CN109735643B - 鉴别或辅助鉴别黄芪的引物对及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及鉴别或辅助鉴别黄芪的引物对及其应用，该引物对可用于对蒙古黄芪与膜荚黄芪进行鉴别。
Description
技术领域
本发明涉及一种鉴别或辅助鉴别黄芪的引物对及其应用，该引物对可用于对蒙古黄芪与膜荚黄芪进行鉴别。
背景技术
黄芪为豆科黄耆属药材，《中国药典》规定黄芪药材植物来源为蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根。膜荚黄芪资源分布较为广泛，多分布于黑龙江、华北及西北等地区，蒙古黄芪的产地变迁较为复杂，目前多在山西、内蒙古、陕西等地栽培分布。
目前市场上蒙古黄芪与膜荚黄芪的种源混乱，严重影响了中药产业的发展。传统的形态等鉴别方法很难准确鉴别蒙古黄芪与膜荚黄芪，例如，从植物外观形态，主要是叶片的形状及数量等，可以初步鉴别膜荚黄芪与蒙古黄芪，但若从种子外观形态及药材的性状来看，则很难对膜荚黄芪与蒙古黄芪作以区分。
分子标记技术如RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA标记)、AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性)、SSR(Simple Sequence Repeat，简单重复序列标记)等结果可重复性差、工作量大、成本高。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指发生在染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性。在漫长的进化过程中，生物体形成了自身特有的DNA碱基序列，比较不同物种间或同一物种不同地方品种间的SNP差异，可以了解物种间的亲缘关系和进化的生物信息学，从而对不同物种或同一物种不同地方的品种进行精细鉴定和分类。从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测，单个核苷酸多态性标记可帮助区分个体间遗传物质的差异。
发明内容
本发明涉及一种基于单核苷酸多态性标记的鉴别或辅助鉴别黄芪的方法，运用分子生物学的分子标记技术，对不同基原的黄芪植物样本进行DNA提取，PCR扩增，引物筛选及生物信息学分析，找到快速准确鉴别不同基原黄芪(蒙古黄芪与膜荚黄芪)的方法。
发明人通过大量阅读文献以及实地调研等方式确定蒙古黄芪与膜荚黄芪的主产区。蒙古黄芪的主产区为山西、内蒙古等地，膜荚黄芪的主产区为山西、吉林等地。通过深入黄芪主产区，与当地种植大户沟通，采集了大量正品的蒙古黄芪与膜荚黄芪野生与栽培样本。
通过对采集的样本进行DNA提取，运用不同的序列引物进行PCR扩增，并测序，通过生物信息学分析比对序列，筛选的序列包括核基因序列ITS(Internal transcribedspacer，内转录间隔区)与ITS2(Internal transcribed spacer 2)，叶绿体基因序列psbA-trnH(主要是指psbA与tRNA-His intergenic spacer region间隔区序列)、rbcL(ribulose1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)、matK(maturase K)。
运用MEGA软件进行序列比对与分析，找到可以稳定准确鉴别蒙古黄芪与膜荚黄芪的引物序列(在该序列某一位点或某几个位点，蒙古黄芪与膜荚黄芪样本的碱基均不一样，且各自一致)。通过最终数据比对筛选，发现核基因ITS序列可以将膜荚黄芪与其变种蒙古黄芪进行鉴别。经过序列比对分析，发现在ITS序列中的476位点(ITS序列为独立的序列，有其固定的组成部分，为ITS1、5.8S、ITS2，虽然不同物种之间各组成部分的长度不同，但同一物种或其近缘种ITS序列的长度是基本一致的。而且通过MEGA软件进行序列比对后，每条序列的碱基均相对应，保证每条序列都是在476位点处产生碱基突变)，呈现规律性的突变碱基(Single Nucleotide Polymorphisms，单核苷酸多态性，SNP变异位点)。蒙古黄芪在ITS序列的476位点为C碱基，膜荚黄芪在ITS序列的476位点为T碱基(如图1所示)。
基于此，本发明提供一种基于单核苷酸多态性标记的鉴别或辅助鉴别黄芪的方法，其包括以下步骤：
1)提取待测黄芪的DNA作为模板；
2)通过测序，若ITS序列第476位点为T碱基，则该待测黄芪是膜荚黄芪，若ITS序列第476位点为C碱基，则该待测黄芪是蒙古黄芪。
在本发明优选的实施方式中，可以加入引物对进行PCR扩增，获得扩增产物，然后对扩增产物进行测序。优选的是，应用ITS序列的4R/5F引物(4R/5F引物对)对模板进行PCR扩增。
在本发明优选的实施方式中，可以加入引物对进行PCR扩增，获得扩增产物，然后对扩增产物进行电泳检测。优选的是，扩增产物为约400bp的DNA片段。
本发明涉及一种用于鉴别或辅助鉴别黄芪的引物对，其可以选自：引物对1、引物对2和引物对3，其中，引物对1的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，引物对2的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，引物对3的序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
本发明涉及一种用于鉴别或辅助黄芪的方法，其包括以下步骤：
1)提取待测黄芪的DNA作为模板；
2)采用至少一种引物对作为PCR扩增引物，进行PCR扩增，获得扩增产物；
3)检测扩增产物。
进一步地，所述检测为分子水平的检测。如可以为杂交、基因芯片、PCR检测等。PCR检测简便易行，因此，优选为PCR检测。
在本发明优选的实施方式中，所述引物对选自：引物对1、引物对2和引物对3，其中，引物对1的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，引物对2的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，引物对3的序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
在本发明优选的实施方式中，引物对1的PCR条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1.5min(每个循环增加3s)，30个循环；72℃延伸7min。
在本发明优选的实施方式中，引物对2的PCR条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1.5min(每个循环增加3s)，30个循环；72℃延伸7min。
在本发明优选的实施方式中，引物对3的PCR条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，48℃退火1min，72℃延伸1.5min(每个循环增加3s)，30个循环；72℃延伸7min。
在本发明优选的实施方式中，可以通过琼脂糖凝聚电泳来检测所述扩增产物，若电泳显示出现扩增条带，则表明该待测黄芪是蒙古黄芪。优选的是，所述的扩增条带的分子量是约400bp。
在本发明优选的实施方式中，可以在扩增后的反应体系中加入荧光染料，例如荧光染料SYBR Green I，若检测到所述含有荧光染料的体系产生绿色荧光，则表明该待测黄芪是蒙古黄芪。优选的是，含有荧光染料的体系是否产生绿色荧光是在365nm紫外波长下进行检测的。
本发明还提供了鉴别黄芪或辅助鉴别黄芪的PCR试剂，其可以含有至少一种上述的引物对，该PCR试剂可以用于检测待测黄芪是否是蒙古黄芪或是否含有蒙古黄芪。
本发明还提供了鉴别黄芪或辅助鉴别黄芪的试剂盒，其可以含有至少一种上述的引物对或者至少一种上述的PCR试剂。该试剂盒为鉴定黄芪提供了便利。
在本发明优选的实施方式中，该试剂盒中包括PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和dNTP。
在本发明优选的实施方式中，该试剂盒中还可以含有荧光染料，例如荧光染料SYBR Green I。
附图说明
图1蒙古黄芪与膜荚黄芪ITS序列SNP变异位点的软件分析的截图
图2引物对1鉴别不同来源的黄芪时的电泳检测图
图3引物对2鉴别不同来源的黄芪时的电泳检测图
图4引物对3鉴别不同来源的黄芪时的电泳检测图
本文中描述并要求保护的发明内容不限于本文中公开的以下具体实施方案的范围，这些实施方案仅旨在说明本发明的几个方面。
实施例1单核苷酸多态性标记的筛选
从山西、内蒙古、吉林等地主产区采集标准的蒙古黄芪与膜荚黄芪野生与栽培植物样本共计89份，可以典型地代表各主产区的样本类型。
黄芪标准品的详细信息见下表1：
采集样本均为实地采集(附GPS信息)
1.1总DNA提取
将采集的各黄芪植物叶片样本使用硅胶进行干燥，待完全干燥后，使用小钢珠与球磨仪(德国FRITSCH，PULVERISETTE 6)将样本粉碎研磨。利用试剂盒法(CTAB法，天根生化，DP305试剂盒)提取植物样本基因组总DNA。具体步骤如下：
1)将研磨好的样本粉末迅速转移至2.0mL的EP管中，加入65℃预热的缓冲液GP1700μl，巯基乙醇1μl；将EP管盖子顶端用Parafilm封口膜进行密封，上下颠倒混匀后，放入65℃水浴30min，在水浴过程中，不断颠倒EP管数次。
2)加入700μl氯仿：异戊醇(24:1)混合液，充分混匀，12000rpm离心5min。
3)将离心后分离的上清液小心转移至新的2.0EP管中，加入700μl异丙醇(放-20℃冰箱保存，低温效果更佳)，充分混匀。
4)将混匀后的液体分两次转移到吸附柱CB3内，12000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液。
5)向吸附柱CB3内加入500μl缓冲液GD(使用前确定加入规定体积的无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液。
6)向吸附柱CB3内加入700μl漂洗液PW，(使用前确定加入规定体积的无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液。
7)重复6步骤。
8)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱CB3放入新的1.5mL EP管中，置室温放置数分钟，直到彻底晾干吸附柱CB3内的残余漂洗液(以无乙醇味为判断标准)。
9)向吸附柱CB3中间滤膜为止悬空加入100μl洗脱液TE，室温放置3-5分钟，使得洗脱液充分洗脱DNA。
10)将放有吸附柱CB3的1.5mLEP管12000rpm离心2min，将溶液收集到1.5mLEP管内，-20℃保存备用。
1.2引物筛选与PCR扩增
选择引物，对蒙古黄芪与膜荚黄芪样本的总DNA进行PCR扩增及电泳
检测。PCR扩增反应体系为25μl，组成为ddH2O 8.5μl，2×Taq PCR MIX 12.5μl，上下游引物各1μl，DNA模板2μl。
各引物序列及PCR反应条件分别为：
ITS2序列，其引物(S2F:ATGCGATACTTGGTGTGAAT,S3R:GACGCTTCTCCAGACTACAAT)，该引物对序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，
94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸45秒，40个循环；72℃延伸10分钟。
ITS序列，其引物(5F:GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG,4R:TCCTCCGCTTATTGATATGC)，该引物对序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，
94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟(每个循环增加3秒)，30个循环；72℃延伸7分钟。
psbA-trnH序列，其引物(fwdPA:GTTATGCATGAACGTAATGCTC,revTH:CGCGCATGGTGGATTCACAATCC)，该引物对序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示，
94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，30个循环；72℃延伸7分钟。
matK序列，其引物(KIM_3F:CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG,KIM_1R:ACCCAGTCCATCTGGAA ATCTTGGTTC)，该引物对序列分别如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示，
94℃预变性1分钟；94℃变性30秒，52℃退火20秒，72℃延伸50秒，35个循环；72℃延伸5分钟。
rbcL序列，其引物(1f:ATGTCACCACAAACAGAAAC,724r:TCGCATGTACCTGCAGTAGC)，该引物对序列分别如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示，
95℃预变性2分钟；94℃变性1分钟，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，34个循环；72℃延伸7分钟。
PCR反应产物电泳检测：配置1％琼脂糖凝胶(0.6g琼脂糖+60mL 0.5×TBE缓冲液，微波加速溶解；加入1μl核酸染料GeneGreen，待冷却至65℃左右时倒入放置梳子的胶盒内；室温放置10-20分钟，凝胶彻底凝固后拔出梳子，将凝胶放入电泳槽内，电泳槽内的TBE缓冲液需没过凝胶；)，将PCR产物点入凝胶内，同时点入DNA Marker(DL2000)，调整电泳仪电压至100-140V，时间为30分钟，开始电泳。电泳结束后，将凝胶放入凝胶成像仪，紫外灯下观察电泳条带，如每份样品均有单一且明亮的条带，说明PCR扩增成功，可进行后续测序工作。
1.3测序与序列比较分析
将全部PCR产物点入琼脂糖凝胶内进行电泳，并对凝胶中的条带位置进行切胶回收，并对回收后的产物进行上机测序。
测序完成后，对返回的序列运用CodonCode Aligener软件进行序列拼接，去掉低质量区序列；运用MEGA软件进行序列比对与分析，找到可以稳定准确鉴别蒙古黄芪与膜荚黄芪的引物序列。经过序列比对分析，发现在ITS序列中的476位点呈现规律性的突变碱基(Single Nucleotide Polymorphisms，单核苷酸多态性，SNP变异位点)。蒙古黄芪在ITS序列的476位点为C碱基，但是如图1所示，膜荚黄芪在ITS序列的476位点为T碱基。
实施例2基于单核苷酸多态性标记对黄芪进行鉴别
2.1总DNA提取
取待测黄芪干燥样本，可在去除表面污染物后直接称取约30mg，放入灭菌的1.5mL离心管内，加入两粒灭菌后的小钢珠，放入球磨仪内1500rpm研磨3-5分钟；新鲜样本可称取约0.5g，去除表面污染物，加入干净的研钵内，用液氮充分研磨成粉末，取适量加入1.5mL离心管内；
加入250μl细胞核裂解液(主要用于将样本中的细胞壁裂解，释放出细胞内的遗传物质)，5μl RNA酶溶液，充分震荡混匀；
加入20μl蛋白酶K，充分震荡混匀；
将其置于65℃水浴锅内水浴1小时(期间反复倒转混合数次)；
加入250μl裂解缓冲液，充分混匀后全部转移至纯化吸附柱内，12000rpm离心5分钟；
去掉收集管内的废液，加入700μl漂洗液(使用前确定已加入无水乙醇)，12000rpm离心40秒；
去掉收集管内的废液，重复步骤6)2次；
去掉收集管内的废液，空管12000rpm离心2分钟，将纯化吸附柱放入新的1.5mL离心管中，室温放置5分钟，待乙醇会发完全；
在纯化吸附柱的中心滤膜上悬空加入100μl灭菌的洗脱缓冲液，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟即得样本DNA模板，放-20℃保存备用。
2.2 PCR扩增
配置PCR反应体系25μl，放入0.2mLPCR管内，体系包括12.5μl 2×Taq PCR Mix，DNA模板2μl，引物(上/下游，2.5μM)各1μl，灭菌双蒸水8.5μl，对待测蒙古黄芪与膜荚黄芪样本的总DNA进行PCR扩增及电泳检测。
引物序列及PCR反应条件分别为：
ITS序列，其引物(5F:GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG,4R:TCCTCCGCTTATTGATATGC)，
94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟(每个循环增加3秒)，30个循环；72℃延伸7分钟。
2.3测序分析
将PCR产物点入琼脂糖凝胶内进行电泳，并对凝胶中的条带位置进行切胶回收，并对回收后的产物进行上机测序。
若ITS序列第476位点为C碱基，则该待测黄芪是蒙古黄芪；若ITS序列第476位点为T碱基，则该待测黄芪是膜荚黄芪。
实施例3特异性引物
根据可稳定鉴别蒙古黄芪与膜荚黄芪的稳定SNP变异位点，以此设计鉴别蒙古黄芪的特异性引物。在ITS序列的上游30-50bp处选择21bp长度的互补序列作为上游引物序列，以蒙古黄芪为例，其ITS序列476位点为C碱基，在ITS序列的476位点前后分别设计三组引物作为下游引物，分别为455-476bp、466-488bp、476-495bp。这三段序列的反向互补序列分别对应特异性引物的下游三组引物序列。此过程可通过软件primer 6.0实现序列与引物序列的转换，或手动修改均可。
三对引物分别为：
引物对1的序列如SEQ ID NO:1(5’-ACTTAGACAAACTTATGAATC-3’)和SEQ ID NO:2(5’-GCCGCGAGGCAACAACGCTCAC-3’)所示；
引物对2的序列如SEQ ID NO:3(5’-ACTTAGACAAACTTATGAATC-3’)和SEQ ID NO:4(5’-AATTTTCAACCAGCCGCGAGGCA-3’)所示；
引物对3的序列如SEQ ID NO:5(5’-ACTTAGACAAACTTATGAATC-3’)和SEQ ID NO:6(5’-AGGACTCAATTTTCAACCAG-3’)所示。
运用primer 6.0软件对引物序列进行分析，确定退火温度并进行试验优化，最终确定各引物对的PCR反应程序为：
引物对1的PCR条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1.5min(每个循环增加3s)，30个循环；72℃延伸7min；
引物对2的PCR条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1.5min(每个循环增加3s)，30个循环；72℃延伸7min；
引物对3的PCR条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，48℃退火1min，72℃延伸1.5min(每个循环增加3s)，30个循环；72℃延伸7min。
实施例4通过特异性引物对鉴别蒙古黄芪的方法
特异性鉴别蒙古黄芪的鉴别系统主要包括DNA提取部分、含PCR试剂的扩增部分与琼脂糖凝胶电泳检测三部分，其中该PCR试剂含特异性引物。DNA提取部分主要包括细胞核裂解液、裂解液缓冲液、RNA酶溶液、蛋白酶K，漂洗液(使用时需加入无水乙醇)、无菌的洗脱缓冲液、纯化吸附柱、收集管、1.5mL灭菌离心管等。PCR扩增部分主要包括2×Taq PCR Mix、特异性引物(上/下游)、标准蒙古黄芪DNA(阳性对照)、标准膜荚黄芪DNA(阴性对照)、灭菌双蒸水等。琼脂糖凝胶电泳检测部分包括琼脂糖、50×TBE缓冲液、DNA marker(DNA分子量标记)以及核酸染料。
检测方法：
4.1总DNA提取
取待测黄芪干燥样本，可在去除表面污染物后，直接称取约30mg，放入灭菌的1.5mL离心管内，加入两粒灭菌后的小钢珠，放入球磨仪内1500rpm研磨3-5分钟；新鲜样本可称取约0.5g，去除表面污染物，加入干净的研钵内，用液氮充分研磨成粉末，取适量加入1.5mL离心管内；
加入250μl细胞核裂解液(主要用于将样本中的细胞壁裂解，释放出细胞内的遗传物质)，5μl RNA酶溶液，充分震荡混匀；
加入20μl蛋白酶K，充分震荡混匀；
将其置于65℃水浴锅内水浴1小时(期间反复倒转混合数次)；
加入250μl裂解缓冲液，充分混匀后全部转移至纯化吸附柱内，12000rpm离心5分钟；
去掉收集管内的废液，加入700μl漂洗液(使用前确定已加入无水乙醇)，12000rpm离心40秒；
去掉收集管内的废液，重复步骤6)2次；
去掉收集管内的废液，空管12000rpm离心2分钟，将纯化吸附柱放入新的1.5mL离心管中，室温放置5分钟，待乙醇会发完全；
在纯化吸附柱的中心滤膜上悬空加入100μl灭菌的洗脱缓冲液，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟即得样本DNA模板，放-20℃保存备用。
4.2 PCR扩增
配置PCR反应体系25μl，放入0.2mLPCR管内，体系包括12.5μl 2×Taq PCR Mix，DNA模板2μl，特异性引物(上/下游，2.5μM)各1μl，灭菌双蒸水8.5μl。除了样本DNA模板外，另行配置阳性对照、阴性对照与空白对照样本PCR反应体系，方法同上，除了DNA模板不同，空白对照用灭菌双蒸水取代DNA模板。
充分混匀体系溶液，用微型离心机离心数秒后，放入PCR仪内。
PCR反应程序与特异性引物相对应，分别为：
引物对1：94℃预变性5min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1.5min(每个循环增加3s)，30个循环；72℃延伸7min；
引物对2：94℃预变性5min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1.5min(每个循环增加3s)，30个循环；72℃延伸7min；
引物对3：94℃预变性5min；94℃变性1min，48℃退火1min，72℃延伸1.5min(每个循环增加3s)，30个循环；72℃延伸7min。
待PCR反应结束后，将PCR产物取出后放入-4℃保存备用，或立即进行琼脂糖凝胶电泳检测
4.3电泳检测
1)琼脂糖凝胶制作
称取0.6g琼脂糖，加入60mL 0.5×TBE缓冲液中(试剂盒内为50×TBE缓冲液，适合长期保存，使用时可用蒸馏水直接稀释至0.5×TBE缓冲液使用，建议现配现用)，加入微波炉内加热加速溶液(高火1-2分钟)，待琼脂糖完全溶解后且温度降至65℃左右时，加入1μl核酸染料，慢慢摇匀后倒入插有梳子的胶盒内，室温下凝固。
2)电泳检测
将新鲜的0.5×TBE缓冲液加入电泳仪的电泳槽内，将凝固好的凝胶放入电泳槽内(缓冲液需没过凝胶)，凝胶的加样孔一侧放在电泳槽的负极。从加样孔的一端依次加入5μl的DNA marker、阳性对照、阴性对照、空白对照、检测样本DNA PCR产物，按5V/cm的恒压进行电泳30分钟。
3)凝胶成像系统分析
电泳结束后，将琼脂糖凝胶放入凝胶成像仪内进行观察拍照。使用紫外灯不断曝光直至胶图上条带清晰为止，保存电泳胶图结果为电子文件，并观察记录电泳检测结果。
4)检测结果分析
如果阴性对照与空白对照均未出现条带，阳性对照出现约400bp的扩增条带，如待测样本出现相应的约400bp的扩增条带，可判定待测样本为阳性结果(蒙古黄芪)；如待测样本未出现与阳性对照相对应的约400bp的扩增条带，可判定该待测样本不是蒙古黄芪。
运用三对特异性引物对蒙古黄芪与膜荚黄芪的标准样本进行PCR扩增与琼脂糖凝胶电泳检测，发现本发明涉及的三对特异性引物均可特异性扩增蒙古黄芪样本，而不能扩增膜荚黄芪样本。三对特异引物对特定黄芪样本进行扩增的电泳检测图如图2、图3和图4所示，选自实施例1中的蒙古黄芪标准品的电泳检测均出现相应的约400bp的扩增条带，而选自实施例1中的膜荚黄芪标准品的电泳检测均未出现相应的约400bp的扩增条带。由此，本发明涉及的三对特异引物均可快速特异性待测黄芪是否是蒙古黄芪。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国中药有限公司
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cgcgcatggt ggattcacaa tcc 23
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cgtacagtac ttttgtgttt acgag 25
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
acccagtcca tctggaaatc ttggttc 27
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
atgtcaccac aaacagaaac 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tcgcatgtac ctgcagtagc 20
Claims (8)
1.一种用于鉴别或辅助鉴别蒙古黄芪的引物对，其选自引物对1、引物对2和引物对3，其中，引物对1的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，引物对2的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，引物对3的序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
2.一种用于鉴别蒙古黄芪的方法，其包括以下步骤：
1)提取待测黄芪的DNA作为模板；
2)采用至少一种选自权利要求1所述的引物对为PCR扩增引物，进行PCR扩增，获得扩增产物；
3)检测扩增产物；
其中通过琼脂糖凝聚电泳来检测所述扩增产物，若电泳显示出现扩增条带，则表明该待测黄芪是蒙古黄芪。
3.权利要求2所述的方法，其中所述的扩增条带的分子量是400bp。
4.权利要求2所述的方法，其中在扩增后的反应体系中加入荧光染料SYBR Green I，若检测到所述含有荧光染料的体系产生绿色荧光，则表明该待测黄芪是蒙古黄芪。
5.一种鉴别或辅助鉴别蒙古黄芪的PCR试剂， 其包含至少一种权利要求1所述的引物对。
6.一种用于鉴别或辅助鉴别蒙古黄芪的试剂盒，其包含至少一种权利要求1所述的引物对或至少一种权利要求5 所述的PCR试剂。
7.权利要求6所述的试剂盒，其包括PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和dNTP。
8.权利要求1所述的引物对、权利要求5所述的PCR试剂或权利要求6-7所述的试剂盒在鉴别或辅助鉴别蒙古黄芪中的应用。
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| WO2007051866A2 (en) * | 2005-11-07 | 2007-05-10 | Cropdesign N.V. | Plants having improved growth characteristics and a method for making the same |
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