CN109777753A - 一株产多糖的小单孢菌yg-1菌株及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种产多糖的小单孢菌YG‑1菌株，属一种小单孢菌(Micromonospora sp.)，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2019年1月17日，保藏编号为：CCTCC M 2019054；该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。上述小单孢菌YG‑1菌株能够用于发酵制备多糖。本发明提供的菌株可以在短期内进行大规模发酵培养，且发酵成本较低，又不受地、季节等条件限制，因此能够通过微生物发酵的途径解决莼菜自然资源日益匮乏的现状，从而实现较高的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种小单孢菌菌株，该菌株可产多糖，属于微生物技术领域。
背景技术
目前植物内生菌的研究逐渐受到重视，不同植物的各种内生菌相继被发现。内生菌种类的多样性也赋予了其代谢产物的多样性，这也预示着利用微生物代谢发掘生物、化学、医药等新资源具有巨大的潜力。大量的研究表明，植物内生菌可产生与宿主植物相同或相似的活性物质及前体，这一发现直接推动了植物内生菌尤其是经济型植物内生菌研究的广泛展开。随着人们对经济型植物内生菌的逐步研究，利用能够代谢产生相应活性成分的内生菌来生产新型、高效、低成本的活性药物，解决珍稀经济型植物资源紧缺的现状，必将成为将来经济型植物内生菌研究的重点。
虽然植物内生菌尤其是经济型植物内生菌近些年来越来越受到广大学者的关注，但是目前仍然只开展了几百种植物的内生菌研究。莼菜(Brasenia schreberi)又名马蹄菜、湖菜、水葵、露葵、水荷叶、花案菜等，是多年生宿根性浮叶水生植物，属睡莲科莼属。莼菜表面的黏性果胶主要成分为黏性多糖，具有极高的营养价值。莼菜是一种重要的水生经济植物，其对水质的要求很高。在莼菜野生境环境日益恶化的当下，寻找一种莼菜多糖生产的替代途径显得尤为重要。
莼菜内生菌近几年来才开始受到人们的关注，总体来说，关于莼菜内生菌尤其是能够代谢产生相应莼菜多糖成分的研究依然相对较少，鲜有关于产莼菜多糖的莼菜内生菌的报道。
发明内容
本发明解决了背景技术中的问题，提供了一种产多糖的小单孢菌YG-1菌株，该菌株可产莼菜多糖。
本发明人筛选到一株新型菌株，该菌株被命名为YG-1，属一种小单孢菌(Micromonospora sp.)，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2019年1月17日，保藏编号为：CCTCC M 2019054；该菌株的16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
上述小单孢菌YG-1菌株能够用于发酵制备多糖。
利用上述小单孢菌YG-1菌株制备多糖的方法包括以下步骤：首先将小单孢菌YG-1菌株接种于LB液体培养基中，200r/min转速37℃过夜振荡培养2天，将发酵菌液于12000r/min离心，取上清液；将上清液与氯仿-正丁醇溶液混合于离心管中，振荡20-30min，再离心后取上清，将上清液用0.45μm的滤膜过滤两遍，过滤后在70℃下加热浓缩至原体积的1/2-2/3，加入4倍体积的95％乙醇，放入冰箱冷冻过夜，最后用12000r/min转速离心10min，所生成的沉淀即为多糖。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明所提供的小单孢菌YG-1菌株能够代谢产生多糖。所代谢产生的多糖与从天然莼菜中分离纯化到的多糖具有相同的HPLC波谱峰和相似的多糖红外波谱特征峰，以及相似或相同的化学功能团。并且该菌株发酵制备的多糖的生物学活性与天然莼菜多糖相比，对羟自由基的清除效显著高于天然莼菜多糖，具有更好的抗氧化活性。
本发明提供的菌株可以在短期内进行大规模发酵培养，且发酵成本较低，又不受地、季节等条件限制，因此能够通过微生物发酵的途径解决莼菜自然资源日益匮乏的现状，从而实现较高的经济效益。
附图说明
图1为本发明提供的菌株在培养基中的菌落形态图；
图2为莼菜多糖提取物与本发明提供的菌株发酵产物多糖的高效液相(HPLC)分析图；
图3为本发明提供的菌株发酵产物多糖的红外光谱分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
莼菜内生菌的分离
取新鲜的莼菜的茎、叶和根，在无菌的环境下，先用升汞消毒再用蒸馏水漂洗几遍，接种到LB固体培养基上，避光培养。从培养基挑取出了生长良好的菌落移至新的LB培养基平板中，分别进行纯化、编号。本实施例中提供的菌株命名为YG-1号菌株，将该菌株的菌落移至新的LB培养基平板中生长良好，其菌落形态图如图1所示，图1中比例尺＝2mm。从图1中可以看出菌落直径约为1-2mm，形状为较规则的圆形，边缘光滑整齐，湿润，呈乳黄色且菌落表面较透明。
莼菜内生菌的鉴定
将分离纯化的内生菌经处理后(提取DNA或者煮沸处理)，扩增细菌16S rDNA序列(用27F/1492R引物)，扩增产物进行sanger测序，测序结果在NCBI网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对分析，以同源性在97％以上且同源性最高的物种判断为内生菌的种属。
16S rDNA序列扩增引物序列：
引物1 27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
引物2 1492R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’
扩增片段大小约1400-1700bp
根据细菌的标准测序方法，测得上述莼菜内共生菌的序列如SEQ ID NO.1所示，测序结果在NCBI网站上进行比对分析，结果表明，本实施例中提供的莼菜内共生菌为细菌，内生菌的拉丁属名为小单孢菌属(Micromonospora sp.)，菌种命名为YG-1。
申请人将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2019年1月17日，专利菌种保藏编号为：CCTCC M 2019054。
莼菜内生菌多糖的制备
从LB培养基平板中的菌分别挑取部分转移至纯化的菌株接种于LB液体培养基中，200r/min转速37℃过夜振荡培养2天，将发酵菌液于12000r/min离心5min，取上清液。配置氯仿-正丁醇溶液(氯仿：正丁醇＝4:1)，将上清液与有机溶液按3:1混合与离心管中，振荡20-30min，8000r/min离心10min后取上清，注意不能吸到两相之间的蛋白质沉淀。继续按上述操作进行5次除蛋白。将上清液用0.45μm的滤膜过滤两遍，过滤后在70℃下加热浓缩至原体积的1/2-2/3，加入4倍体积的95％乙醇，放入冰箱冷冻过夜，第二天用12000r/min转速离心10min，沉淀即为内生菌多糖。
为比较本发明提供的莼菜内生菌的发酵液是否含有多糖，对内生菌发酵液提取物进行了多糖含量的测定。
首先从天然莼菜中提取和分离出粗多糖作为参照物，方法如下：取莼菜嫩芽，放入NaOH(0.1mol/L)中浸提，料液比1:2(w/v)，25℃碱液浸提1.5h后调节pH至7.0。挑出莼菜芽，用离心机离心分离残渣，用磁力搅拌器将上清液在60℃浓缩1h。然后用sevage法反复处理浓缩的粗提液去除游离蛋白质，再次浓缩至原体积的2/3左右。加入四倍体积无水乙醇沉淀过夜，然后将混合物以4000r/min离心10min以获得沉淀物，用少量水溶解沉淀后浓缩再次加入四倍体积乙醇沉淀过夜，重复操作三次，最后干燥获得莼菜多糖(BSP)。
测定方法如下：将多糖经硫酸水解后，采用DNS法(3-氨基-5-硝基水杨酸)测定菌液中的分泌糖含量，以D-葡萄糖醛酸为标准，首先通过不同浓度的葡萄糖标准液与DNS试剂、硫酸反应后的吸光度做出标准曲线。经测定，标准曲线为y＝0.0368x-0.0436(R2＝0.9807)。根据标准曲线，测定多糖的含量。实验结果表明，BSP样品中多糖的含量为0.30±0.01mg/mL，小单孢菌属YG-1菌株发酵提取物中的多糖含量为0.07±0.001mg/mL。
多糖组分的性能鉴定
为比较莼菜内生菌多糖和莼菜多糖是否还有相同的多糖组分，本实施例进行了HPLC分析。结果如图2所示，其中上图为本实施例中内生菌多糖，下图为提取到的天然莼菜多糖，从图2中可以看出，小单孢菌属放线菌多糖提取物在19min有一波谱峰，在第21min出现一个次波谱峰，值得注意的是，第21min出现的次波普峰与莼菜多糖的HPLC出峰时间类似，表明了莼菜内共生菌除产生特定的多糖峰值外，也具备产生与莼菜多糖类似的多糖成份的能力。
莼菜多糖的结构分析与内生菌的糖类比较
为进一步确定莼菜内生菌多糖和莼菜多糖是否还含有相同的化学功能团，本实施例中进一步进行了红外光谱分析。
从LB培养基平板中的菌分别挑取部分转移至纯化的菌株接种于LB液体培养基中，200r/min转速37℃过夜振荡培养2天。将菌液离心，上清液用sevage法除去蛋白，再用4倍体积乙醇醇析，过滤分离沉淀，用红外光谱分析沉淀或醇析液中是否具有糖苷键。用红外光谱分析从莼菜中提取出的多糖，与含有糖苷键的沉淀或醇析液的图谱作比较。
红外光谱图如图3所示，图3中分析表明，本实施例提供的莼菜内生菌多糖具有9个特征吸收峰。从红外光谱图上可看出，3385.07cm-1处的吸收峰是-OH的伸缩振动吸收峰，2926.01cm-1是C-H的伸缩振动吸收峰，这是两个多糖典型的波谱峰，这与莼菜多糖的典型波谱峰类似；2854.65cm-1、1558.48cm-1和1458.18cm-处的吸收峰是苯环上的C-H的伸缩振动吸收峰，其是莼菜内共生菌特有的多糖波谱峰；1653.00cm-1处的吸收峰是碳氧双键(C＝O)吸收峰；1406.11cm-1，549.71cm-1处的吸收峰均是C-H的伸缩振动吸收峰。特别注意的是，1083.99cm-1处的吸收峰是与配糖键C-O-H相关联的吸收峰，是β-葡聚糖的特征峰。
与莼菜多糖相比，莼菜内共生菌产多糖在3385.07cm-1和2926.01cm-1具有相同的多糖吸收峰，同时又具有独特的特征峰(在2854.65cm-1、1558.48cm-1和1458.18cm-1)。莼菜内共生菌和莼菜多糖，在1083.99cm-1处有相同的β-葡聚糖的特征峰。不同来源多糖红外光谱分析及其特征峰解析如下表所示：
多糖抗氧化活性的测定
本实施例使用南京建成生物提供的羟自由基试剂盒对莼菜多糖提取物进行检测。将多糖样品与试剂混合均匀，于37℃准确反应1min，立即加入显色剂终止反应，混合均匀后，室温放置20min。将分光光度计用蒸馏水调零，在550nm处测各管的吸光度值。通过实验结果显示对羟自由基的清除能力，得出莼菜多糖的部分抗氧化活性。
多糖的重要性体现在其生理活性上。羟自由基(·OH)是一种氧化能力很强的自由基，其性质很活泼，氧化各种有机物和无机物的速率极快，是造成组织脂质过氧化、核酸断裂、蛋白质和多糖分解的主要因素，与机体衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬能力有关。为进一步确定莼菜内共生菌多糖的生物学活性，本实施例中以羟自由基产生体系比较了莼菜内共生菌多糖的抗氧化活性。研究结果表明，莼菜内共生菌多糖对羟自由基的产生的抑止作用在1.0mg/mL情况下达到最强(如下表所示)，而莼菜多糖对羟自由基产生的抑止效应随着浓度的升高而升高(如下表所示)。实验结果显示，莼菜内共生菌多糖对羟自由基的清除效应显著高于莼菜多糖。
序列表
<110> 中南民族大学
<120> 一株产多糖的小单孢菌YG-1菌株及其用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1420
<212> DNA
<213> 小单孢菌(Micromonospora sp.)
<400> 1
gcatggcagc gctagagttg ctcctggagc ggaaggccct tcggggtact cgagcggcga 60
acgggtgagt aacacgtgag taacctgccc caggctttgg gataaccctc ggaaacgggg 120
gctaataccg aatatgacct ccggacgcat gtttggtggt ggaaagtttt tcggcctggg 180
atgggctcgc ggcctatcag cttgttggtg gggtgatggc ctaccaaggc gacgacgggt 240
agccggcctg agagggcgac cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg 300
gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcggaagcct gatgcagcga cgccgcgtga 360
gggatgacgg ccttcgggtt gtaaacctct ttcagcaggg acgaagcgta agtgacggta 420
cctgcagaag aagcgccggc caactacgtg ccagcagccg cggtaagacg tagggcgcga 480
gcgttgtccg gatttattgg gcgtaaagag ctcgtaggcg gcttgtcgcg tcgaccgtga 540
aaacttgggg ctcaacccca agcctgcggt cgatacgggc aggctagagt tcggtagggg 600
agactggaat tcctggtgta gcggtgaaat gcgcagatat caggaggaac accggtggcg 660
aaggcgggtc tctgggccga tactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga 720
ttagataccc tggtagtcca cgctgtaaac gttgggcgct aggtgtgggg ggcctctccg 780
gttccctgtg ccgcagctaa cgcattaagc gccccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct 840
aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggcgg agcatgcgga ttaattcgat 900
gcaacgcgaa gaaccttacc tgggtttgac atggccgcaa aacctccaga gatggggggt 960
ccttcggggg cggtcacagg tggtgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1020
gttaagtccc gcaacgagcg caaccctcgt tcgatgttgc cagcgcgtta tggcggggac 1080
tcatcgaaga ctgccggggt caactcggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcatcatgc 1140
cccttatgtc cagggcttca cgcatgctac aatggccggt acaatgggct gcgataccgt 1200
gaggtggagc gaatcccaaa aagccggtct cagttcggat cggggtctgc aactcgaccc 1260
cgtgaagtcg gagtcgctag taatcgcaga tcagcaacgc tgcggtgaat acgttcccgg 1320
gccttgtaca caccgcccgt cacgtcacga aagtcgtcaa cgtaggaagt gcggtggccc 1380
caccctggtg gaggcaacgt tagagtagag ctatccgccc 1420
Claims (3)
1.一株产多糖的小单孢菌(Micromonospora sp.)YG-1菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2019054，该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述小单孢菌YG-1菌株的用途，其特征在于：用于发酵制备多糖。
3.利用权利要求1所述小单孢菌YG-1菌株制备多糖的方法，其特征在于包括以下步骤：首先将小单孢菌YG-1菌株接种于LB液体培养基中，200r/min转速37℃过夜振荡培养2天，将发酵菌液于12000r/min离心，取上清液；将上清液与氯仿-正丁醇溶液混合于离心管中，振荡20-30min，再离心后取上清，将上清液用0.45μm的滤膜过滤两遍，过滤后在70℃下加热浓缩至原体积的1/2-2/3，加入4倍体积的95％乙醇，放入冰箱冷冻过夜，最后用12000r/min转速离心10min，所生成的沉淀即为多糖。
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