CN109770163A

CN109770163A - 一种去除燕窝蛋白来源中内源性激素的方法

Info

Publication number: CN109770163A
Application number: CN201910199142.8A
Authority: CN
Inventors: 胡勇刚; 冯涛
Original assignee: Talp (beijing) Pharmaceutical Technology Co Ltd
Current assignee: Talp (beijing) Pharmaceutical Technology Co Ltd
Priority date: 2019-01-07
Filing date: 2019-03-15
Publication date: 2019-05-21

Abstract

本申请公开了一种去除燕窝蛋白来源中内源性激素的方法，涉及内源性激素的分离技术领域，解决了现有技术中尚未出现去除燕窝中激素的技术问题。本申请的去除燕窝蛋白来源中内源性激素的方法，包括以下步骤：(1)、选取干净的干燕窝在水溶液中进行超声波处理后捞出，控干游离水后，得到第一燕窝；(2)、将第一燕窝加入蛋白质保护剂的水溶液中，进行浸泡后，得到第二燕窝；(3)、将第二燕窝放入超临界络合釜中，设置第一萃取参数，开启循环泵，使得超临界流体在超临界络合釜循环，进行激素络合，得到第三燕窝；(4)、设置第二萃取参数，进行激素分离，得到第四燕窝。本申请主要用于燕窝蛋白来源中内源性激素的分离。

Description

一种去除燕窝蛋白来源中内源性激素的方法

技术领域

本申请涉及内源性激素的分离，具体涉及一种去除燕窝蛋白来源中内源性激素的方法。

背景技术

由于食品安全事件频发，消费者对“激素奶粉”、“健美猪”以及快餐店里的“快生鸡”产生了恐慌，导致了全球范围内各国政府、媒体及人民群众对食品中激素恐慌。特别是媒体报道吃燕窝导致性早熟等新闻，大部分人群对激素缺乏正确的认识。

动物激素主要由动物分泌细胞或内分泌腺分泌的一类信息传递物质，大部分是蛋白质，少部分是RNA和固醇类物质。在极微量的水平对机体生理过程起重要调节作用的物质。激素的概念有狭义广义之分，狭义的激素指机体自身分泌的内源性激素，广义的激素包括内源性激素和有激素作用的外源性激素。人工合成的激素类药物、环境激素属于外源性激素。国内外在兽医临床和动物养殖过程中允许使用经过批准使用的激素类兽药

固醇类激素包括：雄激素、雌激素、孕激素三类；雌激素包括：雌二醇、雌三醇、雌酚、雌酮，是由卵巢分泌的雌激素。雌激素是一类有广泛生物活性的类固醇化合物。

根据其化学结构和来源可分为三大类:内源性性激素，包括睾酮、孕酮、雌酮、17β-雌二醇等；人工合成类固醇激素，包括丙酸睾酮、甲烯雌醇、苯甲酸雌二醇、醋酸群勃龙等；人工合成的非类固醇激素，包括己烯雌酚、己烷雌酚等。

研究表明，经常摄入含有性激素含量较高的食物可导致儿童性早熟、诱发癌症、引起内分泌失调等问题出现。如玉米赤霉醇，又称畜大壮，是一种具有雌激素样作用的物质，其残留会引起人体性激素机能紊乱及影响第二性征的正常发育，在外部条件诱导下还可能致癌。

燕窝是指经过金丝燕喉部有很发达的粘液腺所分泌的唾液在空气中凝结成固体所形成的。燕盏是毛燕经过清洗、挑毛、定型和干燥后达到少有杂质、可正常炖食标准的燕窝。以燕窝的来源分类，可分两大类，洞燕和屋燕两类，燕窝是中国自明代以来开始被食用的传统名贵食品之一。主产于马来西亚、印度尼西亚、泰国和缅甸等东南亚国家。燕窝含有丰富的糖类、有机酸、游离氨基酸以及特征物质——唾液酸，具有滋阴、润燥和补中益气等功效，作为药食两用的高档滋补品，深受国内外消费者的喜爱。

燕窝里的激素包括：雌二醇、雌三醇、甲羟孕酮、17α-羟基孕酮和黄体酮等。

发明内容

本申请的目的在于提出一种去除燕窝蛋白来源中内源性激素的方法，用于解决现有技术中尚未出现去除燕窝中激素的技术问题。

本申请的去除燕窝蛋白来源中内源性激素的方法，包括以下步骤：

(1)、选取干净的干燕窝在水溶液中进行超声波处理后捞出，控干游离水后，得到第一燕窝；

(2)、将第一燕窝加入蛋白质保护剂的水溶液中，进行浸泡后，得到第二燕窝；

(3)、将第二燕窝放入超临界络合釜中，设置第一萃取参数，开启循环泵，使得超临界流体在超临界络合釜中循环，进行激素络合，得到第三燕窝；

(4)、设置第二萃取参数，进行激素分离，得到第四燕窝。

具体地，步骤(1)中水溶液的温度控制在0℃～20℃，超声时间为20min～1h。优选地，步骤(1)中，水溶液的温度控制在0℃～10℃，超声时间为20min～30min。

具体地，步骤(2)中使用的蛋白质保护剂为聚乙二醇，优选聚乙二醇的分子量在1000以上，再优选聚乙二醇2000或者聚乙二醇3000。

具体地，步骤(2)中蛋白质保护剂与干燕窝的质量比为(0.2～1)：1，优选(0.5～1)：1，再优选(0.6～0.8)：1，浸泡时间为20min～40min。

具体地，步骤(3)中的第一萃取参数为：压力10.0Mpa～30.0Mpa，温度15℃～45℃，时间20min～60min；优选地，步骤(3)中的第一萃取参数为：压力15.0Mpa～20.0Mpa，温度20℃～35℃，时间30min～50min；再优选地，激素萃取参数为：压力18.0Mpa～20.0Mpa，温度25℃～30℃，时间30min～50min。

具体地，步骤(4)中的第二萃取参数为压力15.0Mpa～35.0Mpa，温度20℃～50℃，时间10min～30min；优选地，步骤(4)中的第二萃取参数为压力20.0Mpa～35.0Mpa，温度25℃～45℃，时间15min～20min；再优选地，步骤(4)中的第二萃取参数为压力25.0Mpa～30.0Mpa，温度35℃～40℃，时间15min～20min。

本申请的去除燕窝蛋白来源中内源性激素的方法，一方面，使用超声波提高了燕窝蛋白质中激素的通透性；一方面，通过加入蛋白质保护剂，避免了燕窝蛋白质的变性；另一方面，通过在超临界二氧化碳中进行络合萃取，实现了激素的精确分离。

在本文中所用的术语具有其在本领域内公知的含义，然而为清楚起见，仍然给出以下定义。

术语“基本”或“基本上”并不排除“完全”的意思。如一个成分“基本上不含”Y，也可以是完全不含有Y。在限定具体数值的情况下，是指该具体数值具有以该具体数值为基础的上下浮动的范围，浮动范围可以是该具体数值的+/-5％，+/-4％，+/-3％，+/-2％，+/-1％，+/-0.5％，+/-0.2％，+/-0.1％，+/-0.05％，+/-0.01％等。如果需要，“基本”或“基本上”可以以上浮动范围代替或从本发明定义中删除。

术语“包括”、“包含”、“含有”和“具有”既包括提到的因素，也允许包括附加的、不确定的因素。

“大约”、“约”、“左右”在限定具体数值的情况下，是指该具体数值具有以该具体数值为基础的上下浮动的范围，浮动范围可以是该具体数值的+/-5％，+/-4％，+/-3％，+/-2％，+/-1％，+/-0.5％，+/-0.2％，+/-0.1％，+/-0.05％，+/-0.01％等。

本发明中，为简明起见而使用的数值范围不仅包括其端点值，也包括其所有的子范围和此范围内所有的单独的数值。例如，数值范围1-6不仅包括子范围，例如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等，也包括此范围内单独的数值，例如1、2、3、4、5、6。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是燕窝原料中标准定量离子质谱及保留时间图。

具体实施方式

下面结合本申请实施例对技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

实施例一

称取100克干燕窝，含水量14.7％，放入超声波水中处理25min，通过加入冰块，水温控制在10℃以下。结束捞出燕窝，控干游离水至无水流滴下，备用。

溶解60克聚乙二醇2000在80℃左右的热水中，等完全溶解后将处理好的燕窝进行浸泡20min。

将以上聚乙二醇2000处理的燕窝放入超临界络合釜中，开启循环泵，使得超临界流体进行循环，萃取参数为，压力18.0Mpa，温度25℃，时间30min，络合激素。

调高超临界流体的压力达到25.0Mpa，升高超临界流体温度到35℃，15min后，进行激素分离，还分离出聚乙二醇2000 59.99g，剩余0.01g存在于流体里面。

泄压后，得到去除激素后的燕窝94.3克，水分含量11.5％，为样品1。

需要说明的是，超临界流体可以为超临界二氧化碳、超临界丙烷、超临界环氧丙烷、超临界甲烷中的任意一种。

实施例二

称取100克干燕窝，含水量14.7％，放入超声波水中处理20min，通过加入冰块，水温控制在20℃。结束捞出燕窝，控干游离水至无水流滴下，备用。

溶解100克聚乙二醇3000在70℃左右的热水中，等完全溶解后将处理好的燕窝进行浸泡40min。

将以上聚乙二醇3000处理的燕窝放入超临界络合釜中，开启循环泵，使得超临界二氧化碳进行循环，萃取参数为，压力10.0Mpa，温度45℃，时间20min，络合激素。

调高超临界二氧化碳的压力达到15.0Mpa，升高超临界二氧化碳的温度到50℃，10min后，进行激素分离，还分离出聚乙二醇3000 99.98g，剩余0.02g存在于超临界二氧化碳中。

泄压后，得到去除激素后的燕窝92.6克，水分含量10.1％，为样品2。

实施例三

称取100克干燕窝，含水量14.7％，放入超声波水中处理60min，通过加入冰块，水温控制在15℃。结束捞出燕窝，控干游离水至无水流滴下，备用。

溶解20克聚乙二醇1000在75℃左右的热水中，等完全溶解后将处理好的燕窝进行浸泡30min。

将以上聚乙二醇1000处理的燕窝放入超临界络合釜中，开启循环泵，使得超临界甲烷进行循环，萃取参数为，压力30.0Mpa，温度15℃，时间60min，络合激素。

调高超临界聚乙二醇1000的压力达到35.0Mpa，升高超临界甲烷的温度到20℃，30min后，进行激素分离，还分离出聚乙二醇1000 19.99g，剩余0.01g存在于超临界甲烷中。

泄压后，得到去除激素后的燕窝95.8克，水分含量10.6％，为样品3。

实施例四

称取100克干燕窝，含水量14.7％，放入超声波水中处理30min，通过加入冰块，水温控制在18℃以下。结束捞出燕窝，控干游离水至无水流滴下，备用。

溶解55克聚乙二醇2000在80℃左右的热水中，等完全溶解后将处理好的燕窝进行浸泡40min。

将以上聚乙二醇2000处理的燕窝放入超临界络合釜中，开启循环泵，使得超临界丙烷进行循环，萃取参数为，压力20.0Mpa，温度20℃，时间30min，络合激素。

调高超临界丙烷的压力达到25.0Mpa，升高超临界丙烷的温度到45℃，20min后，进行激素分离，还分离出聚乙二醇2000 54.97g，剩余0.03g存在于超临界丙烷中。

泄压后，得到燕窝94.7克，水分含量11.7％，为样品4。

分别准确称取1.0g上述实施例制得的燕窝样品(分别为样品1、样品2、样品3、样品4)和燕窝原料，经60℃烘干12h，用粉碎机粉碎,磨成细粉,将各样品混匀分装于超纯水润洗后干燥的容器内,并标明标记，按照GB/T21981，SN/T1980，农业部1031号公告-1-2008的检测条件检测以上制得的燕窝产品中的：雌二醇、雌三醇、甲羟孕酮、17α-羟基孕酮和黄体酮等激素指标。

液相色谱的条件为：采用ACQUITYBEH C1色谱柱(50mm×2.1mm，1.7μm)、质谱检测器，进样量10μL。流动相为甲醇和水，梯度洗脱，流速为0.25mL/min，柱温45℃。

质谱的条件为：使用安捷伦电喷雾单级四级杆质谱与高效液相色谱串联.电喷雾源最优化的运行参数如下:(1)负离子模式:电离方式为电喷雾电离(ESI)；电喷雾电压(IS)为3000V；离子源温度(TEM)为110℃；气帘气压力(CUR)为89.63kPa；雾化气压力(GS1)为137.90kPa；辅助气流速(GS2)为137.90kPa；流速为0.16mL/min；脱溶剂温度为480℃；(2)正离子模式:电喷雾电压(IS)为3000V；检测方式为多反应监测(MRM)；离子源温度为110℃；喷雾气体压力为89.63kPa；雾化气压力(GS1)为137.90kPa；辅助气流速(GS2)为137.90kPa；流速为0.16mL/min；脱溶剂温度为480℃。

检测极限达到了μg/kg，ng/g，燕窝原料的检测结果如下1所示：

样品1、样品2、样品3、样品4对应的样品中均未显示有峰值，样品1、样品2、样品3、样品4中不存在激素。

燕窝原料样品中检测出的激素成分如图1所示。

图1是燕窝原料中标准定量离子质谱及保留时间图。如图1所示，图1中横坐标表示燕窝原料中的激素成分：从左到右分别为：17beta-NT为诺龙4-雄甾烯-19-去甲-17β-醇-3-酮；ETS为睾酮；17A-MEG为醋酸甲地孕酮；ANR为醋酸炔诺酮；17A-CMN为醋酸氯地孕酮；17A-MED为醋酸甲羟孕酮；PG为孕酮；ADR为雄酮；17PETS为丙酸睾丸素；17beta-EST为苯甲酸雌二醇；EST为雌三醇；COR为皮质甾酮；17-beta-EST为雌二醇；ESN为雌酮；EES为炔雌醇；17-alpha-EST为17α-雌二醇；17A-HPG为17α-羟基孕酮；MED为黄体酮。

需要指出的是，本申请的去除燕窝蛋白来源中内源性激素的方法适用于不同水分含量的干燕窝；本申请中的蛋白质保护剂在其溶剂度以上温度的水中溶解。

尽管已描述了本申请的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本申请范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本申请进行各种改动和变型而不脱离本申请的精神和范围。这样，倘若本申请的这些修改和变型属于本申请权利要求及其等同技术的范围之内，则本申请也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一种去除燕窝蛋白来源中内源性激素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(3)、将第二燕窝放入超临界络合釜中，设置第一萃取参数，开启循环泵，使得超临界流体在超临界络合釜循环，进行激素络合，得到第三燕窝；

(4)、设置第二萃取参数，进行激素分离，得到第四燕窝。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中水溶液的温度控制在0℃～20℃，超声时间为20min～1h。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，水溶液的温度控制在0℃～10℃，超声时间为20min～30min。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中使用的蛋白质保护剂为聚乙二醇。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中使用的蛋白质保护剂为聚乙二醇的分子量在1000以上。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中使用的蛋白质保护剂为聚乙二醇2000或者聚乙二醇3000。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中蛋白质保护剂与干燕窝的质量比为(0.2～1)：1，浸泡时间为20min～40min。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的第一萃取参数为：压力10.0Mpa～30.0Mpa，温度15℃～45℃，时间20min～60min。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的第一萃取参数为：压力15.0Mpa～20.0Mpa，温度20℃～35℃，时间30min～50min。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中的第二萃取参数为压力15.0Mpa～35.0Mpa，温度20℃～50℃，时间10min～30min。