CN109725097A - 一种原料药中dbu的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明具体涉及一种原料药中DBU的检测方法，包括以下内容：1)取DBU制备得到对照品溶液；2)取原料药样品制备得到供试品溶液；3)采用高效液相色谱法进行检测。本发明采用高效液相色谱法检测该方法检测灵敏度高，检测限为0.02μg/ml(S/N约5.1)，定量限为0.04μg/ml(S/N约13.1)，可用于低浓度的DBU的检测。同时，该方法的线性范围广，在定量限～限度浓度的200％范围内(0.04μg/ml‑0.4μg/ml)DBU的峰面积和浓度呈现良好的线性关系，相关系数R为0.9999。

Description

一种原料药中DBU的检测方法

技术领域

本发明涉及检测方法领域，特别是涉及一种原料药中DBU的检测方法。

背景技术

DBU，中文名：1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯，化学式：C₉H₁₆N₂，一种多功能的碱性试剂或催化剂，易溶于水、乙醇，具有很强的碱性，在异构、酯化、缩合、消除等反应中得到广泛的应用，且反应的条件温和、副反应少，反应选择性专一、产物转化率高，在化药领域有广泛的应用。

基于DBU的广泛应用，在DBU参与反应获得的原料药的纯度检测中，需要对DBU的残留量进行控制。例如枸橼酸托法替布原料工艺中即使用强碱DBU，因而必须对其残留做研究，以保证用药的安全性。然而，对于原料药中的DBU残留量检测这一研究少有文献报道。

发明内容

目前对于易挥发性有机溶剂杂质，常用GC常规手段来进行检测，但是我们发现在使用GC方法时，枸橼酸托法替布原料药中的酸根易与强碱DBU成盐，使得DBU在GC进样口出无法气化，导致在GC方法中的DBU回收率不达标或完全不能回收，使得GC方法难以采用。

原料药中DBU的限度要求在0.1％，含量低，检测准确性要求高，且鉴于DBU在紫外检测器低波段下有紫外吸收，因此我们开发了便捷的HPLC方法进行DBU的残留分析。

为实现本发明目的，采用的技术方案为：

一种原料药中DBU的检测方法，包括以下内容：

1)取DBU制备得到对照品溶液；

2)取原料药样品制备得到供试品溶液；

3)采用高效液相色谱法进行检测。

本发明一实施例中，1)或2)中制备过程采用稀释剂稀释制得相应的对照品溶液和供试品溶液，其中供试品不能直接在乙腈水溶液中溶解，故样品配制过程为：加一定量的乙腈后，逐渐滴加水至样品完全溶解，再以水定容。在实际实验过程中发现乙腈浓度大容易出现溶剂效应，实验过程中选用20％乙腈水(v/v)稀释时即出现明显的溶剂效应，基于无溶剂效应，且满足样品能完全溶解的要求，本发明选用8-12％乙腈水(v/v)，优选10％乙腈水(v/v)。上述体积百分比的含义为，如10％乙腈水(v/v)指的是100份乙腈水由10体积份乙腈、90体积份水组成。

本发明一实施例中，3)中，色谱条件包括以下内容：所述色谱柱采用十八烷基键合硅胶为填料；色谱柱优选为亲水型的高强度硅胶基质颗粒色谱柱；色谱柱优选为WatersXselect HSS T3色谱柱；

流动相包括流动相A和流动相B，其中流动相A为缓冲液，流动相B为有机溶剂；进行梯度洗脱，洗脱程序中起始和结束流动相A和B的体积比为91-93：7-9。

本发明一实施例中，3)中，检测波长为210-220nm；优选为215nm。

本发明所述缓冲盐选用磷酸盐，采用磷酸盐作为缓冲盐具有基线好的优点；优选为磷酸二氢钾，浓度选自20mmol/L，在研究过程中发现随着缓冲液的pH值的下降呈酸性峰型逐渐变好，本发明选用的pH值为4-5；进一步的，考虑DBU峰型不佳，在缓冲液中添加扫尾剂，发现峰型差和拖尾现象得到改善。其中，所述扫尾剂为三乙胺，加入量为缓冲液体积的0.1％。特别的，加入三乙胺以后再调节pH值。

申请人考察了甲醇和乙腈作为有机相，发现选用甲醇作为有机相时出现基线不平的问题，而选用乙腈作为有机相的峰型好。

本发明一具体实施中，3)中，3min起始流动相A和B的体积比为91-93：7-9；5min起始流动相A和B的体积比为87-89:11-13。

本发明一具体实施例中，所述洗脱程序为：

或

。

本发明一实施例中，为了使DBU出峰时间延后，在基线较为平滑段出峰，流动相流速选自0.7-0.9ml/min。优选为0.8ml/min。

本发明具体的采用以下计算公式计算DBU的含量：

其中：A_供：供试品中DBU峰面积；

F：响应因子，DBU对照品浓度与主峰面积的比值C对/A对；

V_供：供试品溶液稀释体积，ml；

m_供：供试品称样量，mg。m_供为供试品原料药游离态的重量。当供试品为药学意义上的盐型时，需要将直接称取的该盐型供试品重量折算为其对应的游离态的重量。例如在对于枸橼酸托法替布原料药进行检测并计算DBU含量时：枸橼酸托法替布的相对分子质量为504.5，托法替布的游离碱相对分子质量为312.377，故需要以换算因子1.615进行折算，也即当直接称取的枸橼酸托法替布重量为1.615mg时，实际折算后m_供应为1mg。

本发明一实施例中，所述色谱柱耐用柱温小于等于45℃；优选为35℃。

研究发现DBU易溶于水且极性大，因此本发明选用的色谱柱为耐受纯水相的色谱柱；具体的本发明优选为Waters XSelect HSS T3，3.5μm，4.6×150mm。

本发明中DBU含量的计算，考虑到DBU购买方便、易得，且此方法只需控制供试品中DBU含量，本发明使用外标法进行计算。

本发明所提供的检测方法针对DBU的特性开发，在本发明的技术构思下，本领域技术人员可针对特定的原料药做方法的适应性细化调整，以普遍适用于多种原料药中DBU的检测。根据本发明的技术构思精神，本发明的检测方法尤其适用于含有或可能含有酸根的原料药中DBU的检测，例如枸橼酸托法替布原料药。

本发明有益效果：

一、本发明采用高效液相色谱法检测该方法检测灵敏度高，检测限为0.02μg/ml(S/N约5.1)，定量限为0.04μg/ml(S/N约13.1)，可用于低浓度的DBU的检测。同时，该方法的线性范围广，在定量限～限度浓度的200％范围内(0.04-0.4μg/ml)DBU的峰面积和浓度呈现良好的线性关系，相关系数R为0.9999。

二、本发明方法的准确度良好，50％、100％和150％三个水平加标供试品溶液中DBU的加标回收率均在90.0％-110.0％之间，结果可靠；且溶液稳定性好，连续12小时进样对照品溶液和加标供试品溶液，DBU的峰面积RSD分别为0.7％和为1.2％。该方法可实现本品中DBU的准确定量。

附图说明

图1 pH7.0下典型色谱图；

图2 pH6.0下典型色谱图；

图3 pH5.0下典型色谱图；

图4 pH4.0下典型色谱图；

图5有机溶剂筛选叠图；

图6稀释剂筛选叠图；

图7专属性叠图；

图8检测限和定量限叠图；

图9 DBU线性图；

图10是本发明应用例中DBU对照品溶液的高效液相色谱图；

图11是本发明应用例中供试品溶液的高效液相色谱图。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料药为自制药，设备均为已知产品，通过购买市售产品获得，详细如下：

1、仪器设备：

2、试剂与样品：

本申请实验过程如下：

1、限度的制定

DBU(全名：1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯)无基因毒性警示结构，且其NOAEL值较高，为120mg/kg/day,拟按照一般杂质控制，限度定为0.10％作为后续方法开发的参考基础。

2、分析方法的开发与建立

2.1色谱柱的筛选

方法开始初期，考虑到DBU易溶于水且极性大的特点，选择了可耐受100％水相的Waters Xselect HSS T3(3.5μm，4.6×150mm)色谱柱来进行分析方法开发。

2.2流动相pH的筛选

方法开发初期，考虑到DBU峰响应的问题，暂时将DBU的浓度定为2μg/ml，进行了方法开发。

表1流动相pH值筛选结果

考虑到DBU峰型不佳，拟在缓冲盐中添加扫尾剂三乙胺，观察峰型是否改善。同时，为了使DBU延后出峰(在相对平缓段出峰)，将流速降低为0.8ml/min。

表2流动相ApH值筛选结果

2.3洗脱梯度的筛选

初期洗脱梯度参考其他项目杂质检测方法，设置初始的有机相比例为11％，后来在方法开发过程中发现当初始有机相比例减小时，可使DBU出峰相对靠后，在较为平滑段出峰，筛选过程如下：

表3洗脱梯度筛选结果

将缓冲盐的pH暂定为4.0(加0.1％三乙胺后调节pH)之后，在初始有机相比例为8％基础下再次进行了洗脱梯度的筛选，筛选过程如下：

表4洗脱梯度筛选结果

2.4供试品浓度及进样量的筛选

拟暂将供试品浓度定为0.2mg/ml，按DBU限度0.1％进行计算，则DBU对照品浓度应为0.2μg/ml。当进样量分别为50μl和20μl时，20μl下主峰峰高约为2mAU左右，已经能够满足方法的灵敏度要求，而且其定量限可低至供试品浓度的0.02％(详见正文6.2部分)。故方法预验证时确定供试品浓度为0.2mg/ml，DBU对照品浓度为0.2μg/ml，进样量为20μl。

表5 DBU浓度及进样量筛选结果

2.5有机相的筛选

如图5，在流动相A、色谱条件相同的情况下，比较了甲醇和乙腈作为有机相的色谱图，图谱中可明确看出乙腈为有机相时，DBU峰型好。甲醇为有机相时，DBU出峰位置基线不平，而且主峰响应较乙腈时低。故选择乙腈为流动相B。

2.6稀释剂的确定

考察了以10％乙腈水(v/v)、20％乙腈水(v/v)为稀释剂，配制DBU溶液，20％乙腈水(v/v)稀释时溶液有明显的溶剂效应，详见图6。故将稀释剂定为10％乙腈水(v/v)溶液。

而供试品不能直接在10％乙腈水(v/v)溶液中溶解，故样品配制过程暂定为：加一定量的乙腈后，逐渐滴加水至样品完全溶解，再以水定容，即得。

2.7波长的确定

DBU在216nm左右有最大吸收波长，检测波长可选自210-220nm，本发明实际选择215nm为最终检测波长。

3.预验证的分析方法，如表6：

表6

4.计算公式

其中：A_供：供试品中DBU峰面积；

F：响应因子，DBU对照品浓度与主峰面积的比值C对/A对；

V_供：供试品溶液稀释体积，ml；

m_供：供试品称样量，mg。

具体实施方式中原料药采用的是枸橼酸托法替布，直接称取的枸橼酸托法替布样品重量除以换算因子1.615折算后即为m_供。

5.方法预验证

5.1系统适用性及专属性

5.1.1溶液配制

空白溶液：10％乙腈水(v/v)，即稀释剂。

DBU储备液：称取DBU 22.41mg于10ml容量瓶中，以稀释剂定容。命名为DBU储备液1。

DBU溶液：取DBU储备液1ml于100ml容量瓶中，以稀释剂定容，命名为DBU储备液2。取DBU储备液2 1ml于100ml容量瓶中，以稀释剂定容。命名为DBU溶液。

供试品溶液：称取供试品16.16mg于50ml容量瓶中，先加入5ml乙腈，在逐渐滴加水至超声溶解，再以水定容。

加标供试品溶液：称取供试品16.29mg于50ml容量瓶中，先加入5ml乙腈，在逐渐滴加水至超声溶解，加入DBU储备液20.5ml，再以水定容。

5.1.2进样分析

表7

编号	溶液名称	进样次数
			1	空白溶液	≥1
2	DBU溶液	1
			3	供试品溶液	1
4	加标供试品溶液	1

5.1.3结果及结论

结论：如图7，本方法系统适用性和专属性良好。

空白溶液的色谱图在DBU出峰位置无干扰峰存在。

DBU溶液中，主峰拖尾因子1.2，理论板数14640。

供试品溶液中未检出DBU。

加标供试品溶液中DBU峰拖尾因子1.2，理论板数15398。

5.2检测限和定量限

5.2.1溶液配制

空白溶液：同5.1.1。

DBU储备液：同5.1.1。

DBU溶液：同5.1.1。

DBU定量限溶液：取DBU溶液0.1ml至进样小瓶中，加入0.4ml稀释剂，混匀，即得。

DBU检测限溶液：取DBU溶液0.3ml至进样小瓶中，加入0.3ml稀释剂，混匀，即得。

5.2.2进样分析

表8

编号	溶液名称	进样次数
			1	空白溶液	≥1
2	定量限溶液	1
			3	检测限溶液	1

5.2.3结果及结论

结论：如图8，本方法结果显示灵敏度高，详细定量限及检测限见下表。

表9检测限和定量限结果

5.3线性与范围

5.3.1溶液配制

空白溶液：同5.1.1。

DBU储备液：同5.1.1。

DBU溶液：同5.1.1。

DBU定量限溶液：同5.2.1。

DBU线性10％(限度浓度)溶液：取DBU溶液进样2μl，即得。

DBU线性50％(限度浓度)溶液：取DBU溶液进样10μl，即得。

DBU线性100％(限度浓度)溶液：取DBU溶液进样20μl，即得。

DBU线性150％(限度浓度)溶液：取DBU溶液进样30μl，即得。

DBU线性200％(限度浓度)溶液：取DBU溶液进样40μl，即得。

5.3.2进样分析

表10

编号	溶液名称	进样次数
			1	空白溶液	≥1
2	上述DBU线性溶液	各1针

5.3.3结果及结论

结论：DBU在定量限～200％浓度(限度浓度)范围内呈现良好的线性，R＝0.9999，Y-截距为-0.1941，斜率为70729.9303，线性方程为y＝70729.9303x-0.1941，如图9。

表11 DBU线性试验结果

5.4准确度

5.4.1溶液配制

空白溶液：同5.1.1。

DBU储备液2：同5.1.1。

DBU溶液：同5.1.1。

供试品溶液：同5.1.1。

加标供试品溶液(50％限度浓度)：称取本品约16mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈5ml和适量水并超声至溶解，精密量取0.25mL的DBU储备液2，用水稀释至刻度，即得。同法制备3份。3份样品称样量为16.50mg、16.39mg、16.10mg。

加标供试品溶液(100％限度浓度)：称取本品约16mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈5ml和适量水并超声至溶解，精密量取0.5mL的DBU储备液2，用水稀释至刻度，即得。同法制备3份。3份样品称样量为16.15mg、16.81mg、16.61mg。

加标供试品溶液(150％限度浓度)：称取本品约16mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈5ml和适量水并超声至溶解，精密量取0.75mL的DBU储备液2，用水稀释至刻度，即得。同法制备3份。3份样品称样量为16.15mg、16.13mg、16.80mg。

5.4.2进样分析

表12

编号	溶液名称	进样次数
			1	空白溶液	≥1
2	DBU溶液	1针
			3	供试品溶液	1针
4	各回收率溶液	各1针

5.4.3结果及结论

四个浓度水平DBU的回收率均在90％～110％之间，每个浓度水平的回收率以及所有浓度水平的回收率RSD均小于10％。

表13准确度试验结果

5.5溶液稳定性

5.5.1溶液配制

空白溶液：同5.1.1。

DBU溶液：同5.1.1。

供试品溶液：同5.1.1。

加标供试品溶液：同5.1.1。

5.5.2在室温下进样分析

表14

编号	溶液名称	进样次数
			1	空白溶液	≥2
2	DBU溶液放置0h	1针
			3	供试品溶液放置0h	1针
4	加标供试品溶液放置0h	1针
			5	DBU溶液放置2h	1针
6	供试品溶液放置2h	1针
			7	加标供试品溶液放置2h	1针
8	DBU溶液放置4h	1针
			9	供试品溶液放置4h	1针
10	加标供试品溶液放置4h	1针
			11	DBU溶液放置8h	1针
12	供试品溶液放置8h	1针
			13	加标供试品溶液放置8h	1针
14	DBU溶液放置12h	1针
			15	供试品溶液放置12h	1针
16	加标供试品溶液放置12h	1针

5.5.3结果及结论

结论：DBU溶液、供试品溶液、加标供试品溶液在12h内峰面积RSD均小于2.0％，表明溶液在室温12小时内稳定。

表15溶液稳定性结果

备注：ND为未检出。

综上所述，本发明提供了一种DBU的检测方法，操作简便，容易控制，检测成本低，检测灵敏度高，检测限为0.02μg/ml(S/N约5.1)，定量限为0.04μg/ml(S/N约13.1)，可用于低浓度的DBU的检测。

同时，该方法的线性范围广，在定量限～限度浓度的200％范围内(0.04-0.4μg/ml)DBU的峰面积和浓度呈现良好的线性关系，相关系数R为0.9999。DBU的加标回收率均在90.0％～110.0％之间，结果可靠；连续12小时进样对照品溶液和加标供试品溶液，DBU的峰面积RSD分别为0.7％和为1.2％，溶液稳定性好。

应用例：基于前述本发明论证的方法，本发明的技术方案在枸橼酸托法替布原料药中的DBU的一个检测实例如下：

稀释剂：精密量取50ml乙腈和450ml水，混匀，即得。

对照品溶液：称取DBU 20mg，精密称定，置10ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，即得对照品母液；精密量取1.0ml对照品母液置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液；精密量取对照品储备液1.0ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释定容至刻度，即得对照品溶液。

供试品溶液：称取枸橼酸托法替布原料药样品16mg，精密称定，置50ml量瓶中，加入约5ml乙腈，再逐渐滴加水至样品完全溶解，再以水定容，摇匀，即得供试品溶液。

采用高效液相色谱法进行检测，具体的色谱条件如下表所示：

对照品溶液和供试品溶液的检测图谱分别依次如图10和图11所示。观察分析图谱，DBU特征峰位于基线平滑位置，峰形良好，且分离度高。根据公式计算供试样品中DBU含量。其中，供试品中DBU峰面积A_供＝7.014mAU·s；相应因子F＝C_对/A_对，DBU对照品溶液浓度C_对＝20×10^-5mg/mL，DBU对照品溶液主峰面积A_对＝15.111mAU·s；供试品溶液稀释体积V_供＝50mL；枸橼酸托法替布原料药样品称重16mg，以1.615的换算因子折算后m_供＝9.90712mg。经过计算得到DBU含量＝0.04685％。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种原料药中DBU的检测方法，其特征在于，包括以下内容：

1)取DBU制备得到对照品溶液；

2)取样品制备得到供试品溶液；

3)采用高效液相色谱法进行检测。

2.根据权利要求1所述原料药中DBU的检测方法，其特征在于：1)或2)中制备过程使用稀释剂进行调配，所述稀释剂为8-12％v/v乙腈水；优选的，2)中，制备供试品溶液时先加乙腈后，逐滴加水至样品完全溶解，再以水定容。

3.根据权利要求1所述原料药中DBU的检测方法，其特征在于，色谱条件包括以下内容：

色谱柱采用十八烷基键合硅胶为填料；色谱柱优选为亲水型的高强度硅胶基质颗粒色谱柱；色谱柱优选为Waters Xselect HSS T3色谱柱；

流动相包括流动相A和流动相B，其中流动相A为含扫尾剂的缓冲盐溶液，流动相B为有机溶剂；进行梯度洗脱，洗脱程序中起始流动相A和B的体积比为91-93：7-9。

4.根据权利要求3所述原料药中DBU的检测方法，其特征在于：3)中，所述流动相A的pH值为4-5。

5.根据权利要求3所述原料药中DBU的检测方法，其特征在于：3)中，所述缓冲盐为磷酸盐；优选为磷酸二氢钾。

6.根据权利要求3所述原料药中DBU的检测方法，其特征在于：3)中，所述流动相B为乙腈。

7.根据权利要求3所述原料药中DBU的检测方法，其特征在于：3)中，3min起始流动相A和B的体积比为91-93：7-9；5min起始流动相A和B的体积比为87-89:11-13。

8.根据权利要求3所述原料药中DBU的检测方法，其特征在于：3)中，所述洗脱程序为：

或

。

9.根据权利要求3所述原料药中DBU的检测方法，其特征在于：所述DBU含量的计算公式为：

其中：A_供：供试品中DBU峰面积；

F：响应因子，DBU对照品浓度与主峰面积的比值C_对/A_对；

V_供：供试品溶液稀释体积，ml；

m_供：供试品称样量，mg。

10.根据权利要求1所述原料药中DBU的检测方法，其特征在于：所述原料药为枸橼酸托法替布。