备高效液相色谱C8柱分离乙腈-水(65:35)洗脱，最后经过半制备高效液相色谱C18柱分离甲醇-水(75:25)得到Linderin A (3.0 mg)。
Linderin A
[α]22.5 D –35.3 (c 0.3, MeOH)；
紫外光谱 (甲醇): λ max (log ε): 195 (4.23), 225 (3.75)；
圆二色谱 (甲醇): 195 (Δε +1.74) nm；
红外光谱, ν max 3742, 2929, 1743, 1451, 1233, 737 cm-1；
核磁数据见表1；
高分辨质谱 m/z 585.2825 [M + Na]+ (计算值为 C34H42O7, 585.2823)，580.3273[M + NH4]+ (计算值为 C34H42O7 580.2639)。
核磁数据见表1。
表1 Linderin A的核磁数据
实施例2 体外TGF-β抑制活性的测定
细胞培养：A549细胞培养于含有10%胎牛血清RPMI1640培养基中，在5%二氧化碳饱和的培养箱中37oC培养。
Western Blot测定：细胞悬液接种于含有FBS1640RPMI培养基的6孔板中培养24 h后，添加不同样品和试剂(如附图11所示)处理。收集细胞，在裂解液中低温裂解30 min后，样品在10%SDS-PAGE凝胶电泳，转移至硝化纤维素膜上。5%BSA封闭，4oC孵化孵育过夜后，抗体室温二次孵育1 h，采用LI-COR Odyssey成像系统(Lincoln, NE)检测蛋白条带。结果显示Linderin A可以显著抑制TGF-β/smad2表达，其IC50为33.41 μM。

Claims (6)

1.一种倍半萜并香叶基尿黑酸甲酯杂合物，命名为Linderin A，其特征在于，其化学结构式如下所示：
。
2.一种权利要求1所述的杂合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1） 将5.0kg乌药干燥块根粉碎，获得粗粉，所述粗粉的粒度小于等于10目，将乌药块根粗粉用乙醇加热回流提取，过滤，合并提取液，减压浓缩回收乙醇，得到总浸膏；
（2） 将步骤（1）的总浸膏分散于水中，然后用石油醚萃取，得到石油醚相提取物；
（3） 将步骤（2）的提取物先经过硅胶柱层析，石油醚-丙酮梯度洗脱，薄层色谱检视后，得到A–G七个组分，组分E经过反相C-18柱层析甲醇-水梯度洗脱后，再分别经过反相C-8乙腈-水等度洗脱和反相C-18甲醇-水等度洗脱，得到倍半萜并香叶基尿黑酸甲酯杂合物(Linderin A)。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）的石油醚-丙酮梯度洗脱过程中，石油醚和丙酮的体积比为100:0至0:100。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）的甲醇-水梯度洗脱中，甲醇和水的体积比为30:70至100:0。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）的乙腈-水等度洗脱的乙腈和水的体积比为65:35；甲醇-水等度洗脱的甲醇和水的体积比为75:25。
6.一种权利要求1所述的杂合物在制备治疗肝纤维化的药物上的应用。
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